Raport ştiinţific şi tehnic în extensor Rezumatul etapei

1

Raport ştiinţific şi tehnic în extensor

Rezumatul etapei:

In cadrul actei etape conform cu planul de realizare a proiectului s-a avut in vedere

dezvoltaea proceselor de fermentatie induse de R. oryzae in conditii discontinue, semicontinue si

continue. S-au inregistrat semnalele metabolice a sporilor liberi si imobilizati in PVA-Cryogel.

Caracterizarae morfologica, FTIR, HPLC s-a realizat pentru fiecare experiment dezvoltat.

Modele PLS si PLA si modele matematice pe procesele de bioconversie au fost realizate. Gradul

de realizarea a activitatilor este de 100%, publicandu-se 3 articole ISI (cu 2 articole peste

numarul de lucrari propuse).

Activitatea 1.1 Cultivarea sporilor de R. oryzae si sisteme de separare- Grad de realizare 100%

Rhizopus oryzae este cunoscut în literatura de specialitate ca un bun producător de acid

lactic, fiind capabil să se dezvolte și în condiții de pH scăzut. Din punct de vedere morfologic, R.

oryzae se prezintă sub forma unor colonii cu aspect pâslos, datorat multiplicării stolonilor, de

culoare alb-galbuie. De pe stoloni se dezvoltă sporangioforii la capătul cărora se acumulează

sporii sub forma unui “săculeț”.Pentru fermentațiile derulate, s-au folosit sporii

microorganismului, atât în stare liberă, cât și imobilizată. Cele 2 forme au fost ulterior supuse

unui proces de activare pentru creșterea productivității

Activarea lui Rhizopus oryzae. În prezentul studiu, ca microorganism a fost folosit

Rhizopus oryzae NRRL 395. Acestă tulpină a fost achiziționată de la ATCC. Într-o primă fază,

fungul a fost activat prin pasare pe un mediu lichid (un bulion cu extract din cartofi- Potato

Dextrose Broth- PDB) și incubare la 30 ℃ timp de 72 h. După această perioadă, pentru a putea fi păstrat, din mediul lichid a fost pasat prin tehnica de însămânțare prin inundare, pe un mediu

solid (un agar cu extract din cartofi- Potato Dextrose Agar- PDA) și reincubat în aceleași condiții

pentru dezvoltarea miceliilor și a sporilor.

Cultivarea lui Rhizopus oryzae și obținerea sporilor. Pentru obținerea sporilor,

microorganismul a fost cultivat pe mai multe plăci Petri conținând mediu solid (PDA). După 72

de ore de incubare, sporii au fost recoltați în condiții sterile prin adăugare de ser fiziologic steril

(soluție NaCl 0,09%) și desprindere cu ajutorul unor sfere de sticlă sterile (figura 1.1.2.1).

Suspensia de spori a fost colectată într-un recipient steril pentru a asigura o omogenizare

2

completă (figura 1.1.2.2). Această suspensie a fost utilizată pentru formarea unui inocul de

concentrație cunoscută.

Figura 1.1.2.1 Figura 1.1.2.2

Concentrația a fost stabilită prin măsurarea densității optice cu ajutorul unui nanodrop ND1000

(figura 1.1.2.3), utilizând metoda McFarland, optimizată.

Figura 1.1.2.3 Nanodrop ND 1000

În vederea verificării numărului de spori, măsurarea densității optice a fost dublată de

numărarea sporilor utilizând un microscop cu obiectiv 100x și un hemocitometru (figura 1.1.2.4)

Figura 1.1.2.4 Hemocitometru și vederea microscopică a gradațiilor

Pentru fermentațiile derulate, s-a stabilit o concentrație a sporilor în soluția de ser fiziologic steril

de 9x107 ufc mL-1, folosită mai departe ca inocul pentru pornirea fermentațiilor. Pentru a atinge

3

această concentrație s-a calculat matematic factorul de diluție pentru a stabili părțile exacte de ser

fiziologic și de suspensie ce trebuie amestecate.

La fermentațiile derulate s-a utilizat același inocul, omogen, divizat în 4 părți, astfel:

a. o parte a fost folosit direct, fermentații denumite în continuare SNN (fermentații cu spori

neimobilizați și neactivați)

b. al doilea volum a fost supus unui proces de activare (SNA- spori neimobilizați și activați),

proces descris la secțiunea 1.1.4

c. al treilea volum a fost imobilizat într-un amestec de PVA-alginat și transformat în sfere de

CryoPVAG’s (SIN – spori imibolizați și neactivați), proces descris la secțiunea 1.1.3

d. A patra parte a fost de-asemenea imobilizată în aceleași condiții, iar sferele de

CryoPVAG’s au fost supuse procesului de activare, la fel ca și în cazul sporilor liberi

(SIA- spori imobilizați și activați).

Figura 1.1.3.1 Amestec soluție PVA-alginat cu spori de R.oryzae

Imobilizarea sporilor și formarea sferelor de cryogel (CryoPVAG’s) .Pentru imobilizarea

sporilor s-a utilizat o soluție de polivinil alcool (denumit în continuare PVA), cu o concentrație

de 8%, la care s-a adăugat 1% alginat față de volumul final de soluție (exemplu: la 40 mL de

soluție de PVA se adaugă 0,4 g alginat de sodiu). Soluția astfel obținută s-a autoclavat la 121 ℃ timp de 30 de minute. Volumul necesar al soluției de PVA-alginat a fost stabilit în

urma încercărilor de laborator, încercări care au avut ca scop principal determinarea pierderilor în

urma procesului de imobilizare și formare a sferelor de CryoPVAG’s. Încercările anterioare au

demonstrat că pierderile variază între 30-35% față de numărul inițial de spori. Sferele de PVA-

4

alginat, au fost obținute parcurgând mai multe etape, descrise mai jos:O primă etapă a constat în

amestecarea sporilor cu soluției de PVA-alginat, autoclavată și răcită în prealabil, astfel:

suspensia de spori obținută anterior (9x107 ufc mL-1 ) a fost adăugată în soluția de PVA-alginat în

raport de 10% față de aceasta, obținându-se o concentrație de 1,3x107 ufc mL-1 în întreaga masă

de soluție (figura 1.1.3.1).

A doua etapă a constat în formarea sferelor de PVA-alginat, în interiorul cărora au fost

imobilizați sporii. Sferele au fost obținute cu ajutorul unui microîncapsulator (figura 1.1.3.2), prin

picurarea amestecului într-o soluție de clorură de calciu sterilă cu o concentrație de 0,5 M L-1.

Sferele astfel obținute au fost menținute în suspensie prin agitare continuă timp de 30 de minute

pentru întărirea alginatului și formarea structurii (figura 1.1.3.3)

Figura 1.1.3.2Microîncapsulatorul utilizat Figura 1.1.3.3Sferele de PVA obținute

În cadrul celei de-a treia etape s-au separat sferele obșinute și s-au supus procesului de obținere a

sferelor de cryogel (CryoPVAG’s). Procesul a constat în supunerea sferelor la 3 etape

consecutive de îngheț (la -27 ℃)-dezgheț (temperatura camerei, 25℃). Modificările survenite în

urma acestui proces sunt ilustrate în figura 1.1.3.4, fiind vizibile datorită adaosului de albastru de

metilen (soluțe 1%) care pune în evidență formarea porilor. Sferele de CryoPVAG’s au fost

divizate astfel încât o parte să fie utilizate pentru inocularea fermentațiilor SIN, iar cealaltă parte

să treacă printr-un proces de activare și să fie folosite drept inocul pentru fermentațiile SIA Toate

etapele mai sus menționate s-au realizat în condiții de sterilitate maximă pentru evitarea

eventualelor contaminări ce ar fi putut apărea datorită manipulărilor.

5

Sfere de PVA

Momentul 0

Sferă PVA momentul 0 Sfere după prima etapă de

congelare

Sfere după etapa 2 de congelare Sfere după etapa 3 de congelare

Figura 1.1.3.4 Evoluția sferelor pe durata procesului de obținere a CryoPVAG’s

Sferele de CryoPVAG’s au fost divizate astfel încât o parte să fie utilizate pentru

inocularea fermentațiilor SIN, iar cealaltă parte să treacă printr-un proces de activare și să fie

folosite drept inocul pentru fermentațiile SIA

Toate etapele mai sus menționate s-au realizat în condiții de sterilitate maximă pentru

evitarea eventualelor contaminări ce ar fi putut apărea datorită manipulărilor.

Activarea sporilor si a sferelor de CryoPVAG’s. În vederea îmbunătățirii randamentului de

producție și reducerii timpului de lag (timpul în care microorganismul trece din starea de spori în

stare vegetativă și se obișnuiește cu noul mediu) din faza de dezvoltare a microorganismelor, atât

sporii cât si sferele de CryoPVAG’s au fost supuse unui proces de activare (în cazul

fermentațiilor SNA și SIA). Mediul utilizat (format din: 50 g L-1 glucoză și 5 g L-1 yeast extract) a

fost autoclavat la 121 ℃ timp de 15 minute și răcit la temperatura camerei. Atât sferele de

CryoPVAG’s cât și volumul de suspensie de spori (identic cu cel utilizat la secțiunea 1.1.1 litera

a) au fost supuse procesului de activare la 34 ℃ timp de 48 h, timp în care microorganismul a trecut din stare de spori în stare vegetativă (figura 1.1.4.1)

6

Figura 1.1.4.1 Activarea sferelor de CryoPVAG’s (imaginea din partea stângă) și a

sporilor (imaginea din partea dreaptă)

Separarea sporilor și a sferelor de CryoPVAG’s activate

Separarea celulelor vegetative libere și a sferelor de CryoPVAG’s s-a făcut prin

centrifugare la 3500 rpm timp de 10 minute, la 25 ℃. Peletul obținut în ambele cazuri a fost spălat cu o soluție de ser fiziologic steril pentru îndepărtarea excesului de mediu de activare.

După recentrifugare, peletele obținute în ambele cazuri au fost transferate în condiții sterile în

flask-uri care conțineau mediile de fermentație.

Fermentațiile propriu-zise – faza de flask

Toate cele 4 tipuri de fermentații (SNN, SNA, SIN și SIA) au fost derulate pe 2 medii

diferite (un mediu martor, la care a fost utilizată ca și sursă de carbon glucoza și un mediu la care

glicerolul brut a constituit sursa de carbon a microorganismului). Mediul martor a fost alcătuit

din: 0,092 g L-1CaCl2 x 2H2O, 4 g L-1 MgSO4 x 7H2O, 6 g L-1 KH2PO4, 16 g L-1 (NH4)2SO4 și 70

g L-1 glucoză, iar mediul cu glicerol brut a fost format din 0,092 g L-1CaCl2 x 2H2O, 4 g L-1

MgSO4 x 7H2O, 6 g L-1 KH2PO4, 16 g L-1 (NH4)2SO4 și 75 g L-1 glicerol brut. pH-ul mediului în

ambele cazuri a fost ajustat la 6, folosind o soluție de hidroxid de sodiu 20%. Mediile au fost

autoclavate la 121℃ timp de 15 minute. Cantitatea de glicerol a fost optimizată în cadrul unor

încercări de laborator, derulate anterior.

După inoculare, toate cele 4 tipuri de fermentații au fost incubate la 30 ℃ timp de 168 de ore, fiind menținute într-o continuă agitare la 200 rpm cu ajutorul unui shaker orbital (figura

1.1.6.1 ).

7

Figura 1.1.6.1 Fermentațiile derulate în flask

Pentru determinările propuse (caracterizarea HPLC, caracterizarea FTIR, cuantificarea activității

alcool dehidrogenazei și a lactat dehidrogenazei, determinarea gradului de epuizare a substratului

și viabilitatea microorganismului) au fost recoltate probe odată la 24 h pe întreaga durată a

procesului. Viabilitatea a fost determinată prin tehnica diluțiilor succesive și metoda însămânțării

pe plăci (mediu PDA).

Toate cele 4 tipuri de fermentații (derulate pe ambele medii) au fost realizate în triplicat și au fost

derulate la nivel de flask (figura 1.1.6.2)

Figura 1.1.6.2 Fermentațiile SIN ziua 2

Metode de saparare a lui R. oryzae. La finalul celor 168 de ore, biomasa de R. oryzae a fost

separată prin centrifugare, iar supernatantul a fost recuperat, deoarece compusul de interes (acid

lactic) se regăsea în acesta.

8

Activitatea 1.2. Cresterea micelara in interiorul matricei- Grad de realizare 100%

În cazul fermentațiilor care au avut drept inocul sferele de CryoPVAG’s (SIN și SIA) a fost

urmărită și capacitatea lui R. oryzae de a se dezvolta în interiorul sferelor.(figura 1.2.1).

Figura 1.2.1 Creșterea micelară în interiorul sferelor

Pentru o bună vizualizare, matricea a fost colorată cu o soluție de albastru de metilen,

fiind utilizat un microscop pentru vizualizare. Avantajul utilizării microorganismului sub formă

imobilizată constă în posibilitatea utilizării acestuia în procesele semi-continue și continue, fără a

fi afectată productivitatea. Dezvoltarea lui R. oryzae este posibilă datorită structurii poroase care

se formează în CryoPVAG’s, structură care permite mediului să pătrundă în matrice, fiind mult

mai accesibil pentru dezvoltarea microorganismului. Formarea porilor poate fi observată în figura

1.1.3.4 prezentată la secțiunea 1.1.3 Imobilizarea sporilor și formarea sferelor de cryogel

(CryoPVAG’s), unde se poate observa structura unei sfere de PVA-alginat de la obținere până la

forma finală de CryoPVAG’s.

Activitate 1.3. Caracterizarea FTIR a spectelor inregistrate pe micelii- Grad de realizare 100%

Inregistrarea spectrelor de absorbtie in infrarosu s-a facut direct prin utilizarea

spectofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 cu accesoriu HATR (Horizontal Attenuated Total

Reflectance) . Spectrele au fost inregistrate pe domeniul de lungimi de unda 650-4000 cm -1 si s-

au identificat benzile de absorbtie caracteristice tipului de legaturi si gruparilor functionale (

exprimate in cm-1). Probele analizate au fost aplicate direct pe accesoriu orizontal de diamant de

tip ATR (Attenuated Total reflectance) cu o singura reflexie de la PIKE, dupa care s-au

inregistrat spectrele de absorbtie in infrarosu prin utilizarea spectofotometrului Shimadzu IR

Prestige -21 fata de apa ca background.

9

Spectrele au fost inregistrate pe domeniul de lungimi de unda 600-4000 cm -1, la o

rezoluție de 4 cm-1, și 64 scanari pentru un spectru.Cristalul ATR a fost curatat cu apa pentru

indepartarea reziduurilor dintre masuratoriExperimentul s-a desfasurat pe durata a sapte zile, in

doua medii diferite ( cu glucoza si glycerol), in fiecare zi colectindu-se porbe pt determinarea

acidului lactic.

3000 2500 2000 1500 10000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

729

819

914

1041

1097

1122

1213

1325

1375

1456

1647

1716

2625

293729

91

Abso

rban

ce(a

.u.)

wavenumber (cm-1)

Lactic Acid

Fig.1. Spectrul FT-IR al acidului lactic pe domeniul 700-3300 cm-1

Probele colectate zilnic au fost centrifugate, 10 ul de proba au fost aplicati pe ATR si

inregistrat spectrul FTIR pentru fiecare

3500 3000 2500 2000 1500 10000.00

0.02

0.04

0.06

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 mediu glucoza ziua 7 mediu glucoza

1633

1033-1078

3300

Fig.2. Spectrele FTIR suprapuse pentru probele in mediu cu glucoza- Fermentația SNN pe domeniul 750- 3500 cm-1, cresterea intensitatii absorbtiei la 1633 cm-1 indicind o crestere a concentratiei acidului lactic de-a lungul celor 7 zile.

10

1800 1600 1400 1200 10000.00

0.02

0.04

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 ziua 7

1033

1633

Fig.3. Spectrele FTIR suprapuse pentru probele in mediu cu glucoza pe domeniul 900- 1800 cm-1

3500 3000 2500 2000 1500 10000.0

0.1

0.2

3300

1633

Absor

bance

(a.u.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 in mediu cu glicerol ziua 7 in mediu cu glicerol

993-1043

Fig.4. Spectrele FTIR suprapuse pentru probele in mediu cu glicerol- Fermentația SNN pe domeniul 750-3500 cm-1, cresterea intensitatii absorbtiei la 1633 cm-1 indicind o crestere a concentratiei acidului lactic de-a lungul celor 7 zile.

1800 1600 1400 1200 10000.0

0.1

1109 1043

Abso

rbanc

e (a.u

.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 ziua 7)

1633

993

Fig.5. Spectrele FTIR suprapuse pentru probele in mediu cu glicerol pe domeniul 900- 1800

cm-1

11

Banda de absorbtie de la 1716 cm-1 este caracteristica acizilor liberi prezenti, in acest caz : acidul

lactic (fig.1.) Deoarece mediul analizat este unul apos, absorbtia legaturii _OH din apa, la 1633

cm-1 este foarte puternica, banda de absorbtie a acidului se suprapune in spectrul FTIR iar

diferentele sint putin sesizabile. Cu toate acestea de la ziua 0 la ziua 7 se observa o crestere a

intensitatii la 1633 cm-1 ceeea ce indica cresterea concentratiei in acid lactic. De asemenea pe

masura ce concentratia de acid lactic creste, scade concentratia in glucoza. Semnalele IR

inregistrate in regiunea 1033 -11078 cm-1 sunt legate de gruparea –COH si asociate cu zaharurile

(maxim de absorbtie pt glucoza la 1033 cm-1). Regiunea de la 3000-3300 cm-1 corespunde apei

respectiv frecventei de absorbtie pentru –OH..In concluzie odata cu scaderea semnalului din zona

glucidelor (consumarea acestora) se constata o crestere a semnalului in zona acizilor (cresterea

concentratiei), pe parcursul fermentatiei

Activitate 1.4. Caracterizarea chimica a glicerolului- Grad de realizare 100%

Glicerolul brut, ca produs secundar principal al biodieselului, este produs prin reacția de

transesterificare a trigliceridelor (uleiuri, grăsimi animale / vegetale) cu un alcool (metanol,

etanol), în prezența unui catalizator (bază, enzime, acizi). Un

raport general între producția de biodiesel și cantitatea de

glicerol rezidual generat indică faptul că pentru fiecare 10 părți

biodiesel furnizat, se produce o parte de glicerol. După reacția

de transesterificare și separarea biodieselului brut, glicerolul

brut nu este suficient de pur pentru o utilizare directă în diferite

aplicații. Astfel, impuritățile prezente sunt îndepărtate printr-un

proces de purificare eficient, pentru a reduce la minimum

costurile de producție și volumul de deșeuri. Din punct de vedere chimic, glicerolul pur (Figura

1 - dreapta) este o substanță lichidă inodoră și incoloră, care este higroscopică și vâscoasă cu un

gust ușor dulce. În schimb, glicerol brut (Figura 1 - stânga) este un produs semi-solid de culoare

maro deschis (datorită impurităților ca metanol, săpunuri, esteri ai acizilor grași, MONG, FAME,

cenușă, metale grele etc.). Glicerolul prezintă trei grupări hidroxilice hidrofilice alcoolice, care

sunt responsabile pentru buna solubilitate în apă și îi conferă acestuia proprietăți higroscopice.

Densitatea glicerolului este de 1,26 g / cm3, are un punct de topire de 18,2° C și un punct de

fierbere de 290 ° C în stare pură anhidră și presiune atmosferică normal. În ceea ce privește

toxicitatea ecologică, degradarea termică a glicerolului la temperaturi ridicate (280-300° C) poate

12

produce acroleină, care este un compus nociv pentru organismele vii. În această activitate,

materia primă (glicerol brut) achiziționată de la o unitate de prelucrare a biodieselului a necesitat

o analiză prealabilă pentru a stabili concentrația și disponibilitatea glicerolului. Datorită

compoziției sale complexe, glicerolul brut a fost tratat și fracționat cu soluții organice apoase,

pentru o mai bună caracterizare a componentelor sale. Fiecare fracție a fost prelucrată individual

și analizată printr-o serie de alte tehnici specific.

Analiza HPLC a glicerolului și a metanolului. Conținutul liber de metanol și glicerol

din glicerolul brut a fost determinat prin metoda HPLC, utilizând fracții apoase rezultate din

fracționarea glicerolului brut, fără saponificare. Conținutul total de glicerol din glicerolul brut a

fost determinat prin metoda HPLC, utilizând fracții apoase rezultate din fracționarea glicerolului

brut, prin saponificare. Fracțiunile apoase au fost filtrate și analizate utilizând un sistem HPLC

LC-20 AB (Schimadzu, Columbia, MD), echipat cu un detector de indice de refracție RID-10A și

un detector FQR-Fast Fruit H, plus coloană (Phenomenex, Torrance, CA). Faza mobilă utilizată a

fost 0,005 N H2S04, având un debit de 0,6 ml / min. Coloana și temperaturile RID au fost

menținute la 60 ° C, respectiv la 55 ° C. Volumul de injectare a fost de 10 µL. A fost construită o

curbă de calibrare prin analizarea soluțiilor standard de glicerol și metanol la valori ale

concentrațiilor diferite.

Analiza GC a trigliceridelor, a glicerolului, a FAME și a FFA. Conținutul liber de

glicerol conținut în glicerolul brut a fost determinat prin metoda gaz-cromatografiei, utilizând

sistemul Schimadzu GC-2010 și un sistem GC (Schimadzu, Columbia, MD) echipat cu un

detector cu ionizare în flacără (FID). Analiza GC a glicerolului a fost după cum urmează:

glicerolul brut (40,0-100,0 mg) a fost acidulat utilizând 100 ml HCI 1: 1 (v / v) și apoi a fost

dizolvat în 10 ml de piridină, într-un tub de sticlă (PyrexCorning, NJ). Apoi, o parte din soluția

obținută anterior a fost amestecată cu 100 µL de soluție standard de 1,2,4-butanetriol (0,89 mg /

ml, standard intern) și derivatizată cu 100 µL MSTFA timp de 15 minute la 38 ° C. Proba a fost

filtrată și injectată (1 µL) într-o coloană MXT Biodiesel TG (14 m, 0,53 mm, 0,16 pm, Restek,

Bellefonte, PA). Ca și fază mobilă s-a utilizat heliu, la un debit de 3 ml / min. Temperaturile

injectorului și ale coloanei au fost crescute ușor de la 50 la 110° C, în timp ce temperatura

detectorului a fost menținută constant la 380 ° C. A fost realizată o curbă de calibrare prin

analizarea glicerolului pur la diferite nivele de concentrație. Concluzie. În urma acestui raport,

13

concentrația de glicerol și disponibilitatea acestuia în fracția reziduală rezultată de la fabricare a

biodieselului, au fost determinate prin utilizarea metodelor HPLC și GS.

Activitate 1.6. Optimizarea raportului dintre inhibitorii ADH, glicerol crud si fung- Grad de

realizare 100%

În cadrul acestei activități s-au investigat mecanismele metabolice de obținere a acidului lactic cu

ajutorul tulpinii fungice de Rhizopus oryzae NRRL 395. De asemenea, s-au încercat stimularea

căii metabolice de sintetizare a lactatului (acid L lactic) și inhibarea căii metabolice cu formare de

alcool etilic (vezi fig.1). Etapele de optimizare a procesului de fermentație a glicerolului au fost

stabilite pe baza protocoalelor dezvoltate în cadrul laboratorului de biotehnologii fermentative. În

vederea optimizării procesului de fermentație a glicerolului de către R. oryzae, cu randament

crescut în ceea ce privește sinteza de acid L lactic, s-a propus inhibarea activității enzimelor

responsabile de sinteza de ethanol (alcool dehidrogenaza – ADH) a tulpinii fungice mai sus

menționate, prin adăugarea de 2, 2, 2, trifluoroetanol și ajoene (Abdel-Rahman și colab., 2013) în

mediul de fermentație, și efectuarea fermentației glicerolului utilizând spori și pelete imobilizate.

Alcool dehidrogenazele (ADH) sunt un grup de enzime care au rol esențial în facilitarea

interconversiei dintre alcooli și aldehide sau cetone, prin reducerea nicotinamid-adenin-

dinucleotidei (NAD+ la NADH).

14

(Meussen et al.,

2012)

Figura 1.6.1. O reprezentare simplificată a principalelor căi de fermentare a glucozei ca sursă de

carbon redată de Meussen et al. 2012. Numerele indică enzimele cheie dintr-o cale specifică unui

anumit metabolit: 1- piruvat decarboxylase (PDC); 2- alcool dehidrogenază (ADH); 3- lactat

dehidrogenază (LDH); 4- piruvat carboxilaza (PYC); 5- malat dehidrogenază (MDH); 6-

fumaraza

Activitate 1.7 si Activitatea 1.8 Cuantificarea acidului lactic pe perioada proceselor de

fermentatie semicontinue discontinue, cu ADH inhibat al R oryzae ( imobilizat si peletizat) Grad

de realizare 100%

Pentru identificarea si cuantificarea acidului lactic s-a utilizat metoda HPLC dezvoltata pe

sistemul HPLC Agilent seria 1200, dotat cu degazor pentru solventi, pompe quaternare, detector

UV-Vis, termostat pentru coloana si injector manul, Agilent Tehnologies, USA. Separarea

acidului lactic s-a realizat pe coloana cromatografica cu faza inversa Acclaim OA 5 µm, 4x150

mm Dionex care a fost eluata timp de 10 min, cu o solutie de fosfat monosodic (NaH2PO4) de

concentratie 50mM si pH=2.8, la un debit de 0.5 ml/min si temperatura T=100C. Cromatogramele

s-au inregistrat la lungimea de unda λ=210 nm.

15

Identificarea acidului lactic in probele analizate s-a facut prin compararea timpului de retentie al

peak-ului cu cel al acidului lactic standard de la firma Fluka, Germania.

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie(min)L-

Lact

ic a

cid

Fig.1. Cromatograma Acid Lactic standard; tR = 3.17 min

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)

mediu de fermentatieglucoza

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


mediu fermentatieglicerol

Fig.2. Cromatograme Medii de fermentatie ( glucoza si glicerol )

16

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 0

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

17

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 6

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.3. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae imobilizati, neactivati (SIN) in mediu cu glucoza

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 0

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 1

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

18

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 8 100

100

200

300

400

500

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

0 2 4 6 8

0

100

200

300

400

500

600

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 6

0 2 4 6 80

100

200

300

400

500

600

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.4. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae imobilizati, neactivati in mediu cu glicerol

S-a calculat cantitatea de acid lactic pentru fiecare zi de fermentatie, in cele doua medii

(glucoza si glicerol), pentru cele 4 variante ale procesului de fermentatie, utilizand curba de

calibrare avand ecuatia y=1555.9x + 302.33, R2 = 0.9938 pentru concentratii cunprinse in

intervalul 1-10 g/l .

19

Pentru calcularea concentratiilor mai mari de 10 g/l s-a utilizat curba de calibrare cu

ecuatia y=359.21x + 15742, R2 = 0.9960. Domeniul de concentratii pe care s-a realizat aceasta

curba de calibrare este 20-80 g/l.

Tabel 1. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae imobilizati, neactivati

(SIN) in mediu cu glucoza, exprimata in g/l.

Linia 1 Linia 2 Linia 3 Ziua 0 0 0 0 Ziua 1 1.073 1.502 1.323 Ziua 2 2.295 2.368 2.054 Ziua 3 2.357 2.917 2.560

Curba calibrare Acid Lactic

y = 1555.9x + 302.33R2 = 0.9938

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 2 4 6 8 10 12

Concentratia (g/l)

Aria

(mA

U)

Curba calibrare Acid Lactic

y = 359.21x + 15742R2 = 0.996

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

10 20 30 40 50 60 70 80

Concentratia (g/l)

Aria

(mA

U)

20

Ziua 4 2.977 3.866 3.270 Ziua 5 6.566 6.911 5.632 Ziua 6 7.842 8.310 7.490 Ziua 7 9.772 10.558 9.631

Tabel 2. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae imobilizati, neactivati

(SIN) in mediu cu glicerol, exprimata in g/l.

Linia 1 Linia 2 Linia 3

Ziua 0 0 0 0

Ziua 1 0 0 0

Ziua 2 0.601 0.768 0.536

Ziua 3 0.925 1.000 0.902

Ziua 4 1.456 1.414 1.724

Ziua 5 1.869 1.620 1.830

Ziua 6 2.298 1.900 2.182

Ziua 7 2.576 2.229 2.558

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 0

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 1

Lact

ic a

cid

21

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid Ziua 6

0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.5. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati (SNN) in mediu cu glucoza

22

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 0

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie (min)La

ctic

aci

d

Ziua 3

0 2 4 6 8

0

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

23

0 2 4 6 80

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 6

0 2 4 6 8

0

100

200

300

400

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.6. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati (SNN) in mediu cu glicerol

Tabel 3. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati,

neactivati (SNN) in mediu cu glucoza, exprimata in g/l.


Ziua 0 0 0 0

Ziua 1 1.312 1.607 1.785

Ziua 2 3.163 2.942 3.041

Ziua 3 3.674 3.696 4.602

Ziua 4 5.271 4.271 4.869

Ziua 5 6.145 6.653 7.284

Ziua 6 7.315 8.740 9.937

Ziua 7 8.974 9.893 9.978

Tabel 4. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati,

neactivati in mediu cu glicerol, exprimata in g/l.


Ziua 0 0 0 0

Ziua 1 0.441 0.229 0.177

Ziua 2 0.791 0.589 0.565

24

Ziua 3 0.945 0.716 0.702

Ziua 4 1.026 0.881 0.876

Ziua 5 1.165 1.013 1.844

Ziua 6 1.393 1.474 1.477

Ziua 7 1.443 1.457 1.772

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 0

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

25

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 6

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 7

Fig.7. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae neimobilizati, activati (SNA) in mediu cu glucoza

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 0

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000Ab

sorb

anta

(mAU

)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

26

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 6

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.8. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae neimobilizati (SNA), activati in mediu cu glicerol

Tabel 5. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati

(SNA) in mediu cu glucoza, exprimata in g/l.


Ziua 0 0.932 3.949 3.949

Ziua 1 79.060 70.246 70.246

Ziua 2 85.969 82.520 82.520

Ziua 3 86.579 84.182 84.182

Ziua 4 47.599 46.012 46.012

Ziua 5 47.462 44.823 44.823

Ziua 6 44.946 44.525 44.525

27

Ziua 7 43.693 44.450 44.450

Tabel 6. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati

(SNA) in mediu cu glicerol, exprimata in g/l.


Ziua 0 0.864 1.648 2.186

Ziua 1 2.772 2.655 3.222

Ziua 2 59.820 50.118 30.219

Ziua 3 39.501 54.233 47.262

Ziua 4 18.452 30.283 31.221

Ziua 5 18.421 30.275 30.971

Ziua 6 14.490 27.419 26.742

Ziua 7 13.159 25.088 23.961

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 0

0 2 4 6 8

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 8

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 3

28

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 4

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Ziua 5

Lact

ic a

cid

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 6

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 7

Fig.9. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae imobilizati, activati (SIA) in mediu cu

glucoza

0 2 4 6 80

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 0

0 2 4 6 80

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 1

29

0 2 4 6 80

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 2

0 2 4 6 80

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 3

0 2 4 6 80

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cidZiua 4

0 2 4 6 8

0

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 5

0 2 4 6 8

0

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 6

0 2 4 6 8

0

100

200

300

Abso

rban

ta (m

AU)


Lact

ic a

cid

Ziua 7

Fig.10. Cromatograme Probe fermentatie cu spori R. oryzae imobilizati, activati (SIA) in mediu

cu glicerol

Tabel 7. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae imobilizati, activati

(SIA) in mediu cu glucoza, exprimata in g/l.

30


Ziua 0 0.839 0.703 0.663

Ziua 1 22.714 14.599 5.061

Ziua 2 28.657 30.520 6.172

Ziua 3 27.847 30.124 6.460

Ziua 4 24.746 25.166 6.910

Ziua 5 22.143 24.576 7.709

Ziua 6 21.144 24.281 8.430

Ziua 7 20.893 23.830 8.870

Tabel 8. Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae imobilizati, activati

(SIA) in mediu cu glicerol, exprimata in g/l.


Ziua 0 0.657 0.691 0.696

Ziua 1 1.021 1.251 1.362

Ziua 2 1.655 1.737 1.968

Ziua 3 0.984 0.995 0.930

Ziua 4 0.900 0.834 0.857

Ziua 5 0.839 0.822 0.664

Ziua 6 0.834 0.783 0.642

Ziua 7 0.812 0.763 0.633

Activitate 1.9 si Activitate 1.10. Inregistrarea FTIR a semnalelor specifice formularii lactatului

(forma peletizata si imobilizata R. oryzae) in fermentatie discontinua si semicontinua- Grad de

realizare 100%

Analiza PLS (Partial Least Squares) pe baza spectrelor FTIR Pentru a efectua determinarile

cantitative bazate pe spectrele FTIR s-a folosit o tehnica de calibrare multivariata numita PLS.

Spectroscopia FTIR și regresia PLS au fost combinate pentru predictia rapida si fiabila a

cantitatii de acid lactic din mediile de cultura.Setul de probe analizat la FTIR a fost analizat si la

31

cromatogarful HPLC, rezultatele obtinute fiind folosite ca referinta in construirea modelului

matematic.

Setul de calibrare - 14 probe

Setul de validare – 7 probe

Spectrele au fost exportate in programul de software Unscramble 10.1, Camo ASA Norvegia

pentru a efectua calibrarea si validarea datelor.Regiunea specifica luata in considerare pentru

prelucarea datelor a fost 750-3500 cm-1 , in prelucrarea spectrelor s-au folosit tehnici matematice

pe baza procedurii Savitzky-Golay de netezire precum si normalizarea acestora. Setul de

calibrare (n=14) a fost folosit pentru a stabili modelele de calibrare dintre datele spectrale si cele

masurate (valori de referinta), setul de predictie (n=7) fiind folosit la validare.

Fermentația 1- SNN, Mediu cu glucoza

Nr. Crt. Denumire proba Acid Lactic Mg/L

Error of prediction % Reference Predicted

Ziua 0 1.0.GL 0 1.091 1.94 Ziua 1 1.1.GL 1.607 3.087 1.99 Ziua 2 1.2.GL 2.942 2.729 1.10 Ziua 3 1.3.GL 3.696 2.778 1.68 Ziua 4 1.4.GL 4.271 3.583 1.58 Ziua 5 1.5.GL 6.653 3.588 2.11 Ziua 6 1.6.GL 8.740 9.299 1.48 Ziua 7 1.7.GL 9.893 9.449 1.27 RMSEP1 1.73787 1.85789 - R-Square(R2)2 0.709029 0.62958 - F3 4 -

Fermentația 1- SNN,Mediu cu glicerol



Ziua 0 1.0.CGY 0 0.630 1.97 Ziua 1 1.1. CGY 0.441 0.690 1.32

32

Ziua 2 1.2. CGY 0.791 0.717 0.89 Ziua 3 1.3. CGY 0.945 0.719 1.63 Ziua 4 1.4. CGY 1.026 0.756 1.77 Ziua 5 1.5. CGY 1.165 0.743 1.68 Ziua 6 1.6. CGY 1.393 1.428 0.44 Ziua 7 1.7. CGY 1.443 1.452 0.44 RMSEP1 0.32589 0.40944 - R-Square(R2)2 0.48771 0.26930 - F3 4 -

Fermentația 2- SNA, Mediu cu glucoza



Ziua 0 2.0.GL 3.949 5.801 1,468 Ziua 1 2.1.GL 70.246 64.625 0,919 Ziua 2 2.2.GL 82.520 65.158 0,789 Ziua 3 2.3.GL 84.142 68.826 0,817 Ziua 4 2.4.GL 46.012 44.158 0,959 Ziua 5 2.5.GL 44.823 37.744 0,842 Ziua 6 2.6.GL 44.525 37.795 0,848 Ziua 7 2.7.GL 44.450 45.051 1,013 RMSEP1 21.2209 25.2837 - R-Square(R2)2 0.25009 0.02094 - F3 1 -

Fermentația 2- SNA,Mediu cu glicerol



Ziua 0 2.0.CGY 0.864 1.545 1,788 Ziua 1 2.1. CGY 2.772 3.272 1,180 Ziua 2 2.2. CGY 59.820 49.829 0,832 Ziua 3 2.3. CGY 39.501 20.031 0,507 Ziua 4 2.4. CGY 18.452 22.809 1,236 Ziua 5 2.5. CGY 18.421 15.053 0,817 Ziua 6 2.6. CGY 14.490 11.857 0,818 Ziua 7 2.7. CGY 13.159 11.072 0,841

33

RMSEP1 15.01173 15.57825 - R-Square(R2)2 0.333269 0.344146 - F3 2 -

Fermentația 3- SIN,Mediu cu glucoza



Ziua 1 3.1.GL 1.502 1.376 0,916 Ziua 2 3.2.GL 2.368 1.955 0,825 Ziua 3 3.3.GL 2.917 3.250 1,114 Ziua 4 3.4.GL 3.866 3.820 0,988 Ziua 5 3.5.GL 6.911 7.373 1,066 Ziua 6 3.6.GL 8.310 7.728 0,929 Ziua 7 3.7.GL 10.558 10.278 0,973 RMSEP1 1.9180 2.0456 - R-Square(R2)2 0.98791 0.88189 - F3 4 -

Fermentația 3- SIN,Mediu cu glicerol



Ziua 1 3.1.CGY 0 0.023 0.18 Ziua 2 3.2.CGY 0.601 0.570 0.18 Ziua 3 3.3.CGY 0.925 0.852 0.22 Ziua 4 3.4.CGY 1.456 1.442 0.23 Ziua 5 3.5.CGY 1.869 1.965 0.20 Ziua 6 3.6.CGY 2.298 2.202 0.18 Ziua 7 3.7.CGY 2.576 2.554 0.23 RMSEP1 0.38107 0.352359 - R-Square(R2)2 0.97445 0.86774 - F3 3 -

Fermentația 4- SIA, Mediu cu glucoza

34



Ziua 0 4.0.GL 0.703 1.02 0,950 Ziua 1 4.1.GL 14.599 13.876 1,034 Ziua 2 4.2.GL 30.520 31.572 0,990 Ziua 3 4.3.GL 30.124 29.835 1,009 Ziua 4 4.4.GL 25.166 25.382 1,003 Ziua 5 4.5.GL 24.576 24.647 0,975 Ziua 6 4.6.GL 24.280 23.664 1,050 Ziua 7 4.7.GL 23.830 25.023 0,950 RMSEP1 0.94127 0.98944 - R-Square(R2)2 0.98944 0.71499 - F3 4 -

Fermentația 4- SIA Mediu cu glicerol


Reference Predicted

4.0.CGY 0.691 NA Ziua 1 4.1.CGY 1.251 NA Ziua 2 4.2.CGY 1.737 NA Ziua 3 4.3.CGY 0.995 NA Ziua 4 4.4.CGY 0.834 NA Ziua 5 4.5.CGY 0.882 NA Ziua 6 4.6.CGY 0.783 NA Ziua 7 4.7.CGY 0.763 NA RMSEP1 0.254201 Nedetreminat R-Square(R2)2 0.400469 Nedeterminat F3 1

Nu s-a reusit discriminarea din cauza cantitatilor mici de acid lactic, sub limita de detectie a

aparatului FTIR.

1- Standard deviation of differences between predicted and reference data

2- The squared correlation coefficient (determination coefficient R2)

35

3- Optimal number of factor

RMSEP – Root Mean Square Error of Prediction

Rezultatele modelelor de regresie partiala pentru acidul lactic comparativ cu valorile de referinta

obtinute prin analiza HPLC, sint prezentate pentru fiecare bacterie in cele 2 medii de cultura

(glucoza si glycerol) sub forma tabelata. S-au prezentat coeficientii de determinare R2, eroarea

mediană pătrată de rădăcină (RMSEP) și numărul optim de factori utilizati.

S-a constatat ca cel mai bun model predictiv este pt bacteria 3 in mediu de glucoza urmata

de bacteria 3 in mediu cu glycerol si bacteria 4 in mediu cu glucoza. Coeficientul de determinare

R2 pentru bacteria 3 in mediu de glucoza Pentru bacteria 4 in mediu cu glycerol ,cantitatile de

acid lactic formate au fost sub limita de detectie a aparatului.

In concluzie, pentru bacteria 3 in cele doua mediii si bacteria 4 in mediu cu glucoza,

corelatia bună dintre valorile ac.lactic preconizate FTIR-PLS si cele determinate prin metoda de

referinta HPLC , precum si valorile reduse RMSEP, demonstrează potentialul spectroscopiei

FTIR ca un instrument rapid, fiabil, simplu și rentabil pentru determinarea acidului lactic.

Pe baza rezultatelor FTIR prezentate mai sus în acest raport , se asteapta de asemenea ca

modelele predictive să se imbunatateasca în continuare, prin incercari de separare si extractie a

acidului lactic. Mediul de cultura fiind apos si opalescent din cauza abundentei bacteriilor precum

si a concentratiilor mari de saruri a ingreunat masurarea spectrelor FTIR si discriminarea probelor

pe baza modelelor de regresie partiala.

Este necesară o analiză suplimentară FTIR pe un număr mare de esantioane pentru

validarea în continuare a modelului de predictie. Cu toate acestea, o astfel de abordare poate fi

utilă pentru evaluarea rapida a cantitatii acidului lactic.

Activitate 1.11. Masurara lactat dehidrogenazei si alcool dehidrogenazei in fermentatia

discontinua si semicontinua Grad de realizare 100%

În cadrul acestui raport este prezentată metoda de măsurare a activității enzimelor LDH

(lactat dehidrogenaza) și ADH (alcool dehidrogenaza). Lactat dehidrogenaza (LDH sau LD) este

o enzimă care se găsește aproape în toate celulele vii (animale, plante și procariote) fiind

răspunzătoare de formarea acidului lactic (lactat) și a piruvatului, iar alcool dehidrogenaza

36

deservește la descompunerea alcoolilor și la regenerarea grupărilor aldehidice, cetonice sau

alcoolice necesare în timpul biosintezei diferiților metaboliți.

Determinarea activității lactat dehidrogenazei (LDH). LDH este enzima responsabilă de

conversia reversibilă a lactatului în acid piruvic, deoarece aceasta transformă reversibil NAD+ în

NADH. Activitatea enzimei LDH în cadrul reacției bidirecționale este monitorizată

spectrofotometric prin măsurarea fie a creșterii NADH-ului la 340 nm produsă în urma reacției

lactat-piruvat (L-P), fie prin scăderea NADH-ului la aceeași lungime de undă produsă în urma

reacției inverse, piruvat-lactat (P-L).

Aceasta determinare s-a realizat urmând două etape principale:

- s-a măsurat spectrofotometric modificarea de ordinul întâi a absorbanței la 340 nm ca

urmare a oxidării NADH-ului, sau a reducerii de NAD+; activitatea reducătoare a LDH

(piruvat à lactat) a fost determinată prin monitorizarea scăderii absorbanței a 175 µM

NADH în amestec cu 0,1 M bis-Tris-propan (pH 6,8), după ce reacția a fost pornită prin

adăugarea de piruvat de sodiu, ajungându-se la o concentrație finală de 4 mM.

- activitatea oxidantă a LDH (lactat à piruvat) a fost determinată prin măsurarea creșterii

absorbanței în prezența a 200 mM lactat de litiu și 0,1 M Tris-Cl (pH 8,0), după ce reacția

a fost inițiată 750 µM NAD+ (concentrație finală). Valorile pH-ului pentru tampoanele de

reacție au fost determinate pe baza rezultatelor experimentelor preliminare în care s-au

stabilit condițiile optime pentru modificarea maximă a absorbanței.

Toate concentrațiile proteinelor au fost ajustate în așa fel încât modificarea absorbanței să

urmeze cinetica de ordinul întâi pentru un timp de cel puțin 3 până la 5 minute. Toate testele au

fost efectuate în triplicat și 1 U de activitate enzimatică a fost definită ca unitate de măsură pentru

convertirea unui µmol de NADH la NAD+ per min, sau a unui µmol de NAD+ la NADH per

minut la o temperatură de 25o C (metoda Vallee and Hoch, 1955).

Determinarea activității alcool dehidrogenazei (ADH)

Alcool dehidrogenazele (ADH) sunt un grup de enzime care facilitează interconversia

între alcooli și aldehide sau cetone, prin reducerea nicotinamid-adenin-dinucleotidei (NAD + la

NADH). NADH-ul prezintă o absorbție UV puternică la 340 nm, în timp ce forma sa oxidată nu

prezintă practic nici o absorbție la această lungime de undă. Prin urmare, dacă se începe cu un

amestec de etanol, NAD+ și o enzimă în soluție tampon, reacția va continua până când se ajunge

37

la o stare de echilibru. Reacția poate fi urmată de măsurarea creșterii absorbției soluției la 340

nm, prin formarea NADH.

Activitatea alcool dehidrogenazei a fost determinată parcurgând următorii pași:

- spectrofotometrul a fost setat în prealabil la temperatura de 25o C, la absorbanța de 340

nm.

- în cuva specifică metodei, s-au pipetat 1,5 mL de tampon fosfat 0,1 M; 0,5 mL etanol 2 M

și 1 mL de NAD+ 0,025 M.

- s-a incubat cuva timp de 3-4 minute în spectrofotometru la 25o C, pentru a atinge

temperatura de echilibru și pentru a stabili proba martor.

- la timpul zero, s-au pipetat în cuvă 0,1 mL de enzimă diluată în prealabil în tampon fosfat,

după care se citește la 340 nm timp de 3-4 minute.

- s-a calculat ΔA340/minut începând cu porțiunea lineară a curbei de calibrare.

- interpretarea rezultatelor s-a realizat prin aplicarea formulei matematice:

𝑈𝑛𝑖𝑡ăț𝑖/𝑚𝐿 =𝛥𝐴-.//01𝑥𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑢𝑙𝑐𝑢𝑣𝑒𝑖𝑥𝑑𝑖𝑙𝑢ț𝑖𝑎𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑒𝑖

6,22𝑥𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑢𝑙𝑝𝑟𝑜𝑏𝑒𝑖

Activitate 1.12. Caracterizarea morfologica a lui R. oryzae pe perioada fermentatiei- Grad de

realizare 100%

Ȋn cazul caracterizării morfologice s-au realizat frotiuri atȃt cu spori de R.oryzae

neȋncapsulați cȃt şi cu spori ȋncapsulați ȋn CryoPVAG’s, care au fost analizate ulterior la

microscop. Ȋn timpul fermentației s-a observat morfologia sporangiilor cu sporangiospori şi a

sporangioforilor. Ȋn timpul germinării sporangiosporii se dezvoltă ȋn celule vegetative cu

structură şi morfologie diferită. Ȋn ceea ce priveşte dezvoltarea fungului pe mediul solid, aceasta

s-a realizat neuniform formȃnd astfel structuri greu de diferențiat datorită formării ȋn abundență a

sporangioforilor. Pentru o bună evidențiere a morfologiei sporilor, preparatele microscopice au

fost colorate utilizȃnd o soluție de albastru de metilen 1%. (figura 1.12.1)

38

Figura 1.12.1 Captură preparat microscopic R.oryzae

Morfologia sporilor de R.oryzae neȋncapsulați. Structura morfologică a hifelor ȋmpreună cu cea

a sporangiilor cu sporangiospori este prezentată ȋn figurile 1.12.1 şi 1.12.1. ȋn care se poate

observa forma sferică a sporangiosporilor dislocați din sporangii, aceştia fiind transparenți. Ȋn

figura 1.12.1 se disting sporangii ȋn care s-au format din abundență sporangiosporii.

Sporangioforii se prezintă sub formă tubulară, ramificată, formând la capăt, ȋn timpul creşterii, un

sporangiu cu sporangiospori. Ȋn cazul fermentației sporilor neimobilizați de R.oryzae ȋn miedul

cu glicerol, dezvoltarea biomasei a fost mai accentuată față de cea ȋn mediul cu glucoză, Acest

lucru poate fi explicat prin faptul că microorganismului îi este mai ușor să sintetizeze piruvat din

glicerol, unitate de bază în metabolismul microbian.

Figura 1.12.1.1 Captură preparat microscopic R.oryzae

Morfologia sporilor de R. oryzae ȋncapsulați ȋn CryoPVAG

Ȋn cazul sporilor ȋncapsulați ȋn CryoPVAG s-a observat o dezvoltare mai întârziată a

acestora decât în cazul sporilor liberi. Morfologia lor este prezentată ȋn figura 1.12.2.1 atȃt ȋn

interiorul sferelor de CryoPVAG’s (imaginea din dreapta) cȃt şi la exteriorul acestora(imaginea

din stânga). Devoltarea sporilor ȋnafara sferelor de CryoPVAG s-a realizat in timpul etapei de

39

germinare, formȃndu-se sporangiofori care s-au ramificat abundent. Creşterea sporilor ȋn

interiorul sferelor a fost neuniformă, iar dezvoltarea acestora a fost mai accentuată ȋnafara

sferelor, ȋn timpul germinării. De asemenea s-a observat o dezvoltare mai accentuată a sporilor ȋn

fermentația ȋn mediul cu glicerol față de cel cu glucoză.

Figura 1.12.2.1 Captură preparat microscopic R.oryzae

Activitate 1.13. Cinetica de dezvoltare a lui R. oryzae in sistem discontinuu si semicontinuu-

Grad de realizare 100%

După realizarea determinărilor în vederea trasării curbelor de epuizare a substratului,

următorul pas a fost realizarea fermentațiilor în sistem semi-continuu. Avantajul fermentațiilor

semi-continue constă în faptul că microorganismul are un ciclu mai mare de viață și de utilizare,

astfel se poate produce mai mult acid lactic. În cazul acestor fermentații, după primele 72 de ore,

s-a eliminat mediul epuizat în care se găsea acidul lactic și a fost adăugată o cantitate de mediu

proaspăt. Acest proces s-a repetat de câteva ori, până capacitatea de producție a lui R. oryzae a

început să scadă

În figura 1.13.1 este prezentată cinetica de dezvoltare a lui R. oryzae în cazul uneia dintre

fermentații. Se poate observa că pe parcursul fermentației apar o serie de schimbări: într-o primă

fază mediul trece din stare de transparență în stare de turbiditate, apoi din ziua 4 biomasa începe

să se grupeze , iar mediul trece încet spre starea de transparență.

40

Ziua 0 Ziua 2 Ziua 4

Ziua 6 Ziua 7

Figura 1.13.1 Cinetica de dezvoltare a lui R.oryzae

Activitățile 1.5, 1.15, 1.16, 1.17, 1.18. Analiza statistica a datelor si generarea unui model

matematic experimental

Notând cu x1 şi x2 cele două variabile amintite, iar Y fiind productivitatea, modelul

matematic liniar, obţinut prin regresie multiplă liniară s-a obţinut ca fiind:

Y = 7.0727 - 0.0780·x1 - 0.0739·x2 + 0.0005·x1·x2

41

Reprezentarea grafică corespunzătoare, pentru valori de x1 în gama 10-80 g/L,

respectiv x2 în gama 20 – 90g/L este cea reprezentată în figura 1, cu o eroare medie pătratică de 4.8919·10-16.

Figura 1. Evoluţia liniară în funcţie de x1, x2

Pentru o mai bună descriere a procesului s-a dezvoltat şi un model neliniar,

conţinând şi termenii pătratici ale celor două variabile alese: Y = 6.6055 - 0.1723·x1 + 0.0778·x2 + 0.0010·x1

2 - 0.0015·x22

Reprezentarea grafică corespunzătoare, pentru aceeaşi gamă de valori x1 şi x2 este

reprezentată în figura 2, evidenţiind o suprapunere mai bună, eroarea medie pătratică fiind de 2.1855·10-16, practic jumătate din eroarea modelului liniar.

0

20

40

60

80 2040

6080

100

-4

-2

0

2

4

6

CG+LGJCG+IN

Biom

ass

yiel

d

42

Figura 2. Evoluţia pătratică în funcţie de x1, x2

Puterile fracţionare fiind folosite cu succes în descrierea mai multor fenomene

biologice, biochimice, s-au determinat o serie de astfel de modele pentru evoluţia biomasei în

funcţie de cele două variabile x1 şi x2. Puterea de 1.8 s-a dovedit a fi cu cea mai mică eroare medie pătratică: 1.0061·10-16. Modelul are forma:

Y = 6. 4565 - 0.1776·x1 + 0.0928·x2 + 0.0017·x11.8 - 0.0025·x2

1.8

iar reprezentarea grafică este în figura 3.

Figura 3. Evoluţia cu putere fracţionară în funcţie de x1, x2

0

50

100 2040

6080

100

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

CG+LGJCG+IN

Biom

ass

yiel

d

0 2040 60 80 20 40 60 80 100

-6

-4

-2

0

2

4

6

CG+LGJCG+IN

Biom

ass

yiel

d

43

Aceleaşi modele s-au determinat pentru evoluţia biomasei în funcţie de cantităţi

diferite de glicerol crud (CG) suplimentat cu nutrienţi inorganici (IN) - notată cu variabila

x1 şi timp – variabila x3. Modelele obţinute sunt: Y = -0.1460 + 0.0218·x1 + 0.1611·x3 - 0.0045·x1·x3

Y = -0.3483 + 0.0537·x1 - 0.1164·x3 - 0.0005·x12 + 0.0057·x3

2

Y = -0.3850 + 0.0602·x1 – 0.0998·x3 - 0.0014·x11.8 + 0.0055·x3

1.8

iar graficele aferente sunt reprezentate în figurile 4, 5, respectiv 6. Erorile medii pătratice corespunzătoare sunt: 1.8735·10-16, 4.1980·10-16, 6.9389·10-17, adică din nou

puterea fracţionară prezintă cele mai bune rezultate.

Figura 4. Evoluţia liniară în funcţie de x1, x3

020

4060

80 02

46

80

0.5

1

1.5

TimeCG+IN

Biom

ass

yiel

d

44

Figura 5. Evoluţia pătratică în funcţie de x1, x3

Figura 6. Evoluţia cu putere fracţionară în funcţie de x1, x3

Având dependenţele în funcţie de x1,x2 respectiv x1, x3, s-a determinat un model

matematic pătratic conţinând variabilele independente x1, x2 şi x3 de forma:

Y = -116.3715·x 2 + 1.3855·x1·x2 + 0.8672·x1·x3 + 0.7246·x2·x3 – 0.1050 x1·x2·x3 +

0.0113·x12 + 1.1389·x2

2 + 6.7875·x32

cu o eroare medie pătratică de 3.6274·10-13.

0 2040 60 80 0 2 4 6 8

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

TimeCG+IN

Biom

ass

yiel

d

0 2040 60 80 0 2 4 6 8

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

TimeCG+IN

Biom

ass

yiel

d

45

Cea mai mică eroare, 6.8359·10-14, adică o suprapunere maximă s-a obţinut pentru

modelul de ordin fracţionar: Y = -4.5443·x 2 + 0.0306·x1·x2 - 0.0153·x1·x3 + 0.0115·x2·x3 – 0.0032 x1·x2·x3 +

0.0258·x12 + 0.4457·x2

2 + 1.7604·x32

Modelul obţinut a fost transpus în platforma Matlab, în vederea folosirii lui în mod

predictiv. Introducând în căsuţele din partea de jos a ecranului valoarea dorită pentru

variabila x1 (cg), x2 (lgj) sau x3 (time), se poate determina valoarea estimată a variabilei Y.

Figura 7. Modelul predictiv determinat

Următorul pas reprezintă rafinarea şi re-iterarea modelului după obţinerea unui alt

set de date experimentale, respectiv determinarea condiţiilor optime prin algoritmi de

optimizare specifici.

46

Activitățile 1.14. 1.18. Paticiparea la conferinta si publicare de articole Grad de realizare 100%

1. DULF, F.V.,VODNAR, D.C*.,DULF, E.H., DIACONEAZA, Z., SOCACIU, C. Liberation andrecoveryofphenolicantioxidantsandlipidsinchokeberry(Aroniamelanocarpa)pomaceby solid-state bioprocessing usingAspergillus nigerandRhizopusoligosporusstrains.LWT-Food Science and Technology.2018. 87:241-249(*correspondingauthor).

2. DULF, F.V.,VODNAR, D.C*.,DULF, E.H., PINTEA, A. Phenolic compounds, flavonoids,lipidsandantioxidantpotentialofapricot (PrunusarmeniacaL.)pomace fermentedbytwo filamentous fungal strains in solid state system.Chemistry Central Journal.2017.11:92(*correspondingauthor).

3. COLNITĂ,A.,DINA,N,E.,LEOPOLD,N.,VODNAR,D.C.,BOGDAN,D.,PORAV,S.A.,DAVID,L. Characterization and discrimination of gram-positive bacteria using RamanSpectroscopywiththeaidofPrincipalComponentAnalysis.Nanomaterials2017.7:248.

4. ParticiparealaConferintaInternationalaPerspectivesoftheThirdMillenumAgriculture,USAMVClujNapoca28-30septembrie2017.

5. Membrii echipei de cercetare UTCN au depus actele necesare organizării sesiunii speciale “Fractional calculus in biotechnologies” la Conferinţa Internaţională IEEE Automation, Quality, Testing and Robotics-2018, Cluj-Napoca, Romania (conferinţă indexată ISI PRO).

Documents

Raport ştiinţific şi tehnic în extensor Rezumatul etapei