Rau má lá sen

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

BỘ MÔN HÓA ----��----

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHÓA HỌC 2003-2007 Tên ñề tài:

ÁP DỤNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC ðỐI VỚI CÂY RAU MÁ LÁ SEN CHỦ YẾU LÀ LOÀI

“Hydrocotyle vulgaris”

Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện: Ths Tôn Nữ Liên Hương Ng. T. Kim Phụng 2033065 Lớp công nghệ Hóa Khoá29

Cần Thơ 12/2007


Lời cảm ơn

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng i

LỜI CẢM ƠN!

Qua hơn ba tháng thực hiện ñề tài tốt nghiệp ” Áp dụng một số phương pháp phân tích hóa học ñối với cây rau má lá sen chủ yếu là loài “Hydrocotyte vulgaris”.Kết quả ñạt ñược như ngày hôm nay. Em xin gửi lời chân thành cảm ơn ñến:

Quý thầy cô khoa công nghệ trường ðại Học Cần Thơ ñã tạo cho em những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích.

Quý thầy cô bộ môn hóa Khoa Khoa Học ñã giúp ñỡ những ñiều kiện cần thiết cho em làm luận văn.

ðặc biệt là cô Tôn Nữ Liên Hương ñã nhiệt tình hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian thực hiện ñề tài.

Xin cảm ơn ñến các bạn ñồng lứa ñã giúp ñỡ ủng hộ nhiệt tình ñể tôi hoàn thành tốt luận văn này.

Có ñược ngày hôm nay là sự dạy dỗ của gia ñình, thầy cô và giúp ñỡ của các bạn . Xin bày tỏ lòng cảm ơn ñến tất cả.


Danh mục các bảng

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết pha rắn ..........................................25

Bảng 2: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng ......................................25

Bảng 3: Kết quả sắc ký cột phân ñoạn I của cao etyl acetat .........................................29

Bảng 4: Tóm tắt kết quả ñịnh tính các hợp chất trong cây ...........................................34


Danh Mục Các Sơ ðồ Và Hình Ảnh Minh Họa

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng iii

DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ VÀ HÌNH ẢNH MINH HỌA

Sơ ñồ 1: Qui trình ñiều chế các loại mẫu cao ............................................................... 20

Hình 1: Cây rau má lá sen Hydrocotyle vulgaris L. ...................................................... 2

Hình 2: Cây “Hydrocotyle vulgaris” ............................................................................ 3

Hình 3: Cây “Hydrocotyle bonariensis” ....................................................................... 4

Hình 4: Cây “Centella asiatica” .................................................................................. 5

Hình 5: Rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” ñã phơi gió và xay nhuyễn .................. 18

Hình 6: Ngâm dầm bột cây với metanol ....................................................................... 18

Hình 7: Cao MeOH tổng .............................................................................................. 18

Hình 8: Máy soxhlet dùng chiết pha rắn ....................................................................... 19

Hình 9: Bình lóng dùng trích lỏng-lỏng ....................................................................... 21

Hình 10: Cột sắc ký cao Ea phân ñoạn I ....................................................................... 23

Hình 11: Cao PE .......................................................................................................... 26

Hình 12: Cao cloroform .............................................................................................. 26

Hình 13: Cao Ea phân ñoạn I ....................................................................................... 27

Hình 14: Cao Ea phân ñoạn II ...................................................................................... 27

Hình 15: Cao Ea ................................................................................................................... 28

Hình 16: Các cao alcol giai ñoạn sau ........................................................................... 28

Hình 17: Phân ñoạn 1-4 ............................................................................................... 30

Hình 18: Lọ 41 ............................................................................................................ 30

Hình 19: Phân ñoạn 43-53 ........................................................................................... 30

Hình 20: Thuốc thử Bouchardat, Cao PE sau và trước khi thêm thuốc thử ................... 31

Hình 21: Cao Ea trước và sau khi thêm thuốc thử, thuốc thử Shibata ........................... 31

Hình 22: Cao PE trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử ............................................... 32

Hình 23: Cao metanol .................................................................................................. 32

Hình 24: Cao metanol trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử gelatin mặn .................... 32

Hình 25: Cao cloroform trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử Molish ........................ 33


Chương 1: Mở ðầu

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng 1

CHƯƠNG 1

MỞ ðẦU

Chúng ta cũng như bạn bè trên thế giới ñều ñánh giá cao sự phong phú, ý nghĩa thực tiễn, giá trị khoa học cũng như kinh tế của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam. Cây thuốc dân tộc và ñặc biệt tri thức y học dân tộc cổ truyền Việt Nam ñã góp phần không nhỏ trong việc duy trì sự tồn tại và phát triển của dân tộc chúng ta từ xa xưa ñến nay. Nó ñang và chắc chắn sẽ còn ñóng vai trò quan trọng trong việc chǎm sóc sức khỏe cho con người và sự tồn tại một cách bền vững của y học cổ truyền Việt Nam.

Từ những năm 1940, y học hiện ñại bắt ñầu nghiên cứu tác dụng của rau má.

Hiện nay rau má ñã ñược sử dụng rất ña dạng dưới hình thức thuốc tiêm, thuốc mở ñể ñiều trị tất cả các chứng bệnh về da như vết bỏng, vết thương do chấn thương, do giải phẩu, cấy ghép da, những vết lở lâu lành, vết lở do ung thư, bệnh phong, vẩy nến.

Rau má ñược dùng trong thực phẩm như một loại rau gia vị (ăn sống), rau ăn (luộc, nấu canh) hoặc nước giải khát (cả cây giã nhuyễn với nước và ñường). ðặc biệt ở miền nam, nhân dân rất ưu chuộng rau má.

Có nhiều loại rau má có ñặc ñiểm lá tròn, cuống lá ở giữa cùng ñược gọi là rau má lá sen. Nhưng thực chất chúng là những loài khác nhau và có tên khoa học riêng biệt, như Hydrocotyle bonariensis, Hydrocotyle vulgaris,…ñặc biệt có vị ñắng hơn loài rau má thường.

Gần ñây, loài “Hydrocotyle bonariensis” ñã ñược nghiên cứu cùng những ứng dụng trong y học, sinh học… Tuy nhiên “Hydrocotyle vulgaris “chưa từng qua khảo sát và nghiên cứu ñể xác ñịnh thành phần hóa học, tìm hiểu công dụng của nó. Nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Áp dụng một số phương pháp phân tích hóa học ñối với cây rau má lá sen chủ yếu là loài “Hydrocotyle vulgaris”.


Chương 1: Mở ðầu


Hình 1: Cây rau má lá sen Hydrocotyle vulgaris L.


Chương 2: Tổng Quan


CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN

2.1. GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ LOÀI RAU MÁ THƯỜNG GẶP

2.1.1. Rau má lá sen (Hydrocotyle vulgaris) [6,7,8,12,13,14,15,16,17,18,19,20,20,21,22]

Hình 2: Cây “Hydrocotyle vulgaris”

2.1.1.1. Danh pháp và phân loại

Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris (L)

Tên nước ngoài: Marsh pennywort,pennywort.water pennywort , Fairy tables, water! white rot, (Ches). Penny rot, (Shrop). Farthing rot, flowkwort, (Norf). Rotgrass, (N'thum). Shilling rot, (Ayr). Sheep rot, War, Cumb, N'thum,…

Tên thường gọi: Rau má lá sen

Phân loại: Giới: Plantae

Phân giới: Viridaeplantae

Ngành: Tracheophyta

Phân ngành: Spermatophytina

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Araliales

Họ: Apiaceae (Hoa tán)

Phân họ: Hydrangeoideae

Tông: Hydrangeae

Chi: Hydrocotyle

Loài: vulgaris L.

2.1.1.2. ðặc ñiểm thực vật

Cỏ lưu niên, nhẵn nhụi, cây mảnh khảnh, khai căn tại các ñốt, cây cao từ 0,1 m ñến 0,5 m, cành non ngăn nhất 4-5 in (1 in=2,54 cm), lá tròn ngang 8-35 mm,




hình khiên, khía tay bèo, không bị rạch ở giữa lá, 6-9 gân lá ñường trục nổi rõ mặt dưới lá, gân lá tỏa ra từ cuống lá, lá kèm có khía khô xác, lá mầm co lại vào cuốn lá, cuốn lá thẳng dài 25 cm ở chính giữa lá, có lông lơ thơ, ra hoa từ tháng 6-8, nhỏ màu trắng nhẹ ñược nhuốm màu với màu hồng và màu xanh lục, 2-5 cánh hoa, thể lưỡng tính, 1mm, ñài hoa tồn tại một thời gian ngắn hoặc không có, bao phấn màu vàng, tự thụ phấn, ra quả từ tháng 7-10 dài 2 mm, rộng 2,5 mm, dày 0,8 mm, không có cuốn lá bào tử.

2.1.1.3. Sinh thái

Lớn lên tùy thích trong những chỗ vũng ñầm lầy, trên những mép của những hồ và những sông…Cây thích ánh sáng, cát, ñất sét phì nhiêu và nặng môi trường dễ bẩn. Cây thích axít, trung tính, kiềm. Nó yêu cầu ñất ẩm ướt.

2.1.1.4. Phân bố

Châu á, bắc mỹ, phía tây vùng Caspian, châu âu, gần ñây phát hiện có mọc ở Việt Nam.

2.1.1.5. Công dụng

Thường dùng ñể trị ung thư, trị ho gà-phương thuốc y học cổ truyền ở ðan Mạch.

2.1.2. Rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis) [4,10]

2.1.2.1. Danh pháp và phân loại

Hình 3: Cây Hydrocotyle bonariensis L.

Tên khoa học: Hydrocotyte bonariensis L.

Tên khác: Hydrocotyte polystachya, Penywort, Large leaf penywort paraguita, rau má lá sen.

Phân loại:

Giới: Thực vật

Ngành: Magnoliophyta





Thứ: Apiales

Họ: Apiaceae

Chi: Hydrocotyle

Loài: Bonariensis

2.1.2.2. ðặc ñiểm thực vật

Là loại cỏ lưu niên, nhẵn, dạng thân rễ, mọc bò, tại mỗi ñốt có nhiều rễ và cho ra 1-2 lá vươn thẳng lên, cọng lá dài 15-20 cm. Lá hình lọng, phiến tròn, mỏng, rộng 3-12 cm, có thùy cạn, mép lá khía tai bèo, cuốn lá ñính ở giữa chứ không phải ở mép như các cây khác; lá kèm khô xác, dài 0,2-0,4 cm.Tán hoa ñường kính 1-6 cm gồm nhiều tua tụ tạo thành vòng tròn, cọng cuốn chính có thể dài tới 40 cm, cuống nhỏ dài 0,2-2 cm. Hoa nhỏ, 5 cánh màu trắng hoặc vàng kem, lá ñài nhọn màu lục. Quả hình bầu dục, dày 0,5-2 mm, rộng 2,5-3 mm, ñáy và ñỉnh có khía sống lưng và phần gân nổi rõ.

Sống dễ trong nước nhưng cũng chịu ñược môi trường khô, xuất xứ ở nam Mỹ, gần ñây phát hiện mọc ở Việt Nam.

2.1.2.3. Công dụng

ðang nghiên cứu tại Khoa Khoa học.

2.1.3. Rau má [9,11]

Hình 4: Cây “Centella asiatica”

2.1.3.1. Phân loại khoa học

Danh pháp khoa học: Centella asiatica

Tên khoa học ñồng nghĩa: Hydrocotyle asiatica L.

Tên khác: Rau má, tích tuyết thảo, lôi công thảo.

Phân loại:

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta


Bộ: Apiales




Họ: Apiaceae (Umbelliferae)

Chi: Centella

Loài: C.asiatica

2.1.3.2. Mô tả

Rau má là một loài cây một năm thân thảo trong họ Hoa tán (Umbelliferae). Thân cây rau má gầy và nhẵn, là loại thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh ñỏ, có rễ ở các mấu. Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài và phần ñỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt. Các lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5-20 cm. Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng ñứng. Chúng có màu trắng kem và ñược che phủ bằng các lông tơ ở rễ.

Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới ñỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gần mặt ñất. Mỗi hoa ñược bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh. Các hoa lưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3 mm), với 5-6 thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị và 2 vòi nhụy. Quả có hình mắt lưới dày dặc, ñây là ñiểm phân biệt nó với các loài trong chi.

Hydrocotyle có quả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn cơm. Quả của nó chín sau 3 tháng và toàn bộ cây, bao gồm cả rễ, ñược thu hái thủ công.

2.1.3.3. Phân bố, thu hái và chế biến

Có nguồn gốc Australia, các ñảo Thái Bình Dương, New Guinea, Melanesia, Malesia và châu Á.

Mọc hoang tại khắp nơi ở Việt Nam và các nước vùng nhiệt ñới như Lào, Campuchia, Indonesia, Ấn ðộ...

Toàn cây khi tươi có vị ñắng, hơi hăng khó chịu; khi khô chỉ còn mùi cỏ khô. Thu hái quanh năm. Dùng tươi hay sao vàng.

2.1.3.4. Thành phần

Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các các hoạt chất có thể sai biệt.

Thành phần của rau má bao gồm những chất sau: beta caroten, sterol, saponin, alkaloid, flavonol, saccharid, Ca, Fe, Mg, Mn, P, K, Zn, các loại vitamins B1, B2, B3, C và K.

2.1.3.5. Sử dụng

Nó ñược sử dụng như một loại rau cũng như trong y học Ayurveda và y học cổ truyền Trung Hoa.

Rau má hiện nay còn là một vị thuốc dùng trong phạm vi nhân dân, ñồng thời còn là loại rau ăn.

Nhân dân ta coi vị rau má là một loại thuốc mát, vị ngọt, hơi ñắng, tính bình, không ñộc, có tính chất giải nhiệt, giải ñộc, thông tiểu, dùng chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch ñới, lợi sữa.

Theo Trung y, rau má có tính hàn (lạnh), tân (cay), khổ (ñắng). Khi ăn ở dạng tươi như một loại rau, người ta cho rằng nó giúp cho việc duy trì sự trẻ trung.




Nước sắc từ lá rau má ñược coi là có tác dụng hạ huyết áp. Loại nước sắc này cũng ñược coi là một loại thuốc bổ dưỡng ñể có sức khỏe tốt (tăng trí nhớ, thị lực). Loại thuốc ñắp từ lá cũng ñược dùng ñể ñiều trị những chỗ ñau, hạ sốt. Nó còn ñược dùng trong ñiều trị các chứng phù; viêm thanh quản, tĩnh mạch, phế quản; các bệnh trĩ, phong, eczema hay vẩy nến; giải ngộ ñộc sắn và lợi tiểu .

Một vài báo cáo khoa học cho thấy khả năng của rau má trong việc hỗ trợ làm lành vết thương. Khi ñiều trị bằng rau má, sự liền sẹo ñược kích thích bằng việc sản xuất ra các chất keo loại I. Việc ñiều trị này cũng cho thấy sự giảm sút ñáng kể của các tác ñộng viêm nhiễm và việc tạo ra các nguyên bào sợi.

Các nhà thảo mộc học còn cho rằng nó có chứa nhân tố trường thọ gọi là Vitamin X trẻ trung có tác dụng bổ dưỡng cho não và các tuyến nội tiết và xác nhận rằng nước chiết từ rau má giúp cải thiện các vấn ñề về hệ tuần hoàn và da.

Tại một số nước, người ta còn nghiên cứu rau má ñể tìm tác dụng chữa bệnh hủi và bệnh lao.

2.2. MỘT SỐ KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY ]5[

Có nhiều cách ñể chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật ñều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng (ngâm dầm, chiết ngấm kiệt, chiết pha rắn....). Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng ñược áp dụng nhiều hơn.

2.2.1. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình có ñậy nắp. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất ñó có chứa trong cây.

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho ñến xấp xấp bề mặt lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt ñộ phòng trong một ñêm hoặc một ngày, ñể cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau ñó, dung dịch chiết ñược lọc qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ ñược cao chiết. Tiếp theo rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết một số lần nữa cho ñến khi chiết kiệt mẫu cây.

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, ñể bốc hơi và xem có còn ñể lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là ñã chiết kiệt.

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng ñảo trộn, xốc ñều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc ñể lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài).

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là ñủ, vì với một lượng dung môi cố ñịnh trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi ñến ñạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm ñược nhiều hơn; có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi.

ðây là quá trình chiết gián ñoạn, không ñòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu.




2.2.2. Kỹ thụật chiết ngấm kiệt

Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh hình trụ ñứng dưới ñáy bình là một van khóa ñể ñiều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa ñặt bên dưới ñể hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng ñể chứa dung môi chiết.

Thực hành: Bột cây ñược xay thô, lọt ñược qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu ñược xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa…sẽ cản trở dòng chảy. ðáy của bình ngấm kiệt ñược lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây ñược ñặt vào bình bên trên lớp bông thủy tinh, lên gần ñầy bình. ðậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh ñể cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần thiết vào bình cho ñến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.

ðể yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và ñồng thời mở khóa bình lóng ñể dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt. ðiều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình ngấm kiệt.

Phương pháp ñược sử dụng phổ biến. So với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này ñòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn, vì ñây là quá trình chiết liên tục dung môi trong bình ngấm kiệt ñã bão hòa mẫu chất sẽ ñược liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết nhưng thao tác với một lượng nhỏ mẫu.

2.2.3. Kỹ thuật chiết pha rắn

Nguyên tắc chiết pha rắn là tương tác giữa các chất tan trong một dung dịch lên trên chất hấp thu (như trong sắc ký cột).

Dụng cụ:

Gồm một cột là phễu lọc xốp bằng thủy tinh, bình tam giác, hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước. Hệ thống chỉ hoạt ñộng với một áp suất vừa phải, khoảng 20-70 mmHg, sử dụng áp suất mạnh sẽ làm gãy cột hấp thu.

Thực hành:

Nạp chất hấp thu vào cột: gắn phễu lọc xốp vào bình tam giác và cho hệ thống tạo áp suất kém hoạt ñộng. Múc từng lượng nhỏ chất hấp thu khô cho vào phễu, dùng nút thủy tinh có ñáy bằng ñể nén nhẹ và ñều. Vừa nạp chất hấp thu vào phễu, vừa gõ nhẹ vào thành phễu ñể chất hấp thu tạo thành một khối ñồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nạp cột chỉ ñược cao khoảng 5cm. Nếu cần chiết tách một lượng nguyên liệu ñầu nhiều hơn thì sử dụng phễu có ñường kính lớn hơn.

Sau khi nạp cột xong, ñặt một lớp bông gòn dầy lên trên bề mặt chất hấp thu ñể tránh cho dung môi sau này làm hư hại bề mặt chất hấp thu.




Rửa và cân bằng cột: sau khi nạp cột, cột này cần ñược rửa với dung môi. Thao tác bằng cách rót dung môi lên trên ñầu cột rồi hút hoặc nén cho dung môi chảy ngang qua cột.

Nạp mẫu lên cột: ñặt mẫu lên trên bề mặt cột sao cho tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt cột. Lượng mẫu nạp lên ñầu cột phải ít hơn khả năng của chất hấp thu.

Giải ly mẫu ra khỏi cột:

Lựa chọn ñộ phân cực của dung môi giải ly hợp chất ra khỏi cột tùy vào mục ñích cần cô lập hợp chất như thế nào.

Nếu muốn thu ñược tất cả sản phẩm có trong nguyên liệu thành một dung dịch ñậm ñặc với lượng thể tích nhỏ sử dụng ngay lập tức một loại dung môi mạnh.

Muốn chia nguyên liệu ban ñầu thành nhiều phân ñoạn có tính phân cực khác nhau giải ly với dung môi có ñộ phân cực tăng theo kiểu bậc thang

Công dụng:

ðể xác ñịnh mức ñộ phân cực của một hợp chất chưa biết

Làm ñậm ñặc một hợp chất

ðể phân chia cao thô ban ñầu thành các phân ñoạn có tính phân cực khác nhau

ðể phân lập một mẫu hợp chất thiên nhiên cần khảo sát

2.2.4. Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Việc chiết lỏng –lỏng ñược thực hiện bằng bình lóng, trong ñó cao alcol thô ban ñầu ñược hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp ñược với nước, ñể chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào ñộ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước.

Việc chiết ñược thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực ñến dung môi phân cực. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết ñược thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết ñến khi không còn chất hòa tan vào dung môi (chiết kiệt) thì ñổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch các lần chiết ñược gom chung lại, làm khan nước, ñuổi dung môi thu ñược cao chiết.

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược ñiểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, dễ tạo nhũ tương gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp.

2.2.5. Lựa chọn dung môi ñể chiết tách:

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không quá dễ cháy, hòa tan ñược hợp chất cần khảo sát; sau khi chiết tách xong, dung môi ñó có thể ñược loại bỏ dễ




dàng. Cẩn tránh các dung môi ñộc như benzen hoặc dễ cháy do có nhiệt ñộ sôi thấp như dietyl eter,…

Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như các hydrocarbon (hexan, toluene), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetate (etyl, butyl), cloroform, clorur metylen. Các loại dung môi này tương ñối rẻ tiền, có bán sẵn, ñộ nhớt thấp, tỷ trọng tương ñối khác so với nước.

2.2.6. Làm khô mẫu chất:

Sau khi làm chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi có ñược cao. Cao chiết này cần ñược sấy khô vì các lý do sau:

Các hợp chất trong cao sẽ ổn ñịnh bền nếu chúng hiện diện ở trạng thái khô hơn là trạng thái lỏng.

ðể tính ñúng thu suất của cao chiết so với lượng cây khô ban ñầu (ghi trong báo cáo, ñể khi cần có thể lặp lại thí nghiệm).

ðể tiếp tục tinh chế cao bằng sắc ký cột

Nếu mẫu là hợp chất tinh khiết muốn ño các số liệu phổ thì mẫu cần ñược sấy khô, nếu còn lẫn vết nước, trên phổ ñồ xuất hiện tín hiệu của nước, gây khó khăn cho việc giải ñoán cấu trúc.

Các phương pháp làm khô mẫu chất: sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không, sấy khô bằng bình hút ẩm,…

2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC ]5,2,1[

2.3.1. Phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp phân tích, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha ñộng và pha tĩnh.

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha ñộng và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính tự hấp phụ v.v…). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha ñộng mới chuyển ñộng dọc theo hệ sắc kí. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha ñộng và pha tĩnh. Trong quá trình pha ñộng chuyển ñộng dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này ñến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp ñi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển ñộng chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ ñặc ñiểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.

2.3.1.1. Sắc ký cột

Cột dùng ñể sắc ký là ống buret ñường kính khoảng 8-12cm, dài khoảng 25-30cm. ðể rửa sạch và sấy khô, kẹp buret ở vị trí thẳng ñứng trên giá sắt. Lót một lớp bông thủy tinh ở ñáy buret. Chất hấp phụ ñể nhồi vào cột ñược chọn theo nguyên tắc sau: chọn silicagel hay nhôm oxit hay than hoạt tính… Tỷ lệ khối lượng giữa hỗn hợp các chất cần sắc ký và khối lượng chất hấp phụ thường 1/100.




Sắc ký cột hở ñược tiến hành ở ñiều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước 50-150 µ m ñược nạp trong một cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách ñược ñặt ở phần trên cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở ñể lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly ñược ñặt phía trên cao cột. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần dưới cột, ñược hứng vào những lọ nhỏ ñặt ngay ống dẫn ra của cột.

Hệ thống này thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Sắc ký cột hở cũng có ưu ñiểm như pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.

Có hai phương pháp nhồi chất hấp phụ vào cột:

Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột: gồm chất hấp thu và dung môi vào cột cùng lúc.

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dung môi ñược cho vào cột trước, sau ñó cho chất hấp thu vào.

2.3.1.2. Sắc ký bản mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong ñó pha ñộng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ ví dụ như silicagel hoặc oxit alumin... Pha tĩnh này tráng thành một lớp mỏng, ñều phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, tấm plastic. Do chất hấp thu ñược tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này ñược gọi là sắc ký lớp mỏng.

Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng

Chuẩn bị vi quản: vi quản là một ống thủy tinh có ñường kính trong của ống phải nhỏ, 1-2mm, một ñầu ñược vót nhọt. Một ống vi quản có thể sử dụng ñể chấm nhiều loại mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung môi hữu cơ, thí dụ như aceton.

Chuẩn bị tấm bản mỏng: với các bản ñể theo dõi sắc ký cột có chiều dài 5cm. Với bản dùng ñể ño Rf, ñể sau này công bố kết quả, nên có chiều dài 10cm.

Từ tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kích thước cần thiết.

Chuẩn bị dung dịch: hòa tan hỗn hợp các chất trong dung môi thích hợp ñể ñược dung dịch có nồng ñộ khoảng 2-5%

ðưa mẫu chất lên bản sắc ký: Dùng ống mao quản nhỏ ñể lấy dung dịch các chất nhỏ lên tuyến xuất phát (cách mép dưới 1 cm) sao cho các vệt cách nhau khoảng 1cm và cách mép bên khoảng 1,5cm. Trên mức tiền tuyến dung môi (cách bờ cạnh trên 0,5-1 cm) dùng một ñầu viết chì vót nhọn vạch một ñường hằn xuống lớp hấp thu. Làm như thế khi dung môi giải ly ñi lên ñến ñầu trên sẽ buộc ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống nhau. ðiều chỉnh lượng dung dịch nhỏ xuống sao cho vệt xuất phát có kích thước nhỏ (ñường kính vệt khoảng 2-5mm). ðể ngoài không khí cho dung môi bay hết.




Chạy sắc ký: quá trình chạy sắc ký ñược tiến hành trong bình ñậy kín chứa dung môi làm pha ñộng. Bình ñược bão hòa bởi dung môi bằng cách dựng mấy băng giấy lọc (tẩm dung môi) xung quanh thành bình rồi ñể yên khoảng 30 phút. Sau ñó, ñặt bản sắc ký vào bình ở ñộ nghiêng khoảng 20-30

0 sao cho dung môi

tiếp xúc với bản mỏng ở dưới tuyến xuất phát rồi ñậy bình.

Hiện hình vết: khi dung môi dâng lên cách mép trên thì nhẹ nhàng nhấc bản sắc ký ra khỏi bình. Cho bay hơi hết dung môi trong không khí.

Khi sắc ký những chất không có màu, ta cần chọn những phương pháp thích hợp ñể nhận ra vệt chất. Trong nhiều trường hợp có thể hiện hình nhờ iot bằng cách ñặt bản sắc ký trong bình kín chứa hơi iot. Lớp chất hấp phụ trên bản sắc ký sẽ nhuốm màu Iot, vùng vệt chất khảo sát không có màu. Có thể xử lý bằng hơi Brom hoặc phun những tác nhân thích hợp (axit Sunfuric ñậm ñặc, dung dịch KMnO 4 ,…) hoặc quan sát bản sắc ký trong ánh sáng tử ngoại.

Tiến hành sắc ký nhanh, sử dụng ít chất, có khả năng làm hiện màu cho các chất khảo sát.

2.4. ðỊNH TÍNH CÁC CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY ]3[

2.4.1. Alcaloid

ðại cương

Alcaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất ña dạng.

Các ñặc tính hóa lý của alcaloid

ða số alcaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với ñiểm nóng chảy xác ñịnh hoặc có khoảng nhiệt ñộ phân hủy. Một vài alcaloid ở dạng nhựa vô ñịnh hình, một vài alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, conilin) và một vài alcaloid có màu (berberin màu vàng, betanidin màu ñỏ).

Alcaloid là những hợp chất base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Các alcaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như cloroform, dietyl eter, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dietyl eter, benzen.

Các thuốc thử ñể ñịnh tính alcaloid

Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Bertrand…

a)Thuốc thử Mayer

HgCl 2 6.8g

Nước cất 500ml

KI 2.5g




b)Thuốc thử Dragendorff

Dung dịch A:

Bi(NO 3 ) 3 850mg

CHCOOH 10ml

Nước cất 40ml

Dung dịch B:

KI 8g

Nước cất 20ml

Khi sử dụng lấy 20 ml dung dịch hỗn hợp 2 dung dịch (A+B), thêm vào CHCOOH (20ml) và nước cất (100 ml).

d)Thuốc thử Bertrand

Axit Silicotungstic 5g

Nước cất 100 ml

2.4.2. Flavonoid

ðại cương

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa,… Phần lớn các flavonoid có màu vàng. Tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, ñỏ, không màu cũng ñược xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học. Các flavonoid thường dễ kết tinh.

Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxy -OCH 3 và ít nhóm hydroxyl –OH, có tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít phân cực như: bezen, cloroform, etyl acetat ñôi khi tan một phần trong hexan. Flavonoid mang nhiều nhóm hydroxyl, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt trong dung môi có tính phân cực như aceton, etanol, metanol, butanol, nước,…

Các thuốc thử ñể ñịnh tính sự hiện diện của flavonoid

Thuốc thử Shibata: HCl ñậm ñặc, bột Mg kim loại, alcol isoamil

2.4.3. Steroid

Hầu hết các steroid là hydrocarbon có mang một số nhóm chức như hydroxyl (-OH), acetyl (-OAc), eter (-O-), carbonyl (C=O ester hoặc acid carboxylic), nối ñôi (-C=C-)… nên nói chung là những hơp chất có tính ít phân cực, có tính thân dầu nên tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter dietyl, cloroform,… ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với các phân tử ñường ñể tạo thành glycosid.

Thuốc thử ñịnh tính steroid

Phản ứng Liebermann – Burchard




Anhidrid acetic 20ml

H 2 SO 4 ñậm ñặc(1 ml)

Phản ứng Salkowski: H 2 SO 4 ñậm ñặc

2.4.4. Saponin

ðại cương về saponin:

Là một glicosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất ñặc trưng: khi hòa vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; saponin thường ở dạng vô ñịnh hình có vị ñắng.

ðể phát hiện sự hiện diện của saponin trong cao chiết cần phải thử tính tạo bọt.

Thử ñịnh tính saponin: Cân bột mẫu (1g) cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ khoảng 30 phút. Lọc ñể nguội và thêm nước cất ñến100 ml (nước sắc)

2.4.5. Tanin

Tanin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật. Người ta gặp tanin hằng ngày trong cuộc sống (trà, rượu vang ñỏ, nhiều loại trái cây nhất là trong vỏ trái măng cụt,…). Các nhóm tanin có trọng lượng phân tử khoảng 500-3000.

Các tanin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt.

Trong kỹ nghệ làm giày da, người ta sử dụng tanin làm thuộc da vì tanin có tính chất làm ñông tụ các protein của lớp da trong: tanin tạo các nối hydrogen liên kết phân tử giữa các nhóm –OH và -NH 2 của protein với các nhóm –OH phenol của tanin.

ðịnh tính tanin bằng thuốc thử sau ñây:

Thuốc thử Stiasny:

Formol 36% 20ml

HCl ñậm ñặc 10ml

Dung dịch gelatin mặn:




Gelatin 20gram

Dung dịch NaCl bão hòa 100ml

Dung dịch axetat chì bão hòa:

Pb(CH 3 COO) 2

Dung dịch FeCl 3 1% trong nước.

2.4.6. Glicosid

ðại cương về glicosid

Các glicosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt,… Các glicosid thường là chất kết tinh và có vị ñắng.

Glicosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có 2 phần: phần ñường và phần không ñường thường ñược gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzym thực vật hoặc acid hoặc kiềm, glicosid bị thủy phân thành aglycon và phần ñường.

Cấu trúc hóa học của glicosid rất ña dạng nên tính phân cực của mỗi phân tử thay ñổi tùy theo cấu trúc của aglycon và số phân tử ñường gắn vào aglycon.

Glicosid có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong eter dầu hỏa, hexan, benzen, nhưng tan trong cloroform, dietyl eter, tan tốt trong alcol, nước.

Thuốc thử dùng ñịnh tính glicosid

Thuốc thử Molish

Dung dịch thymol 2% 1-2 giọt

H 2 SO 4 ñậm ñặc 1ml


Chương 3: Thực Nghiệm


CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM

3.1. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1. PHƯƠNG TIỆN

Dụng cụ

Máy soxhlet, máy cô quay, cột sắc ký.

Tủ sấy, máy xay bột cây, bình thủy tinh, chay ñựng dung dịch, chay bi, các dụng cụ khác …

Hóa chất

Dung môi metanol (MeOH), eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol ñể tạo ra các cao tương ứng và dùng trong quá trình sắc ký cột, dùng cho giải ly bản mỏng, dùng trong quá trình chiết pha rắn và chiết lỏng-lỏng.

Silica gel 60 (0,04-0,63 mm) dùng trong sắc ký cột.

Silica gel 60 GF 254 dùng trong chiết pha rắn ñể tạo ra các phân ñoạn cao từ phân

ñoạn cao tổng metanol.

Dung môi dùng cho quá trình ñịnh tính các hợp chất hữu cơ có trong cây: OHCH 3 , Pb(CH 3 COO) 2 , HCl, H 2 SO 4 …

3.1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xử lý nguyên liệu cây rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris”:

Thu hái và làm sạch, làm khô, xay nhuyễn.

Phương pháp tách chiết:

Dùng phương pháp ngâm dầm tạo cao thô ban ñầu từ bột cây và chiết pha rắn ñể phân chia cao thô trên thành những phân ñoạn cao có tính phân cực khác nhau.

Chiết lỏng-lỏng cao MeOH tổng thu ñược các cao dùng trong quá trình ñịnh tính.

ðịnh tính các nhóm chất hữu cơ trong cây:

Từ các loại cao thực hiện các phản ứng ñịnh tính.

Phân lập các cấu tử hữu cơ từ cao chiết:

Sắc ký lớp mỏng các cao chiết trên.

Từ cao etyl acetat tiến hành sắc ký cột trên silica gel ñồng thời sắc ký lớp mỏng các cao chiết thu ñược.

3.2. THỰC NGHIỆM

3.2.1. Xử lý nguyên liệu cây rau má lá sen “Hydrocotyte vulgaris”

Cây rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” sau khi thu hái vào thời gian 10-11 giờ sáng hoặc 2-4 giờ chiều tại 6/8C Mậu Thân, TPCT. ðem rửa sạch, bỏ lá úa, lá sâu, phơi




gió cho ñến héo, sau ñó sấy ở nhiệt ñộ 45-50 0 C trong tủ sấy. Sau ñó ñược xay nhuyễn tạo nguyên liệu ban ñầu (bột cây) dùng ngâm dầm với MeOH.

Hình 5: Rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” ñã phơi gió và xay nhuyễn

3.2.2. Phương pháp tách chiết

Phương pháp ngâm dầm:

Lượng bột cây sau khi xử lý nguyên liệu ñem ngâm dầm (1,5 kg) với lượng MeOH vừa ñủ trong 12 giờ mỗi ngày, dịch chiết ñược lọc qua giấy lọc ñem thu hồi dung môi thu ñược cao chiết MeOH tổng có màu xanh ñen. Qúa trình cứ lặp ñi lặp lại ñến khi chiết kiệt mẫu cây.

Thời gian ñể thực hiện: 15 ngày ñêm

Hình 6: Ngâm dầm bột cây với metanol Hình 7: Cao MeOH tổng

Phương pháp chiết pha rắn:

Từ cao MeOH tổng thu ñược trên ñem chiết pha rắn với dung môi có ñộ phân cực tăng dần lần lượt eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, sau khi ñuổi dung môi thu ñược những cao chiết tương ứng ñều có màu xanh ñen.

Thời gian ñể thực hiện:

Cao eter dầu hỏa cloroform etyl acetat metanol

Thời gian(giờ) 72 60 48 60




Hình 8: Máy sohxlet dùng chiết pha rắn




Sơ ñồ 1: Qui trình ñiều chế các loại mẫu cao

Chiết lỏng-lỏng cao MeOH tổng:

Cao MeOH tổng ñem pha với nước và tiến hành chiết lỏng-lỏng với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol thu dược các cao tương ứng dùng trong quá trình ñịnh tính.

Chiết pha rắn với metanol Cô quay thu hồi dung môi

Cao metanol

Cao etyl acetat Bã còn lại

Bã còn lại

Cao cloroform

Chiết pha rắn với cloroform Cô quay thu hồi dung môi

Cao eter dầu hỏa Bã còn lại

Chiết pha rắn với eter dầu hỏa Cô quay thu hồi dung môi

Ngâm dầm với metanol Cô quay thu hồi dung môi

Rửa sạch,phơi gió sấy 45-50 0 C,xay nhuyễn

Bột cây

Cao metanol tổng

Chiết pha rắn với etyl acetat Cô quay thu hồi dung môi

Bã




Hình 9: Bình lóng dùng chiết lỏng-lỏng

Thời gian ñể thực hiện:

Cao eter dầu hỏa cloroform etyl acetat butanol

Thời gian(giờ) 12 48 12 12

3.2.3. ðịnh tính các nhóm chất hữu cơ trong cây

ðịnh tính alcaloid: Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Bertrand…

Thực nghiệm

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm 2 ml mẫu thử, 1 ống nghiệm làm ñối chứng và lần lượt cho từng giọt các thuốc thử trên vào các ống nghiệm thứ 2.

• Thuốc thử Mayer cho kết tủa màu vàng nâu với dịch chứa alcaloid

• Thuốc thử Dragendorff

Khi sử dụng lấy 20 ml dung dịch hỗn hợp 2 dung dịch (A+B), thêm vào CHCOOH (20ml) và nước cất (100 ml). Cho trầm hiện màu vàng cam với dung dịch chứa alcaloid.

• Thuốc thử Bertrand

Cho kết tủa màu trắng ñục với dịch chứa alcaloid.

ðịnh tính sự hiện diện của flavonoid: Thuốc thử Shibata

Cách thử: Cho mẫu thử (2ml) vào 2 ống nghiệm, ống thứ nhất làm ñối chứng. Trong ống thứ nhì, thêm HCl ñậm ñặc (5ml), bột Mg, thêm alcol isoamil dọc theo thành ống nghiệm, ñun nhẹ. Nếu có một vòng màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang màu ñỏ tím thì phản ứng dương tính.

ðịnh tính steroid

Phản ứng Liebermann – Burchard: Phản ứng dương tính là dung dịch ñổi thành màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc ñỏ.




Phản ứng Salkowski: Hòa tan mẫu thử (1ml) và nhỏ thêm vào H 2 SO 4 ñậm ñặc

(1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch tách thành 2 lớp, lớp H 2 SO 4 có màu xanh và lớp cloroform có màu ñỏ với thuốc thử Salkowski.

ðịnh tính saponin

Cách thử: Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, ñường kính 16 mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…10 ml nước sắc (cao chiết lỏng). Thêm nước cất vào mỗi ống cho ñủ 10 ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây lắc 2 lần. ðể yên trong 15 phút. ðo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin.

ðịnh tính tanin :

Thuốc thử stiasny:

Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu ñỏ.

Dung dịch gelatin mặn:

Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện vô ñịnh hình màu vàng, ñể lâu hóa nâu.

Dung dịch acetat chì bão hòa:

Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu vàng

Dung dịch FeCl 3 1% trong nước:

Dung dịch chuyển sang màu xanh lơ khi có sự hiện diện của tanin

ðịnh tính glicosid

Cách thử: Lấy 2 ống nghiệm cho vào ống thứ nhất 2 ml mẫu thử (làm ñối chứng). Cho 2ml dung dịch mẫu thử vào ống nghiệm thứ nhì, cho từng giọt thuốc thử Molish vào. Nếu thấy xuất hiện màu ñỏ là phản ứng dương tính

3.2.4. Phân lập các cấu tử hữu cơ từ cao chiết

Sắc ký bản mỏng các cao: Các cao thu ñược ñem sắc ký bản mỏng với hệ giải ly và nhúng vào thuốc thử thích hợp ñể hiện hình vết.

Qúa trình sắc ký cột:

Sắc ký cột phân ñoạn I cao etyl acetat (1,2 g) ñể phân lập chất tinh khiết. Dùng dung môi cloroform là dung môi giải ly ñầu tiên. Dung dịch giải ly hứng trong lọ thủy tinh với thể tích như nhau 100ml mỗi lọ. Sau ñó ñem cô quay chân không ( thu hồi dung môi) tạo dung dịch ñậm ñặc hơn và ñược sắc ký lớp mỏng trên cùng bản mỏng. Nếu các lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau thì gom lại chung một phân ñoạn, ñuổi dung môi ở áp suất khí quyển và tính thu suất của nó.




Hình 10: Sắc ký cột cao Ea phân ñoạn I


Chương 4: Kết Quả


Chương 4

KẾT QUẢ

4.1. Thu suất bột cây so với cây tươi

ðợt 1: Cây tươi (13800 g) tạo thành bột cây (1350 g)

⇒% ñộ ẩm trong cây = 100*2

1

m

m= 100*

13800

1350= 9,78 %

ðợt 2: Cây tươi (9350 g) tạo thành bột cây (800 g)

⇒% ñộ ẩm trong cây = 100*2

1

m

m= 100*

9350

800= 8,56 %

Trong ñó: 1m :khối lượng bột cây (g)

2m :khối lượng cây tươi (g)

� ðộ ẩm trung bình trong cây: 9,17 %

4.2. Thu suất các loại cao

4.2.1. Thu suất cao metanol tổng so với bột cây

Sử dụng 1500g bột cây ñem ngâm dầm với metanol ñể ñiều chế cao metanol tổng (148,54 g)

⇒Thu suất: H%= 100*4

3

m

m= 100*

1500

54,148=9,90 %

Trong ñó: 3m :khối lượng bột cây (g)

4m :khối lượng cao metanol tổng (g)

4.2.2. Thu suất các cao bằng phương pháp chiết pha rắn

Cao metanol tổng ñợt I (93,6g) ñem chiết pha rắn thu ñược các cao sau:




Cao Eter dầu hỏa Cloroform Etyl

acetat Metanol

Khối lượng(g)

35,43 4,78 3,00 5,83

Thu suất

riêng phần(%)

37,85 5,11 3,21 6,23

Thu suất tổng(%)

52,40

Bảng 1: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết pha rắn

4.2.3. Thu suất các cao bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

Sử dụng cao metanol tổng (21 g) pha nước ñể chiết lỏng-lỏng với các dung môi, thu ñược:

Cao Eter dầu hỏa Cloroform Etyl

acetat Butanol

Khối lượng(g)

1,60 1,70 1,20 2,10

Thu suất

riêng phần(%)

7,62 8,10 5,71 10,00

Thu suất tổng(%)

31,43

Bảng 2: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

4.3. Sắc ký bản mỏng các cao chiết

4.3.1. Cao eter dầu hỏa

Sắc ký bản mỏng cao 2 PE (chiết pha rắn và chiết lỏng-lỏng) với hệ giải ly PE : Ea = 1:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol

5 6




5: Phương pháp chiết pha rắn

6: Phương pháp chiết lỏng-lỏng

Hình 11:Cao PE

4.3.2. Cao cloroform

Sắc ký bản mỏng 2 cao cloroform (chiết pha rắn và chiết lỏng-lỏng) với 2 hệ giải ly khác nhau hexan:M=3:1; hexan:Ea=3:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol

Hình 12: Cao cloroform

5: Phương pháp chiết pha rắn


a: Hệ giải ly Hexan:M=3:1

b: Hệ giải ly Hexan:Ea=3:1

4.3.3. Cao etyl acetat

Trong quá trình chiết pha rắn ñể ñiều chế cao etyl acetat, các phần thu ñược có kết tinh khác nhau nên chúng tôi xem là cao etyl acetat phân ñoạn I (1,2g), cao etyl acetat phân ñoạn II (1,8g). Sắc ký bản mỏng trong cùng hệ giải ly xác thực ñiều này. Tuy nhiên

5a 6a 5aab

6b

3 4




do cao phân ñoạn II cho kết quả không phù hợp nên sắc ký bản mỏng với hệ giải ly M:HCl ñậm ñặc = 20ml:1 giọt. Kết quả sắc ký bản mỏng như sau:

Hinh 13: Cao Ea phân ñoạn I Hình 14: Cao Ea phân ñoạn II

3: Với hệ giải ly Ea:M=9:1

4: Với hệ giải ly C:M=8:2

Bên cạnh ñó: Sắc ký bản mỏng cao Ea phân ñoạn I (chiết pha rắn) với các hệ giải ly Ea:M = 9:1 và C:M = 8:2, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol cho thấy hệ giải ly Ea:M = 9:1 là phù hợp hơn cả.

Ngoài ra sắc ký bản mỏng cao Ea phân ñoạn I và cao Ea (chiết lỏng-lỏng) với hệ giải ly Ea:M = 9:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol nhận thấy có sự tương ñồng:

Hình 15: Cao Ea

1: Phương pháp chiết pha rắn (phân ñoạn I)


4.3.4. Các cao alcol

Sắc ký bản mỏng cao butanol (chiết lỏng-lỏng) và metanol (chiết pha rắn) với hệ giải ly M : HCl ñậm ñặc = 20ml:1 giọt, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol

1 2




Cao butanol (chiết lỏng-lỏng) Cao metanol (chiết pha rắn)

Hình 16: Các cao alcol giai ñoạn sau

4.4. Quá trình sắc ký cột cao Ea phân ñoạn I

Căn cứ vào quá trình kiểm tra sắc ký sơ bộ bằng sắc ký bản mỏng các loại cao, chúng tôi chọn cao Ea phân ñoạn I ñể thực hiện sắc ký cột nhằm phân lập những hợp chất riêng biệt. Lượng cao Ea phân ñoạn I dùng ñể nạp cột (1,2 g), sử dụng chất hấp phụ trên cột silica gel (25 g) và giải ly với dung môi tinh khiết có ñộ phân cực tăng dần, kể từ cloroform ñến metanol. Trong thời gian có hạn chỉ sử dụng ñơn dung môi cloroform. Kết quả sắc ký ñược ghi ở bảng 3, sau ñây:




Bảng 3: Kết quả sắc ký cột phân ñoạn I của cao etyl acetat

� Thu suất sắc ký cột: H%=0,203

1, 2*100=16,92 %

Sắc ký bản mỏng một số phân ñoạn thu ñược từ sắc ký cột:

TT Lọ

Dung môi

giải ly cột

Tính chất cao Dung môi giải ly bản

mỏng

Dung dịch nhúng bản mỏng

Kết quả giải ly bản mỏng

Khối lượng

(g)

1-4

CHCl 3 Tinh thể vàng C:M=9:1

H 2 SO 4 10% trong metanol

1 vết tím 0,057

5-7 “ Dầu màu

xanh Ea:M=9:1 “

4 vết tím,3 vết hồng

0,006

8-11 “ Cao màu

xanh C:M=9:1 “

1 vết tím, 1 vết hồng,1 vêt

vàng 0,012

12-18 “ Cao màu

xanh C:M=9:1 “

3 vết hồng,1 vết tím

0,018

19-30 “ Cao màu

xanh Ea:M=9:1 “

1 vết tím,1vết hồng

0,004

31-40 “ Sáp màu

xanh Ea:M=9:1 “ 4 vết hồng 0,026

41 “ Kết tinh vàng C:M=9:1 “ 1 vết

hồng,1vết tím hồng

0,008

42 “ Cao màu

vàng xanh Ea:M=9:1 “ 2 vết hồng 0,002

43-53 “ Cao màu

vàng xanh C:M=9:1 “ 3 vết hồng 0,006

54-70 “ Cao màu

vàng xanh C:M=9:1 FeCl 3 10% 2 vết xanh

chàm 0,035

71-126 “ Kết

tinh vàng C:M=9:1 FeCl 3 10% 4 vết xanh

chàm 0,029




Phân ñoạn 1-4 thu ñược có dạng bột màu vàng lục (0,057 g) ñược tinh chế nhiều lần, kết quả nhận ñược tinh thể màu vàng nhạt (0,053 g).Sắc ký bản mỏng với hệ giải ly C:M =9:1 cho thấy vết phân ñoạn này tròn hơn và sạch hơn.

Hình 17:Phận ñoạn 1-4

Ngoài ra, lọ 41 thu ñược từ sắc ký cột cũng có dạng kết tinh màu vàng sáng nên cũng ñược khảo sát thêm. Sắc ký bản mỏng với hệ giải ly C:M =9:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol, kết quả thấy 2 vết có ñộ phân cực chênh lệch nhiều:

Hình 18: lọ 41

Sắc ký bản mỏng phận ñoạn 43-53 với hệ giải ly C:M =9:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H 2 SO 4 10% trong metanol

Hình 19: Phận ñoạn 43-53

4.5. ðịnh tính các cao chiết

4.5.1. Alcaloid




Hình 20: Thuốc thử Bouchardat, Cao PE sau và trước khi thêm thuốc thử

Thuốc thử Bộ phận cây

Dạng mẫu Bouchardat Mayer Bertrand Dragendorff

Cao eter dầu hoả + - - -

Cao cloroform - - - -

Cao etyl acetat - - - +

Cao metanol + - - -

Cây

Cao butanol - - - +

� Vậy trong cây có alcaloid

4.5.2. Flavonoid

Hình 21: Cao Ea trước và sau khi thêm thuốc thử, thuốc thử Shibata

Bộ phận cây

Dạng mẫu Phản ứng shibata

Cao eter dầu hoả +

Cao cloroform -

Cao etyl acetat +

Cao metanol +

Cây

Cao butanol -

� Vậy trong cây có flavonoid

4.5.3. Steroid

Liebermann-Burchard Salkowski




Hình 22: Cao PE trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử


Dạng mẫu Liebermann-Burchard Salkowski

Cao eter dầu hoả + +

Cao cloroform + +

Cao etyl acetat + -

Cao metanol - -

Cây

Cao butanol - -

� Vậy trong cây có steroid

4.5.4. Saponin

Hình 23: Cao metanol

Kết quả : Cao metanol cho kết quả dương tính. Trong cây có saponin.

4.5.5. Tanin

Hình 24: Cao metanol trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử gelatin mặn


Dạng mẫu Stiasny Gelatin mặn Acetat chì FeCl 3 1%

Cao eter dầu hoả - - - -

Cao cloroform - - - -

Cao etyl acetat + + + -

Cao metanol + + + +

Cây

Cao butanol - - - +




� Vậy trong cây có tanin

4.5.6. Glicosid

Hình 25: Cao clorofrom trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử Molish

Bộ phận cây

Dạng mẫu

Thuốc thử

Molish

Cao eter dầu hoả -

Cao cloroform +

Cao etyl acetat +

Cao metanol +

Cây

Cao butanol +

� Vậy trong cây có glicosid

Bảng 4: Tóm tắt kết quả ñịnh tính các hợp chất trong cây

Hợp chất Kết quả

Steroid

+++

Flavonoid +++

Tanin +++

Saponin +

Glycosid ++++

Alcaloid ++++




� Trong cây có chứa glycosid, alcaloid phân bố rải rác ở 4 phân ñoạn cao khác nhau. Steroid, flavonoid, tanin ở 3 phân ñoạn cao. Còn saponin chỉ nằm trong 1 phân ñoạn cao metanol tổng.

Trong ñó:

Glycosid hiên diện trong cao cloroform, etyl acetat, butanol, metanol tổng.

Alcaloid có trong cao eter dầu hoả, etyl acetat, butanol, metanol tổng.

Tanin có trong cao etyl acetat, butanol, metanol tổng.

Steroid có trong cao eter dầu hoả, cloroform, etyl acetat.

Flavonoid có trong cao eter dầu hoả, etyl acetat, metanol tổng.


Tài Liệu Tham Khảo


Chương 5

KẾT LUẬN

Qua thời gian hơn ba tháng khảo sát cây rau má lá sen với loài “Hydrocotyle

vulgaris” cho thấy: Từ nguyên liệu cây rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” ñã qua xử lý thành bột cây khô ñã xác ñịnh ñược ñộ ẩm tương ñối của cây ñạt xấp xỉ 9%.

ðầu tiên, dùng phương pháp ngâm dầm bột cây với metanol thu ñược cao metanol tổng.

Sau ñó, từ cao metanol tổng trên ñem ñiều chế các cao có ñộ phân cực khác nhau ñược tiến hành bằng hai phương pháp chiết ly, qua nhiều công ñoạn với các dung môi khác nhau. ðã tiến hành chiết pha rắn thu ñược các cao eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol. Bên cạnh ñó chiết lỏng-lỏng thu ñược các cao eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol. Tiến hành sắc ký bản mỏng so sánh các cao nhận thấy vết sắc ký ñối với cao chiết lỏng-lỏng nhiều hơn, nên sử dụng các cao này ñể ñịnh tính.

Trong quá trình ñiều chế các cao ñã tốn thời gian khá dài ñể thu suất một lượng cao cần thiết (ñặc biệt ở giai ñoạn làm khô các cao).

So sánh 2 phương pháp chiết pha rắn và chiết lỏng-lỏng bằng sắc ký bản mỏng cao etyl acetat và cao cloroform thấy chiết pha rắn sạch hơn chiết lỏng-lỏng và có sự khác nhau về thành phần các chất. Thu suất các cao chiết lỏng-lỏng thấp hơn chiết pha rắn.

Thu suất so cao metanol tổng so với bột cây chỉ ñạt gần 10%. Thu suất tổng các cao so với cao metanol tổng ñạt 52%.

Chiết lỏng-lỏng thu ñược các cao metanol, eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol dùng cho quá trình ñịnh tính bước ñầu ñã xác ñịnh sự hiện diện các chất có trong cây gồm: steroid, flavonoid, tanin, glycosid, saponin, alcaloid.

ðã sắc ký cột cao etyl acetat thu ñược 11 phân ñoạn khác nhau. Sắc ký ñiều chế phân ñoạn 1-4 ñược chất tinh khiết (V). Do thời gian có hạn nên không xác ñịnh cấu trúc hóa học chất này (0,057g).

Tiến hành sắc ký cột, sắc ký bản mỏng các cao chiết, tinh chế các hợp chất có trong cây cần sự theo dõi chặt chẽ, tỉ mỉ trong công việc.

Chúng tôi hy vọng các nghiên cứu tiếp theo sẽ tìm hiểu sâu hơn thành phần hóa học và công dụng của cây “Hydrocotyle vulgaris”.


Tài Liệu Tham Khảo


TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Duy Ái, Nguyễn Tinh Dung, Trần Thành Huế, Trần Quốc Sơn, Nguyễn Văn Tòng. Một số vấn ñề chọn lọc của hóa học. Tập ba. NXB Giáo dục.

[2] Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi. Cở Sở Hóa Học Phân ích. NXB KHKT Hà Nội.

[3] Nguyễn Văn ðàn, Nguyễn Viết Thụ. Các phương pháp khoa học nghiên cứu cây thuốc. NXB Y Học TPHCM,1985.

[4] Ths Tôn Nữ Liên Hương. Luận Án Thạc Sĩ.

[5] Nguyễn Kim Phi Phụng. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB ðại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2007.

[6] http://www.ars-grin.gov/%7Esbmljw/cgi-bin/taxon.pl?414426

[7] http://www.timjohnson.info/herbage/files/H722.htm

[8] http://zipcodezoo.com/Plants/H/Hydrocotyle_vulgaris.asp#

[9] http://vi.wikipedia.org/wiki/Rau_m%C3%A1

[10] http://members.iinet.net.au/~weeds/western_weeds/plant_images_a-m/hydrocotyle_bonariensis.jpg

[11] http://hanoi.vnn.vn/gocyte/details.asp?topic=36&id=BT3130550840

[12] http://www.spookspring.com/Umbels/Hydro.html

[13] http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_html?Hydrocotyle+vulgaris

[14] http://wetwebmedia.com/PlantedTksSubWebIndex/hydrocotyle.htm

[15] http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrocotyle_vulgaris

[16] http://www.plantoftheweek.org/week321.shtml

[17] http://pagesperso-orange.fr/erick.dronnet/hydrocotyle_vulgaris2.htm

[18] http://www.irishwildflowers.ie/pages/332a.html

[19] http://aquaflora.dk/plant-e/besk/hydr-vul.html

[20] http://www.mobot.org/gardeninghelp/plantfinder/Plant.asp?Code=A639

[21] http://glass-wasserpflanzen.de/Uferpflanzen/Hydrocotyle-vulgaris.jpg

[22] http://images.21wh.com/newcms/wewh/????/101709.jpg

Documents

Rau má lá sen