RAZVOJ HPL ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE … · RAZVOJ HPL ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE SPROŠČANJA ZDRAVILNIH UČINKOVIN IZ MEDIINSKIH OLOG O SOČASNEM UPOŠTEVANJU EROZIJE NOSILNEGA

Magistrsko delo

RAZVOJ HPLC ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE SPROŠČANJA ZDRAVILNIH UČINKOVIN IZ

MEDICINSKIH OBLOG OB SOČASNEM UPOŠTEVANJU EROZIJE NOSILNEGA MATERIALA

September, 2015 Natalija Virant

Natalija Virant

Razvoj HPLC analizne metode za določanje sproščanja zdravilnih učinkovin iz medicinskih oblog ob

sočasnem upoštevanju erozije nosilnega materiala

Magistrsko delo

Maribor, september 2015

Razvoj HPLC analizne metode za določanje sproščanja

zdravilnih učinkovin iz medicinskih oblog ob

sočasnem upoštevanju erozije nosilnega materiala

Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje

Študent: Natalija Virant

Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemija

Predvideni strokovni naslov: magistrica kemije

Mentor: doc. dr. Mitja Kolar

Komentor: red. prof. dr. Darinka Brodnjak-Vončina

Komentor: prof. dr. Karin Stana Kleinschek

Maribor, september 2015

Razvoj HPLC analizne metode za določanje sproščanja zdravilnih učinkovin iz medicinskih oblog ob sočasnem upoštevanju erozije nosilnega materiala

I

Kazalo

1 Uvod .................................................................................................................................. 1 1.1 Namen, hipoteze in cilji ............................................................................................. 2

2 Teoretični del ..................................................................................................................... 3 2.1 Kromatografija ........................................................................................................... 3

2.2 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) .............................................. 3 2.2.1 Sestavni deli HPLC sistema................................................................................ 4

2.3 Validacija ................................................................................................................... 6 2.3.1 Selektivnost in specifičnost ................................................................................ 6 2.3.2 Linearnost ........................................................................................................... 6

2.3.3 Delovno območje ................................................................................................ 7

2.3.4 Natančnost .......................................................................................................... 7

2.3.5 Točnost ............................................................................................................... 7 2.3.6 Meja zaznavnosti (LOD) .................................................................................... 7 2.3.7 Meja določljivosti (LOQ) ................................................................................... 8 2.3.8 Občutljivost......................................................................................................... 8

2.3.9 Robustnost .......................................................................................................... 8 2.4 Elektropredenje .......................................................................................................... 9

2.4.1 Parametri, ki vplivajo na elektropredenje ......................................................... 12

2.4.2 Karakterizacija izpredenih vlaken .................................................................... 14 2.5 Celulozni acetat ........................................................................................................ 15

2.6 Lokalni anestetiki ..................................................................................................... 16 2.6.1 Benzokain ......................................................................................................... 17

2.7 Karakterizacijske metode ......................................................................................... 19

2.7.1 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) ....................................................... 19

2.7.2 Infrardeča spektroskopija (IR) .......................................................................... 19 2.7.3 Določanje stičnega kota .................................................................................... 20

3 Eksperimentalni del ......................................................................................................... 21

3.1 Materiali ................................................................................................................... 21 3.1.1 Kemikalije......................................................................................................... 21

3.1.2 Steklovina in pribor .......................................................................................... 21 3.1.3 Aparature .......................................................................................................... 21

3.2 Laboratorijske metode ............................................................................................. 23

3.2.1 Priprava nanovlaken iz celuloznega acetata s postopkom elektropredenja ...... 23 3.2.2 Sproščanje benzokaina v Franz-ovi difuzijski celici ........................................ 27

3.2.3 Razvoj analizne metode na HPLC sistemu ....................................................... 27

4 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 30

4.1 Priprava nanovlaken iz celuloznega acetata s postopkom elektropredenja ............. 30 4.1.1 Optimizacija postopka elektropredenja ............................................................ 30 4.1.2 Lastnosti predilne raztopine .............................................................................. 36 4.1.3 SEM analiza ...................................................................................................... 36 4.1.4 Premer vlaken ................................................................................................... 38

4.1.5 FTIR analiza ..................................................................................................... 39 4.1.6 Nabrekanje vlaken ............................................................................................ 41 4.1.7 Stični kot ........................................................................................................... 42

4.2 Razvoj HPLC analizne metode za določanje benzokaina ........................................ 43 4.3 Validacija HPLC analizne metode ........................................................................... 46


II

4.3.1 Ustreznost kromatografskega sistema ............................................................... 46

4.3.2 Natančnost ......................................................................................................... 46 4.3.3 Točnost .............................................................................................................. 49 4.3.4 Linearnost.......................................................................................................... 49 4.3.5 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ) ..................................... 50 4.3.6 Robustnost ......................................................................................................... 51

4.4 Določanje benzokaina v realnih vzorcih .................................................................. 54 4.4.1 Sproščanje benzokaina iz nanovlaken ............................................................... 54 4.4.2 Sproščanje benzokaina iz filmov ...................................................................... 56 4.4.3 Primerjava sproščanja iz nanovlaken in filmov ................................................ 58

5 Zaključek ......................................................................................................................... 59

6 Literatura.......................................................................................................................... 61 7 Priloge .............................................................................................................................. 65

7.1 Priloga 1: Vpliv spremembe pH na obliko kromatografskega vrha ......................... 65

7.2 Priloga 2: Izračun sproščenih količin benzokaina .................................................... 66 8 Življenjepis ...................................................................................................................... 67


III

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledal/a sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Science direct (http://www.sciencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

Electrospinning IN cellulose acetate 19

HPLC IN validation IN benzocaine 11

Drug release 2

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid&lani=si)


HPLC IN validacija 9

Lokalni anestetiki 1

Vir: Digitalna knjižnica Univerze v Mariboru (http://dkum2.uni-mb.si/podrocje.aspx?id=0)


Elektropredenje 1

Vir: Digitalna knjižnica Slovenije (http://www.dlib.si/)


Elektropredenje 1

Elektronska vrstična mikroskopija 2

Lokalni anestetiki 1

Skupno število pregledanih člankov: 56

Skupno število pregledanih knjig: 14

Maribor, september 2015 Natalija Virant


IV

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorju doc. dr. Mitji Kolarju za

strokovno svetovanje, pomoč, koristne nasvete, spodbudo in

vodenje pri opravljanju magistrske naloge. Prav tako se

zahvaljujem somentoricama red. prof. dr. Darinki Brodnjak-

Vončina in prof. dr. Karin Stana Kleinschek za pomoč in pregled

magistrskega dela.

Posebej se zahvaljujem dr. Manji Kurečič za vse nasvete,

spodbudne besede in pomoč pri eksperimentalnem delu. Hvala

tudi dr. Silvu Hriberniku za opravljene SEM analize in Tanji

Kos za pomoč pri izvedbi eksperimentalnega dela. Hvala tudi

ostalim, ki niso imenovani in so kakorkoli pripomogli k

nastanku tega dela.

Iskreno se zahvaljujem moji družini, ki mi je omogočila študij in

me skozi vsa leta spodbujala in podpirala.

Posebna zahvala velja Aleksu za vso ljubezen, razumevanje in

polepšanje študijskih dni.


V


Povzetek

Namen magistrskega dela je bil razviti in validirati HPLC analizno metodo za določanje

sproščanja benzokaina iz nanovlaken. V ta namen smo pripravili elektropredena nanovlakna

z benzokainom in optimizirali postopek elektropredenja iz celuloznega acetata (CA). Pri tem

smo preučevali vpliv procesnih parametrov in parametrov predilne raztopine na potek

elektropredenja. Dobljena nanovlakna smo okarakterizirali s SEM in FTIR analizo, določili

smo tudi stopnjo nabrekanja in stični kot.

Koncentracije benzokaina smo določali z uporabo kolone Supelcosil LC-18 (20 cm x 4,6 cm,

3µm) in UV-VIS detektorja pri valovni dolžini 285 nm. Kot optimalno mobilno fazo smo

izbrali acetonitril:voda (60:40) pri pretoku 0,8 ml/min. Pri teh pogojih se je benzokain eluiral

pri 4,26 min. Potrdili smo, da je razvita metoda natančna, točna in linearna v območju med 5

in 50 mg/l. Meja zaznavnosti (LOD) znaša 1,08 mg/l, meja določljivosti (LOQ) pa 3,27

mg/l.

Gladka nanovlakna, s premerom med 400 in 900 nm, smo izpredli iz 17 ut. % CA v 85 %

ocetni kislini. Optimalni procesni parametri elektropredenja so: napetost 75 kV in razdalja

med elektrodama 160 mm. Optimalni predilni raztopini smo dodali 5 % benzokaina (glede

na maso CA) in ta dodatek ni vplival na postopek elektropredenja.

Ključne besede: tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC), validacija,

elektropredenje, benzokain, kinetika sproščanja

UDK: 543.544.5(043.2)


VI

Development of HPLC method for determination of various pharmaceutical compounds and study of supporting material erosion

Abstract

The aim of the master thesis was developed and validated HPLC analysis method for

determination of benzocaine release from nanofibers. For this purpose we have prepared

electrospun nanofibers with benzocaine and optimized electrospinning process of cellulose

acetate (CA). We have studied the influence of solution parameters and process parameters

of electrospinning. Electrospun nanofibers were characterized by SEM and FTIR analysis.

Swelling behaviors and contact angle were also investigated.

Concentrations of benzocaine were determined using Supelcosil LC-18 (20 cm x 4,6 cm,

3µm) column. The UV-VIS detector was set at 285 nm. The mobile phase consisted of

acetonitrile:water (60:40) and used flow rate was 0,8 ml/min. Under these conditions

benzocaine eluted at 4,26 min. We confirmed that method was precise, accurate and linear

from 5 to 50 mg/l. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) values were 1,08

mg/l and 3,27 mg/l, respectively.

Smooth nanofibers with diameters ranging from 400 to 900 nm were electrospun from a 17

ut. % CA solution in 85 % acetic acid. Optimal electrospinning parameters are 160 mm

distance between electrodes and 75 kV voltage. The addition of 5 % benzocaine (based on

the weight of CA) in the spinning formulation did not affect the fiber formation.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC), validation, electrospinning,

benzocaine, drug release kinetics

UDK: 543.544.5(043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 2-1: Prednosti in slabosti igelnega in brezigelnega elektropredenja........................... 11

Tabela 3-1: Odpipetirani volumni osnovne standardne raztopine benzokaina za pripravo

standardnih raztopin benzokaina za umeritveno krivuljo ....................................................... 28

Tabela 3-2: Kromatografski pogoji za določanje benzokaina ................................................ 28

Tabela 4-1: Izmerjeni stični koti za vlakna brez in z zdravilno učinkovino ........................... 42

Tabela 4-2: Vpliv spremembe mobilne faze na kromatografske parametre ........................... 43

Tabela 4-3: Vpliv spremembe pH mobilne faze na kromatografske parametre ..................... 44

Tabela 4-4: Vpliv topila na kromatografske parametre .......................................................... 45

Tabela 4-5: Vrednosti parametrov ustreznosti kromatografskega sistema ............................. 46

Tabela 4-6: Ponovljivost standardne raztopine benzokaina (30 mg/l) ................................... 46

Tabela 4-7: Preverjanje obnovljivosti ..................................................................................... 48

Tabela 4-8: Dobljeni rezultati obnovljivosti za vseh šest dni ................................................. 49

Tabela 4-9: Preverjanje točnosti metode ................................................................................ 49

Tabela 4-10: Preverjanje linearnosti metode .......................................................................... 50

Tabela 4-11: Robustnost metode ............................................................................................ 52

Tabela 4-12: Določene koncentracije sproščenega benzokaina iz nanovlaken ...................... 55

Tabela 4-13: Določene koncentracije sproščenega benzokaina iz filmov .............................. 57

Tabela 7-1: Preračun sproščenih koncentracij benzokaina iz mg/l v mg/cm2 ........................ 66


VIII

Seznam slik

Slika 2-1: Shematski prikaz HPLC sistema .............................................................................. 4

Slika 2-2: Shematski prikaz aparature za elektropredenje ...................................................... 10

Slika 2-3: Oblikovanje Taylorjevega stožca ........................................................................... 10

Slika 2-4: Oblikovanje nanovlaken s postopkom elektropredenja.......................................... 12

Slika 2-5: Shema brezigelnega elektropredenja ...................................................................... 12

Slika 2-6: Strukturna formula celuloznega acetata ................................................................. 15

Slika 2-7: Strukturna formula benzokaina .............................................................................. 17

Slika 2-8: Sinteza benzokaina ................................................................................................. 17

Slika 2-9: Ravnovesje sil, katerim je izpostavljena kapljica tekočine, ki jo nanesemo na trdno

površino ................................................................................................................................... 20

Slika 3-1: Instrument za elektropredenje NanoSpider NS LAB 500 ...................................... 24

Slika 3-2: Izpredena nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini .................................. 24

Slika 3-3: FTIR spektrometer Perkin Elmer FTIR System Spectrum GX .............................. 25

Slika 3-4: Fotogoniometer OCA35 Dataphysics .................................................................... 26

Slika 3-5: Franz-ova difuzijska celica ..................................................................................... 27

Slika 3-6: Tekočinski kromatograf Varian ProStar ................................................................. 29

Slika 4-1: Vrednosti prevodnosti in viskoznosti predilnih raztopin ....................................... 31

Slika 4-2: 12 ut. % CA v 85 % ocetni kislini .......................................................................... 32






Slika 4-8: Viskoznost, prevodnost in površinska napetost predilnih raztopin ........................ 36

Slika 4-9: Vlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini ......................................................... 37

Slika 4-10: Vlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom ....................... 37

Slika 4-11: Film iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini ........................................................... 38

Slika 4-12: Film iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom ........................... 38

Slika 4-13: Porazdelitev premera vlaken ................................................................................ 39

Slika 4-14: FTIR spekter za nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini in za

nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom ................................... 40

Slika 4-15: FTIR spekter za benzokain ................................................................................... 41

Slika 4-16: Merjenje stičnega kota.......................................................................................... 42

Slika 4-17: Vpliv spremembe mobilne faze na elucijo benzokaina ........................................ 44

Slika 4-18: Vpliv izbire topila na obliko kromatografskega vrha ........................................... 45

Slika 4-19: Umeritvena krivulja za benzokain ........................................................................ 50

Slika 4-20: Stabilnost standardne raztopine benzokaina (30 mg/l)......................................... 53

Slika 4-21: Kromatogrami realnih vzorcev ............................................................................. 55


IX

Slika 4-22: Različni profili sproščanja benzokaina iz vlaken ................................................. 56

Slika 4-23: Profil sproščanja benzokaina iz filmov ................................................................ 57

Slika 4-24: Primerjava kromatogramov po sproščanju benzokaina iz filmov in nanovlaken 58

Slika 7-1: Vpliv spremembe pH na obliko kromatografskega vrha ....................................... 65


X

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

sproščena količina po določenem času t (mg/cm2)

As površina vzorca (cm2)

b0 odsek linearne regresijske premice (-)

b1 naklon linearne regresijske premice (-)

c koncentracija (mol/l)

k' kapacitivni faktor (-)

n število meritev (-)

N število teoretskih podov (-)

r korelacijski koeficient (-)

S stopnja nabrekanja (%)

s standardni odmik (-)

sy standardni odmik odseka linearne regresijske premice (-)

Tf faktor simetrije (%)

tr retencijski čas (min)

V jakost električnega polja (V/m)

Vc kritična vrednost jakosti električnega polja (V/m)

VFc volumen Franz-ove difuzijske celice (ml)

Vs volumen odvzetega vzorca (ml)

wd masa suhih vlaken (g)

we masa nabreklih vlaken (g)

w1 masa suhih vlaken po 24 h nabrekanju (g)

w1/2 širina vrha na polovični višini vrha (s)

xi posamezna meritev (-)

povprečje meritev (-)

y regresijska premica (-)

Grški simboli

γ masna koncentracija (g/l)

γl medfazna napetost med kapljevino in zrakom (N/m)

γs medfazna napetost med trdno površino in zrakom (N/m)

γsl medfazna napetost med kapljevino in trdno površino (N/m)

θ stični kot (°)

λ valovna dolžina (nm)

ν valovno število (cm-1

)


XI

Kratice ACN acetonitril

AFM mikroskopija na atomsko silo

BIAS sistematsko odstopanje

CA celulozni acetat

CD cirkularni dikroizem

DAD detektor z nizom fotodiod

DCM diklorometan

DMAc N, N-dimetilacetamid

DMF N, N-dimetilformamid

DPAdSV diferencialna pulzna adsorptivna striping voltametrija

DS stopnja substitucije

DSC diferenčna dinamična kalorimetrija

FESEM vrstični elektronski mikroskop s poljsko emisijo

FIA pretočna injekcijska analiza

FTIR infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

IR infrardeča spektroskopija

LA lokalni anestetiki

LOD meja zaznavnosti

LOQ meja določljivosti

MS masna spektrometrija

NMR jedrska magnetna resonanca

PABA para-aminobenzojska kislina

PBS fosfatni pufer s soljo

RSD relativni standardni odmik

SEM vrstična elektronska mikroskopija

SWAXS rentgensko sipanje

TEM transmisijski elektronski mikroskop

XPS rentgenska fluorescenčna spektroskopija

XRD rentgenska praškovna difrakcija


1

1 Uvod

Sproščanje zdravilnih učinkovin je že desetletja ena pomembnejših tem na področju dostave

zdravilnih učinkovin. Napredek v oblikovanju materiala in inženiringa je privedel do hitrega

razvoja novih materialov z večjo kompleksnostjo in funkcijami. Tako naravne kot sintetične

makromolekule se v veliki meri uporabljajo pri kontroliranem sproščanju zdravilnih

učinkovin za povečanje bioučinkovitosti, za olajšanje klinične uporabnosti in izboljšanja

kakovosti življenja [1]. Terapija kontroliranega sproščanja zdravilne učinkovine vključuje

dostavo vnaprej določene količine zdravila, v določenem časovnem obdobju in na

predvidljiv način. Cilj vseh sistemov s kontroliranim sproščanjem je izboljšati učinkovitost

terapije z zdravili. To izboljšanje terapije se lahko kaže v obliki povečanja terapevtske

aktivnosti v primerjavi z intenzivnostjo stranskih učinkov, zmanjšanja števila uporabljenih

zdravil potrebnih med zdravljenjem, ali pa v odpravljanju potrebe po specializiranem vnosu

zdravila (npr. ponavljajoče injekcije) [2].

Danes obstajajo številni sistemi s kontroliranim sproščanjem. Med njimi so preučevani

predvsem polimerni sistemi za dostavo zdravilnih učinkovin, kjer se kot materiali

uporabljajo biorazgradljivi polimeri. Razvite so bile različne nanotehnologije, ki se

osredotočajo na oblikovanje terapevtskih sredstev v biorazgradljivih matricah, kot so

nanodelci, nanokapsule, micelarni sistemi in konjugati [2].

Ena izmed obetavnih tehnik za sisteme s kontroliranim sproščanjem je tudi elektropredenje,

saj ponuja veliko izbiro sintetičnih in naravnih ter biorazgradljivih oz. nerazgradljivih

polimerov [3]. Pri postopku elektropredenja uporabljamo elektrostatske sile za oblikovanje

neskončnih nanovlaken iz polimernih raztopin [4]. Prednost elektropredenja je torej

vlaknasta morfologija, ki v sistemih za dostavo zdravilnih učinkovin omogoča ciljano

dostavo zdravilne učinkovine v telo. Pomembno je tudi veliko razmerje med površino in

volumnom. Odvisno od lastnosti polimera lahko sproščanje zdravilne učinkovine poteka

samo preko difuzije (nerazgradljivi polimeri) ali simultano preko difuzije in degradacije

ogrodja [3].

Elektropredenje iz celuloze in njenih derivatov ni precej raziskano. Za razliko od ostalih

derivatov celuloze obstaja precej raziskav o elektropredenju iz celuloznega acetata (CA).

Raziskano je bilo elektropredenje iz CA z uporabo različnih topil. Tungprapa s sodelavci [5]

je proučeval vpliv različnih topil in koncentracij raztopin na morfologijo izpredenih vlaken

iz CA. Kot topilo so uporabljali aceton, kloroform, metanol, N, N-dimetilformamid (DMF),

diklorometan (DCM), piridin in mravljično kislino, uporabljali pa so tudi mešane sisteme

topil, kot so aceton-N, N-dimetilacetamid (DMAc), kloroform-metanol in metanol-DMC.

Izmed vseh uporabljenih topil so gladka vlakna pridobili iz 16 % (w/v) CA, ki so ga raztopili

v raztopini aceton-DMAc v razmerju 1:1, 2:1 in 3:1. Gladka vlakna so pridobili tudi v 14-20

% (w/v) CA raztopljenem v acetonu-DMCa-ju (2:1) ter v 8-12 % (w/v) CA raztopljenem v

raztopini DMC-metanol v razmerju 4:1 [5]. Iz 16 % (w/v) CA raztopljenega v

acetonu:DMAc-ju (2:1) je Tungprapa s sodelavci [6] elektropredel tanka vlakna z

vključenimi zdravilnimi učinkovinami- naproksen, ibuprofen, indometacin in sulindak (20

ut. % glede na maso CA) ter spremljal kinetiko sproščanja zdravilnih učinkovin. V enakem

topilu so 17 % CA topili tudi Taepaiboon s sodelavci [7] in Phiriyawirut s sodelavcem [8].

Taepaiboon s sodelavci je vlakna izpredal z dodatkom 0,5 ut. % Retina-A in 5 ut. %

vitamina E, [7] medtem ko pa je Phiriyawirut s sodelavcem izpredal vlakna z vključeno

galno kislino (2,5-10 ut. % glede na maso CA) [8].


2

Raziskav, kjer so kot topilo za CA uporabljali ocetno kislino ni veliko. Prvi je o

elektropredenju CA raztopljenega v ocetni kislini poročal Han s sodelavci [9]. Ugotovili so,

da CA lahko raztopimo v raztopini s 70 % oz. višjim deležem ocetne kisline. Dolga

nanovlakna so izpredli iz 17 ut. % CA raztopljenega v raztopini ocetne kisline in vode v

razmerju 75:25 [9]. Leta 2010 je Wongsasulak poročal o pripravi nanovlaken iz 20 % (w/w)

CA raztopljenega v 85 % ocetni kislini z dodatkom 12 % (w/w) jajčnega beljaka

raztopljenega v 50 % mravljični kislini [10]. O elektropredenju nanovlaken iz CA z

vključenim benzokainom nismo zasledili objav.

Najpogosteje uporabljeni metodi s katerimi ovrednotimo količino sproščene zdravilne

učinkovine sta UV-VIS spektrofotometrija in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

(HPLC). Grillo s sodelavci je poročal o razvoju in validaciji HPLC metode za določanje

benzokaina v mikro in nanodelcih iz biorazgradljivih polimerov. Meritve so izvajali v RP-

C18 koloni, kot mobilno fazo pa so uporabili acetonitril in vodo v razmerju 50:50. Pretok

mobilne faze so naravnali na 1 ml/min, valovna dolžina UV-VIS detektorja pa je znašala 285

nm. Pri teh pogojih se je benzokain eluiral pri 5 min [11]. Kot mobilno fazo je acetonitril

uporabil tudi Floriani s sodelavci, le da je uporabil gradientno elucijo (A- acetonitril, B- 0,05

M amonijev format- pH= 3,1) [12]. Ostali avtorji, ki so meritve izvajali na C18 koloni, so

uporabljali metanolno mobilno fazo. Perez-Lozano s sodelavci je razvil in validiral metodo

za določanje benzokaina s HPLC v bioadhezivnem gelu. Mobilna faza je bila sestavljena iz

metanola in 10 % ocetne kisline, uporabili pa so gradientno elucijo pri pretoku 2 ml/min

[13]. Ortiz-Boyer s sodelavci je kot mobilno fazo uporabil metanol in 10 mM KH2PO4 (pH=

3,31) v razmerju 75:25. Pretok mobilne faze je bil 1 ml/min, valovno dolžino detektorja so

naravnali na 270 nm in pri teh pogojih se je benzokain eluiral pri 3,5 min [14]. Tudi de

Araujo s sodelavci je uporabil metanolno mobilno fazo, natančneje metanol, vodo in ocetno

kislino v razmerju 56:40:4. Pretok mobilne faze so naravnali na 1,3 ml/min, valovna dolžina

UV-VIS detektorja je znašala 294 nm [15].

1.1 Namen, hipoteze in cilji

Namen magistrske naloge je bil pripraviti elektropredena nanovlakna in optimizirati

postopek elektropredenja iz CA. Pri tem smo preučevali vpliv procesnih parametrov in

parametrov predilne raztopine na potek elektropredenja. Dobljena nanovlakna smo

okarakterizirali s SEM in FTIR analizo, določili smo tudi stopnjo nabrekanja in stični kot.

Pripravljena nanovlakna z vključeno zdravilno učinkovino (benzokain) smo sproščali v

Franz-ovi difuzijski celici. Z namenom, da bi določili količino sproščenega benzokaina iz

nanovlaken, smo razvili in validirali HPLC analizno metodo za določanje benzokaina. Pri

razvoju metode smo spremljali vpliv parametrov (sprememba mobilne faze, pretoka, pH,

temperature kolone, itd.) na kromatografsko ločbo.


3

2 Teoretični del

2.1 Kromatografija Kromatografija je separacijski proces za katerega je značilno, da najprej ločimo posamezne

komponente vzorca, nato pa jih, s ciljem kvalitativne in kvantitativne določitve, zaznamo z

ustrezno detekcijo [16, 17]. Široko se uporablja za separacijo, identifikacijo in določanje

kemijskih spojin v kompleksnih matricah [18]. Začetke kromatografije pripisujejo letu 1906,

ko je ruski botanik Tswett uporabil kromatografsko kolono za separacijo ksantofilov in

karotenov na kalcijevem karbonatu s petrolejem. Temelje teorije tekočinske kromatografije

sta postavila Martin in Synge, ki sta za svoje delo leta 1952 prejela Nobelovo nagrado [16].

Princip kromatografije je ta, da se komponente analita ločijo med seboj na podlagi različnih

kemijskih in fizikalnih lastnosti ter različnih fizikalnih interakcij z mobilno in stacionarno

fazo [16, 17]. Mobilna faza je ekstrakcijska faza, ki se premika skozi sistem, stacionarna faza

pa je faza, ki ostane v fiksnem položaju [19]. Mobilno fazo lahko predstavlja tekočina, plin

ali superkritična faza, stacionarno fazo pa predstavlja trden ali tekoči film, ki je nanesen na

trdno površino [19, 20]. Glede na mobilno fazo lahko kromatografijo razdelimo na plinsko in

tekočinsko kromatografijo. Če je mobilna faza plin, govorimo o plinski kromatografiji, če pa

je tekočina, pa o tekočinski kromatografiji [17].

2.2 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je kolonska kromatografija, za katero

je značilno, da kot stacionarno fazo uporabljamo zelo majhne delce, katerih velikost je od

0,5 do 10 µm [17]. Princip metode je, da komponente raztopimo v primernem topilu ter jih

nato z visokotlačno črpalko pod visokim tlakom potiskamo skozi kolono s pomočjo mobilne

faze [19]. Je vsestranska analitska tehnika, ki se uporablja za analizo farmacevtskih

komponent, biomolekul, polimerov, številnih organskih in ionskih spojin, [21] kozmetike,

okoljskih in forenzičnih vzorcev ter industrijskih kemikalij [22].

Glavne prednosti HPLC sistema so sposobnost večkomponentne analize realnih vzorcev in

kompleksnih matric, hitra in natančna kvantitativna analiza, avtomatizirano delovanje ter

detekcija visoke občutljivosti. Ena izmed prednosti HPLC je tudi ta, da lahko s HPLC

določimo od 60 do 80 % vseh obstoječih spojin. Slabosti oz. omejitve HPLC pa so, da ni

univerzalnega detektorja, manjša učinkovitost separacije kot s kapilarno plinsko

kromatografijo ter težje upravljanje s sistemom za začetnike [21].


4

2.2.1 Sestavni deli HPLC sistema

Osnovni kromatografski sistem, katerega shema je prikazana na sliki 2-1 [22], je sestavljen

iz rezervoarja za mobilno fazo, injektorja, kromatografske kolone, detektorja, črpalke in

osebnega računalnika s programsko opremo [16].

Slika 2-1: Shematski prikaz HPLC sistema

2.2.1.1 Kolona

Kolona predstavlja glavni del HPLC sistema, saj v njej potekajo najpomembnejši procesi

separacije [16, 17]. Je ravna cev iz nerjavečega jekla, napolnjena z majhnimi delci

stacionarne faze, velikosti od 3 do 10 µm [19, 24]. Manjši kot so delci, višja je učinkovitost

kolone in višji je protitlak [22, 23]. Običajne dolžine kolone se gibljejo od 10 do 30 cm,

njihov notranji premer pa je od 4 do 10 mm [18]. Krajše kot so kolone, slabša je ločljivost,

medtem ko pa daljše kolone povzročijo večji padec tlaka v HPLC sistemu [16, 17]. HPLC

sistem ponavadi vsebuje dve koloni: analitsko kolono v kateri poteka separacija in

predkolono, ki je nameščena pred analitsko kolono, da jo ščiti pred kontaminacijo [19].

Uspešna separacija je odvisna od pravilne izbire stacionarne faze. Za delo v tekočinski

kromatografiji je tako na voljo več različnih stacionarnih faz, kot so adsorpcijske stacionarne

faze, reverzne faze, ionsko-izmenjevalne stacionarne faze, permeabilne stacionarne faze in

kiralne stacionarne faze [16, 17].

2.2.1.2 Mobilna faza

Da preprečimo degradacijo kolone, morajo biti topila, ki se uporabljajo za HPLC analizo,

zelo čista [23]. Ostale zahteve, ki jih mora imeti mobilna faza, so tudi te, da ne sme reagirati

s polnilom, s kolonami ter kovinskimi deli aparata [17]. Mobilno fazo, ki je najpogosteje

shranjena v steklenih posodah, moramo pred uporabo razpliniti, saj lahko mehurčki plinov

povzročajo nevšečnosti v črpalki, koloni in detektorju [23]. Topila lahko razplinimo s

prepihovanjem ali z ultrazvokom in vodno črpalko, s katero ustvarimo podtlak.

Priporočljivo je tudi, da vse mobilne faze pred uporabo prefiltriramo [17].

Ločimo izokratsko in gradientno elucijo. Pri izokratski eluciji je sestava mobilne faze skozi

celotno analizo enaka, medtem ko se pri gradientni eluciji sestava mobilne faze skozi proces

ločbe spreminja ter tako pogosto izboljša učinkovitost separacije [18].


5

2.2.1.3 Črpalka

Vsi HPLC sistemi vsebujejo eno ali več črpalk, s katerimi zagotovimo enakomeren pretok

mobilne faze. Zvišan tlak, ustvarjen pred injektorjem, je odvisen od pretoka ter viskoznosti

mobilne faze in velikosti delcev stacionarne faze [24]. Glavne zahteve, ki jih morajo imeti

črpalke, so: ustvarjanje tlaka do 15 MPa, brezpulzno delovanje, kemijska odpornost,

ustvarjanje pretoka mobilne faze v območju med 0,1 in 10 ml/min, obnovljivost in

enakomernost pretoka z relativno napako, nižjo kot 0,5 % [18, 20].

2.2.1.4 Injektor

Glavna naloga injektorja je, da pod visokim tlakom prenese vzorec do kolone [19]. Injektor

je običajno integralni del HPLC sistema, ki ima zamenljive zanke, kar omogoča izbiro

volumna injiciranega vzorca med 5 in 500 µl [18]. Za avtomatski vnos vzorca se uporabljajo

avtomatski vzorčevalniki, ki zmanjšajo stroške dela ter povečujejo produktivnost in

natančnost testiranja [21].

2.2.1.5 Detektor

Najpomembnejša lastnost detektorja je ta, da lahko z njim določimo koncentracijo separirane

komponente (kvantitativna določitev) [16, 17]. Idealen detektor je občutljiv za nizke

koncentracije vsakega analita, zagotavlja linearen odziv v širokem območju, ne povzroča

razširitve vrhov ter je neobčutljiv na spremembe temperature in sestave mobilne faze [23].

Najpogosteje uporabljeni detektorji pri HPLC so UV-VIS detektor, fluorescenčni detektor,

detektor na lomni količnik, masno spektrometrijski (MS) detektor, detektor na električno

prevodnost, voltametrijski detektor, amperometrični detektor in kulometrijski detektor [20].

Izmed naštetih detektorjev so najbolj uporabljeni UV-VIS detektorji, predvsem zaradi

njihove enostavnosti, univerzalnosti, občutljivosti in selektivnosti. Njihovo delovanje temelji

na absorpciji svetlobe v ultravijoličnem in vidnem delu spektra, predvsem okoli valovnih

dolžin 254 nm in 280 nm, saj tu absorbira svetlobo velika večina organskih molekul [16, 17].

Ena izmed omejitev za uporabo UV-VIS detektorjev je ta, da mobilna faza ne sme močno

absorbirati pri izbrani valovni dolžini [19].

Najnaprednejši detektorji, kot je detektor z nizom fotodiod (DAD detektor), omogočajo

spreminjanje valovne dolžine med analizo ali pa omogočajo sočasno snemanje absorbance

pri večih valovnih dolžinah. Ti detektorji se ne uporabljajo samo za snemanje

kromatograma, ampak omogočajo tudi spektralne informacije, s katerimi lahko

identificiramo spojine [24].


6

2.3 Validacija Validacija je postopek pri katerem s preiskovanjem potrdimo in zagotovimo objektivne

dokaze, da smo izpolnili določene zahteve za predvideno uporabo [25]. Je precej zamuden in

drag postopek. Vse rezultate validacije moramo dokumentirati in zabeležiti, prav tako je

potrebno shraniti vse dokumente, izračune in izpise o validaciji. Osnovni parametri, ki jih

določamo pri validaciji so: selektivnost in specifičnost, linearnost, delovno območje,

natančnost, točnost, meja določljivosti, meja zaznavnosti, občutljivost in robustnost [26].

2.3.1 Selektivnost in specifičnost

Izraza selektivnost in specifičnost pogosto zamenjujemo. Oba izraza se nanašata na

zmožnost metode, da točno določi analit v prisotnosti drugih komponent v vzorcu.

Specifična metoda je tista, s katero lahko določimo samo en analit. Metodo, s katero lahko

določimo več komponent hkrati, pod pogojem, da se te komponente med seboj razlikujejo,

pa imenujemo selektivna metoda [27]. ICH definira specifičnost kot sposobnost nedvoumne

ocene analita v prisotnosti komponent, ki jih lahko pričakujemo v vzorcu. Te komponente so

nečistoče, razgradni produkti, matrica itd [28, 29].

2.3.2 Linearnost

Linearnost je definirana kot zmožnost metode, da v določenem območju daje rezultate, ki so

proporcionalni koncentraciji komponente v vzorcu [28-30]. Priporoča se, da za določitev

linearnosti izmerimo minimalno 5 različnih koncentracij standardne raztopine [28, 30].

Linearnost je možno oceniti vizualno ali matematično. Matematično se izrazi tako, da preko

linearne regresije določimo regresijsko premico in izračunamo korelacijski koeficient (r).

Regresijsko premico določimo po enačbi 2.1.

(2.1)

kjer je:

b1 naklon linearne regresijske premice

b0 odsek linearne regresijske premice.

Naklon premice izraža občutljivost metode, [27] odsek na ordinati pa predstavlja merilo za

sistematsko odstopanje metode (BIAS) [16]. Korelacijski koeficient (enačba 2.2) prikazuje

prileganje eksperimentalnih točk premici [31]. Metoda je linearna, ko je koeficient korelacije

≥ 0,99 [26].

(2.2)

kjer je:

xi, yi trenutni vrednosti x in y,

x, y povprečni vrednosti x in y

n število meritev.


7

2.3.3 Delovno območje

ICH definira delovno območje kot interval med zgornjo in spodnjo koncentracijo

komponente v vzorcu, za katero je dokazano, da je metoda natančna, točna in linearna [28,

29]. Spodnji del območja je omejen z mejo določljivosti, zgornji del območja pa

opredeljujejo koncentracije pri katerih so opazne signifikantne anomalije v občutljivosti

[32].

2.3.4 Natančnost

Natančnost opisuje sipanje posameznih meritev okoli povprečne vrednosti [17]. Običajno jo

izrazimo s standardnim odmikom (s) ali relativnim standardnim odmikom (RSD), ki ju

izračunamo s pomočjo enačbe 2.3 in enačbe 2.4 [16, 26].

(2.3)

(2.4)

kjer je:

xi posamezna meritev

povprečje meritev.

2.3.5 Točnost

ICH definira točnost kot stopnjo ujemanja med pravo vrednostjo in rezultatom, ki ga

pridobimo z analizno metodo [28, 29]. Izrazimo jo kot % izkoristka med znano dodano

količino analizirane komponente (delovni standard) ter količino izračunano iz rezultatov

analize (enačba 2.5). Prav tako jo lahko podamo kot % odstopanja dobljenega od dodane

vrednosti (enačba 2.6) [16].

(2.5)

(2.6)

2.3.6 Meja zaznavnosti (LOD)

Mejo zaznavnosti (LOD) definiramo kot najnižjo koncentracijo analita, katero lahko

zaznamo, ni pa je vedno možno kvantitativno ovrednotiti [28, 29]. Pri kromatografiji LOD

predstavlja tisto koncentracijo analita, kjer je višina vrha 2 ali 3- krat večja od šuma bazne

linije [29, 30]. LOD lahko določimo tudi s pomočjo linearne regresije (enačba 2.7).

(2.7)

kjer je:

sy standardni odmik odseka linearne regresijske premice

b1 naklon linearne regresijske premice [28].


8

2.3.7 Meja določljivosti (LOQ)

Mejo določljivosti (LOQ) predstavlja najnižja koncentracija analita, katero še določimo z

zadovoljivo točnostjo ter natančnostjo [26]. LOQ lahko prav tako kot LOD določamo z

vizualno metodo, s pomočjo razmerja signal/šum ali z linearno regresijo. Tipično razmerje

med signalom in šumom mora biti 10:1, da dana koncentracija analita ustreza LOQ

vrednosti. LOQ lahko izrazimo z enačbo 2.8 [27, 28].

(2.8)

2.3.8 Občutljivost

Občutljivost analizne metode je sposobnost metode, da razloči majhne razlike v

koncentraciji ali masi testiranega analita. Določa jo naklon umeritvene krivulje [29].

2.3.9 Robustnost

Robustnost metode je definirana kot sposobnost metode, da ohranja kakovost rezultatov

pridobljenih pri majhnih spremembah parametrov, ki jih meritvam namerno vnašamo [28,

32]. Robustnost preverjamo zato, da ugotovimo kakšen je vpliv majhnih sprememb

parametrov na rezultat analize. Glavni parametri, ki jih spreminjamo pri tekočinski

kromatografiji so sestava mobilne faze, pH mobilne faze, temperatura kolone, pretok

mobilne faze, uporaba kolon različnih proizvajalcev, [27] volumen injiciranja in valovna

dolžina [29]. Tipičen parameter za preverjanje robustnosti metode je tudi stabilnost raztopin

[27].


9

2.4 Elektropredenje Elektropredenje je metoda, pri kateri uporabljamo elektrostatske sile za oblikovanje

neskončnih vlaken iz polimernih raztopin. Premer proizvedenih vlaken je med deset

nanometri in nekaj mikrometri, hkrati pa imajo nastala vlakna izjemno veliko aktivno

površino na enoto mase (pri premeru 100 nm je površina vlaken 40 m2/g) [4]. Pomembne

lastnosti izpredenih vlaken so tudi visoka poroznost, visoka prepustnost plinov in majhna

velikost por med vlakni [33].

Elektropredenje je stara tehnika, ki jo je leta 1897 prvi razvil Rayleigh, leta 1934 pa je

Formhals patentiral prvi instrument za proizvodnjo tekstilne preje z uporabo elektrostatičnih

sil. V zadnjih letih je postal ta postopek zelo priljubljen, saj narašča število aplikacij, ki

temeljijo na elektropredenju. Priljubljenost te tehnike potrjuje tudi podatek, da več kot 200

univerz in raziskovalnih inštitutov po svetu proučuje različne dejavnike postopka

elektropredenja [34].

Z elektropredenjem lahko izdelamo nanovlakna iz naravnih ali sintetičnih polimerov in

njihovih mešanic, iz polimerov z vključenimi različnimi nanodelci (kovinskimi, keramičnimi

delci…) ali z vključenimi zdravilnimi učinkovinami. Ta postopek je postal zelo pomemben

del raziskav na številnih področjih uporabe tehničnih tekstilij, kot so zaščitni materiali,

zračni in oljni filtri za avtomobilsko industrijo in agrotekstilije [4]. Postopek elektropredenja

je pomemben predvsem na področju elektronike in medicine, predvsem za proizvodnjo

edinstvenih transplantatov in skeletnega tkiva [35]. Številne študije so pokazale uspešno

uporabo izpredenih vlaken za nadomestitev različnih tkiv, vključno s kožo, kostmi,

hrustanca, krvnih žil in živčnega tkiva [36]. Metoda je uporabna za izdelavo materialov za

baterije in fotovoltaične celice, [4] nanovlakna, proizvedena z metodo elektropredenja, so

pomembna tudi na področju dostave zdravil, biosenzorjev, encimske imobilizacije,

afinitetnih membran in kozmetike [33].

Slika 2-2 prikazuje shemo aparature za elektropredenje [34]. Aparatura je sestavljena iz treh

glavnih komponent: vir visoke napetosti, predilna šoba (npr. konica igle) in ozemljena

zbiralna površina (kovinski zaslon, vrtljivo vreteno) [3, 34]. Postopek elektropredenja se

izvaja pri atmosferskem tlaku ter sobni temperaturi [4]. Poznamo horizontalno in vertikalno

postavitev aparature [3, 34].

Osnovni princip elektropredenja je uporaba visoke napetosti (15-25 kV) na polimerni

raztopini ali talini, z namenom, da se premaga površinska napetost polimera in se vzpodbudi

nastanek curka [3]. Postopek elektropredenja je sestavljen iz treh stopenj: sprožitev curka,

podaljševanje curka ter cepljenje curka, ki mu sledi strjevanje curka v nanovlakna. Koničasta

površina, imenovana Taylorjev stožec, s kotom 49, 3°, se tvori, ko kapljico podvržemo

zunanjemu električnemu polju. Slika 2-3 prikazuje oblikovanje Taylorjevega stožca [4].

Zaradi električnega polja se naboj inducira na površini kapljice. Ta naboj izravna sile

površinske napetosti in kapljica spremeni obliko iz sferične v stožčasto. Ko jakost

električnega polja (V) doseže določeno kritično vrednost (VC), elektrostatske sile premagajo

površinsko napetost polimerne raztopine in sila izvrže iz konice Taylorjevega stožca curek

kapljevine. Najvišja gostota naboja je prisotna v konici stožca, od koder se začne tvoriti

curek [4, 37].


10

Slika 2-2: Shematski prikaz aparature za elektropredenje

Slika 2-3: Oblikovanje Taylorjevega stožca

Curek je stabilen samo v predilni šobi, medtem ko v električnem polju ni stabilen [34, 38].

Kadar curek pospešeno potuje skozi atmosfero proti zbiralni površini, nanj vpliva upogibna

nestabilnost [39]. Curek se začne cepiti, to pa se zgodi takrat, kadar pride do sprememb v

obliki in naboju zaradi raztezanja curka in izhlapevanja topila. To povzroči neravnovesje

med električnimi silami in površinsko napetostjo, zaradi česar postane curek nestabilen [37].

Hohman s sodelavci in Shin s sodelavci sta dokazala obstoj treh tipov nestabilnosti. Prva je

Rayleighjeva nestabilnost, ki je osnosimetrična glede na središče curka in nastane zaradi

nasprotnih sil, katere delujejo na površino curka. [37, 38] Rayleighjeva nestabilnost se

pojavi, ko je uporabljena jakost električnega polja nizka, ali ko je viskoznost raztopine pod

optimalno vrednostjo [40]. Druga nestabilnost je osnosimetrična nestabilnost, tretja

nestabilnost je neosnosimetrična [37, 38]. Katera nestabilnost prevladuje je močno odvisno

od gostote površinskega naboja in polmera curka [4].


11

Poznamo dva tipa elektropredenja, igelno in brezigelno elektropredenje [38]. Glavne

prednosti in slabosti obeh vrst elektropredenja so prikazane v tabeli 2-1. Ena izmed slabosti

igelnega elektropredenja je nizka stopnja proizvodnje nanovlaken, ki je ponavadi pod 0,3 g/h

[38, 41]. Vsaka izpredilna šoba namreč vsakič generira le en curek. Enostaven način za

povečanje produktivnosti elektropredenja je povečanje števila igel, kar imenujemo tudi

multi-igelno elektropredenje [41].

Nedavno se je kot alternativa pojavilo brezigelno elektropredenje, katerega prednost je

proizvodnja nanovlaken v velikem obsegu (slika 2-4) [41]. Pri brezigelnem elektropredenju,

katerega shema je prikazana na sliki 2-5, se nanovlakna izpredejo neposredno z odprte

površine tekočine [4, 38, 41].

Ena izmed glavnih prednosti brezigelnega elektropredenja je, da se število in prostor, kjer se

bodo oblikovali curki, vzpostavi naravno v njihovih optimalnih položajih, curki pa so

porazdeljeni po površini elektrode z določeno periodičnostjo [4].

Tabela 2-1: Prednosti in slabosti igelnega in brezigelnega elektropredenja

Igelno elektropredenje Brezigelno elektropredenje

Prednosti Predilna raztopina s širokim

razponom viskoznosti

Enostavno vzdrževanje

Predenje pri relativno nizki

napetosti

Zagotavlja dovolj raztopine

Zbiralno površino je mogoče

namestiti v katerikoli smeri

glede na šobo

Izdelava vlaken z različnimi

konfiguracijami (npr.

multikomponentna, votla

vlakna)

Slabosti Interference električnega polja

med šobami

Potrebna je zelo visoka napetost

Težko vzdrževanje (čiščenje

šobe)

Težko ohranjanje konsistentne

viskoznosti raztopine zaradi

izhlapevanja topila

Težko ohraniti enotno stopnjo

napajanja skozi vsako odprtino


12

Slika 2-4: Oblikovanje nanovlaken s postopkom elektropredenja

Slika 2-5: Shema brezigelnega elektropredenja

2.4.1 Parametri, ki vplivajo na elektropredenje

Velikost, gostota in morfologija izpredenih vlaken je odvisna od različnih parametrov, ki jih

lahko razdelimo na :

parametri predilne raztopine (viskoznost, koncentracija, molekulska masa, površinska

napetost, prevodnost, dipolni moment, dielektrična trdnost),

procesni parametri (hitrost pretoka predilne raztopine, električna napetost, razdalja med

predilno šobo in zbiralno površino, oblika igle, geometrija in sestava zbiralne površine),

parametri delovnega okolja (temperatura, vlažnost, hitrost pretoka zraka) [3].

2.4.1.1 Parametri predilne raztopine

Lastnosti predilne raztopine vplivajo na zmogljivost predenja [36]. Koncentracija polimerne

raztopine določa ali se lahko predilna raztopina izprede v nanovlakna, hkrati pa ima

pomemben vpliv na morfologijo vlaken [33]. Koncentracija polimera v predilni raztopini je


13

ključnega pomena, saj koncentracija raztopine neposredno vpliva tako na viskoznost kot

površinsko napetost predilne raztopine [39]. Curek predilne raztopine s prenizko

koncentracijo polimera se bo pri potovanju do zbiralne površine, zaradi površinske napetosti,

razbil na kapljice, še preden bo dosegel zbiralno površino. Kadar pa ima predilna raztopina

previsoko koncentracijo, se zaradi visoke viskoznosti vlakna ne bodo tvorila, saj le-to

otežuje kontroliranje pretoka raztopine skozi kapilaro [36, 39]. Učinek viskoznosti deluje na

enak način kot koncentracija [3]. Raziskovalci so ugotovili, da povečanje koncentracije

predilne raztopine povzroči povečanje premera vlaken in njihove enakomernosti [33, 34].

Molekulska masa polimera ima pomemben vpliv na morfologijo vlaken in na reološke ter

električne lastnosti kot so: viskoznost, površinska napetost, prevodnost in dielektrična

trdnost. Ugotovljeno je bilo, da se pri prenizkih molekulskih masah uporabljenih polimerov

tvorijo kroglice namesto vlaken, medtem ko se pri visokih molekulskih masah polimerov

tvorijo vlakna z velikim premerom [4, 34].

Prevodnost raztopine v glavnem določa vrsta polimera, uporabljeno topilo in razpoložljivost

soli, ki lahko ionizirajo [34]. Proces elektropredenja zahteva prenos električnega naboja od

elektrode do predilnega curka, zato je minimalna električna prevodnost bistvena za tvorbo

nanovlaken [33]. Ugotovljeno je bilo, da se z naraščanjem električne prevodnosti raztopine

znatno zmanjša premer izpredenih nanovlaken. Rezultat nizke prevodnosti raztopine je

nezadosten raztezek curka z električno silo za proizvodnjo enotnih vlaken, opazimo pa lahko

tudi nastanek kroglic [34].

2.4.1.2 Procesni parametri

Električna napetost je kritičen parameter elektropredenja, saj zagotavlja površinski naboj

curka ter vpliva na premer nanovlaken [33]. V večini primerov visoka napetost povzroči

večje raztezanje raztopine zaradi večanja Coulombovih sil v curku, povzroča pa tudi

močnejše električno polje. Ti učinki vodijo do zmanjšanja premera vlaken in hitrega

izhlapevanja topila iz vlaken [34]. Visoka napetost lahko povzroči tudi nastanek kroglic [33].

Jakost električnega polja nadzira oblikovanje vlaken v premeru od nekaj mikronov do deset

nanometrov in lahko privede tudi do napak izpredenih vlaken (kroglice) ali celo do

neuspešnosti tvorbe curka [39].

Pretok predilne raztopine skozi predilno šobo je pomemben procesni parameter, saj vpliva na

hitrost curka in prenos raztopine, [34] hkrati pa vpliva na velikost, poroznost in obliko

vlaken [40]. Megelski s sodelavci je ugotovil, da se z naraščanjem hitrosti pretoka predilne

raztopine poveča velikost por in premer vlaken [39]. Nižji pretok predilne raztopine je bolj

zaželen, saj je tako dovolj časa, da topilo izhlapi [34]. Pri visokem pretoku predilne

raztopine pride do nastanka kapljic, saj se vlakna ne morejo popolnoma posušiti, preden

dosežejo zbiralno površino. Nepopolno sušenje vlaken vodi tudi do tvorbe sploščenih

vlaken, ki so podobna traku [39].

Razdalja med predilno šobo in zbiralno površino vpliva na morfologijo in premer vlaken.

Potrebna je minimalna razdalja, da imajo vlakna dovolj časa, da se posušijo preden dosežejo

zbiralno površino. Kadar je razdalja prekratka ali predolga, se lahko tvorijo kapljice [4, 34].

Pomemben parameter, ki vpliva na morfologijo vlaken, je tudi sestava in geometrija zbiralne

površine [3]. Zbiralna površina služi kot prevodni substrat, kjer se zbirajo nanovlakna [34].

Pogosto uporabljene zbiralne površine so aluminijasta folija, prevoden papir, prevodna krpa,

žična mreža, rotirajoči cilinder, netopne tekočine kot so metanol, amonijev hidroksid, itd.

[3]. Vrsta zbiralne površine (rotirajoči disk ali boben) in njena hitrost vrtenja vplivata na

morfologijo kristalov in orientacijo molekul. Uporaba rotirajočih zbiralnih površin z visoko

hitrostjo povzroči hitrejše izhlapevanje topila kot uporaba stacionarnih zbiralnih površin

[40].


14

2.4.1.3 Parametri delovnega okolja

Najbolj pogosto spremljan parameter delovnega okolja je temperatura, predvsem zaradi

njenega vpliva na hitrost izhlapevanja topila ter vpliva na viskoznost raztopine [42]. Pri

proučevanju vpliva temperature (od 25 do 60 °C) na elektropredenje vlaken poliamida-6 je

bilo ugotovljeno, da se s povišanjem temperature zmanjša premer vlaken, kar so pripisali

zmanjšanju viskoznosti polimerne raztopine. Obstaja torej obratno sorazmerje med

temperaturo in viskoznostjo raztopine [34]. Drugi pomemben parameter delovnega okolja je

relativna vlažnost. Učinek relativne vlažnosti na morfologijo izpredenih nanovlaken je

odvisen od sestave polimera. Kadar izpredamo nanovlakna iz hidrofobnega polimera pri

visokih relativnih vlažnostih, je opazna tvorba poroznih nanovlaken. Pelipenko J. s sodelavci

je proučeval vpliv relativne vlažnosti na morfologijo vlaken. Ugotovili so, da nižje relativne

vlažnosti povzročijo hitro izhlapevanje topila, rezultat česar so debelejša nanovlakan,

medtem ko je pri višji relativni vlažnosti izhlapevanje topila počasnejše, dobimo pa tanjša

nanovlakna [42].

2.4.2 Karakterizacija izpredenih vlaken

Tako kot izdelava enakomernih in kontroliranih nanovlaken, predstavlja tudi karakterizacija

le-teh eno izmed težjih nalog. Fizikalna karakterizacija izpredenih vlaken je povezana s

strukturo in morfologijo vzorca. Geometrijske lastnosti vlaken vključujejo premer,

orientacijo in morfologijo vlaken. Za določanje geometrijskih lastnosti se pogosto

uporabljajo vrstični elektronski mikroskop (SEM), transmisijski elektronski mikroskop

(TEM), vrstični elektronski mikroskop s poljsko emisijo (FESEM) in mikroskopija na

atomsko silo (AFM). Za kemijsko karakterizacijo nanovlaken (molekulska struktura) se

uporabljajo infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FTIR), jedrska magnetna

resonanca (NMR), diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC), cirkularni dikroizem (CD),

rentgenska praškovna difrakcija (XRD) in rentgensko sipanje (SWAXS) [33, 34]. Površinske

lastnosti nanovlaken lahko ovrednotimo po njihovi hidrofilnosti, ki se lahko določi z

merilnikom stičnega kota ter z rentgensko fluorescenčno spektroskopijo (XPS). Poroznost in

velikost por se lahko meri z živosrebrno porozimetrijo, mehanske lastnosti pa določajo z

AFM in sistemi za testiranje nano nateznosti [34].


15

2.5 Celulozni acetat Celulozni acetat (CA) je pomemben ester celuloze, ki ga pridobimo pri reakciji celuloze z

ocetno kislino in njenim anhidridom v prisotnosti žveplove kisline, ki služi kot katalizator

(slika 2-6) [43]. Zlahka se lahko oblikuje v filme, membrane in vlakna. Zaradi relativno

nizke cene, dostopnosti in dobre hidrolitske stabilnosti se pogosto uporablja v polprepustnih

membranah za separacijske procese ter v biomedicinskih aplikacijah [44]. Uporablja se tudi

za antimikrobne membrane, biosenzorske trakove, filme za čiščenje vode, [45] v fotografiji

in kot sestavni del lepila [46]. CA v obliki elektropredenih vlaken ponuja različne možne

aplikacije zaradi ugodnih lastnosti kot so biokompatibilnost, biorazgradljivost, regenerativne

lastnosti, visoka afiniteta z drugimi snovmi, visok modul in ustrezna upogibna in natezna

trdnost [45]. Topnost CA je med drugim odvisna tudi od stopnje substitucije (DS). CA z DS

med 2 in 2,5 je topen v acetonu, dioksanu in metil acetatu, medtem ko so višje acetilirane

vrste topne v diklorometanu. Prav tako je tudi ocetna kislina dobro topilo za CA z DS višjo

od 0,8 [43].

Slika 2-6: Strukturna formula celuloznega acetata


16

2.6 Lokalni anestetiki Učinkovine, ki zavirajo nastajanje in širjenje impulzov v živčnih vlaknih, imenujemo lokalni

anestetiki (LA) [47]. Uporabljajo se lokalno, njihova naloga je, da odpravijo občutek

bolečine na omejenem delu telesa, ne da bi pri tem povzročile nezavest. Eden izmed glavnih

mehanizmov delovanja LA je:

inhibicija napetostnih Na+ kanalov na živčnih membranah,

onemogočanje nastanka ter širjenja akcijskega potenciala [48].

LA delujejo tako, da zavirajo odpiranje Na+ kanalov v membrani živca in tako preprečijo

potovanje Na+ ionov v notranjost celice. Posledica tega je dvig vzdražnega praga

električnega vzburjenja, upočasnitev širjenja impulzov, zmanjšanje stopnje povečanja

akcijskega potenciala, kadar pa je koncentracija učinkovine dovolj velika, povzroči popolno

blokado prevajanja impulzov [47].

LA se med sabo razlikujejo v strukturi in farmakoloških značilnostih [47]. Vsi LA imajo v

svoji kemijski zgradbi amino skupino, ki je povezana z aromatskim obročem (amino skupina

je hidrofilna, aromatska pa lipofilna). Poznamo amidne in estrske LA. Pri amidnih LA je

aromatska struktura povezana z vmesno verigo preko amidne vezi, pri estrskih LA pa preko

estrske vezi. Estrski LA se presnavljajo v plazmi s pomočjo encimov psevdoholinesteraz,

medtem ko se amidni LA presnavljajo v jetrih [47, 49]. Za estrske LA je značilno, da niso

obstojni v obliki raztopin [49] ter da pogosteje povzročajo alergične reakcije [47]. Amidni

LA pa so zelo obstojni v raztopinah [49].

Anestetična aktivnost LA je primarno določena z njihovimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi,

kot so vezava na beljakovine, pKa in topnost v maščobah. LA z večjo sposobnostjo vezave

na beljakovine imajo daljši učinek, na trajanje učinka LA pa vplivajo tudi njihovi periferni

učinki na ožilje. LA, ki so bolj topni v maščobah, hitreje prehajajo skozi membrano vlakna

in povzročajo močnejše blokade. Anestetične lastnosti LA se lahko oblikujejo z mestom

vbrizgavanja, odmerjanjem, alkalizacijo, dodatki in z mešanjem LA, na anestetične lastnosti

pa vpliva tudi stanje bolnika [47].

LA imajo precej neželenih učinkov na kardiovaskularni sistem (zmanjšana prevodnost in

kontrakcija srca) in centralni živčni sistem (zaspanost, vrtoglavica, slabost) [48]. Glavni

neželeni učinek LA so alergične reakcije, ki so povezane z estrskimi LA in presnovkom

para-aminobenzojske kisline (PABA) [47]. Neželen učinek LA je tudi sistemska toksičnost,

katere znaki so prizadetost osrednjega živčevja, prizadene pa lahko tudi obtočila [48].


17

2.6.1 Benzokain

Benzokain ali etil p-aminobenzoat (slika 2-7) je lokalni anestetik estrskega tipa, ki se

pogosto uporablja v topikalnih pripravkih [50], kot komponenta pastil za zdravljenje

bolečega grla, krem, gelov ali tekočin za lajšanje zobobola ali razdražene kože, kot lokalni

anestetik za endoskopske operacije itd. [51]. Najdemo ga tudi v antihemeroidnih kremah, v

različnih proizvodih, ki zmanjšujejo bolečino, srbenje ali pekoč občutek, ki je povezan z

odrgninami, piki žuželk ali razjedami nog [52].

Slika 2-7: Strukturna formula benzokaina

Njegovo delovanje je hitro in kratkotrajno [53]. Benzokain reverzibilno zmanjšuje

prepustnost nevronske membrane za natrijeve ione ter blokira prevajanje živčnih impulzov.

Njegova struktura povzroča hiter transmukozalni in v manjši meri tudi transdermalni

transport. [51] Je bel kristaliničen prah, brez vonja in rahlo grenkega okusa. Dobro je topen v

kloroformu, etru in etanolu, v vodi pa je zelo slabo topen [54]. Tališče benzokaina je pri 88-

90 °C, medtem ko je temperatura vrelišča okoli 310 °C. Gostota benzokaina je 1,17 g/cm3. Je

etilni ester PABA, pripravimo ga lahko iz PABA in etanola s Fischerjevo esterifikacijo ali z

redukcijo etil para-nitrobenzoata [55]. Slika 2-8 prikazuje sintezo benzokaina, ki se prične iz

para-aminotoluena [54]. Po zaščiti amino skupine z acetiliranjem se nastali para-

acetamidotoluen oksidira s kalijevim permanganatom v para-acetamidobenzojsko kislino. V

naslednji stopnji se odstrani acetilna skupina, nastala PABA pa se zaestri z etanolom [53].

Slika 2-8: Sinteza benzokaina


18

Kljub temu, da ima benzokain nizko stopnjo toksičnosti, ni povsem neškodljiv [53].

Prekomerna uporaba benzokaina namreč lahko poveča tveganje za pljučno aspiracijo in

metemoglobinemijo, motnjo, pri kateri je količina kisika, ki ga nosi kri, močno zmanjšana.

Vendar je ta neželen učinek najpogostejši pri otrocih, mlajših od dveh let [55]. Benzokain

lahko povzroča tudi alergijske reakcije, višji odmerki včasih povzročijo sistemsko

toksičnost, ki se odraža z razdraženostjo, sledi pa ji depresija centralnega živčnega sistema

[54].

Benzokain se pogosto pojavlja v kompleksnih matricah, kar ponavadi zahteva uporabo

separacijskih metod za njegovo določitev. Najpogosteje je uporabljena HPLC metoda na

reverzni fazi s spektrofotometrično detekcijo. Benzokain so določali tudi s HPLC in

pretočno injekcijsko analizo (FIA) z amperometrično detekcijo [51]. Reddy T. M. s

sodelavci je poročal o določanju benzokaina v vzorcih človeškega urina s pomočjo

diferencialne pulzne adsorptivne striping voltametrije (DPAdSV) in uporabo elektrode iz

steklastega ogljika, modificirane z nafionom [56].


19

2.7 Karakterizacijske metode

2.7.1 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM)

Eden izmed najpomembnejših in najpogosteje uporabljenih instrumentov za karakterizacijo

materialov je vrstični elektronski mikroskop (SEM) [57]. S SEM lahko ocenimo debelino

plasti in velikost zrn v plasteh ter na površini vzorcev, določimo lahko tudi število plasti v

večplastnih strukturah [58]. Številne prednosti so spodbudile uporabo vrstične elektronske

mikroskopije tako za organske kot tudi za anorganske vzorce. Te prednosti so preprosta

priprava vzorcev, široko območje povečav z odlično globinsko ostrino in dobro ločljivostjo,

raznovrstni signali in enostavna tvorba slike ter interpretacija rezultatov [57]. Glavne

komponente SEM so elektronska puška, elektronske leče, detektor elektronov in vakuumska

enota. Elektronski curek nastane v SEM s termično ali poljsko emisijo, nato pa se z uporabo

elektromagnetnih polj fokusira na vzorec. Kondenzorske in objektivne leče zmanjšajo

premer osnovnega curka, ki je pospešen skozi elektronsko puško v komoro mikroskopa na

vzorec. Glavna naloga zaslonk je, da zmanjšajo ali povečajo premer elektronskega curka.

Boljšo ločljivost dobimo, če uporabimo manjši premer curka ali če zmanjšamo delovno

razdaljo [57]. Vakuumska enota zagotavlja v komori nizke tlake, od 0, 0001 do 0, 00001 Pa

[59]. Pred dobrimi dvajsetimi leti je šel napredek vrstičnih elektronskih mikroskopov v smeri

višanja tlaka oziroma zmanjšanje vakuuma v komori. Višji tlak in dodani plin v komori

ustvarita pogoje, kjer na preiskovani površini vzorca ni presežka elektronov oziroma se

površina sproti razelektri. Tako lahko opazujemo mastne ali mokre vzorce ter celo živa bitja.

Opazujemo lahko tudi in-situ procese, kot so segrevanje in žarjenje pri visokih temperaturah,

kristalizacijo, taljenje, strjevanje, korozijo itd. Prednost teh mikroskopov je, da ni potrebna

posebna pred-priprava površine vzorcev [57].

2.7.2 Infrardeča spektroskopija (IR)

Infrardeča spektroskopija (IR) je ena izmed pomembnejših spektroskopskih tehnik za

določanje organskih in anorganskih komponent. Glavni cilj IR analize je določitev kemijskih

funkcionalnih skupin v vzorcu. Različne funkcionalne skupine absorbirajo karakteristične

frekvence IR sevanja. Zaradi uporabe različnih pripomočkov za vzorčenje lahko z IR

analiziramo tekoče, trdne in plinaste vzorce. IR spektroskopija je pomembna in priljubljena

tehnika za identifikacijo spojin ter pojasnitev strukture [60]. Glavna prednost

spektroskopskih metod pred drugimi metodami je v tem, da za analizo porabimo majhno

količino vzorca (< 10 mg) ter da spojine pri večini spektroskopskih metod ne izgubimo. Vse

spektroskopske metode temeljijo na interakciji med elektromagnetnim valovanjem (energijo)

in karakterističnimi strukturnimi elementi spojine. Pri IR spektroskopiji obsevamo vzorec z

infrardečo svetlobo (λ > 750 nm), energijo pa opišemo z valovnim številom ν, katerega

izračun prikazuje enačba 2.9.

(2.9)

kjer je:

λ valovna dolžina (nm)

ν valovno število (cm-1

) [61].

Najbolj pogosto uporabljeno območje valovnih števil je med 600 in 4000 cm-1

. IR spekter je

zapis absorpcije oz. prepustnosti IR svetlobe v določenem območju frekvenc, pri čemer vsak

absorpcijski trak ustreza deformaciji določene vezi in je značilen za posamezno vez. IR


20

spekter je prikazan kot količina absorbirane IR svetlobe v odvisnosti od valovne dolžine IR

svetlobe ali valovnega števila [62].

Prehod IR svetlobe skozi vzorec povzroči nihanja vezi, ki jih delimo na vzdolžna (valenčna)

nihanja (ang. stretching) in prečna (deformacijska) nihanja (ang. bending) [61]. Za pripravo

vzorcev uporabljamo nosilce, ki ne absorbirajo IR svetlobe (alkalijski halogenidi-KBr, NaCl,

KI). Trdne vzorce zmešamo s KBr in stisnemo v tableto, tekoče vzorce pa analiziramo v

obliki filma med dvema NaCl ploščicama [61-63].

Klasične IR spektrometre z dvojnim žarkom so zamenjali FTIR spektrometri (Fourier-

transform), pri katerih se žarek cepi. Del žarka se na zrcalu odbije, drugi del pa potuje skozi

vzorec in se nato odbije na zrcalu. Oba odbita žarka se združita, kot rezultat dobimo

interferogram, iz katerega, s Fourierjevo transformacijo, dobimo navaden spekter [63].

Glavne prednosti FTIR so kratek čas analize (meritve so opravljene v nekaj sekundah),

občutljivost, mehanska enostavnost (majhna možnost mehanske okvare) ter notranja

kalibracija (instrument se kalibrira sam) [64].

2.7.3 Določanje stičnega kota

Stični kot je kot θ, ki ga oklepa tangenta na gladino kapljevine ob stiku s trdno površino.

Odvisen je od medfaznih napetosti γl (med kapljevino in zrakom), γsl (med kapljevino in

trdno površino) in γs (med trdno površino in zrakom), kar prikazuje slika 2-9. Vsota vseh

površinskih sil, ki delujejo na stični kot je enaka 0, saj se rob kapljevine v vodoravni smeri

ne premika (enačba 2.10).

(2.10)

Ko je stični kot enak 0 °, se kapljevina razlije po površini, torej absolutno moči trdno

površino, če pa je kot enak 180 °, potem kapljevina ne moči trdne površine. O hidrofilnih

površinah (kapljevina moči trdno površino) govorimo takrat, ko je kot 0° < θ < 90 °, o

hidrofobni površini pa takrat, če je stični kot 90 ° < θ < 180 °. V primeru hidrofobnih površin

tekočina ne omoči trdne površine, ampak tekočina v kapljicah ostane na površini [65].

Slika 2-9: Ravnovesje sil, katerim je izpostavljena kapljica tekočine, ki jo nanesemo na trdno

površino


21

3 Eksperimentalni del

Eksperimentalni del magistrske naloge smo opravljali v Laboratoriju za obdelavo in

preskušanje polimernih materialov na Fakulteti za strojništvo Univerze v Mariboru, kjer smo

pripravljali vzorce, ter v Laboratoriju za analizno kemijo in industrijsko analizo na Fakulteti

za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Mariboru, kjer smo izvedli analize

pripravljenih vzorcev.

3.1 Materiali

3.1.1 Kemikalije

Pri eksperimentalnem delu smo uporabljali naslednje kemikalije:

Celulozni acetat (Mw= 30.000), proizvajalca Sigma Aldrich

Benzocainum micron., proizvajalca Galenski laboratorij, Lekarna Ljubljana

Benzokain, proizvajalca Sigma Aldrich

Fosfatni pufer s soljo- PBS, proizvajalca Sigma Aldrich

Ocetna kislina (≥ 99,85 %), proizvajalca Sigma Aldrich

Acetonitril, proizvajalca Sigma Aldrich

Metanol, proizvajalca Sigma Aldrich

Milli-Q voda

3.1.2 Steklovina in pribor

Uporabljali smo naslednjo steklovino:

Merilne polnilne pipete; 1 ml, 2 ml, 5 ml

Merilne bučke; 10 ml, 50 ml, 250 ml; A kvaliteta

Merilne čaše; 100 ml, 2000 ml

Merilni valj; 100 ml

Franz-ova difuzijska celica; 7,5 ml

PET membrana

Laboratorijska žlička

Steklena palčka

Magnetni mešalčki

Viale

Brizge, 3 ml (Henke Sass Wolf)

Igle, Φ= 0,9x40 mm (Henke Sass Wolf)

Filtri, velikost por: 0,45 µm, Φ=13 mm (Restek)

3.1.3 Aparature

Viskozimeter Smart Series (Fungilab)


22

Konduktometer (Mettler Toledo)

Fotogoniometer OCA35 Dataphysics

Tenziometer Krüss K12

FTIR spektrofotometer (Perkin Elmer)

Vrstični elektronski mikroskop (FE-SEM SUPRA 35 VP, Carl Zeiss)

Sušilnik (Memmert)

Elektronsko mešalo

Magnetno mešalo

Analitska tehtnica ALS 120-4N (Kern)

Naprava za elektropredenje NanoSpider NS LAB 500 (Elmarco)

Analitska tehtnica (Mettler Toledo)

Tekočinski kromatograf Varian ProStar, ZDA

Ultrazvočna kopel


23

3.2 Laboratorijske metode Eksperimentalni del je bil sestavljen iz dveh delov: (I) priprava vzorcev s postopkom

elektropredenja in (II) razvoj analizne metode za določanje benzokaina s HPLC.

3.2.1 Priprava nanovlaken iz celuloznega acetata s postopkom elektropredenja

3.2.1.1 Priprava raztopin za elektropredenje

Pripravili smo raztopine celuloznega acetata (CA) različnih koncentracij (12 ut. %, 15 ut. %,

17 ut. % in 20 ut. % CA) v različnih koncentracijah ocetne kisline (75, 80 in 85 vol. %

ocetna kislina). Za pripravo 50 g 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini smo v 100 ml čašo

zatehtali 8,5 g CA in dodali 85 % ocetno kislino do 50 g. Tako pripravljeno predilno

raztopino smo dobro premešali z elektronskim mešalom, dokler nismo dobili homogene

raztopine (2 h). Vsaki predilni raztopini smo izmerili viskoznost, prevodnost in površinsko

napetost.

Predilno raztopino z vključeno zdravilno učinkovino (benzokainom) smo pripravili po

enakem postopku, le da smo k 17 ut. % CA dodali še 5 % benzokaina glede na maso CA.

3.2.1.2 Optimizacija postopka elektropredenja

Postopek elektropredenja smo izvajali na instrumentu NanoSpider NS LAB 500

(proizvajalec ElMarco), ki je prikazan na sliki 3-1. Instrument omogoča brezigelno

elektropredenje, vlakna pa smo oblikovali z malo žično elektrodo. Postopek elektropredenja

smo izvedli tako, da smo v kad namestili elektrodo in jo do 2/3 dopolnili s predilno

raztopino. Kad smo namestili v aparaturo in pričeli izpredati vlakna. Med postopkom

elektropredenja smo spreminjali procesne parametre. Uporabljeno napetost smo spreminjali

od 60 do 75 kV, razdaljo med elektrodama pa smo spreminjali med 150 in 190 mm.

Nanovlakna, ki smo jih pridobili s postopkom elektropredenja, so prikazana na sliki 3-2.

Končni pogoji pri katerih smo izpredali vlakna so bili naslednji:

uporabljena napetost: 75 kV;

razdalja med elektrodama: 160 mm;

hitrost vrtenja elektrode: 3,8 rpm

čas izpredanja vlaken: 40 min.


24

Slika 3-1: Instrument za elektropredenje NanoSpider NS LAB 500

Slika 3-2: Izpredena nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini


25

3.2.1.3 Karakterizacija vlaken

Dobljena vlakna smo okarakterizirali s SEM in FTIR analizo, prav tako smo vlaknom s

pomočjo fotogoniometra določili stični kot.

SEM analiza

Morfološke lastnosti izpredenih vlaken smo proučevali z vrstičnim elektronskim

mikroskopom (FE-SEM SUPRA 35 VP, Carl Zeiss). Vzorce smo namestili na kovinske

nosilce s prevodnim ogljikovim trakom ter jih opazovali pri pospeševalni napetosti 1 kV in

delovni razdalji 4,5 mm.

FTIR analiza

Vzorce smo analizirali z uporabo Perkin Elmer FTIR System Spectrum GX (slika 3-3).

Spektri so bili merjeni pri valovnem številu med 650 in 4000 cm−1

z resolucijo 4 cm-1

ter 16

ponovitvami.

Slika 3-3: FTIR spektrometer Perkin Elmer FTIR System Spectrum GX

Stični kot

Stični kot smo določali s pomočjo fotogoniometra OCA35 Dataphysics (slika 3-4). Na

nosilno mizico goniometra smo postavili majhen vzorec vlaken ter določili primerno ostrino

slike. Nato smo na vzorec spustili kapljico destilirane vode ter s pomočjo programske

opreme označili obris kapljice in določili stični kot. Na vsakem vzorcu smo opravili vsaj 6

ponovitev, kot rezultat pa smo podali povprečno vrednost meritev.


26

Slika 3-4: Fotogoniometer OCA35 Dataphysics

3.2.1.4 Določanje stopnje nabrekanja in izgube mase

Za določitev stopnje nabrekanja smo uporabili gravimetrično metodo. Določeno količino

suhih vlaken (med 40 in 50 mg) smo zatehtali v mrežico ter jo za 24 h potopili v Milli Q

vodo. Po 24 h smo mrežico z vzorcem popivnali s papirjem, da smo odstranili površinsko

vodo, ter jo stehtali. Stopnjo nabrekanja smo izračunali po enačbi 3.1:

(3.1)

kjer je:

S stopnja nabrekanja (%)

we masa nabreklih vlaken (g)

wd masa suhih vlaken (g).

Nato smo mrežico z vlakni 3 h sušili v sušilniku pri 50 °C ter jo ponovno stehtali. Izgubo

mase smo izračunali po enačbi 3.2.

(3.2)

kjer je:

wd masa suhih vlaken (g)

w1 masa suhih vlaken po 24 h nabrekanju (g).


27

3.2.2 Sproščanje benzokaina v Franz-ovi difuzijski celici

Sproščanje benzokaina smo izvajali v treh Franz-ovih difuzijskih celicah z volumnom 7,5 ml

(slika 3-5). Najprej smo v celice vstavili magnetni mešalček, nato smo med receptorski in

donorski del celic namestili PET membrano in 10 plasti nanovlaken s premerom 2,2 cm.

Celice smo sestavili, jih ovili s parafilmom ter jih položili v vodno kopel s 37 °C. V celice

smo dodali 7,5 ml 0,01 M PBS in jih dobro zatesnili. 1 ml vzorca smo iz celic jemali na 5,

10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 1440 in 2880 min. Po vsakem odvzemu 1 ml

vzorca iz celice smo v celico dodali 1 ml 0,01 M PBS, tako, da je bil volumen sproščanja ves

čas enak. Odvzete vzorce smo prefiltrirali in shranili v hladilniku do HPLC analize.

Slika 3-5: Franz-ova difuzijska celica

3.2.3 Razvoj analizne metode na HPLC sistemu

3.2.3.1 Priprava in izbira najprimernejše mobilne faze

Po pregledu literature smo kot začetno mobilno fazo uporabili acetonitril in vodo v

volumskem razmerju 50:50. Kot mobilni fazi smo uporabili tudi metanol:voda (60:40) ter

10 mM KH2PO4:metanol v razmerju 25:75 (pH= 3,20). Za optimalno mobilno fazo smo

izbrali acetonitril:voda (60:40).

1000 ml mobilne faze (acetonitril:voda= 60:40) smo pripravili tako, da smo v merilnem

valju odmerili 600 ml acetonitrila, ga prelili v reagenčno steklenico ter dodali 400 ml Milli-

Q vode. Pripravljeno mobilno fazo smo razplinili z uporabo ultrazvočne kopeli.

3.2.3.2 Priprava topila

Kot topilo smo uporabljali fosfatni pufer s soljo (PBS). 0,01M PBS smo pripravili tako, da

smo 1 tableto PBS raztopili v 200 ml Milli-Q vode.

3.2.3.3 Priprava standardnih raztopin

Osnovno standardno raztopino benzokaina s koncentracijo 100 mg/l smo pripravili tako, da

smo v 50 ml bučko zatehtali 5 mg benzokaina ter dopolnili z 0,01 M PBS do oznake. Iz

osnovne raztopine smo z ustreznim redčenjem pripravili standardne raztopine s

koncentracijami 5 mg/l, 10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l in 50 mg/l. Za pripravo


28

standardne raztopine benzokaina s koncentracijo 5 mg/l smo v 10 ml bučko odpipetirali 0, 5

ml osnovne raztopine benzokaina ter dopolnili z 0,01 M PBS do oznake. Ostale standardne

raztopine benzokaina smo pripravili po enakem postopku, odpipetirani volumni osnovne

raztopine benzokaina pa so zapisani v tabeli 3-1. Pred injiciranjem v HPLC sistem smo

standardne raztopine benzokaina prefiltrirali s filtrom (0,45 µm).

Tabela 3-1: Odpipetirani volumni osnovne standardne raztopine benzokaina za pripravo standardnih

raztopin benzokaina za umeritveno krivuljo

Koncentracija standardne

raztopine benzokaina (mg/l)

Volumen odpipetirane osnovne

standardne raztopine

benzokaina s koncentracijo 100

mg/l (ml)

Volumen bučke (ml)

5 0,5 10

10 1 10

20 2 10

30 3 10

40 4 10

50 5 10

3.2.3.4 Kromatografska analiza

Benzokain smo določali z uporabo tekočinskega kromatografa Varian ProStar, ki je prikazan

na sliki 3-6. Pred pričetkom analiz smo sistem 1 h spirali z uporabljeno mobilno fazo.

Najprej smo injicirali standardne raztopine, nato pa vzorce. S pomočjo programa Star

Chromatograph Workstation smo iz dobljenih kromatogramov zbrali podatke o ustreznosti

kromatografskega sistema ter določili ploščine pod kromatografskimi vrhovi.

Izbrani kromatografski pogoji za določanje benzokaina so prikazani v tabeli 3-2.

Tabela 3-2: Kromatografski pogoji za določanje benzokaina

Kolona Supelcosil LC-18, 3µm, 20 cm x 4,6 cm

Mobilna faza Acetonitril:voda= 60:40

Pretok mobilne faze 0,8 ml/min

Detekcija UV-VIS, 285 nm

Volumen injiciranja 10 µl

Temperatura kolone 30 °C

Temperatura avtomatskega vzorčevalnika 8 °C

Čas analize 6 min


29

Slika 3-6: Tekočinski kromatograf Varian ProStar


30

4 Rezultati in diskusija

4.1 Priprava nanovlaken iz celuloznega acetata s postopkom elektropredenja

4.1.1 Optimizacija postopka elektropredenja

Postopek izdelave nanovlaken iz celuloznega acetata (CA) smo optimizirali glede na

lastnosti predilne raztopine in procesnih parametrov elektropredenja. Glede optimizacije

predilne raztopine smo spreminjali koncentracijo CA in delež uporabljenega topila (ocetna

kislina). Vlakna smo poskušali oblikovati iz 12, 15, 17 in 20 ut. % CA, ki smo ga raztapljali

v 75, 80 in 85 % ocetni kislini. Vsaki izmed raztopin smo izmerili viskoznost in prevodnost,

katerih vrednosti so prikazane na sliki 4-1. Iz rezultatov je razvidno, da se z višanjem

koncentracije CA viša viskoznost raztopin. Vrednosti za viskoznost se pri posamezni

koncentraciji CA v odvisnosti od deleža ocetne kisline bistveno ne razlikujejo.

Pri merjenju viskoznosti pripravljenih raztopin smo ugotovili, da prihaja do spremembe v

odvisnosti od časa. Če smo raztopini izmerili viskoznost kmalu po končanem dvournem

mešanju, smo dobili nižje viskoznosti kot če smo raztopini viskoznost izmerili po daljšem

času. Viskoznost je namreč odvisna od temperature, ta pa se pri povišani temperaturi zniža.

V našem primeru se je raztopina ob konstantnem mešanju segrela in posledično se je

raztopini znižala viskoznost. Vrednosti viskoznosti, ki so prikazane na sliki 4-1, so bile

izmerjene takoj po končanem mešanju, saj smo iz teh raztopin neposredno po pripravi

izpredali nanovlakna in je zato ta vrednost najbolj relevantna.

Podatek o viskoznosti nam je podal informacijo o tem ali je predilna raztopina primerna za

elektropredenje ali ne. Če je predilna raztopina preveč viskozna, iz nje ne moremo izpredati

nanovlaken. V našem primeru nanovlaken nismo mogli izpredati iz 20 ut. % CA,

raztopljenega v 75, 80 in 85 % ocetni kislini. Viskoznosti so pri vseh treh deležih ocetne

kisline previsoke, gibljejo se med 16325 in 18218 mPas. Vlakna se niso tvorila, saj

previsoka viskoznost povzroča sušenje polimerne raztopine na žični elektrodi in hkrati

preprečuje tvorbo finih filamentov iz polimerne raztopine.

V nasprotju z viskoznostjo pa prevodnost raztopin z višjim deležem ocetne kisline pada.

Ugotovili smo, da koncentracija CA ne vpliva na prevodnost, saj se vrednosti prevodnosti pri

posameznem deležu ocetne kisline v odvisnosti od koncentracije CA bistveno ne razlikujejo.

Padec prevodnosti je posledica disociacije ocetne kisline, ki je otežena pri nižjem deležu

vode, zaradi česar se posledično zmanjša gostota naboja v raztopinah CA.


31

Slika 4-1: Vrednosti prevodnosti in viskoznosti predilnih raztopin

4.1.1.1 Vpliv procesnih parametrov na elektropredenje

Iz pripravljenih in okarakteriziranih predilnih raztopin smo nanovlakna izpredali pri različnih

razdaljah med elektrodama ter pri različnih napetostih. Razdaljo med elektrodama smo

spreminjali med 150 in 190 mm, uporabljeno napetost pa smo variirali med 60 in 75 kV.

Med izpredanjem nanovlaken smo spremljali tudi vrednosti električnega toka. Ugotovili

smo, da je bil električni tok med izpredanjem vlaken precej nizek, gibal se je med 0,02 in 0,1

mA. Jakost električnega toka je bila odvisna od uporabljene napetosti in razdalje med

elektrodama. Najvišje vrednosti električnega toka smo dosegli pri najvišji uporabljeni

napetosti. Pri odločitvi za optimalne pogoje elektropredenja smo upoštevali tudi vrednost

električnega toka, ki je morala biti čim višja, da so se vlakna lepo in enakomerno izpredala.

Ker smo najvišje vrednosti električnega toka dosegli pri najvišji uporabljeni napetosti- 75

kV, smo za optimalno uporabljeno napetost izbrali 75 kV.

Instrument za elektropredenje ElMarco NanoSpider NS LAB 500 omogoča spreminjanje

razdalje med 100 in 200 mm, mi pa smo razdaljo variirali med 150 in 190 mm zato, ker je to

območje najprimernejše za elektropredenje z organskimi topili. Pomembno je, da izberemo

primerno razdaljo med elektrodama, da se vlakna posušijo, preden se odložijo na zbiralno

površino. Ugotovili smo, da sprememba razdalje med elektrodama bistveno ne vpliva na

morfologijo vlaken, vpliva pa na jakost električnega toka ter na zmožnost tvorbe vlaken.

Npr. pri 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini smo opazili, da se pri posamezni napetosti z

večanjem razdalje med elektrodama jakost električnega toka niža, kar posledično vpliva na

nezmožnost tvorbe vlaken pri nižjih vrednostih uporabljene napetosti (60 in 65 kV). Kot

optimalno razdaljo med elektrodama smo izbrali 160 mm, saj smo v tem primeru dosegli

najvišje vrednosti električnega toka ter enakomerno porazdelitev vlaken.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0

20

40

60

80

100

120

140

Vis

kozn

ost

(m

PaS

)

Pre

vod

no

st (

μS/

cm)

Viskoznost (mPas)

Prevodnost (µS/cm)

75 % 80 % 85 % 75 % 80 % 85 % 75 % 80 % 85 % 75 % 80 % 85 % ocetna kislina ocetna kislina ocetna kislina ocetna kislina

12 ut. %CA 15 ut. % CA 17 ut. % CA 20 ut. % CA


32

4.1.1.2 Vpliv koncentracije polimerne raztopine na elektropredenje

Slike 4-2, 4-3 in 4-4 prikazujejo SEM posnetke izpredenih nanovlaken iz 12, 15 in 17 ut. %

CA v 85 % ocetni kislini pri 75 kV, razdalja med elektrodama pa je znašala 150 mm. Iz SEM

posnetkov je opazno, da se z višanjem koncentracije CA tvorijo vlakna. Pri 12 ut. % CA

opazimo, da so se poleg vlaken tvorile še sfere. Razlog temu je neustrezna koncentracija in

viskoznost predilne raztopine, kar je vodilo do nastanka elektro pršenja. Ko je koncentracija

predilne raztopine prenizka, polimerni curki, zaradi površinske napetosti, razpadejo na

kapljice, še preden dosežejo zbiralno površino [36]. Opazimo, da se z višanjem koncentracije

CA zmanjšuje število kroglic, posledično pa se zaradi višje viskoznosti polimerne raztopine

tvorijo vlakna z večjim premerom. Pri 15 ut. % CA je opazno zmanjšanje števila nastalih

kroglic, te pa so pri 17 ut. % CA popolnoma izginile in se je tvorila samo vlaknasta

struktura. Za optimalno predilno raztopino smo določili 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini,

saj so se pri teh pogojih tvorila samo vlakna.

Slika 4-2: 12 ut. % CA v 85 % ocetni kislini


33



4.1.1.3 Vpliv deleža ocetne kisline na elektropredenje

Delež ocetne kisline je vplival na potek elektropredenja in na morfologijo vlaken. Pri 17 ut.

% CA se vlakna niso izpredala v 75 % ocetni kislini, medtem ko so se v 80 in 85 % ocetni

kislin izpredala. Ugotovili smo, da sprememba deleža ocetne kisline pri 17 ut. % CA

bistveno ne vpliva na morfologijo vlaken, saj smo v obeh primerih dobili vlakna z gladko

površino. Pri 12 ut. % CA sprememba deleža ocetne kisline prav tako ne vpliva na

morfologijo vlaken, saj so se pri vseh treh deležih ocetne kisline poleg vlaken tvorile še

kroglice. Precejšnji vpliv spremembe deleža ocetne kisline smo opazili pri 15 ut. % CA, kar

prikazujejo slike 4-5, 4-6 in 4-7. Opazimo, da se z višanjem deleža ocetne kisline zmanjšuje

prisotnost kroglic in se tvorijo le vlakna.


34




35


4.1.1.4 Priprava nanovlaken z vključeno zdravilno učinkovino

Ko smo določili optimalno predilno raztopino, smo vanjo zamešali določeno količino

zdravilne učinkovine (benzokaina). Z namenom, da bi pripravili nanovlakna s čim višjim

deležem benzokaina, smo predilni raztopini dodali 10 % benzokaina (glede na maso CA). Ta

delež benzokaina je bil previsok, kar je posledično vplivalo na elektropredenje, saj se vlakna

niso izpredala. Nato smo delež benzokaina zmanjšali na 5 % (glede na maso CA), v tem

primeru pa so se vlakna lepo izpredala.

Opazili smo, da dodatek benzokaina vpliva na postopek elektropredenja, saj smo po enakem

času elektropredenja (40 min), dobili tanjšo plast nanovlaken, kot če smo vlakna izpredali

brez dodane zdravilne učinkovine. Benzokain namreč vsebuje ionizirajoče skupine (-NH2),

ki pripomorejo k povečanju naboja v raztopini. Zaradi večjega števila nabitih ionov v

raztopini ima curek, ki se oblikuje na površini elektrode, večjo tendenco do potovanja k

zbiralni površini, zato so vlakna tanjša, saj se med potovanjem do zbiralne površine bolj

raztezajo in s tem posledično zmanjšajo premer vlaken.


36

4.1.2 Lastnosti predilne raztopine

Slika 4-8 prikazuje izmerjene vrednosti viskoznosti, prevodnosti in površinske napetosti

predilnih raztopin z in brez zdravilne učinkovine (benzokain). Ugotovili smo, da ima

dodatek zdravilne učinkovine izrazit vpliv na spremembo prevodnosti, medtem ko na

viskoznost in površinsko napetost bistveno ne vpliva. Z dodatkom zdravilne učinkovine se

prevodnost predilne raztopine poviša. Povišanje prevodnosti je posledica prisotnosti

ionizirajočih skupin (-NH2) v benzokainu, zaradi česar se poveča gostota naboja v raztopini.

Slika 4-8: Viskoznost, prevodnost in površinska napetost predilnih raztopin

4.1.3 SEM analiza

Sliki 4-9 in 4-10 prikazujeta SEM posnetke vlaken iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini in

vlaken z vključeno zdravilno učinkovino (benzokain). Iz primerjave SEM posnetkov

opazimo, da v obeh primerih dobimo vlakna z gladko površino, iz česar lahko potrdimo, da

dodatek zdravilne učinkovine ne vpliva na morfologijo vlaken. Ker na površini vlaken z

vključeno zdravilno učinkovino ni opaznih kristalov zdravila niti drugih vrst agregatov

zdravila, lahko glede na literaturo [6] predpostavimo, da je zdravilna učinkovina popolnoma

vključena znotraj vlaken. Ravno nasprotno pa prikazujeta SEM posnetka filmov (slika 4-11

in slika 4-12), pripravljena iz identičnih polimernih raztopin (17 ut. % CA v 85 % ocetni

kislini in 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom). SEM posnetka jasno

prikazujeta, da postane površina filma z dodatkom zdravilne učinkovine groba, kar potrjuje

na prisotnost kristalov zdravila. Na podlagi pregledane literature [6] lahko predpostavimo, da

na prisotnost agregatov zdravila na vlaknih in filmih vpliva tudi hitrost izhlapevanja topila

med samo izdelavo. Pri izdelavi vlaken s postopkom elektropredenja namreč pride do

izhlapevanja topila zelo hitro (med prenosom polimerne raztopine do zbiralne površine). V

nasprotju z elektropredenjem pa pri izdelavi filmov poteka izhlapevanje topila dalj časa, kar

je lahko razlog za prisotnost agregatov zdravila na filmih.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini + 5 % benzokain

Vis

kozn

ost

(m

Pas

)

Pre

vod

no

st (

µS/

cm)

Po

vrši

nsk

a n

ape

tost

(m

N/m

)

Površinska napetost (mN/m)

Prevodnost (µS/cm)

Viskoznost (mPas)


37

Slika 4-9: Vlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini

Slika 4-10: Vlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom


38

Slika 4-11: Film iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini

Slika 4-12: Film iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom

4.1.4 Premer vlaken

S pomočjo programa ImageJ smo določili premer vlaken. Premer smo določili 30 vlaknom iz

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini in 30 vlaknom iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini z

dodatkom zdravilne učinkovine. Slika 4-13 prikazuje porazdelitev premera vlaken za vlakna

brez in z zdravilno učinkovino. Ugotovili smo, da imajo izpredena vlakna neenakomeren

premer, saj se velikost vlaken giblje med 200 in 1100 nm. Pri vlaknih z vključeno zdravilno

učinkovino ima največ vlaken premer med 300 in 500 nm, pri vlaknih brez zdravilne

učinkovine pa je premer vlaken za 44 % večji. Največ vlaken ima premer med 400 in 900

nm. Iz literature [34] lahko potrdimo, da je razlog, da smo pri vlaknih z zdravilno učinkovino

dobili vlakna z manjšim premerom, višja prevodnost predilne raztopine. Povišanje

prevodnosti namreč povzroči zmanjšanje premera vlaken. Da smo dobili vlakna z velikim

premerom ter da je premer vlaken neenakomerno porazdeljen, lahko pripišemo previsoki


39

koncentraciji polimerne raztopine, ki povzroča neenakomerno gibanje polimernega curka od

elektrode do zbiralne površine.

Slika 4-13: Porazdelitev premera vlaken

4.1.5 FTIR analiza

Slika 4-14 prikazuje FTIR spektra za nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini in za

nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom. Oba spektra imata

enake izrazite vrhove, iz česa lahko sklepamo, da je dodatek zdravilne učinkovine prenizek,

da bi vplival na spremembo spektra. Iz spektra za CA opazimo izrazit vrh pri 1739 cm-1

, ki

ustreza karbonilni skupini C=O. Vrh pri 1224 cm-1

ustreza etrski skupini, medtem ko vrh pri

1037 cm-1

ustreza –C-O- vezi od –CH2-OH skupine. Manj izrazit je vrh pri 3474 cm -1

, ki ga

lahko pripišemo hidroksilni skupini –OH [10]. Vrhova pri 1367 in 1431 cm-1

pa lahko

pripišemo simetričnim in nesimetričnim vibracijam CH3 skupine [44].

0

1

2

3

4

5

6

7

8

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Šte

vilo

vla

ken

Premer vlaken (nm)

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini + 5 % benzokain


40

Slika 4-14: FTIR spekter za nanovlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini in za nanovlakna iz 17

ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom

Na sliki 4-15 je prikazan FTIR spekter za benzokain. S pomočjo literature [66] smo uspeli

identificirati izrazite vrhove. Primarni amin določujeta dva izrazita vrhova pri 3420 in 3341

cm-1

, ki ustrezata asimetričnim in simetričnim vibracijam –N-H vezi. Vrhovi med 1280 in

1366 pa ustrezajo C-N vezi za aromatske amine. Aromatskemu estru pripisujemo vrhove pri

1679, 1250 in 1123 cm-1

, natančneje vrh pri 1679 ustreza C=O vezi, vrhova pri 1280 in 1123

pa C-O vezi. Prisotnost aromatske skupine potrjujejo vrhovi med 1441 in 1595 cm-1

, ki

ustrezajo aromatski C=C vezi ter vrhovi med 640 in 770 cm-1

, ki ustrezajo aromatskim C-H

vezem. Da je benzenov obroč 1,4 disubstituiran, potrjuje izrazit vrh pri 845 cm-1

. Vrhove

med 2900 in 2985 pa lahko pripišemo C-H vezem.

Date: 23.3.2015

17 % CA v 85 % ocetni kislini.sp

17 % CA v 85 % ocetni kislini + 5 % benzokain_1.sp

4000,0 3000 2000 1500 1000 650,0cm-1

%T

3473,51 2922,74

2052,10

1739,53

1431,82

1368,04

1223,83

1161,17

1036,98

901,84

3472,97 2944,68

1737,34

1605,751431,83

1367,46

1220,17

1171,45

901,45

845,44773,97


41

Slika 4-15: FTIR spekter za benzokain

4.1.6 Nabrekanje vlaken

Stopnjo nabrekanja in izgubo mase smo določali z gravimetrično metodo po 24 h namakanju

v destilirani vodi. Poskus smo izvedli v treh ponovitvah in kot rezultat podali povprečje treh

ponovitev. Stopnja nabrekanja za 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini znaša 1698,2 %. Vlakna

se med nabrekanjem praktično ne raztopijo, saj izguba mase znaša le 1,8 %. Za vlakna iz 17

ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5 % benzokainom stopnja nabrekanja znaša 1657,2 %,

izguba mase pa 5,6 %. Opazimo, da dodatek zdravilne učinkovine ne vpliva na nabrekanje

vlaken, saj se dobljeni stopnji nabrekanja za vlakna z in brez zdravilne učinkovine bistveno

ne razlikujejo. Glede na vir [6] lahko veliko količino absorbirane vode v vlaknih pripišemo

količini vode, ki je fizično absorbirana v posameznih vlaknih in količini vode, ki se zadržuje

v porah med vlakni.

Pri izgubi mase pa je opazna razlika med vlakni z in brez zdravilne učinkovine. Izguba mase

za vlakna z zdravilno učinkovino je višja kot za vlakna brez zdravilne učinkovine. Razlog

temu je najverjetneje sproščanje benzokaina iz vlaken.

Date: 5/26/2015

BENZOKAIN.sp

4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0

8.2

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

98.6

cm-1

%T

3420.60

3340.51

3222.25

2985.00

2957.462900.32

2676.56

1917.98

1679.06

1633.66

1595.25

1574.411514.17

1474.77

1441.13

1392.36

1366.21

1342.25

1309.78

1170.361122.82

1108.59

1079.49

1025.39

965.45882.49

845.00

770.18

699.65

639.39

502.26


42

4.1.7 Stični kot

Stični kot smo določali s fotogoniometrom na večji površini vlaken. Iz tabele 4-1 je

razvidno, da sta vzorca močno hidrofobna, saj sta stična kota večja od 90 °. Stični kot za

vlakna iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini znaša 132,9 °, za vlakna z dodano zdravilno

učinkovino pa 134,5 °. S tem lahko potrdimo, da dodatek zdravilne učinkovine ne vpliva na

spremembo lastnosti vlaken. Na določanje stičnega kota je močno vplivala nehomogenost

vzorca in neravna površina. Vlakna so neenakomerno izpredena, zato debelina plasti vlaken

ni po celotni površini enaka. Zaradi omenjenega razloga nismo mogli določiti stičnega kota

na tisti površini, kjer so bila izpredena vlakna tanjša. Na tovrstno težavo smo naleteli

predvsem pri vlaknih z vključeno zdravilno učinkovino, saj je bila debelina plasti teh vlaken

precej tanjša kot pri vlaknih brez zdravilne učinkovine. Na sliki 4-16 je prikazana kapljica

vode na vlaknih iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini, kar potrjuje popolno hidrofobnost

vzorca.

Tabela 4-1: Izmerjeni stični koti za vlakna brez in z zdravilno učinkovino

Vzorec Stični kot (°)

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini 132,9

17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini + 5 %

benzokain

134,5

Slika 4-16: Merjenje stičnega kota


43

4.2 Razvoj HPLC analizne metode za določanje benzokaina Po pregledu literature smo razvoj metode začeli pri pogojih, ki so zapisani v viru [11]. Kot

mobilno fazo smo uporabili acetonitril in vodo v volumskem razmerju 50:50. Benzokain (γ=

100 mg/l) smo topili v acetonitrilu. Pri pretoku 1 ml/min se je benzokain eluiral pri 4,181

min. S povišanjem deleža organske faze v mobilni fazi se je benzokain eluiral še hitreje, kar

prikazuje tabela 4-2. Opazimo, da višji delež acetonitrila ne uspe izboljšati simetričnosti

kromatografskega vrha. Izmed uporabljenih mobilnih faz smo najbolj zadovoljive

kromatografske parametre dobili, ko smo kot mobilno fazo uporabili acetonitril in vodo v

volumskem razmerju 60:40. Pri tej mobilni fazi je zadovoljeno pogojem, da je kapacitivni

faktor večji od 2, saj znaša 2,43, benzokain pa se je eluiral pri 3,431 min. Na podlagi teh

ugotovitev smo se odločili, da bomo nadaljnje analize izvajali pri tej mobilni fazi.

Tabela 4-2: Vpliv spremembe mobilne faze na kromatografske parametre

Mobilna

faza

Pretok

(mL/min)

Tlak

(bar)

tr (min) k' Tf (%) N w1/2

ACN:H20=

50:50

1,0 147 4,181 3,18 1,84 4817 8,82

ACN:H20=

60:40

1,0 139 3,431 2,43 1,94 9365 5,01

ACN:H20=

70:30

1,0 119 2,896 1,90 2,10 4218 6,30

Razvoj metode smo nadaljevali z uporabo puferske mobilne faze, ki so jo uporabili Ortiz-

Boyer in sodelavci [14]. Mobilna faza je bila sestavljena iz 10 mM KH2PO4 in metanola v

razmerju 25:75 (pH= 3,20). Pretok mobilne faze smo naravnali na 0,8 ml/min, benzokain (γ=

50 mg/l) pa smo raztopili v mobilni fazi. Pri teh pogojih se je benzokain eluiral pri 3,650

min, faktor simetrije pa je znašal 1,77 %. Nadalje smo analize izvedli še v mobilni fazi, ki je

bila sestavljena iz metanola in vode v različnih razmerjih (60:40, 70:30 in 80:20). Pri vseh

treh mobilnih fazah smo benzokain raztopili v mobilni fazi, pretok mobilne faze pa je bil 0,8

ml/min. Ugotovili smo, da so z uporabo metanolne mobilne faze kromatografski vrhovi širši

kot če uporabimo acetonitril, prav tako je obratovalni tlak sistema višji. Izmed uporabljenih

metanolnih mobilnih faz smo za optimalno izbrali metanol:voda (60:40).

Kromatogram na sliki 4-17 prikazuje vpliv različnih mobilnih faz na elucijo benzokaina. Pri

vseh treh uporabljenih mobilnih fazah je bil pretok mobilne faze 0,8 ml/min, benzokain pa

smo raztopili v mobilni fazi. Opazimo, da se je benzokain, z zadovoljivimi kromatografskimi

parametri, najhitreje eluiral z uporabo puferske mobilne faze. Toda, ker smo pri tej mobilni

fazi uravnavali še pH, smo za optimalno mobilno fazo raje izbrali bolj enostavno mobilno

fazo (acetonitril in voda= 60:40), kjer smo prav tako dosegli zadovoljive kromatografske

pogoje in hitro elucijo benzokaina. Na izbiro optimalne mobilne faze je vplival tudi

obratovalni tlak sistema. Z uporabo acetonitrila in vode (60:40) smo dosegli najnižji tlak

sistema, ki je znašal 113 bar. Ko pa smo uporabili metanolno mobilno fazo, je bil obratovalni

tlak sistema precej višji. Pri puferski mobilni fazi je tlak znašal 160 bar, pri mobilni fazi iz

metanola in vode (60:40) pa je bil tlak še višji, znašal je 188 bar. Zaradi zgoraj omenjenih

razlogov smo kot optimalno mobilno fazo izbrali acetonitril in vodo v volumskem razmerju

60:40.


44

Slika 4-17: Vpliv spremembe mobilne faze na elucijo benzokaina

Zaradi nesimetričnosti kromatografskega vrha, smo spremljali tudi vpliv spremembe pH

mobilne faze. pH mobilne faze mora biti nižji kot pKa vrednost analita, da spojina ne

protonira. Delovno območje pH uporabljene kolone je od 2 do 7,5, medtem ko je pKa

vrednost benzokaina 2,51. Da spojina ne bi protonirala, bi morali pH mobilne faze uravnati

pod 2,5, s čimer pa bi lahko negativno vplivali na življenjsko dobo kolone. S pomočjo

H3PO4 smo pH mobilne faze (MeOH:H2O= 60:40) uravnali na 3,0 ter pri pretoku 0,8 ml/min

v sistem injicirali standardno raztopino benzokaina (γ= 20 mg/l). Tabela 4-3 prikazuje

kromatografske parametre, ki smo jih pridobili pri zgoraj omenjenih pogojih. Opazimo, da z

uravnavanjem pH nismo uspeli bistveno izboljšati simetričnosti kromatografskega vrha. Ko

uravnamo pH mobilne faze na 3,0, se zniža ploščina pod kromatografskim vrhom,

kromatografski vrh pa postane širši. Prav tako opazimo, da se spremeni retencijski čas. V

prilogi 1 je prikazan kromatogram, ki prikazuje kako sprememba pH mobilne faze vpliva na

obliko kromatografskega vrha. Ker smo pri uporabi metanolne mobilne faze dobili preveč

širok vrh, smo se odločili, da bomo pri nadaljnjih analizah kot organsko fazo uporabljali

acetonitril.

Tabela 4-3: Vpliv spremembe pH mobilne faze na kromatografske parametre

Mobilna faza Topilo tr (min) Ploščina

(mAU)

k' Tf (%) N w1/2

MeOH:H2O=

60:40

Metanol 5,744 352772 4,74 1,90 2482 16,3

MeOH:H2O=

60:40 pH= 3,0

Metanol 5,787 328062 4,79 1,96 2066 18,0


45

Ker z uravnavanjem pH mobilne faze nismo izboljšali simetričnosti, smo preverili še kakšen

vpliv ima izbira topila na kromatografsko ločbo. Iz kromatograma na sliki 4-18 je razvidno,

kako izbira topila vpliva na obliko kromatografskega vrha. Opazimo, da dobimo bolj

simetričen vrh takrat, ko kot topilo uporabimo matrico-PBS. V tabeli 4-4 so prikazani ostali

kromatografski parametri, ki smo jih pridobili, ko smo benzokain (γ= 30 mg/l) raztopili v

mobilni fazi in PBS-u. Ko smo kot topilo uporabili PBS, se faktor simetrije zmanjša in

ustreza dovoljenim mejam (1 ≤ Tf ≤ 2). Prav tako je iz tabele 4-4 razvidno, da obstajajo

razlike v ploščinah kromatografskih vrhov, če kot topilo uporabimo mobilno fazo ali PBS.

Na podlagi tega smo se odločili, da bomo pri nadaljnjih analizah kot topilo uporabljali PBS.

Tabela 4-4: Vpliv topila na kromatografske parametre

Koncentracija

(mg/l)

Topilo tr

(min)

Ploščina

(mAU)

k' Tf (%) N w1/2

30 Mobilna faza

(ACN:H20= 60:40)

4,244 627714 3,24 2,09 9856 6,04

30 PBS 4,262 637533 3,26 1,34 2876 11,23

Slika 4-18: Vpliv izbire topila na obliko kromatografskega vrha


46

4.3 Validacija HPLC analizne metode

4.3.1 Ustreznost kromatografskega sistema

Ustreznost kromatografskega sistema smo preverili tako, da smo vsakodnevno, pred

pričetkom analiz, 6-krat zaporedno injicirali standardno raztopino benzokaina (γ= 30 mg/l).

Iz dobljenih kromatogramov smo določili ploščine pod kromatografskimi vrhovi ter

izračunali relativni standardni odmik (RSD) ploščine kromatografskega vrha in retencijskega

časa. Določili smo še ostale parametre (Tf, k' in N), ki so prikazani v tabeli 4-5. Iz tabele 4-5

lahko razberemo, da vse dobljene vrednosti ustrezajo zahtevanim kriterijem, zato lahko

potrdimo ustreznost kromatografskega sistema za rutinsko delo.

Tabela 4-5: Vrednosti parametrov ustreznosti kromatografskega sistema

Parameter ustreznosti Vrednosti Kriterij sprejemljivosti

RSD (%) ploščine

kromatografskega vrha

0,39 RSD ≤ 1% za n ≥ 5

RSD (%) retencijskega časa 0,34 RSD ≤ 1% za n ≥ 5

Tf (%) 1,33 Tf ≤ 2

k' 3,24 k' > 2

N 2972 N > 2000

4.3.2 Natančnost

Natančnost metode opisuje sipanje posameznih ponovitev meritev okoli povprečne vrednosti

[17]. Ponavadi jo izrazimo s standardnim odmikom (s) ali relativnim standardnim odmikom

(RSD), ovrednotimo pa jo kot ponovljivost in obnovljivost [28].

4.3.2.1 Ponovljivost

Ponovljivost predstavlja natančnost, katero dobimo iz rezultatov meritev pri ponovljivih

pogojih, kot so ista metoda, isti reagenti, isti laboratorij, isti analitik in ista oprema [26].

Ponovljivost smo preverili tako, da smo standardno raztopino benzokaina (γ= 30 mg/l) 6-krat

injicirali v kromatografski sistem. Tabela 4-6 prikazuje ploščine vrhov, določene

koncentracije benzokaina ter izračunani standardni odmik in RSD. RSD znaša 0,45 %, s

čimer smo potrdili, da je metoda ponovljiva.

Tabela 4-6: Ponovljivost standardne raztopine benzokaina (30 mg/l)

Število meritev Ploščina (mAU) Dejanska koncentracija

(mg/l)

1 629418 29,48

2 626919 29,36

3 628492 29,43

4 629382 29,48

5 630576 29,53

6 622729 29,16

Povprečje 627919,3 29,4

s 2818,2 0,1

RSD (%) 0,5 0,5


47

4.3.2.2 Obnovljivost

Obnovljivost predstavlja natančnost, ki jo dobimo z rezultati meritev pri obnovljivih pogojih

(ista metoda, isti vzorec, drugi laboratorij, drugi analitik, različna oprema ter daljše časovno

obdobje med meritvami) [26]. Obnovljivost smo preverjali tako, da smo šest dni izvajali

ponovitve meritev treh standardnih raztopin benzokaina s koncentracijami 10, 30 in 50 mg/l.

Iz dobljenih rezultatov smo izračunali standardni odmik, RSD vrednosti in dejanske

koncentracije benzokaina. RSD vrednosti po posameznih dnevih se gibljejo od 0,1 do 1,1 %,

kar prikazuje tabela 4-7. V tabeli 4-8 pa so prikazane RSD vrednosti za vseh šest dni.

Ugotovili smo, da je RSD za vseh šest dni v območju med 2,1 in 2,3 %, zato lahko potrdimo,

da je metoda obnovljiva.


48

Tabela 4-7: Preverjanje obnovljivosti

Dan Koncentracija

(mg/l)

Ploščina 1

(mAU)

Ploščina 2

(mAU)

Ploščina 3

(mAU)

Povprečje

ploščine

(mAU)

s RSD (%) Dejanska

koncentracija

(mg/l)

1. dan

10 210453 210844 210111 210469,3 366,77 0,2 9,7

30 621868 630332 624512 625570,7 4330,17 0,7 29,3

50 1023484 1014335 1027992 1021937 6958,69 0,7 48,0

2. dan

10 207664 207191 208394 207749,7 606,06 0,3 9,6

30 631747 626885 625970 628200,7 3105,10 0,5 29,4

50 1039658 1033194 1018355 1030402 10922,43 1,1 48,4

3. dan

10 213886 215764 218039 215896,3 2079,66 1,0 9,9

30 647563 647797 652131 649163,7 2572,45 0,4 30,4

50 1034941 1043743 1037351 1038678 4548,64 0,4 48,8

4. dan

10 216265 217223 218289 217259 1012,48 0,5 10,0

30 659305 659555 666118 661659,3 3863,34 0,6 31,0

50 1075552 1084318 1093013 1084294 8730,52 0,8 51,0

5. dan

10 217974 217194 217205 217457,7 447,19 0,2 10,0

30 629418 626919 628492 628276,3 1263,38 0,2 29,4

50 1038412 1039249 1036872 1038178 1205,70 0,1 48,8

6. dan

10 207321 207174 209140 207878,3 1095,10 0,5 9,6

30 628196 622915 626456 625855,7 2691,20 0,4 29,3

50 1036922 1030625 1033224 1033590 3164,44 0,3 48,6


49

Tabela 4-8: Dobljeni rezultati obnovljivosti za vseh šest dni

4.3.3 Točnost

Točnost metode smo določili tako, da smo v slepi vzorec dodali znano koncentracijo

benzokaina. V vialo smo odpipetirali 0,3 ml standardne raztopine benzokaina (γ= 100 mg/l)

in dodali 0,7 ml slepega vzorca. S tem smo v slepi vzorec dodali 30 mg/l benzokaina. Tako

pripravljen vzorec smo injicirali v štirih ponovitvah in dobljene vrednosti primerjali z

dobljenimi vrednostmi za standardno raztopino benzokaina s koncentracijo 30 mg/l. V tabeli

4-9 so prikazani dobljeni rezultati. Točnost smo izračunali po enačbi 2.5, odstopanje (BIAS)

pa po enačbi 2.6. Dokazali smo, da je metoda točna, saj povprečna točnost znaša 95,7 %,

odstopanje od privzete vrednosti pa -4,3 %.

Tabela 4-9: Preverjanje točnosti metode

Standardna raztopina

benzokaina- 30 mg/l-

dodano

Slepi vzorec z dodatkom

benzokaina (30 mg/l)-

dobljeno

Število

meritev

Ploščina

(mAU)

Dejanska

koncentracija

(mg/l)

Ploščina

(mAU)

Dejanska

koncentracija

(mg/l)

Točnost

(%)

Odstopanje

(%)

1 673217 31,55 654561 30,38 96,3 -3,7

2 667700 31,29 648986 30,11 96,2 -3,8

3 671555 31,47 649196 30,12 95,7 -4,3

4 672066 31,49 643140 29,84 94,7 -5,3

Povprečje 671134,5 31,5 648970,6 30,1 95,7 -4,3

s 2392,8 0,1 4665,5 0,2 0,7

RSD (%) 0,4 0,4 0,7 0,7 0,8

4.3.4 Linearnost

Linearnost metode smo preverjali s šestimi različnimi koncentracijami standardnih raztopin

benzokaina v koncentracijskem območju med 5 in 50 mg/l. Vsako standardno raztopino smo

trikrat injicirali v sistem, iz povprečja dobljenih ploščin pod kromatografskimi vrhovi pa

smo izrisali umeritveno krivuljo. Umeritveno krivuljo smo ponovili 4-krat, zato smo skupno

opravili 12 meritev za posamezno koncentracijo standardne raztopine benzokaina. V tabeli

4-10 so prikazane povprečne ploščine, RSD vrednosti in izračunane dejanske koncentracije

za posamezne koncentracije standardnih raztopin benzokaina. Opazimo, da se RSD vrednosti

gibljejo od 1,5 do 2,9 %. Iz umeritvene krivulje, ki je prikazana na sliki 4-19, je razvidno, da

je metoda linearna, saj korelacijski koeficient znaša 0,9995. Na podlagi tega lahko potrdimo,

da je metoda linearna v koncentracijskem območju med 5 in 50 mg/l.

Koncentracija

(mg/l)

Povprečje

ploščine (n= 18)

s RSD

(%)

Dejanska

koncentracija (mg/l)

Izkoristek

(%)

10 212785,1 4428,99 2,1 9,8 97,9

30 636454,4 14562,99 2,3 29,8 99,4

50 1041180 21429,39 2,1 48,9 97,9


50

Tabela 4-10: Preverjanje linearnosti metode

Koncentracija

(mg/l)

Število

meritev

Povprečje

ploščine (mAU)

s RSD

(%)

Dejanska


5 12 111369,8 3236,23 2,9 5,0

10 12 214641,0 3617,47 1,7 9,9

20 12 425987,9 6531,56 1,5 19,9

30 12 643326,4 11572,40 1,8 30,1

40 12 865486,1 20412,55 2,4 40,6

50 12 1053011,8 25611,69 2,4 49,5

Slika 4-19: Umeritvena krivulja za benzokain

Parametri linearne regresije:

Enačba premice:

Naklon premice: b1= 21163

Odsek na ordinati: b0= 5587

Korelacijski koeficient: r= 0,9995

4.3.5 Meja zaznavnosti (LOD) in meja določljivosti (LOQ)

ICH definira mejo zaznavnosti (LOD) kot najnižjo koncentracijo analita v vzorcu, ki jo

lahko kvalitativno zaznamo, medtem ko je meja določljivosti (LOQ) najnižja koncentracija

analita, ki jo kvantitativno določimo z ustrezno točnostjo in natančnostjo [28].

LOD in LOQ smo določili s pomočjo linearne regresije. Za izračun LOD in LOQ vrednosti

smo uporabili standardni odmik odseka ter naklon umeritvene krivulje (enačbi 4.1 in 4.2).

(4.1)

(4.2)

y = 21163x + 5587 R² = 0,9995

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 10 20 30 40 50 60

Plo

ščin

a (m

AU

)

Koncentracija (mg/l)


51

Določili smo, da meja zaznavnosti znaša 1,08 mg/l, meja določljivosti pa 3,27 mg/l, kar

pomeni, da pod to vrednostjo ni možno kvantitativno ovrednotiti koncentracijo zdravilne

učinkovine.

4.3.6 Robustnost

Robustnost metode smo preverjali tako, da smo standardno raztopino benzokaina (γ= 30

mg/l) injicirali pri spremenjenih kromatografskih pogojih. Spreminjali smo pretok mobilne

faze (± 0,1 ml/min), temperaturo kolone (± 2 °C) in sestavo mobilne faze (± 2 % organske

faze). Dobljene rezultate smo primerjali z originalnimi kromatografskimi pogoji, kar

prikazuje tabela 4-11. Opazimo, da ima največji vpliv na rezultate sprememba pretoka

mobilne faze, saj skupni RSD znaša 13,0 %. Sprememba temperature kolone in sestava

mobilne faze bistveno ne vplivata na rezultate, saj skupni RSD znaša 1,0 % za spremembo

temperature kolone ter 1,3 % za spremembo sestave mobilne faze. Na podlagi tega lahko

potrdimo, da je metoda robustna pri spremembi temperature kolone (± 2 °C) in sestavi

mobilne faze (± 2 % organske faze), glede spremembe pretoka mobilne faze (± 0,1 ml/min)

pa ta metoda ni robustna.


52

Tabela 4-11: Robustnost metode

Kromatografski pogoji Sprememba Povprečje tr

(min)

RSD

(%) tr

Povprečje

ploščine (mAU)

RSD (%)

ploščine

Dejanska


Odstopanje

(%)

RSD

(%)

Pretok (ml/min)

0,7 4,846 0,05 772160,4 0,36 36,2 18,3

13,0 0,8 4,269 0,22 653403,6 0,67 30,6

0,9 3,792 0,09 573045,1 0,93 26,8 -12,4

Temperatura kolone

(°C)

28 4,295 0,08 666720,7 0,27 31,2 2,1

1,0 30 4,269 0,22 653403,6 0,67 30,6

32 4,248 0,08 663336,7 0,53 31,1 1,5

Sestava mobilne faze

(ACN:H2O)

58:42 4,449 0,13 655894,5 0,46 30,7 0,4

1,3 60:40 4,269 0,22 653403,6 0,67 30,6

62:38 4,135 0,13 669792,6 0,54 31,4 2,5


53

4.3.6.1 Stabilnost standardne raztopine benzokaina

Da bi preverili stabilnost standardne raztopine benzokaina (γ= 30 mg/l), smo tako

pripravljeno raztopino injicirali v treh ponovitvah skozi daljše časovno obdobje (1 mesec).

Standardno raztopino benzokaina smo hranili v hladilniku pri 4 °C. Iz grafa, ki je prikazan

na sliki 4-20, je razvidno, da je standardna raztopina benzokaina stabilna 1 mesec. Prav tako

lahko glede na kriterije za stabilnost (RSD ≤ 2, 0 %) potrdimo, da je standardna raztopina

benzokaina stabilna 1 mesec, saj RSD znaša 1,1 %.

Slika 4-20: Stabilnost standardne raztopine benzokaina (30 mg/l)

26,0

28,0

30,0

32,0

34,0

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Ko

nce

ntr

acija

(m

g/l)

Čas (dan)


54

4.4 Določanje benzokaina v realnih vzorcih

4.4.1 Sproščanje benzokaina iz nanovlaken

Prvotno smo sproščanje v Franz-ovih difuzijskih celicah izvedli na 1x1 cm velikem vzorcu

nanovlaken, vendar je bila sproščena koncentracija benzokaina prenizka, da bi jo lahko

zaznali z razvito HPLC metodo. Z namenom, da bi določili višje koncentracije benzokaina,

smo izrezali 5 okroglih vzorcev, s premerom Franz-ove difuzijske celice (2,2 cm) in

ponovno sproščali vzorce. Ker so bile tudi v tem primeru koncentracije benzokaina prenizke,

da bi jih določili na HPLC, smo sproščanje izvedli iz 10 plasti nanovlaken s premerom 2,2

cm. Debelina ene plasti nanovlaken je bila 90 µm. V tabeli 4-12 so prikazane izmerjene

koncentracije benzokaina v 10 plasteh nanovlaken iz 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini s 5

% benzokainom. Iz tabele 4-12 je razvidno, da se koncentracija benzokaina s časom

sproščanja viša. Pri vseh treh serijah so bile koncentracije sproščenega benzokaina po 5 in 10

min sproščanja pod mejo določljivosti in jih zato nismo mogli zaznati na HPLC. Opazimo,

da se koncentracija sproščenega benzokaina do 180 min viša, nato upade in se pri 1440 min

ponovno poviša. Razlog temu je ta, da smo po vsakem odvzemu vzorca dodali 1 ml svežega

PBS-a ter s tem posledično razredčili raztopino. Odvzeto koncentracijo vzorca smo

upoštevali pri preračunu sproščenega benzokaina v mg/cm2. Tabela z izračuni je prikazana v

prilogi 2, kjer smo vrednosti preračunali v mg/cm2 po enačbi 4.3. Po vsakem odvzemu 1 ml

vzorca smo prejšnjemu vzorcu prišteli odvzeto koncentracijo in ob upoštevanju tega

potrdimo, da koncentracija benzokaina narašča s časom sproščanja.

(4.3)

kjer je:

AR sproščena količina po določenem času t (mg/cm2)

γ sproščena koncentracija (mg/ml)

VFc volumen Franz-ove difuzijske celice (ml)

Vs volumen odvzetega vzorca (ml)

As površina vzorca (cm2).

Ugotovili smo, da se koncentracije sproščenega benzokaina, po serijah, med sabo

razlikujejo. Razlog temu je nehomogenost vzorca in neenakomerna debelina plasti vlaken.

Kromatogrami na sliki 4-21 prikazujejo, kako narašča ploščina pod kromatografskim vrhom

v odvisnosti od časa sproščanja. To potrjuje, da koncentracija benzokaina prav tako narašča s

časom sproščanja.


55

Tabela 4-12: Določene koncentracije sproščenega benzokaina iz nanovlaken

Čas vzorčenja (min) Koncentracija

benzokaina (mg/l)-

1. serija

Koncentracija

benzokaina (mg/l)-

2. serija

Koncentracija

benzokaina (mg/l)-

3. serija

5 < LOQ < LOQ < LOQ

10 < LOQ < LOQ < LOQ

20 4,4 < LOQ < LOQ

30 5,8 3,6 < LOQ

60 8,4 4,9 3,8

120 10,9 6,3 5,2

180 10,9 6,2 5,4

240 10,3 6,0 5,5

300 9,4 5,6 6,6

360 8,9 5,2 7,2

420 8,6 4,8 6,9

1440 12,5 4,4 7,8

2880 13,6 6,6 6,6

Slika 4-21: Kromatogrami realnih vzorcev

Na sliki 4-22 je prikazano sproščanje benzokaina (mg/cm2) iz nanovlaken. Določene

vsebnosti benzokaina smo preračunali v mg/cm2, katerega izračun je prikazan v prilogi 2. Iz

slike 4-22 lahko potrdimo, da je sproščanje benzokaina iz nanovlaken kontrolirano, saj se je

benzokain sproščal počasi. Pri 1. in 2. seriji opazimo, da se je benzokain do 120 min sproščal

hitro, med 120 in 420 min se je sproščal počasneje, plato pa smo dosegli med 420 in 2880

min. Pri 3. seriji se je benzokain sproščal hitro do 420 min, plato pa je bil dosežen med 420

in 2880 min.


56

Slika 4-22: Različni profili sproščanja benzokaina iz vlaken

4.4.2 Sproščanje benzokaina iz filmov

Za primerjavo smo sproščanje izvedli še iz filmov, ki smo jih pripravili tako, da smo

polimerno raztopino, iz katere smo izpredali nanovlakna, vlili v petrijevko in jo pustili 3 dni,

da je topilo izhlapelo. Dobili smo precej debelejše filme v primerjavi z vlakni, saj je debelina

filma znašala 550 µm. Pri sproščanju smo zopet naleteli na težave, saj se je iz vzorca

velikosti 1x1 cm sprostilo premalo zdravilne učinkovine. Ker so bili filmi debelejši od

nanovlaken, smo lahko v Franz-ovo difuzijsko celico vstavili le 2 plasti filma velikosti 1x1

cm. V nasprotnem primeru Franz-ova difuzijska celica ni dovolj tesnila in bi se zaradi tega

še povečalo izhlapevanje vzorca. Iz tabele 4-13 so razvidne izmerjene sproščene

koncentracije benzokaina iz 2 plasti filma (1x1 cm). V primerjavi z vlakni smo pri filmih

vzorce odvzemali po 30 min in nato na 1 h, saj se je benzokain iz filmov sproščal počasneje.

Prav tako kot pri sproščanju iz vlaken tudi pri filmih opazimo, da sproščene koncentracije

benzokaina s časom vseskozi ne naraščajo. Toda ob upoštevanju koncentracije in odvzetega

volumna (enačba 4.3) lahko ponovno potrdimo, da koncentracija benzokaina s časom

narašča.

Sproščanje smo izvedli v treh serijah, toda pri 2.seriji so bile koncentracije benzokaina

prenizke, da bi jih lahko določili na HPLC. Ta podatek nam ponovno potrjuje, da so izdelani

filmi nehomogeni ter neenakomerne debeline, zaradi česar je tudi porazdelitev benzokaina

neenakomerna.

0,0000

0,0010

0,0020

0,0030

0,0040

0,0050

0,0060

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Spro

ščan

je (

mg/

cm2

)

Čas (min)

1. serija

2. serija

3. serija


57

Tabela 4-13: Določene koncentracije sproščenega benzokaina iz filmov

Čas vzorčenja (min) Koncentracija benzokaina

(mg/l)- 1. serija

Koncentracija benzokaina

(mg/l)- 3. serija

30 < LOQ < LOQ

60 < LOQ < LOQ

120 < LOQ 4,6

180 < LOQ 6,0

240 3,6 6,6

300 3,9 6,9

360 3,5 6,4

420 4,2 6,2

480 3,8 5,6

1440 8,8 5,7

1620 9,3 5,3

1800 8,8 4,3

2880 7,3 3,9

Slika 4-23 prikazuje sproščanje benzokaina v mg/cm2 iz filmov. Iz slike 4-23 lahko

potrdimo, da je sproščanje benzokaina kontrolirano pri 3. seriji, saj se benzokain sprošča

počasi. Med 30 in 480 min se je benzokain sproščal hitro, od 1440 do 2880 min pa se je

sproščal počasneje (dosegli smo plato). Pri 1. seriji opazimo, da se je benzokain sproščal

hitro do 1620 min, plato smo dosegli med 1620 in 2880 min.

Slika 4-23: Profil sproščanja benzokaina iz filmov

0,0000

0,0100

0,0200

0,0300

0,0400

0,0500

0,0600

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Spro

ščan

je (

mg/

cm2

)

Čas (min)

1.serija

3.serija


58

4.4.3 Primerjava sproščanja iz nanovlaken in filmov

Na zmožnost sproščanja zdravilne učinkovine iz polimerne matrike vpliva več dejavnikov,

kot so: topnost zdravilne učinkovine v polimerni matriki, topnost zdravilne učinkovine v

testnem mediju, topnost polimerne matrike v testnem mediju in sposobnost nabrekanja.

Izmed naštetih dejavnikov imata slednja največji vpliv na sproščanje [6]. Slika 4-24

prikazuje kromatograma, ki smo ju posneli za sproščena vzorca iz vlaken in filmov po 180

min. Po primerjanju sproščenih koncentracij (v mg/l) iz filmov in vlaken ter iz

kromatograma na sliki 4-24 ugotovimo, da se je benzokain iz filmov sproščal počasneje in v

nižjih koncentracijah kot iz vlaken. Glede na literaturne podatke [6] lahko potrdimo, da je

sproščanje benzokaina iz filmov počasnejše zaradi nezmožnosti nabrekanja filmov in manjše

specifične površine v primerjavi z vlakni. Izpredena vlakna imajo zelo porozno strukturo, kar

zagotovi veliko večjo površino na enoto volumna ali mase kot pa gosta struktura

pripravljenih filmov [8].

V kolikor pa primerjamo sproščeno količino benzokaina v mg/cm2, opazimo, da se je na cm

2

sprostilo bistveno več benzokaina iz filmov kot pa iz vlaken. Ta rezultat je logičen in

sprejemljiv, saj smo pri filmih sproščanje izvedli le iz 2 cm2 velikega vzorca, medtem ko

smo pri vlaknih sproščanje izvedli iz večjega vzorca (38 cm2). Razlog za višje sproščene

količine benzokaina (mg/cm2) iz filmov je verjetno tudi ta, da smo filme pripravili

neposredno iz polimerne raztopine, zaradi česar je bila v filmih višja koncentracija

benzokaina kot v vlaknih. Sklepamo, da so delci benzokaina pri izpredanju vlaken ostali v

kadi s polimerno raztopino in je zato posledično v vlaknih prisotnega manj benzokaina.

Hkrati so se vlakna neenakomerno izpredla, kar tudi vpliva na porazdelitev benzokaina po

celotni površini vlaken.

Slika 4-24: Primerjava kromatogramov po sproščanju benzokaina iz filmov in nanovlaken


59

5 Zaključek

S pomočjo razvite HPLC metode smo v nanovlaknih CA določili kinetiko sproščanja

benzokaina. Nanovlakna CA smo pripravili s postopkom elektropredenja, katerega smo

optimizirali glede na lastnosti predilne raztopine in procesnih parametrov. Spreminjali smo

koncentracijo CA in uporabljenega topila (ocetna kislina). Vlakna smo poskušali oblikovati

iz 12, 15, 17 in 20 ut. % CA, ki smo ga raztapljali v 75, 80 in 85 % ocetni kislini. Ugotovili

smo, da se z višanjem koncentracije CA tvorijo vlakna. Pri 12 ut. % CA so se poleg vlaken

tvorile še kroglice, pri 20 ut. % CA pa zaradi previsoke viskoznosti elektropredenje ni bilo

mogoče. Kot optimalno predilno raztopino smo določili 17 ut. % CA v 85 % ocetni kislini,

saj smo dobili enakomerna in gladka vlakna. Optimalni procesni parametri elektropredenja

so uporabljena napetost 75 kV in razdalja med elektrodama 160 mm. Optimalni predilni

raztopini smo dodali 5 % benzokaina (glede na maso CA) in iz njiju izpredali vlakna 40 min.

Dobljena vlakna smo okarakterizirali s SEM in FTIR analizo, določili smo tudi stopnjo

nabrekanja in stični kot. Iz SEM posnetkov smo ugotovili, da dodatek zdravilne učinkovine

ne vpliva na morfologijo vlaken, saj smo v obeh primerih dobili vlakna z gladko površino.

Dodatek zdravilne učinkovine prav tako ne vpliva na lastnosti vlaken, saj pri določanju

stopnje nabrekanja in stičnega kota ni bilo razlik. Za vlakna brez zdravilne učinkovine smo

določili, da stopnja nabrekanja znaša 1698,2 % in stični kot 132,9 °, medtem ko pa za vlakna

z vključeno zdravilno učinkovino stopnja nabrekanja znaša 1657,2 %, stični kot pa 134,5 °.

Do razlike pa je prišlo pri določanju izgube mase, saj je izguba mase za vlakna brez

zdravilne učinkovine znašala 1,8 %, za vlakna z zdravilno učinkovino pa 5,6 %, kar lahko

pripišemo sproščanju benzokaina iz vlaken. Dodatek benzokaina je vplival tudi na premer

vlaken, saj smo pri vlaknih z zdravilno učinkovino dobili manjši premer vlaken. Razlog

temu je višja prevodnost predilne raztopine, saj povišanje prevodnosti povzroči zmanjšanje

premera vlaken.

Pri razvoju HPLC analizne metode smo spremljali vpliv spremembe mobilne faze, pretoka,

uporabljenega topila, itd. na kromatografsko ločbo. Kot mobilne faze smo uporabljali

pufersko mobilno fazo (10 mM KH2PO4:metanol= 25:75, pH= 3,20), acetonitril in vodo ter

metanol in vodo v različnih razmerjih (50:50, 60:40 in 70:30). Ugotovili smo, da so z

uporabo mobilne faze metanol in voda kromatografski vrhovi širši, prav tako je obratovalni

tlak sistema višji. Pri uporabi puferske mobilne faze se je benzokain eluiral najhitreje, vendar

smo zaradi uravnavanja pH in visokega obratovalnega tlaka raje izbrali acetonitril kot

mobilno fazo. Zadovoljive kromatografske pogoje in hitro elucijo benzokaina, pri 4,26 min,

smo dosegli z uporabo acetonitrila in vode (60:40) pri pretoku 0,8 ml/min. Kot topilo smo

uporabili matrico-PBS, saj smo v tem primeru izboljšali simetričnost kromatografskega vrha,

kot če smo kot topilo uporabili mobilno fazo. Razvito metodo smo tudi validirali. Določili

smo, da je razvita metoda natančna, saj RSD za ponovljivost znaša 0,5 %, za šest dnevno

obnovljivost pa se RSD vrednosti gibljejo med 2,1 do 2,3 %. Prav tako smo dokazali, da je

metoda točna, saj povprečna točnost znaša 95,7 %. Potrdili smo, da je metoda linearna v

koncentracijskem območju med 5 in 50 mg/l, saj je korelacijski koeficient ≥ 0,99. LOD

znaša 1,08 mg/l, LOQ pa 3,27 mg/l, prav tako smo potrdili, da je standardna raztopina

benzokaina stabilna 1 mesec, saj RSD znaša 1,1 %.

Sproščanje benzokaina smo izvedli v Franz-ovih difuzijskih celicah iz 10 plasti vlaken s

premerom 2,2 cm. Ugotovili smo, da se koncentracije sproščenega benzokaina, po serijah,

med sabo razlikujejo, kar lahko pripišemo nehomogenosti vzorca in neenakomerni debelini


60

plasti vlaken. Potrdili smo, da je sproščanje benzokaina iz nanovlaken kontrolirano, saj se je

benzokain sproščal počasi. Za primerjavo smo sproščanje izvedli še iz filmov, iz 2 plasti

velikosti 1x1 cm. Ugotovili smo, da se v primerjavi z vlakni, iz filmov benzokain sprošča

počasneje in v nižjih koncentracijah. Prav tako, smo dokazali, da je tudi iz filmov sproščanje

benzokaina kontrolirano.

Pri izvajanju eksperimentalnega dela nam je največ težav povzročilo sproščanje benzokaina

iz vlaken. Sproščanje bi morali izvesti iz 1x1 cm velikega vzorca, vendar so bile sproščene

koncentracije benzokaina prenizke, da bi jih lahko zaznali na HPLC. Edina možnost, ki nam

je preostala, je bilo povečanje površine vzorca, saj vlaken z višjim dodatkom benzokaina

nismo mogli pripraviti. V predilno raztopino smo lahko dodali maksimalno 5 % benzokaina

glede na maso CA, sicer se vlakna niso hotela izpredati.

V sklopu magistrskega dela smo uspeli pripraviti nanovlakna z vključeno zdravilno

učinkovino, katere sproščanje je kontrolirano. Možnosti za uporabo so predvsem v

medicinskih aplikacijah, natančneje pri dostavi zdravilnih učinkovin. Pripravljena

nanovlakna bi se lahko uporabljala kot dermalni oz. transdermalni obliži. Delo bi lahko

nadgradili z vezavo druge zdravilne učinkovine v vlakna, prav tako bi lahko izpopolnili

HPLC metodo za določanje še nižjih koncentracij zdravilne učinkovine.


61

6 Literatura

[1] Fu Y., Kao J. W. Drug Release Kinetics and Transport Mechanisms of Nondegradable

and Degradable Polymeric Delivery Systems. Expert Opinion on Drug Delivery, 7 (4),

429-444, 2010.

[2] Xu X., Chen X., Ma P., Wang X., Jing X. The release behaviour of doxorubicin

hydrochloride from medicated fibers prepared by emulsion-electrospinning. European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 70, 165-170, 2008.

[3] Rogina A. Electrospinning process: Versatile preparation method for biodegradable

and natural polymers and biocomposite systems applied in tissue engineering and drug

delivery. Applied Surface Science, 296, 221–230, 2014.

[4] Kurečič M., Sfiligoj Smole M. Electrospinning: Nanofibre Production Method.

Tekstilec, 56 (1), 4-12, 2013.

[5] Tungprapa S., Puangparn T., Weerasombut M., Jangchud I., Fakum P., Semongkhol

S., Meechaisue C., Supaphol P. Electrospun cellulose acetate fibers: effect of solvent

system on morphology and fiber diameter. Cellulose, 14, 563–575, 2007.

[6] Tungprapa S., Jangchud I., Supaphol P. Release characteristics of four model drugs

from drug-loaded electrospun cellulose acetate fiber mats. Polymer, 48, 5030-5041,

2007.

[7] Taepaiboon P., Rungsardthong U., Supaphol P. Vitamin-loaded electrospun cellulose

acetate nanofiber mats as transdermal and dermal therapeutic agents of vitamin A acid

and vitamin E. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 67, 387–

397, 2007.

[8] Phiriyawirut M., Phaechamud T. Gallic Acid-loaded Cellulose Acetate Electrospun

Nanofibers: Thermal Properties, Mechanical Properties and Drug Release Behaviour.

Open Journal of Polymer Chemistry, 2, 21-29, 2012.

[9] Han O. S., Youk J. H., Min K. D., Kang Y. O., Park W. H. Electrospinning of

cellulose acetate nanofibers using a mixed solvent of acetic acid/water: Effects of

solvent composition on the fiber diameter. Materials Letters, 62, 759–762, 2008.

[10] Wongsasulak S., Patapeejumruswong M., Weiss J., Supaphol P., Yoovidhya T.

Electrospinning of food-grade nanofibers from cellulose acetate and egg albumen

blends. Journal of Food Engineering, 98, 370–376, 2010.

[11] Grillo R., De Melo F. S. N., De Araujo R. D., De Paula E., Dias Filho L. N., Rosa H.

A., Fraceto F. L. Validation of an HPLC Method for quantitative Determination of

Benzocaine in PHBV-Microparticles and PLA-Nanoparticles. Latin American Journal

of Pharmacy, 28 (3), 393-399, 2009.

[12] Floriani G., Cleverson Gasparetto J., Pontarolo R., Guilherme Goncalves A.

Development and validation of an HPLC-DAD method for simultaneous determination

of cocaine, benzoic acid, benzoylecgonine and the main adulterants found in products

based on cocaine. Forensic Science International, 235, 32–39, 2014.

[13] Perez-Lozano P., Garcia-Montoya E., Orriols A., Minarro M., Tico J.R., Sune-Negre J.

M. A new validated method for the simultaneous determination of benzocaine,

propylparaben and benzyl alcohol in a bioadhesive gel by HPLC. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39, 920-927, 2005.


62

[14] Ortiz-Boyer F., Tena T. M., Luque de Castro M. D., Valcarcel M. Development and

validation of chromatographic methods (HPLC and GC) for determination of the active

components (benzocaine, tyrothricin and menthol) of a pharmaceutical preparation.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 13, 1297-1303, 1995.

[15] de Araujo D. R., Padula C., Cereda M. C., Tofoli G. R., Brito R. B. Jr., de Paula E.,

Nicoli S., Santi P. Bioadhesive Films Containing Benzocaine: Correlation Between In

Vitro Permeation and In Vivo Local Anesthetic Effect. Pharmaceutical Research, 27

(8), 1677-1686, 2010.

[16] Žorž M. HPLC. Ljubljana: samozaložba, 1991.

[17] Brodnjak Vončina D. Analizna kemija II, zbrano gradivo. Maribor: Univerza v

Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2013.

[18] Skoog D. A., West D. M., Holler F. J. Analytical chemistry: an introduction. 6th ed.

Philadelphia: Saunders College, 1994.

[19] Harvey D. Modern Analytical Chemistry. The McGraw-Hill Companies, 2000.

[20] Kellner R., Mermet J.M., Otto M., Widmer M.M. Analytical Chemistry: the approved

text to the FECS curriculum analytical chemistry. Weinheim: Wiley-VCH, 1998.

[21] Dong W. M. Modern HPLC for practicing scientists. Hoboken, New Jersey: John

Wiley & Sons, Inc., 2006.

[22] Waters, The science of what's possible. HPLC - High Performance Liquid

Chromatography, 2014. (dostop 28.11.2014

http://www.waters.com/waters/en_SI/How-Does-High-Performance-Liquid-

Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055)

[23] Harris D. C. Quantitative Chemical Analysis. 4th ed. New York: W. H. Freeman,

1996.

[24] Rouessac F., Rouessac A. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and

Techniques. 2th ed. Chichester : J. Wiley & Sons, 2007.

[25] SIST EN ISO/IEC 17025. Splošne zahteve za usposobljenost preskuševalnih in

kalibracijskih laboratorijev, 2005.

[26] Statistične metode in merilna negotovost. Zbornik predavanj. Ljubljana, 1998.

[27] Lazarić K. Validacija analitičkih metoda – osnovna načela. Svijet po mjeri, 61-64,

2012.

[28] International conference on Harmonization (ICH). Validation of analytical methods:

Text and methodology Q2 (R1), 2005.

[29] Huber L. Validation of Analytical Methods. Agilent Technologies, 2010.

[30] Lopez Garcia P., Buffoni E., Pereira Gomes F., Vilchez Quero J. L. Analytical Method

Validation. Wide Spectra of Quality Control. InTech, 2011.

[31] Brodnjak Vončina D. Industrijska analiza: zbrano gradivo. Maribor: Univerza v

Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2007.

[32] Eurachem Guide. The Fitness for Purpose of Analytical Methods- A Laboratory Guide

to Method Validation and Related Topics. 2nd ed, 2014.

[33] Okutan N., Terzi P., Altay F. Affecting parameters on electrospinning process and

characterization of electrospun gelatin nanofibers. Food Hydrocolloids, 39, 19-26,

2014.

[34] Bhardwaj N., Kundu S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique.

Biotechnology Advances, 28 (3), 325–347, 2010.

http://www.waters.com/waters/en_SI/How-Does-High-Performance-Liquid-Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055

http://www.waters.com/waters/en_SI/How-Does-High-Performance-Liquid-Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055


63

[35] Agić A. Teorijske osnove i procesni parametri elektropredenja. Polimeri: Plastics and

Rubber Journal, 25 (4), 116-121, 2004.

[36] Braghirolli D. I., Steffens D., Pranke P. Electrospinning for regenerative medicine: a

review of the main topics. Drug Discovery Today, 1-30, 2014.

[37] Garg K., Bowlin G. L. Electrospinning jets and nanofibrous structures. Biomicrofluids,

5 (1), 1-19, 2011.

[38] Gašparič P. Študij postopka elektropredenja karboksimetilceluloznih vlaken z nano-

hidroksiapatitom. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za strojništvo, 2013.

[39] Sill T. J., von Recum H. A. Electrospinning: Applications in drug delivery and tissue

engineering. Biomaterials, 29 (13), 1989–2006, 2008.

[40] Baji A., Mai Y. W., Wong S. W., Abtahi M., Chen P. Electrospinning of polymer

nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties.

Composites Science and Technology, 70 (5), 703–718, 2010.

[41] Niu H., Lin T. Fiber Generators in Needleless Electrospinning. Journal of

Nanomaterials, 1-13, 2012.

[42] Pelipenko J., Kristl J., Janković B., Baumgartner S., Kocbek P. The impact of relative

humidity during electrospinning on the morphology and mechanical properties of

nanofibers. International Journal of Pharmaceutics, 456 (1), 125–134, 2013.

[43] Fischer S., Thuümmler K., Volker B., Hettrich K., Schmidt I., Fischer K. Properties

and Applications of Cellulose Acetate. Macromolecular Symposia 262 (1), 89–96,

2008.

[44] Zhou W., He J., Cui S., Gao W. Studies of Electrospun Cellulose Acetate Nanofibrous

Membranes. The Open Materials Science Journal, 5, 51-55, 2011.

[45] Yu D.G., Li X. Y., Wang X., Chian W., Liao Y. Z., Li Y. Zero-order drug release

cellulose acetate nanofibers prepared using coaxial electrospinning. Cellulose, 20 (1),

379-389, 2013.

[46] Tian Y., Wu M., Liu R., Li Y., Wang D., Tan J., Wu R., Huang Y. Electrospun

membrane of cellulose acetate for heavy metal ion adsorption in water treatment.

Carbohydrate Polymers, 83 (2), 743–748, 2011.

[47] Škvarč Krčevski N. Lokalni anestetiki, farmakologija in toksičnost. Kontinuirano

podiplomsko izobraževanje iz anesteziologije (CME)/12. tečaj FEEA - Fondation

Européenne d'Enseignement en Anesthésiologie, 1-14, 2004.

[48] Rožnik Močnik S. Analgezija v nosečnosti, med porodom in v času dojenja.

Farmacevtski vestnik, 63, 15-20, 2012.

[49] Wikipedija, prosta enciklopedija. Lokalni anestetiki, 2013.

http://sl.wikipedia.org/wiki/Lokalni_anestetik (dostop 10. 4. 2014)

[50] Morales C. M., de Matos A. P., de Paula E., Rosa A. H., Fraceto L. F. Benzocaine

loaded biodegradable poly-(d,l-lactide-co-glycolide) nanocapsules: factorial design and

characterization. Materials Science and Engineering: B, 165 (3), 243–246, 2009.

[51] Dejmkova H., Vokalova V., Zima J., Barek J. Determination of Benzocaine Using

HPLC and FIA with Amperometric Detection on a Carbon Paste Electrode.

Electroanalysis, 23 (3), 662–666, 2011.

[52] González-Rodríguez A. J., Gutiérrez-Paredes E. M., Revert Fernández A., Jordá-

Cuevas A. Allergic Contact Dermatitis to Benzocaine: The Importance of Concomitant

Positive Patch Test Results. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition), 104 (2),

156–158, 2013.


64

[53] Silva De Melo N. F., De Araújo D. R., Grillo R., Moraes C. M., De Matos A. P., de

Paula E., Rosa A. H., Fraceto L. F. Benzocaine-loaded polymeric nanocapsules: Study

of the anesthetic activities. Journal of pharmaceutical sciences, 101 (3), 1157–1165,

2012.

[54] Vježbe iz farmaceutske kemije: Benzokain.

file:///C:/Users/Natalija/Downloads/BENZOKAIN%20.pdf (dostop 15. 4. 2014)

[55] Wikipedia, free encyclopedia. Benzocaine, 2013.

http://en.wikipedia.org/wiki/Benzocaine (dostop 15.4.2014)

[56] Reddy T. M., Balaji K., Reddy S., Reddy J. Differential Pulse Adsorptive Stripping

Voltammetric Determination of Benzocaine and Butacaine with Nafion Modified

Glassy Carbon Electrode. Croatica Chemica Acta, 79 (2) 253-259, 2006.

[57] Bončina T. Elektronska vrstična mikroskopija pri povišanem tlaku (ESEM).

Vakuumist, 31 (2), 14-19, 2011.

[58] Samardžija Z., Čeh M., Čakare L., Malič B. Karakterizacija keramičnih tankih plasti z

vrstično elektronsko mikroskopijo. Materiali in tehnologije, 34 (5), 269-273, 2000.

[59] Wikipedija, prosta enciklopedija. Vrstični elektronski mikroskop, 2014.

http://sl.wikipedia.org/wiki/Vrsti%C4%8Dni_elektronski_mikroskop (dostop 10. 1.

2015)

[60] Settle F. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. Prentice

Hall, 1997.

[61] Svete J. Preparativna organska kemija. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in

kemijsko tehnologijo, 1999.

[62] Žigon M. Uvod v polimere, zapiski predavanj. Kemijski inštitut, Ljubljana, 2009.

[63] Petriček S., Perdih F., Demšar A. Vaje iz anorganske kemije za visokošolski strokovni

študij kemijske tehnologije. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologijo, 2012.

[64] Thermo Nicolet. Introduction to Fourier Transform Infrared Spectrometry, 2001.

http://mmrc.caltech.edu/FTIR/FTIRintro.pdf (dostop 16. 4. 2014)

[65] Planinšek O., Srčič S. Vaje iz fizikalne farmacije. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za

farmacijo, 2008.

[66] Marjanovic´ B., Juranic´ I., Ciric´-Marjanovic G., Pašti I., Trchová M., Holler P.

Chemical oxidative polymerization of benzocaine. Reactive & Functional Polymers,

71, 704-712, 2011.


65

7 Priloge

7.1 Priloga 1: Vpliv spremembe pH na obliko kromatografskega vrha

Slika 7-1: Vpliv spremembe pH na obliko kromatografskega vrha


66

7.2 Priloga 2: Izračun sproščenih količin benzokaina

Tabela 7-1: Preračun sproščenih koncentracij benzokaina iz mg/l v mg/cm2

Vzorec Čas

(min)

Ploščina

(mAU)

V

vzorca

(mL)

Koncentracija

(mg/L)

Koncentracija

benzokaina

(mg/cm2)

Koncentracija

odvzeta

(mg/cm2)

Skupaj

(mg/cm2)

5min-1 5 < LOQ

10min-1 10 < LOQ

20min-1 20 97894,3 1 4,36 0,0009 0,00011 0,0009

30min-1 30 127557,3 1 5,76 0,0011 0,00015 0,0013

1ura-1 60 184144,3 1 8,44 0,0017 0,00022 0,0019

2uri-1 120 235746,7 1 10,88 0,0021 0,00029 0,0026

3ure-1 180 235805,3 1 10,88 0,0021 0,00029 0,00292

4ure-1 240 223228 1 10,28 0,0020 0,00027 0,0031

5ur-1 300 203723 1 9,36 0,0018 0,00025 0,0032

6ur-1 360 193035,3 1 8,86 0,0017 0,00023 0,0033

7ur-1 420 188247,7 1 8,63 0,0017 0,00023 0,0035

24ur-1 1440 269851,7 1 12,49 0,0025 0,00033 0,0045

48ur-1 2880 292325 1 13,55 0,0027 0,00036 0,0050


67

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Natalija Virant

Krajnčica 32, 3230 Šentjur

(+386)40 150 255

[email protected]

Spol Ženski | Datum rojstva 10.9.1990 | Državljanstvo slovensko

ŽELENO PODROČJE DELA Kemik/kemičarka

DELOVNE IZKUŠNJE

1.10. 2014-30.7.2015 Delo v laboratoriju

Fakulteta za strojništvo, Inštitut za inženirske material in oblikovanje, Maribor, 2000 Maribor

▪ Optimizacija postopka elektropredenja iz celuloznih derivatov

▪ Sproščanje iz Franz-ovih celic in določanje kinetike sproščanja

▪ Sinteze nanodelcev hidroksiapatita in celuloznega acetata

▪ Izvajanje meritev na UV-VIS spektrofotometru, FTIR-u in QCM aparatu Vrsta dejavnosti ali sektor : Laboratorij za obdelavo in preskušanje polimernih materialov

1.2. 2015-30.7. 2015 Sodelovanje pri projektu »Po kreativni poti do praktičnega znanja«

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor, 2000 Maribor

▪ Ekstrakcije v Soxhletovem in Clevengerjevem aparatu

▪ Določanje antioksidativnosti ekstraktov

▪ Priprava mikrokapsul Vrsta dejavnosti ali sektor : kemija

1.4. 2014-30.9. 2014 Sodelovanje pri projektu »Po kreativni poti do praktičnega znanja«


▪ Razvoj in validacija kromatografskih metod

▪ Določanje oksalatov v zelenih rastlinah s pomočjo ionske kromatografije Vrsta dejavnosti ali sektor : kemija

2.9. 2013-26.9. 2013 Opravljanje obvezne študijske prakse

CINKARNA, Metalurško-kemična Industrija Celje, d.d., Kidričeva 26, 3001 Celje

▪ Analize žveplove (VI) kisline- določanje masnega deleža H2SO4 in Fe, določitev porabe KMnO4 in določitev žarilnega ostanka

▪ Določitev masnega deleža HCl v tehnični klorovodikovi kislini Vrsta dejavnosti ali sektor : Analitski laboratorij

16.8. 2011-31.8. 2011 Počitniško delo

Štore Steel d.o.o., Železarska cesta 3, 3220 Štore

Vrsta dejavnosti ali sektor : Metalografski laboratorij

18.7. 2011-12.8. 2011 Opravljanje obvezne študijske prakse

Pivovarna Laško d.d., Trubarjeva ulica 28, 3270 Laško

▪ Osnovne analize voda- pH, celokupno trdoto, karbonatno trdoto, vsebnost kisika, motnost in prevodnost

▪ Analize v končnih proizvodih – določanje pH, bistrosti, barve, grenčice


68

Vrsta dejavnosti ali sektor : Laboratorij za kontrolo kakovosti

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

1.10. 2012-23. 9. 2015 Magistrica kemije Raven 7 EOK


▪ Organska analiza

▪ Koordinacijska kemija

▪ Termodifuzijska in bioreakcijska tehnika

▪ Kemometrija

1.10. 2009- 30.9. 2012 Diplomirana kemičarka Raven 6 EOK


▪ Splošna in anorganska kemija

▪ Organska kemija

▪ Analizna kemija

▪ Biokemija

▪ Računalništvo v kemiji

▪ Matematika

▪ Fizika

1.9. 2005-30. 9. 2009 Gimnazijski maturant Raven 4 EOK

Gimnazija Celje-Center

KOMPETENCE

Materni jezik slovenščina

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno sporočanje

Angleščina B2 B2 B1 B1 B2

Nemščina A2 A2 A1 A1 A1

Stopnja: A1/A2: Osnovni uporabnik - B1/B2: Samostojni uporabnik - C1/C2: Usposobljeni uporabnik Skupni evropski jezikovni okvir

Organizacijske/vodstvene kompetence

Prilagodljivost, delo v ekipi, sposobnost učinkovitega organiziranja lastnega dela, prevzemanje odgovornosti.

Obvladovanje laboratorijskih metod

▪ Kromatografija (HPLC), UV-VIS spektrofotometrija, FTIR, elektropredenje

Računalniške kompetence ▪ dobro poznavanje orodij Microsoft Office (Word, Excel, PowerPoint)

▪ poznavanje uporabe statističnega programa SPSS

Vozniško dovoljenje ▪ B

Documents

RAZVOJ HPL ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE … · RAZVOJ HPL ANALIZNE METODE ZA DOLOČANJE SPROŠČANJA ZDRAVILNIH UČINKOVIN IZ MEDIINSKIH OLOG O SOČASNEM UPOŠTEVANJU EROZIJE NOSILNEGA