1

1

RAZVOJ HROMATOGRAFSKE

METODE

2

Koraci u razvoju HPLC metode

1. Definisanje cilja metode

2. Izbor početnih hromatografskih uslova

3. Priprema uzorka

4. Optimizacija i robusnost

5. Validacija metode

2

3

1. Definisanje cilja metode i razumevanje hemije analita

Cilj HPLC metode u farmaceutskoj analizi može biti:

� Identifikacija aktivne farmaceutske supstance

� Određivanje sadržaja aktivne farmaceutske supstance u sirovini i farmaceutskom proizvodu

� Određivanje količine rastvorene supstance nakon dissolution testa

� Ispitivanje srodnih supstanci u aktivnoj farmaceutskoj supstanci i farmaceutskom proizvodu

� Razvoj metode za praćenje stabilnosti leka

Itd...

4

1. Da li je cilj dobijanje maksimalne vrednosti faktora rezolucije za sve komponente?Može se definisati vrednost faktora rezolucije samo za kritičan par.

U ovoj fazi mogu se definisati i sledeći ciljevi:

Kritičan par –ramiprilat i ramipril

Hromatografsko razdvajanje ramiprila i njegovih 5 nečistoća

3

5

2. Koje je optimalno vreme trajanja analize?Ako se razvija metoda za određivanje sadržaja

supstance to može biti i do 5 minuta.

Razdvajanje smeše beta agonista i beta blokatora

6

3. Kakva treba da bude ekonomičnost metode? Na primer, metanol je kao organski rastvarač jeftiniji

od acetonitrila.

4. Kakva je stabilnost kolone i za koliko uzoraka se može koristiti?

Neke kolone se mogu koristiti za svega 200 injektovanja.

4

7

5. Koji stepen osetljivosti je potreban?

Ako je metoda za određivanje srodnih supstanci, onda mora biti veoma osetljiva.

8

Važne osobine analita

Pregledom literature poželjno je sakupiti što više informacija vezanih za analit koji se ispituje.

5

99

Uzorak

Mr<2000? Mr>2000

Rastvoran u vodi? Rastvoran u organskim rastvaračima? Rastvoran u vodi? Rastvoran u organskim

Rastvaračima?

Rastvoran u THF?

Nejonska?

Jonska?

RP-HPLC

RP-HPLC

RP-HPLC supresija jona

RP-HPLC – jon par

Jonoizmenjivačka hromatografija

Rastvoran u THF?

Rastvoran u MeOH, MeOH-voda, AcN, AcN-voda?

Rastvoran u heksanu?

RP-HPLC

RP-HPLC

HPLC normalnih faza

Gel permeaciona RP-HPLC

Hromatografija zasnovana na

Izmeni jona

Permeaciona hromatografija

10

2. Izbor početnih hromatografskih uslova

� Radi se na smeši aktivne supstance i srodnih supstanci

� Odnos koncentracija bi trebao da odgovara odnosu analita u samom uzorku

� Kod složenih smeša koje imaju veći broj srodnih supstanci posebna pažnja se obraća na razdvajanje značajnih srodnih supstanci (preporuka R>2)

� U ovoj fazi se mogu koristiti različiti kompjuterski softveri u cilju lakšeg razvoja metode

Na primer,kod metoda za stabilnost

6

1111

Izbor stacionarne faze

Nakon izbora tipa hromatografije vrši se izbor stacionarne faze. Postoji veliki broj komercijalno dostupnih kolona i izbor zavisi od vrste analize koja se izvodi. Preporuka je da se izvrši pažljiv pregled literature čime je olakšana selekcija između postojećih kolona. Takođe, vrsta laboratorije i kolone koje postoje u laboratoriji uticaće na izbor.

Primer: ponašanje parabena na sličnim reverzno-faznim kolonama i sa sličnim mobilnim fazama.

1. metil-paraben

2. etil-paraben

3. propil-paraben

Kolona: fenil-bonded silika

Mobilna faza: metanol-voda 60:40 v/v

Kolona: etil-bonded silika

Mobilna faza: metanol-voda 55:45 v/v

12

Punjenje kolone

C18, C8, C4, silka, cijano, amino, fenil, diol...

Primer kolona sa dodatnom zaštitom:

7

13

Dimenzije kolone

Dužina (od 3 cm do 30 cm) i unutrašnji prečnik (od 2,1 mm do 22 mm).

• Kratke (30 mm - 50 mm) – kratko vreme trajanja analize, nizak

pritisak

• Duge (250 mm - 300 mm) – visoka rezolucija, dugo vreme

trajanja analize

• Mali prečnik (≤ 2,1 mm) – visoka osetljivost

• Širina (10 mm – 22 mm) – moguć rad sa većom količinom uzorka

Oblik čestica

14

Veličina čestica

Sa manjim česticama dobija se veća efikasnost, ali i veći pritisak

Kolona sa česticama veličine 3 µm bira se kada je potrebno

razdvojiti složene ili multikomponentne uzorke, a u ostalim

slučajevima biraju se kolone sa veličinom čestica 5 µm ili 10

µm

8

15

Izbor mobilne faze

Zavisi od prirode supstanci, od vrste odabrane kolone, od ciljeva metode...

16

1. Rastvorljivost ispitivanih komponenti smeše (polarnost)

2. Čistoća, bez stranih primesa organskog i neorganskog porekla (filtriranje)

3. Oslobođena mehurića gasova (deaerizovana)

4. Viskoznost

5. Protok

6. Temperatura

7. pH mobilne faze

8. Kompatibilnost sa detektorom

9. Ne menja karakteristike kolone

Zahtevi za mobilnu fazu

9

17

Izbor načina eluiranja

17

Kad se primenjuje gradijentno eluiranje?

Kod gradijentnog eluiranja dolazi do promene sastava rastvarača tokom hromatografske analize. Primenjuje se kada izokratsko eluiranje ne dovodi do zadovoljavajućeg razdvajanja komponenti. Naime, na početku analize eluent može eluirati neke komponente smeše ali je previše “slab” da bi eluirao ostale komponente. Dakle, snaga eluenta će se pojačati u cilju eluiranja ostalih komponenti sa kolone.

Izokratsko eluiranje: komponente koje se brzo eluiraju su dobro razdvojene.

Gradijentno eluiranje: sve komponente su elirane i razdvojene u zadovoljavajućem vremenu

18

Primer izokratskog eluiranja smeše od 8 analita

10

19

Izokratsko eluiranje smeše od 8 analita

Postignuto je dobro razdvajanje ali je vreme trajanja analize 130 minuta!

20

Gradijentno eluiranje prema određenom programu uz povećanje sadržaja organskog rastvarača

Uz kraće trajanje analize postignuto je

optimalno razdvajanje

analita

11

21

Uticaj temperature na separaciju

22

Uticaj pH na razdvajanje

Kolona: Develosil ODS-UG-5 150 x 4.6 mm

Mobilna faza: Metanol/20mM natrijum-fosfat pH 3,0, pH 7,0, pH 10 (35:65 V/V)

Protok: 1.0 mL/min.Temperatura: 30 °CDetekcija: UV 254 nm

Uzorak :1. Pyridoxine 2. Amiloride3. Pyridine4. Benzylamine5. Procainamide6. N-Methylbezylamine7. N-Acethylprocainamide

12

23

Uticaj pH na razdvajanje i redosled eluiranja

24

S povećanjem pH mobilne faze smanjuje se retenciono vreme

kiselih jedinjenja (crni hromatogram)

Promena vrednosti pH mobilne faze of 2,9 do 4,1 i uticaj na retenciona vremena kiselih i baznih jedinjenja

13

25

Uticaj protoka mobilne faze na separaciju

26

Izbor detektoraIzbor detektora zavisi od:

•Hemijske strukture ispitivanih jedinjenja

•Zahtevane osetljivosti

•Zahtevane selektivnosti

•Izbora eluenta

Primer: koji detektor izabrati ako je potrebno ispitati šećere (fruktozu i glukozu) u reverzno-faznom sistemu?

Odgovor:

UV/VIS – nije pogodan jer komponente ne sadrže hromofore

Refraktometrijski detektor – može biti pogodan ali mu je problematična osetljivost i selektivnost

Amperometrijski detektor – pogodan je za analizu jer se komponente mogu oksidovati a ima veću osetljivost i selektivnost od refraktometrijskog detektora

14

27

3. Priprema uzorka

�Izbor rastvarača za ekstrakciju uzorka – ispitivanje procenta

organskog rastvarača, pH, kao i procedure ekstrakcije na

tačnost, preciznost i osetljivost metode

�Poželjno je koristiti mobilnu fazu kao rastvarač uvek kada je

to moguće

28

U ovoj fazi, poželjno je definisati i način izračunavanja koncentracije uzorka!

Kvantitativna analiza se može vršiti:

1. Metodom normalizacije pikova

2. Metodom eksternog standarda

3. Metodom internog standarda

15

29

4. Optimizacija i robusnost

Optimizacija�Postavljanje optimalnih

hromatografskih uslova

�Definisanje ponašanja

ispitivanih supstanci u

odgovarajućem opsegu

faktora

�Najčešće se ispituje

uticaj sadržaja organskog

rastvarača u mobilnoj fazi,

pH mobilne faze,

temperatura kolone itd

30

Robusnost

Robusnost neke analitičke metode mera je njene sposobnosti

da se odupre malim i namernim promenama u parametrima

metode, a ujedno je i mera pouzdanosti metode tokom

rutinske primene.

Zahteva primenu eksperimentalnog

dizajna

16

31

...

Faktori integracije

Faktori detektora

Faktori kolone (tip stacionarne faze, proizvođač, starost kolone)

Za gradijentno eluiranje (početni sastav mobilne faze, krajnji sastav

mobilne faze, nagib gradijenta)

Temperatura kolone

Protok mobilne faze

Koncentracija aditiva

Koncentracija pufera, koncentracija soli ili jonska jačina

Količina organskog rastvarača u mobilnoj fazi

pH mobilne faze

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom

FaktoriMetoda

Faktori koji se mogu ispitivati pri proceni robusnosti metode

32

5. Validacija metode

U postupku validacije metode ispituju se:

• selektivnost/specifičnost

• linearnost

• opseg

• tačnost

• preciznost

• limit kvantifikacije i limit detekcije

Konačna potvrda da je metoda pogodna za primenu.

17

33

Primer hromatografskog razdvajanja smeše neutralnih jedinjenja

34

Objašnjenje

�Za neutralne komponente i njihovo razdvajanje važnu ulogu igra ravnoteža između polarnosti i lipofilnosti koja će odrediti koliko je vremena potrebno za eluiranje iz kolone

�Ovde pH mobilne faze ne igra značajnu ulogu

�U slučaju nepolarne kolone najlipofilnija komponenta će se poslednja elurati sa stacionarne faze, tj. iz kolone

Poslednji se eluira betametazon 17, 21

dipropionat kao najlipofilniji

18

35

Prednizolon se eluira pre betametazona jer je manje lipofilan (nema metil grupu na položaju 16 i fluor u položaju 9) .

PrednizolonBetametazon

36

�od estara valerata brže se eluira 17-valerat

�kod betametazon-17-valerata slobodna primarna alkoholna grupa na položaju 21

�kod betametazon-21-valerata slobodna tercijarna alkoholna grupa na položaju 17

Betamerazon-17-valerat

Betamerazon-21-valerat

Primarna alkoholna grupa gradi jače vodonične veze sa mobilnom fazom od tercijarne alkoholne grupe ⇒ betametazon-17-valerat više u mobilnoj fazi od betametazon-21-valerata

19

37

Kako uticati na ovo razdvajanje?

�Estri 21-valerat i dipropionat biće bolje razdvojeni povećanjem

sadržaja vode u mobilnoj fazi, ali će se produžiti i vreme trajanja

analize

�Dodatkom metanola može se ubrzati eluiranje estara koji se eluiraju

nakon prednizolona i betametazona, a da se vrednost faktora

rezolucije između prednizolona i betametazona ne promeni značajno

�Gradijentnim eluiranjem može se uticati na vreme trajanja analize

U sistemu normalnih faza redosled eluiranja će biti obrnut!!!

38

Primer razdvajanja komponenti koje jonizuju podešavanjem pH mobilne faze

Kontrolom pH vrednosti mobilne faze možemo uticati na retenciono ponašanje supstanci kod kojih stepen jonizacije zavisi od pH sredine što i jeste slučaj kod većine lekova.

20

39

A) acetonitril/pufer pH 8,4 (60 : 40 v/v) B) acetonitril/pufer pH 7,4 (60 : 40 v/v)

40

Najveći uticaj pH je na bupivakain i pentakain koji su strukturno vrlo

slični i imaju iste pKa vrednosti (8,1) pri čemu su i promene pH mobilne

faze ± 1 pH jedinicu u odnosu na njihovu pKa vrednost.

Najmanji efekat pH ima na prokain koji ima pKa vrednost 9,0 i pri

pH=8,4 je u najvećem procentu (80 %) već jonizovan tako da dalje

snižavanje pH neće značajno uticati na njegovo retenciono vreme.

Efekat snižavanja pH na retenciono vreme prilokaina sličan je efektu na

bupivakain i pentakain ali je manje izražen.