Reaktionen in Mikrofluidiktröpfchen

Tr�pfchenbasierte MikrofluidikDOI: 10.1002/ange.200601554

Reaktionen in Mikrofluidiktr�pfchenHelen Song, Delai L. Chen und Rustem F. Ismagilov*

AngewandteChemie

Stichw�rter:Analysemethoden · Grenzfl�chen ·Kompartimente · Mikrofluidik ·Mikroreaktoren

R. F. Ismagilov et al.Aufs�tze

7494 www.angewandte.de � 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2006, 118, 7494 – 7516

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1. Einleitung: Reaktionen in Tr�pfchen

Mithilfe von Tr pfchen in Mikrofluidikkan�len als che-mischen Mikroreaktoren k nnen Reaktionen im Mikromaß-stab ausgef�hrt werden (Abbildung 1).[1] Allgemeine Mikro-

reaktoren[2] und micellare Systeme[3] waren bereits Gegen-stand aktueller Aufs�tze in der Angewandten Chemie undwerden hier deshalb nicht behandelt. Wir beschreiben vor-nehmlich neue Techniken, die zur Ausf�hrung chemischerReaktionen in Tr pfchen entwickelt wurden, und gehen aufeinige Prozesse ein, die mit diesen Techniken untersuchtworden sind. Dar�ber hinaus diskutieren wir, wie die tr pf-chenbasierte Mikrofluidik zu neuen wissenschaftlichen Me-thoden und Erkenntnissen f�hrt.

1.1. Reaktionsf�hrung im Hochdurchsatz

Viele Anwendungen z.B. in derWirkstoffentwicklung, der Genex-pressionsanalyse und in Hochdurch-

satz-Assays erfordern eine parallele Reaktionsf�hrung. Auspraktischen Gr�nden k nnen solche Reaktionen nur im Mi-kromaßstab ausgef�hrt werden, da die Reagentien teuer odernur in geringenMengen vorhanden sind. In anderen F�llen isteine große Zahl von Reaktionen notwendig, um stochastischeProzesse wie die Keimbildung von Kristallen zu charakteri-sieren.

Die Mikrofluidik erm glicht die Handhabung kleinerFl�ssigkeitsvolumina und deren Verwendung als Mikroreak-toren.[2,4, 5] Zu den Vorteilen einer Miniaturisierung geh render geringe Reagensverbrauch sowie die M glichkeit, sehrviele Funktionseinheiten schnell anfertigen zu k nnen. ZumBeispiel ist die weichlithographische Bearbeitung von Po-ly(dimethylsiloxan) (PDMS) eine schnelle und billige Me-thode zur Herstellung[6,7] und Modifizierung[8–10] von Funkti-onseinheiten.

1.2. Parallele oder serielle Kompartimentierung mehrererReaktionen

Eine Reaktionsf�hrung im Hochdurchsatz verlangt, dassjede Reaktionsbedingung individuell adressierbar oder indi-ziert sein muss. Die Reaktionen k nnen indiziert werden,indem jede Reaktionsbedingung entweder parallel oder se-

[*] H. Song, D. L. Chen, Prof. Dr. R. F. IsmagilovDepartment of Chemistry and Institute for Biophysical DynamicsThe University of Chicago5735 South Ellis Avenue, Chicago, IL 60637 (USA)Fax: (+1)773-702-0805E-Mail: [email protected]: http://ismagilovlab.uchicago.edu/

Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag (Videos zur TrApf-chenbildung und Durchmischung in Mikrofluidikkan�len sowie zurDurchmischung von Knetmasse durch chaotische Advektion) sindim WWW unter http://www.angewandte.de zu finden oder kAnnenbeim Autor angefordert werden.

Tr�pfchenbasierte Mikrofluidiksysteme bieten in der Chemie undBiologie ausgezeichnete experimentelle M�glichkeiten f(r dieGrundlagenforschung und angewandte Forschung. Sie erm�glichendie Miniaturisierung von Reaktionen, indem Reaktionsvolumina infemto- bis mikrolitergroßen Tr�pfchen kompartimentiert werden. DieKompartimentierung in Tr�pfchen erm�glicht die schnelle Durch-mischung der Reagentien, die zeitliche Steuerung der Reaktionen imBereich von Millisekunden bis zu Monaten, die Steuerung vonGrenzfl.cheneigenschaften und die Synthese und den Transport vonfesten Reagentien und Produkten. Mithilfe von tr�pfchenbasiertenMikrofluidiksystemen k�nnen Anwendungen im Bereich des chemi-schen und biologischen Screenings, der Proteinkristallisation und derEnzymkinetik verbessert und beschleunigt werden. Dar(ber hinausbietet die m�gliche Steuerung von Tr�pfchen in MikrofluidikeinheitenAussichten auf neue wissenschaftliche Methoden und Erkenntnisse.

Aus dem Inhalt

1. Einleitung: Reaktionen inTr�pfchen 7495

2. Voraussetzungen f�rReaktionen in Tr�pfchen 7498

3. Anwendungen vonMikrofluidiktr�pfchen 7504

4. Schlussfolgerungen undAusblick 7512

Abbildung 1. In Mikrofluidikkan�len erzeugte TrApfchen kAnnen alsMikroreaktoren eingesetzt werden. Die Reaktionen kAnnen z.B. inw�ssrigen TrApfchen ablaufen, die die Reagentien A und B und einetrennende PufferlAsung enthalten. Die TrApfchen werden mit einerSchicht einer z.B. fluorierten TransportflDssigkeit umschlossen unddurch die Mikrokan�le transportiert. Wiedergabe aus Lit. [1].

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riell kompartimentiert wird (Abbildung 2).[11] Zur parallelenKompartimentierung der Reaktionsbedingungen werdenMikrotiterplatten eingesetzt (Abbildung 2a), und das Resul-tat einer Reaktion wird als Funktion der r�umlichen Positionder Mikrovertiefung indiziert.[12–14] Bei der Fließinjektions-analyse k nnen Reaktionsbedingungen seriell komparti-mentiert werden (Abbildung 2b), wobei das Resultat einerReaktion in diesem Fall als Funktion der Elutionszeit indi-ziert wird. In der kombinatorischen Chemie dienten auchMolek�lmarker,[15] markierte K�gelchen[16,17] und codiertePartikel[18,19] zur Indizierung.

1.3. Steuerung der Kompartimentierung

Bei einer parallelen Reaktionsf�hrung ist es erforderlich,die Handhabung der Fl�ssigkeiten und die Verdampfung inden Kompartimenten zu kontrollieren. Eine M glichkeitbieten PDMS-Funktionseinheiten mit integrierten Kammernund Ventilen, die eine Reaktionsf�hrung im Multiplexver-fahren zulassen.[20–23] Dieses Verfahren wurde zur Protein-

kristallisation,[24–26] chemostatischen Bakterienkultur[27]

und Synthese isotopenmarkierter Sonden[22] eingesetzt.Die Ventile, die zur Steuerung der Fl�ssigkeiten ver-wendet werden, werden durch ein Multischichtverfah-ren hergestellt. Ein Problem besteht darin, dass PDMSf�r D�mpfe organischer und w�ssriger L sungendurchl�ssig ist, sodass es zu Verdampfungsverlustenkommen kann. Allerdings konnte diese Durchl�ssigkeitauch f�r einige Anwendungen gezielt genutztwerden,[28] z.B. zum Bef�llen von Sackgassenkan�-len.[25]

Bei der seriellen Reaktionsf�hrung in einphasigerStr mung kann es durch Dispersion zur Querkontami-nierung zwischen den Reaktionsbedingungen und somitzu Probenverd�nnung kommen. Die druckgetriebeneStr mung einer einphasigen L sung durch einen Mi-krokanal ist laminar und weist ein parabolisches Ge-schwindigkeitsprofil auf.[29,30] Wegen dieses paraboli-schen Str mungsprofils werden die Reagentien in Mi-krokan�len mit unterschiedlichen Geschwindigkeitentransportiert. Die Taylor-Dispersion beschreibt denTransport und die Verbreiterung eines Konzentrati-onspulses eines gel sten Stoffes in einer durch einStr mungsrohr fließenden L sung.[29,30] Die Lokalisie-rung der Reaktion und die genaue Steuerung der Re-

aktionszeit sind wegen der Dispersion schwierig. ZwischenPulsen unterschiedlicher Reagentien, die sich durch dasselbeStr mungsrohr bewegen, kann Querkontamination auftreten.Außerdem sind die Reagentien in direktem Kontakt mit derfesten Wand des Mikrokanals, weshalb auch die chemischenOberfl�cheneigenschaften der Wand kontrolliert werdenm�ssen. Besonders bei Funktionseinheiten, die das Problemder Taylor-Dispersion durch die Anwendung einer elektro-osmotischen Str mung l sen, ist die Kontrolle der Oberfl�-cheneigenschaften wichtig.[31,32] Ferner kann durch Diffusionin der einphasigen Str mung eine Verd�nnung der Proben-l sung auftreten, besonders bei l�ngeren Inkubationszeiten.Eine solche Verbreiterung der Konzentrationspulse trittsowohl bei druckgetriebenen als auch bei elektroosmotischgelenkten Fl�ssen auf.

1.4. Kompartimentierung in nanolitergroßen Tr�pfchen

Nanolitergroße Tr pfchen lassen sich in großer Zahl alsKompartimente nutzen, wobei jedes Tr pfchen eine Reakti-

Helen Song studierte Chemie an der Uni-versit�t Chicago (M.Sc. 2002). Im Rahmenihrer Promotion, die sie unter der Leitungvon Prof. Rustem Ismagilov anfertigte und2005 abschloss, besch�ftigte sie sich mit derEntwicklung von Techniken f.r die tr/pf-chenbasierte Mikrofluidik und deren Anwen-dung in der Enzymkinetik.

Delai Chen studierte Chemie an der Univer-sit�t Peking (B.Sc.) und an der Universit�tChicago (M.Sc.). Unter der Anleitung vonProf. Rustem Ismagilov forscht er seit 2004.ber die Anwendung der tr/pfchenbasiertenMikrofluidik zur Untersuchung stochastischerProzesse bei der Proteinkristallisation undzur Optimierung der Reaktionsbedingungenorganischer Reaktionen.

Abbildung 2. Vergleich zwischen parallel und seriell kompartimentierten Reaktionen.a) Paralle ReaktionsfDhrung mithilfe von Mikrotiterplatten: Die Reagentien werden inden Mikrovertiefungen vorgelegt, und die Probe wird mit einem Mehrfachpipettierer zu-gegeben. Die einzelnen Reaktionsprodukte werden nacheinander bestimmt, und jedeReaktion wird als Funktion der r�umlichen Position der Mikrovertiefung indiziert. b) Se-rielle ReaktionsfDhrung mithilfe einer StrAmung: Die Reagentien werden pulsweise vor-gelegt und sind durch eine PufferlAsung voneinander getrennt. Die StrAmung transpor-tiert die Pulse durch die Reaktionskapillare, und die Probe wird zugesetzt. Die Reakti-onsprodukte werden mit einem station�ren Detektor bestimmt, an dem die Pulse durchdie StrAmung vorbeitransportiert werden. Die Reaktionen werden als Funktion der Eluti-onszeit indiziert.




onsbedingung tr�gt. Wenn mehrphasige Systeme aus nicht-mischbaren Fl�ssigkeiten eingesetzt werden, um die Tr pf-chen in den Mikrofluidikkan�len zu erzeugen, lassen sichProbleme wie Verdampfung, komplizierte Fluid-Handha-bung, Dispersion und Diffusion vermeiden (Abbildung 1).[1]

Die Verdampfung bei Experimenten mit langer Inkubati-onszeit l�sst sich kontrollieren, indem die Tr pfchen inGlaskapillaren transportiert werden.[33, 34] Eine komplizierteHandhabung der Fl�ssigkeiten entf�llt, da sich gleichm�ßiggroße Tr pfchen spontan bilden, wenn die Str mungenzweier nichtmischbarer Fl�ssigkeiten in einer geeignetenKreuzung zusammengef�hrt werden.[1,35–39] Mithilfe derStr mung der Fl�ssigkeiten in den Mikrokan�len lassen sichdie Tr pfchen und die Tr pfchenarrays gezielt manipulie-ren.[1,37,38,40–42] Da die Reagentien in den Tr pfchen einge-schlossen sind, tritt keine Dispersion durch Konvektion oderDiffusion auf. Dar�ber hinaus kann die Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�che zwischen den nichtmischbaren Phasen der Rea-gens- und der Transportfl�ssigkeit leicht kontrolliertwerden.[43] Eine Durchmischung innerhalb der Tr pfchenl�sst sich mit chaotischer Advektion erreichen.[1, 37,40,44,45]

Um station�re Kompartimente zu erhalten (analog zuMikrotiterplatten), k nnen die Tr pfchen in Kapillarentransportiert und bis zu einem Jahr lang inkubiert werden.Bewegliche Kompartimente (analog zur Fließinjektionsana-lyse) lassen sich mit Tr pfchen realisieren, die durch Str -mung kontinuierlich durch die Mikrokan�le in der Funkti-onseinheit transportiert werden. Der Einsatz von Mikroflui-diktr pfchen erm glicht sowohl die Kompartimentierung vonReaktionen als auch die genaue Steuerung der Reaktionszeit.

1.5. Thema des Aufsatzes

Wir diskutieren in diesem Aufsatz Reaktionen, die insegmentierten Str mungen in Mikrofluidiksystemen ablau-fen. Eine segmentierte Str mung besteht aus mindestens zweinichtmischbaren Phasen, einer dispersen und einer kontinu-ierlichen Phase. Die Tr pfchen bestehen aus der dispersenPhase, w�hrend die kontinuierliche Phase vorzugsweise dieOberfl�che des Mikrokanals benetzt oder beschichtet und dieTr pfchen umschließt.

Wir betrachten zwei Arten segmentierter Str mungen,die sich durch die Phase unterscheiden, in der die Reaktionstattfindet. Bei der ersten Art sind die einzelnen Fl�ssig-keitstr pfchen von einer Transportfl�ssigkeit umschlossen,

die den Mikrokanal benetzt (Abbildung 3a).[1] Diese ovalenPfropfen („plugs“) bilden die disperse Phase, in der die Re-aktionen ablaufen. Von den segmentierten Fließinjektions-systemen unterscheiden sich die Pfropfkompartimentsystemedahingehend, dass die Reagentien nicht mit der Mikroka-nalwand in Kontakt kommen und dispersionsfrei transpor-tiert werden. Bei der zweiten Art segmentierter Str mungwerden zylindrische Pfopfen („slugs“) erzeugt, die durcheinzelne Gasblasen voneinander getrennt sind (Abbil-dung 3b).[46–51] In diesem Fall finden die Reaktionen in derkontinuierlichen Phase statt. Die Reagentien kommen mitden Kanalw�nden in Kontakt, und es tritt eine charakteristi-sche Dispersion auf. Dieses zweite System �hnelt den seg-mentierten Fließinjektionssystemen.[52–56] Im Folgendenwerden wir die Bezeichnungen Oval- und Zylinderkompar-timente („plugs and slugs“) zur Unterscheidung dieser beidenArten segmentierter Str mung verwenden.

Nicht Gegenstand dieses Aufsatzes sind Reaktionen inmakroskopischen Fl�ssigkeitssystemen aus nichtmischbarenPhasen, z.B. micellaren Systemen und Emulsionen. Emul-sionen bieten sehr viel geringere M glichkeiten zur r�umli-chen Steuerung als Kompartimentsysteme. Reaktionen inmicellaren[3] und kolloidalen Systemen,[57, 58] in Miniemulsio-nen[59] und in Multischichtmikrokapseln[60] wurden bereits inausf�hrlichen Jbersichtsartikeln behandelt. Emulsionen undVesikeln wurden zur In-vitro-Kompartimentierung einge-setzt,[61,62] wobei Vesikelreaktoren auch als synthetischeZellen verwendet wurden.[63–65] Durch Mikrofluidik herge-stellte Emulsionen[66–68] wurden zur Synthese von permeablenKolloiden[69] und von monodispersen Kapseln mithilfe kon-stanter koaxialer Fl�ssigkeitsstrahlen eingesetzt.[70]

Ebenfalls nicht behandelt wird der Bereich der digitalenMikrofluidik, bei der die Tr pfchen nicht durch eine konti-

Rustem Ismagilov promovierte 1998 an derUniversit�t Wisconsin in Madison bei Prof.Stephen F. Nelsen. Nach einem Postdoc-Aufenthalt an der Harvard University beiProf. George M. Whitesides begann er imJahr 2001 mit eigenen Forschungen an derUniversit�t Chicago, wo er 2005 zum Assoc-iate Professor ernannt wurde. Seine gegen-w�rtigen Forschungen gelten der Anwendungder Mikrofluidik zur r�umlichen und zeitli-chen Steuerung komplexer chemischer undbiologischer Systeme.

Abbildung 3. Bei Reaktionen in Mikrofluidikkan�len werden zwei Artensegmentierter StrAmungen unterschieden. a) Einzelne ovale FlDssig-keitspfropfen werden durch eine nichtmischbare kontinuierliche Phase(z.B. einen Fluorkohlenwasserstoff) kompartimentiert. Die Reaktionenlaufen in der dispersen Phase, d.h. den ovalen Pfropfen ab. Aufgrundder oberfl�chenchemischen Eigenschaften der Mikrokanalw�ndewerden die W�nde bevorzugt von der kontinuierlichen Phase benetzt.b) Im zweiten Fall werden zylindrische Pfropfen erzeugt, indem diekontinuierliche Phase durch eine zweite nichtmischbare Phase (z.B.einzelne Gasbl�schen) kompartimentiert wird. Die Reaktionen laufenin der kontinuierlichen Phase, d.h. den zylindrischen Pfropfen ab.


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nuierliche Str mung („passive Steuerung“), sondern durcheine Anordnung von Elektroden („aktive Steuerung“) ge-lenkt werden.[71–75] Die auf der Elektrobenetzung beruhendenMethoden zur Steuerung der Tr pfchen und die Automati-sierung dieser Techniken wurden bereits in Jbersichtsarti-keln beschrieben.[76–78] Digitale Mikrofluidik wurde f�r eineReihe von Aufgaben eingesetzt: zur Analyse von Proteinenund Peptiden durch matrixunterst�tzte Laser-Desorptionsio-nisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS),[79, 80] zur Aus-f�hrung von Polymerasekettenreaktionen mit optischer De-tektion,[81] zur Messung der Glucosekonzentration in Tr pf-chen durch optische Detektion[82] sowie in Luciferase-Assays[83] und zur Synthese anisotroper Partikel.[84]

Mikrofluidiksysteme, die zwar mit mehrphasigen Str -mungen arbeiten, in denen aber keine Reaktionen ablaufen,werden wir ebenfalls nicht im Detail diskutieren. Wir defi-nieren „Reaktion“ in einem umfassenden Sinne, der auch diegegenseitige Umwandlung chemischer Spezies[85] und Pha-sen�berg�nge wie Kristallisation oder die Bildung von festenTeilchen einschließt. Es werden fortlaufend Methoden zurHerstellung und Manipulation von Tr pfchen entwickelt, dieauf neuartigen physikalischen Konzepten beruhen: Elektro-benetzung,[86–88] magnetische Felder,[89,90] optisch induzierteMarangoni-Effekte,[91,92] akustische Wellen[93] und Oberfl�-chenchemie.[94, 95] Zu den aktuellen Neuerungen bei der Er-zeugung von Gasbl�schen in Mikrofluidiksystemen geh rendie Anwendung segmentierter Str mungen in Mikrokan�lenals mehrphasige Monolithreaktoren,[96] die Herstellung mo-nodisperser Gasbl�schen durch Str mungsfokussierung,[97,98]

die Untersuchung der nichtlinearen Dynamik eines str -mungsfokussierenden Bl�schengenerators[99] und die Cha-rakterisierung des Transports von Bl�schen in Kan�len mitquadratischem Querschnitt.[100]

Eine Str mung nichtmischbarer Fl�ssigkeiten kann inMikrokan�len anstelle der Bildung von Tr pfchen auch zueiner kontinuierlichen laminaren Str mung der Fl�ssigkeitenf�hren.[101] Derartige Systeme, die f�r Bioassays[102–104] sowiezur Strukturierung und Mikrofabrikation in Mikrokan�-len[105, 106] genutzt wurden, sind ebenfalls nicht Gegenstanddieses Aufsatzes.

Wir konzentrieren uns auf aktuelle Entwicklungen bei derVerwendung von Tr pfchen in derMikrofluidik als chemischeReaktoren. Wir stellen die Methoden zur Steuerung vonReaktionen vor und diskutieren Beispiele von Reaktionen intr pfchenbasierten Mikrofluidiksystemen. Ferner zeigen wirauf, wie die Mikrofluidik zur Erschließung neuer For-schungsbereiche f�hren kann.

2. Voraussetzungen f�r Reaktionen in Tr�pfchen

Um Reaktionen in Mikrofluidikeinheiten ausf�hren zuk nnen, sollten zumindest zwei Voraussetzungen erf�llt sein:Erstens sollte die Mikrofluidikeinheit die typischen Arbeits-abl�ufe erm glichen, die auch bei Reaktionen im Makro-maßstab anfallen. Hierzu geh ren die kontrollierte Zugabeder Reagentien zur Reaktionsmischung, die gr�ndliche Mi-schung der Reagentien, die Kontrolle der Reaktionszeit, dieVereinigung und Trennung von Reaktionsgemischen bei

mehrstufigen Reaktionen und die Jberwachung des Reakti-onsverlaufs. Zweitens sollte der Einsatz der Mikrofluidik ir-gendeinen charakteristischen Vorteil mit sich bringen, z.B.die M glichkeit, mehr Reaktionen bei einer gr ßeren Zahlvon Reaktionsbedingungen zu testen. Wie bei jedem Hoch-durchsatz-Screening muss eine Methode zur Organisationund Indizierung der Reaktionsbedingungen vorhanden sein.Ebenso muss es eine wirksame Methode zur Pr�fung vonReaktionsbedingungen und zur Optimierung einer bestimm-ten Bedingung geben. Diese Methoden sollten skalierbar,direkt und einfach sein. In diesem Abschnitt werden wirTechniken diskutieren, die f�r die tr pfchenbasierte Mikro-fluidik entwickelt wurden, um die oben genannten Kriterienzu erf�llen.

2.1. Erzeugung von Tr�pfchen in Mikrofluidikkan&len

Die Tr pfchenerzeugung in zweiphasigen Systemenwurde sowohl f�r Fl�ssig-fl�ssig-[107–109] als auch f�r Gas-fl�ssig-Str mungen[110] ausf�hrlich untersucht. W�hrend zurHerstellung makroskopischer Emulsionen sehr viele Metho-den zur Verf�gung stehen, kommen zur Erzeugung vonTr pfchen in Mikrofluidikkan�len im Wesentlichen nur zweiTechniken zum Einsatz: T-Kreuzungen[1,35–39] und Str -mungsfokussierung.[36,97,98,111–115] Beim Einsatz von T-Kreu-zungen werden die disperse Phase und die kontinuierlichePhase in die beiden Einl�sse eines T-St�cks geleitet. DieTr pfchen der dispersen Phase bilden sich aufgrund derScherkraft und der Grenzfl�chenspannung an der Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�che (Abbildung 4; siehe auch Abbildung 1).

Die Phase mit der geringeren Grenzfl�chenspannung zurKanalwand bildet die kontinuierliche Phase.[37] Bei der Str -mungsfokussierung werden die Tr pfchen erzeugt, indem diekontinuierliche Phase durch zwei �ußere Kan�le und die dis-perse Phase durch einen zentralen Kanal in eine enge Nff-nung geleitet werden (Abbildung 5).[111] Dieser Aufbau istgeringf�gig schwieriger zu realisieren als die T-Kreuzung undhat sich besonders bei der Herstellung sehr kleiner oder vis-koser Tr pfchen bew�hrt.[45, 97,111,115–117] Bei beiden Methodenwerden der kontinuierlichen Phase h�ufig Tensidverbindun-gen zugesetzt, um die Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�chen derTr pfchen zu stabilisieren.[1,35,111] Die Bedingungen, unter

Abbildung 4. Erzeugung von TrApfchen in der T-Kreuzung einer Mikro-fluidikeinheit.[35] Als Flphase kann z.B. eine Mischung von Kohlenwas-serstoffen und dem Tensid Span80 verwendet werden. Die Kan�le be-stehen in diesem Fall aus acryliertem Polyurethan. Wiedergabe mitGenehmigung aus Lit. [35]. Copyright 2001 American Physical Society.




denen sich monodisperse Tr pfchen bilden, sind ausf�hrlichbeschrieben worden.[96, 118–123] Vor dem allgemeinen Einsatzvon Tr pfchen als Mikroreaktoren muss aber ein Weg ge-funden werden, wie die Reagentien in Tr pfchen eingebrachtwerden k nnen.

2.2. Zuf�hrung der Reagentien in die Tr�pfchen

Zur Zuf�hrung der Reagentien stehen mehrere Metho-den zur Verf�gung, die an spezielle Anforderungen tr pf-chenbasierter Mikrofluidiksysteme angepasst sind. BeimHochdurchsatz-Screening wird die Zielprobe unter einerVielzahl von Reaktionsbedingungen getestet, wobei jedeReaktionsbedingung durch unterschiedliche Reagentien oderunterschiedliche Reagenskombinationen definiert sein kann.Bei kinetischen Messungen oder zur Optimierung von Re-aktionsbedingungen werden den Tr pfchen dann nur wenigeReagentien zugesetzt, deren Konzentration aber variiertwerden muss. Bei mehrstufigen Reaktionen muss ein Rea-gens zu einer genau festgelegten Zeit w�hrend des Reakti-onsverlaufs zugesetzt werden. Jede dieser Anwendungen er-fordert eine andere Methode der Reagenszuf�hrung.

2.2.1. Kartuschentechnik

Zum Screening einer Zielprobe gegen eine Vielzahl vonReaktionsbedingungen lassen sich Kartuschenmodule vor-bereiten, in denen ein Array von Ovalkompartimenten ge-speichert ist (Abbildung 6a,b).[42] Jedes Kompartiment defi-niert eine andere Reaktionsbedingung aus unterschiedlichenReagentien. Zum Beispiel wurde ein Array von 48 Oval-kompartimenten von jeweils 15 nLVolumen hergestellt, vondenen jedes ein anderes Reagens enthielt.[42] Die Zielprobekann an einer T-Kreuzung der Mikrokan�le in die vorberei-teten Kompartimente injiziert werden (Abbildung 6c). Rea-genskartuschen k nnen in versiegelten Kapillaren mehrereMonate ohne Verdampfung und Kontakt mit der Umgebungaufbewahrt werden.[42]

Reagenskartuschen werden zum parallelen Screeningeiner Zielprobe gegen eine große Zahl von Reagentien oderReaktionsbedingungen eingesetzt. Mithilfe einer Funktions-einheit zur Tr pfchenaufspaltung wurden z.B. 16 Reagens-

kartuschen mit Ovalkompartimenten von 20 nL aus einemArray von gr ßeren Tr pfchen (ca. 320 nL) parallel herge-stellt.[125] Eine solche parallele Vorbereitung von Reagens-kartuschen erm glicht ein beschleunigtes Hochdurchsatz-Screening. Reagenskartuschen wurden bereits in einer Reihevon F�llen angewendet: zum Screening von Proteinkristalli-sationsbedingungen und in Enzymassays,[42] zum Screeningder Reaktionsbedingungen einer organischen Reaktion[126]

und f�r Immunassays (wobei eine Kartusche mit einemFl�ssig-Luft-Zweiphasensystem eingesetzt wurde).[127]

2.2.2. Variieren der Reagenskonzentration

F�r einige Reaktionen wurden Geschwindigkeitskon-stanten und optimale Reaktionsbedingungen ermittelt, indemdie Reagenskonzentrationen variiert wurden. In einem Fallkonnten in einer laminaren Str mung zwei Reagentien inOvalkompartimenten auf einem Chip verd�nnt werden.[44]

Die Kompartimente wurden aus zwei Reagensstr men undeinem mittigen Pufferstrom erzeugt, der ein vorzeitiges Mi-schen der beiden Reagentien verhindert (Abbildung 7). DieReagenskonzentrationen in den Kompartimenten wurden�ber die relativen Str mungsgeschwindigkeiten der drei

Abbildung 5. Erzeugung von TrApfchen durch StrAmungsfokussie-rung.[111] a) Aufbau der Funktionseinheit; b) Ausschnitt mit dem in (a)eingezeichneten Rechteck. Wiedergabe in ver�nderter Form ausLit. [111]. Copyright 2003 American Institute of Physics.

Abbildung 6. Kartuschenmodule mit Ovalkompartimenten ermAgli-chen das Screening einer Probe gegen vielz�hlige Reagentien im Sub-mikrolitermaßstab.[42,124] a, b) Vier unterschiedliche Reagentien sind ineinem Array von Ovalkompartimenten in einer Kapillare gespeichert.Die Kompartimente sind von einem Fluorkohlenwasserstoff als Trans-portflDssigkeit umgeben sowie (unter b) zus�tzlich durch Luftbl�schengetrennt, um einen Substanzaustausch zwischen den Kompartimentenzu verhindern. Skalierung: 200 mm. c) ProbenzufDhrung zu den Oval-kompartimenten aus einer Kartusche mithilfe einer T-Kreuzung. Dieresultierenden Ovalkompartimente werden in eine Aufnahmekapillaretransportiert und gesammelt. d) Photographie der T-Kreuzungseinheit.Wiedergabe aus Lit. [42] (a,b) und mit Genehmigung von Elsevier ausLit. [124].


Chemie



w�ssrigen L sungen eingestellt (Abbildung 7c). Beispiels-weise f�hrte eine h here Geschwindigkeit der das Reagens Aenthaltenden Str mung (gr�n; 45 nLs�1) zu einem gr ßerenAnteil dieses Reagens im Ovalkompartiment (Abbildung 7c,links).

Mit dieser Technik wurde auch ein Array von Ovalkom-partimenten hergestellt, bei dem jedes Kompartiment vierReagentien in einem anderen Mischungsverh�ltnis ent-hielt.[128] Das Mischungsverh�ltnis wurde computergesteuert�ber die relativen Geschwindigkeiten der Reagensstr meeingestellt. Dadurch lassen sich die Reaktionsbedingungenschnell �ndern, ohne das Experiment zu stoppen oder Rea-gentien zu vergeuden. Die Methode ist nicht auf den in Ab-bildung 7 gezeigten Versuchsaufbau beschr�nkt, sondernauch mit der Str mungsfokussierungstechnik kompatibel(Abbildung 5).

2.2.3. Direkte Injektion von Reagentien in Tr�pfchen

Bei mehrstufigen Reaktionen l�sst man die Reaktions-mischung eine bestimmte Zeitdauer reagieren und setzt dannein weiteres Reagens zu. In der tr pfchenbasierten Mikro-fluidik kann die erste Stufe der Reaktion in einem Oval-kompartiment enthalten sein, das durch den Mikrokanaltransportiert wird. Auf dem weiteren Weg durch das Mikro-kanalnetzwerk kann dann �ber einen Seitenkanal ein Rea-gens f�r die zweite Reaktionsstufe in das Kompartiment in-jiziert werden.

Mithilfe einer T-Kreuzung kann ein Reagens, das durcheinen Seitenkanal transportiert wird, direkt in die Tr pfcheninjiziert werden, wie es in Abbildung 6 am Beispiel der In-jektion einer Zielprobe in ein Array von Ovalkompartimen-

ten gezeigt ist. Wenn allerdings die T-Kreuzung bevorzugtdurch die Transportfl�ssigkeit benetzt wird (z.B. bei einerhydrophoben Kreuzung und w�ssrigen Reagentien), ist dieInjektion des Reagens in ein Kompartiment nur bei kleinenWerten der Kapillarzahl (Ca� 0.01) m glich.[129,130] Bei h -heren Ca-Werten (beispielsweise bei h heren Str mungsge-schwindigkeiten) kann die Injektion durch mechanische Be-wegung des PDMS-Kanals unterst�tzt werden.[129]

F�r den Fall, dass der Seitenkanal bevorzugt durch dieReagensfl�ssigkeit benetzt wird (z.B. bei einem hydrophilenKanal und w�ssrigen Reagentien), wurde eine andere Injek-tionsmethode entwickelt (Abbildung 8a).[131,132] Wenn die

Reagensfl�ssigkeit aus dem Seiten- in den Hauptkanal ein-tritt, bildet sich ein Tr pfchen, das sich wegen der Benetzungdes Seitenkanals erst dann l st, wenn ein Ovalkompartimentdie Kreuzung passiert; dabei wird das Tr pfchen in dasKompartiment aufgenommen.[131] Bei dieser Injektionsme-thode nimmt das Volumen des in das Kompartiment inji-zierten Reagens linear mit der Geschwindigkeit der Rea-gensstr mung im Seitenkanal zu (Abbildung 8b).[132] Mithilfevon Fluoreszenzmessungen wurde gezeigt, dass die Quer-kontamination zwischen den Ovalkompartimenten an der T-Kreuzung minimal war.[131]

Bei Gas-fl�ssig-Systemen mit Zylinderkompartimentenm�ssen die Reagentien der kontinuierlichen Phase zugef�hrtwerden, da dort die Reaktion stattfindet. Eine solche Injek-tion ist recht einfach, da die kontinuierliche Phase immer mitder Mikrokanalwand in Kontakt ist. Allerdings kann, beson-ders bei rechteckigen Mikrokan�len, eine Kontaminierungzwischen den Kompartimenten auftreten. F�r Zylinderkom-partimente wurde gezeigt, dass die kontinuierliche Phase inMikrokan�len mit Tracer-Farbstoffen versetzt werdenkann.[48]

Abbildung 7. Die Reagenskonzentrationen in OvalkompartimentenkAnnen durch On-Chip-VerdDnnung eingestellt werden.[44] a) Experi-menteller Aufbau; das blaue Rechteck markiert den Bereich der in (c)gezeigten Mikrophotographien. b) Diagramm zur Quantifizierung derOn-Chip-VerdDnnung; dargestellt sind die gemessenen Konzentratio-nen, die sich aus der Fluoreszenzintensit�t der durch den Mikrokanaltransportierten Ovalkompartimente ergeben, als Funktion der theoreti-schen Konzentrationen, die sich aus den StrAmungsgeschwindigkeitenvon Reagens A, Reagens B und dem VerdDnnungspuffer ergeben.c) Die Konzentrationen der Reagentien werden durch die relativenGeschwindigkeiten der ReagensstrAme (Werte in Klammern, in nLs�1)eingestellt. Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit. [44]. Copyright 2003American Chemical Society.

Abbildung 8. Injektion einer CaCl2-LAsung in ein Ovalkompartiment(Blut) Dber einen hydrophilen Seitenkanal.[132] a) Mikrophotographien,die die zeitliche Abfolge der Injektion zeigen. b) Das injizierte Volumenwird durch die Geschwindigkeit der CaCl2-StrAmung [mLmin�1] einge-stellt. Jeder Datenpunkt im Diagramm resultiert aus Messungen anzehn Kompartimenten (y=24.947 x�0.2312, R2=0.9849). Wiedergabemit Genehmigung aus Lit. [132]. Copyright 2006 American ChemicalSociety.




2.3. Steuerung der Durchmischung durch chaotische Advektion

Bei chemischen Reaktionen und autokatalytischen Pro-zessen in Mikrokan�len ist es wichtig, die Durchmischung zusteuern.[133,134] Eine schnelle Durchmischung der Reagentienist notwendig, um die Startzeit einer Reaktion genau festle-gen zu k nnen. Die tr pfchenbasierte Mikrofluidik erm g-licht eine schnelle Durchmischung, und der Mischungsgradkann quantitativ erfasst werden.[1, 40,135] F�r eine einphasigemikrofluidische Str mung wurde aufgezeigt, dass ein Rea-gens durch hydrodynamische Fokussierung mit einem großenJberschuss eines zweiten Reagens bei Mischzeiten von nur10 ms gemischt werden kann.[136] Der Mischvorgang lief soschnell ab, dass die Zeitaufl sung kinetischer Messungendurch die Dispersion und nicht durch die Durchmischungbegrenzt war. Durch chaotische Advektion mithilfe von ge-staffelten Mischungseinheiten, deren Kanalw�nde mit Zick-zackstrukturen versehen waren, gelang eine vollst�ndigeDurchmischung von zwei Reagentien im Millisekundenbe-reich bei verringerter Dispersion.[137] Die Technik der chao-tischen Advektion (siehe Abbildung 9 sowie ein Video in den

Hintergrundinformationen) wurde auch auf Tr pfchen an-gewendet.[1,40,46] Das Prinzip der chaotischen Advektion[137–139]

besteht in der wiederholten Faltung und Dehnung der beidenFl�ssigkeitsphasen, wobei eine alternierende Schichtung er-halten wird. Die Dicke der einzelnen Schichten nimmt ex-ponentiell ab (Abbildung 9), sodass schließlich eine schnelleVermischung durch Diffusion eintritt. In Tr pfchen kanndurch chaotische Advektion eine schnelle Vermischung imSubmillisekundenbereich[40] erzielt werden, ohne dass Dis-persion auftritt; dies ist besonders n�tzlich, wenn einerseitseine schnelle Durchmischung erforderlich ist und anderer-seits die Dispersion �ber einen l�ngeren Zeitraum kontrol-liert werden muss.

In Tr pfchen, die durch Mikrokan�le transportiertwerden, existiert eine interne Zirkulation, die zur Verbesse-

rung der Durchmischung in Oval-[37,140–143] und Zylinder-kompartimenten[46,50,144–146] genutzt wurde. In geraden Kan�-len treten in der linken und rechten H�lfte eines Ovalkom-partiments zwei symmetrische Wirbel auf (in der Bewe-gungsrichtung des Kompartiments, Abbildung 3). DieDurchmischung erfolgt durch Konvektion in jeder H�lfte desKompartiments und haupts�chlich durch Diffusion zwischenden beiden H�lften. In gewundenen Kan�len kommt es beijeder Richtungs�nderung zu einer Umorientierung derGrenzfl�che zwischen den beiden H�lften des Ovalkompar-timents, und die nachfolgende Zirkulation f�hrt dann zurDehnung und Faltung der Grenzfl�che (Abbildung 10). Diese

Technik erm glicht eine stark verbesserte Durchmischung(siehe zwei Videos in den Hintergrundinformationen, indenen die Durchmischung in geraden und gewundenen Ka-n�len verglichen wird).

Das Ausmaß der Durchmischung h�ngt von der Zahl derKurven ab und l�sst sich mithilfe von Fluoreszenzbildernquantitativ bestimmen (Abbildung 11). Durch den EinsatzAbbildung 9. Modell fDr die Durchmischung zweier Reagentien durch

chaotische Advektion bei kleinen Reynolds-Zahlen; Photographien vonzwei Schichten Knetmasse, die abwechselnd gedehnt und gefaltetwerden. Die Bilder wurden freundlicherweise von Joshua D. Tice zurVerfDgung gestellt.

Abbildung 10. Durchmischung durch chaotische Advektion in einemOvalkompartiment, das durch einen gewundenen Kanal strAmt. Beider Bewegung des Kompartiments durch die Kurven und geraden Ab-schnitte des Kanals werden die Grenzfl�chen zwischen roten undblauen FlDssigkeiten umorientiert, gedehnt und gefaltet. Wiedergabemit Genehmigung aus Lit. [40]. Copyright 2003 American Institute ofPhysics.

Abbildung 11. Schnelle Durchmischung in TrApfchen durch chaotischeAdvektion.[40] Links: Schema des Mikrofluidiksystems; rechts: a) Hell-feld- und b) Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Ovalkompartimenten,die durch gewundene Kan�le transportiert werden. Die Fluoreszenzentspricht dem zeitlichen Mittel der Fluoreszenzintensit�t von vielenOvalkompartimenten, die innerhalb der Belichtungszeit von zwei Se-kunden das Blickfeld passieren. Die Durchmischung wurde mithilfeeines fluorogenen Substrats (Fluo-4) visualisiert, dessen Fluoreszenzbei Bindung von Ca2+-Ionen ansteigt. Wiedergabe mit Genehmigungaus Lit. [40]. Copyright 2003 American Institute of Physics.


Chemie



eines Schlaglochmischers („bumpy mixer“) (Abbildung 12)lassen sich oszillierende Scherkr�fte zwischen den Oval-kompartimenten erzeugen; dadurch konnten sogar viskosebiologische Proben mit hohen Konzentrationen von Rinder-serumalbumin oder H�moglobin innerhalb von Millisekun-den durchmischt werden.[45] Die bei diesem Mischer beob-achtete Schichtung (Abbildung 12c) �hnelt stark der Schich-tung bei chaotischer Advektion (Abbildungen 9 und 10).

2.4. Steuerung der Grenzfl&chenchemie

In derMikrofluidik spielen Oberfl�cheneffekte wegen deshohen Oberfl�che-Volumen-Verh�ltnisses eine wichtigeRolle. Oberfl�cheneffekte k nnen an der Grenzfl�che zwi-schen der festen Wand des Mikrokanals und der Fl�ssigkeit(fest-fl�ssig) oder an der Grenzfl�che zwischen den beidennichtmischbaren Fl�ssigkeiten imMikrokanal (fl�ssig-fl�ssig)auftreten. F�r ein Molek�l in einem Tr pfchen werden dieWechselwirkungen an der Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�che beson-ders relevant, wenn sich die Gr ße des Tr pfchens demQuotienten Gmax/C0 ann�hert; hier ist Gmax [molm�2] die ma-ximale Oberfl�chenbedeckung, die sich an der Grenzfl�chebei der S�ttigungskonzentration der Molek�le einstellt, undC0 [molm�3] ist die anf�ngliche Konzentration der Molek�le.In einem neueren Aufsatz wird beschrieben, wie sich Grenz-fl�chen zwischen Fl�ssigkeiten und Wechselwirkungen inFl�ssigkeiten mithilfe der Mikrofluidik kontrollierenlassen.[119] Diese Wechselwirkungen k nnen dazu eingesetztwerden, gel ste Stoffe in den Tr pfchen anzureichern,[147] dieAktivit�t von Katalysatoren auf den Mikrokanalw�nden zumaximieren[104] und beschichtete Partikel mithilfe vonGrenzfl�chenreaktionen zu synthetisieren.[112,117] Das hoheOberfl�che-Volumen-Verh�ltnis stellt einen schnellen W�r-meaustausch zwischen den Ovalkompartimenten und derTransportfl�ssigkeit sicher und erm glicht schnelle Tempe-raturwechsel. Ein schneller Temperaturwechsel ist entschei-

dend f�r Anwendungen wie DNA-Amplifikation,[148] In-vitro-Expression von Proteinen in Ovalkompartimenten[149] undDNA-Analyse.[51]

Die Wechselwirkungen an Fest-fl�ssig- und Fl�ssig-fl�s-sig-Grenzfl�chen in Mikrokan�len k nnen f�r bestimmteAnwendungen von Vorteil sein, in anderen F�llen aber auchst ren. Es ist deshalb wichtig, diese Wechselwirkungen be-herrschen zu k nnen. Bei Ovalkompartimenten laufen Re-aktionen in der dispersen Phase ab, die nicht mit der festenWand des Mikrokanals in Kontakt kommt, sondern von einerSchicht der Transportfl�ssigkeit umschlossen ist. Reaktionenin Ovalkompartimenten werden daher vom Oberfl�chenver-halten der Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�che beeinflusst. Bei Zylin-derkompartimenten laufen Reaktion dagegen in der konti-nuierlichen Phase ab, die sowohl mit der Mikrokanalwand alsauch mit der dispersen Phase in Kontakt ist. Reaktionen inZylinderkompartimenten werden daher durch das Oberfl�-chenverhalten sowohl der Fest-fl�ssig- als auch der Fl�ssig-gasf rmig-Grenzfl�che beeinflusst.

Damit in den Mikrokan�len Ovalkompartimente erzeugtwerden k nnen, sollten die Kanalw�nde so behandeltwerden, dass sie bevorzugt von der Transportfl�ssigkeit undnicht von der w�ssrigen Phase benetzt werden. Die Oberfl�-chenspannung zwischen der w�ssrigen Phase und der Trans-portfl�ssigkeit sollte geringer sein als die zwischen der w�ss-rigen Phase und der Kanalwand. Durch Tenside in derTransportfl�ssigkeit l�sst sich die Oberfl�chenspannung ander Grenzfl�che zwischen der w�ssrigen Phase und derTransportfl�ssigkeit verringern. Allerdings sollte die Ober-fl�chenspannung nicht zu klein werden, denn die KapillarzahlCa der Str mung muss einen kleinen Wert haben, damit sichOvalkompartimente bilden k nnen;[38] die Kapillarzahl istdefiniert alsCa= mU/g, wobei m [kgm�1 s�1] die Viskosit�t derFl�ssigkeit, U [ms�1] die Str mungsgeschwindigkeit und g

[Nm�1] die Grenzfl�chenspannung zwischen der w�ssrigenPhase und der Transportfl�ssigkeit ist.

Perfluorierte Kohlenwasserstoffe sind optimale Trans-portfl�ssigkeiten f�r die Erzeugung von Ovalkompartimen-ten. Sie gelten als chemisch und biologisch inert und wurdenals Blutersatzstoffe,[150] zur Fl�ssigkeitsbeatmung vonFeten,[151] zur diagnostischen Ultraschall-Bildgebung,[152] f�rZellkulturen[153,154] und zumWirkstofftransport eingesetzt.[155]

Viele Arten von Fluorkohlenwasserstoffen und fluoriertenTensiden sind kommerziell erh�ltlich (aktuelle Ergebnissezeigen allerdings, dass sich einige fluorierte Tenside in Ge-weben anreichern;[156,157] diese Tenside m�ssen daher vor-sichtig gehandhabt werden). Des Weiteren sind Fluorkoh-lenwasserstoffe und fluorierte Tenside chemisch orthogonalzu Reaktionen in organischen Phasen.[158]

Fluorierte Tenside lassen sich zur Kontrolle der Oberfl�-chenchemie an der Fl�ssig-fl�ssig-Grenzfl�che zwischen derw�ssrigen und der fluorierten Phase einsetzen,[43] �hnlich wieKohlenwasserstofftenside genutzt werden, um Adsorption anGrenzfl�chen zwischen w�ssrigen und Kohlenwasserstoff-phasen zu blockieren.[159–161] Fluorierte Tenside sind in derw�ssrigen Phase unl slich und reichern sich an der Grenz-fl�che zwischen w�ssriger und fluoriger Phase an. Da dieOvalkompartimente von einer d�nnen Schicht der Trans-portfl�ssigkeit umschlossen sind, l�sst sich das Oberfl�chen-

Abbildung 12. Durchmischung von viskosen LAsungen in Ovalkompar-timenten mithilfe eines Schlaglochmischers.[45] a) SchematischerAufbau des Schlaglochmischers mit Kanalwindungen; VL: viskose LA-sungen, X und Y: Reagentien. b) Durchmischung von Ovalkomparti-menten einer LAsung von Rinderserumalbumin (BSA) (200 mgmL�1)und einem Calceinfarbstoff. c) Schichtbildung in Ovalkompartimentenbei der Durchmischung einer H�moglobin- (300 mgmL�1) mit einerBSA-LAsung (260 mgmL�1 mit 5 mm Calcein). Wiedergabe mit Geneh-migung aus Lit. [45]. Copyright 2006 American Chemical Society.




verhalten variieren, indem man, anstatt die Mikrokanalwandzu funktionalisieren, einfach das Tensid in der fluoriertenTransportfl�ssigkeit wechselt. Mit dieser Methode wurde dieAdsorption von Fibrinogen in einem Ovalkompartiment ge-lenkt (Abbildung 13). Ein mit einer Carbons�uregruppeausgestattetes Tensid f�hrte zur Adsorption von Fibrinogenan der Grenzfl�che (Abbildung 13a), w�hrend ein Tensid mitOligoethylenglycol-Kopfgruppe die Adsorption an derGrenzfl�che verhinderte (Abbildung 13b).

2.5. Vereinigen und Aufspalten von Tr�pfchen

Bei mehrstufigen Reaktionen ist es notwendig, Reakti-onsmischungen zu vereinigen und wieder aufzuspalten. Dietr pfchenbasierte Mikrofluidik erm glicht die zeitlicheSteuerung von Wechselwirkungen zwischen Reaktionen.[1]

Reaktionen lassen sich vereinigen, indem man die reagens-haltigen Tr pfchen miteinander vereinigt, und sie lassen sichauftrennen, indem man ein Tr pfchen in zwei kleinereTr pfchen aufteilt (Abbildung 14).[1,162]

Zum Vereinigen und Aufspalten von Tr pfchen wurdenetliche Methoden entwickelt. Um zwei parallele Reaktionenzu kombinieren, kann man zwei Gruppen von Tr pfchen inzwei parallelen Mikrokan�len erzeugen, die sich zu einemHauptkanal vereinigen. Die Tr pfchen der beiden Gruppenwerden sich im Hauptkanal vereinigen, wenn die Tr pfchen-frequenzen aufeinander abgestimmt sind und die Tr pfchenunterschiedliche Gr ßen haben (Abbildung 14a).[1] Die Ver-einigung von mehreren kleinen Tr pfchen mit einem einzel-nen gr ßeren Tr pfchen[163] sowie von zwei gleich großenTr pfchen[164] wurde ebenfalls beschrieben. Die Aufspaltungvon Tr pfchen wurde an sich verengenden T-Kreuzungen(Abbildung 14b)[1,125] und an isolierten Hindernissen unter-sucht.[165]

Zahlreiche Studien besch�ftigten sich mit der Steuerungund Handhabung von Tr pfchen in Mikrokan�len;[166] zu den

Beispielen geh ren das Sortieren von Tr pfchen mithilfe di-elektrophoretischer Kr�fte,[167] Steuerung des Tr pfchenvo-lumens, der chemischen Konzentration und der Tr pfchen-sortierung[168] sowie numerische Studien zu Deformation,Zerfall und Koaleszenz von Tr pfchen.[110,130,169] Vor kurzemwurde eine Methode entwickelt, um Tr pfchen in Mikroka-n�len mithilfe elektrischer Kr�fte zu vereinigen und aufzu-spalten. Hierbei wurden zwei Gruppen von Tr pfchen er-zeugt und die Grenzfl�chen zwischen Transportfl�ssigkeitund w�ssriger Phase mit entgegengesetzten elektrostatischenLadungen versehen (Abbildung 15). Die beiden Tr pfchen-str me wurden synchronisiert und vereinigten sich beim Zu-sammenfluss vollst�ndig im Verh�ltnis 1:1.[170a] Die neutralenTr pfchen ließen sich wieder in zwei entgegengesetzt gela-dene Tr pfchen aufspalten,[170a] die außerdem mithilfe elek-trischer Wechselwirkungen sortiert werden konnten.[170a] Eineweitere Methode steuerte die Koaleszenz von Pfropfen durchWechselstromfelder.[170b] Diese Techniken sollten f�r dieEntwicklung von automatisierten Funktionseinheiten f�r dietr pfchenbasierte Mikrofluidik n�tzlich sein.

2.6. Indizierung von Reaktionsbedingungen mithilfe vonTr�pfchenpaaren

Bei Systemen mit einer großen Zahl von Tr pfchen, dieunterschiedliche Reaktanten enthalten, ist eine Indizierungder Tr pfchen wichtig. Eine M glichkeit besteht in der

Abbildung 13. Steuerung des Oberfl�chenverhaltens von Ovalkomparti-menten mithilfe von Tensiden an der Grenzfl�che zwischen der w�ssri-gen und der fluorigen Phase. a) Ein COOH-Tensid mit fluorierter Sei-tenkette (Rf) erzeugt eine nichtinerte Grenzfl�che, an der Proteine ad-sorbieren. b) Ein Tensid mit fluorierter Seitenkette und einer polarenOligoethylenglycol(OEG)-Kopfgruppe erzeugt eine inerte biokompa-tible Grenzfl�che. Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit. [43]. Copy-right 2005 American Chemical Society.

Abbildung 14. Vereinigen und Aufspalten von TrApfchen in Mikrokan�-len.[1] Links: Aufbau des Mikrofluidiksystems; rechts: Mikrophotogra-phien von Ovalkompartimenten, die durch die Mikrokan�le transpor-tiert werden. a) Spontane Vereinigung von Ovalkompartimentpaarenzu einem einzelnen Ovalkompartiment im Hauptmikrokanal. b) Spon-tane Aufspaltung von Ovalkompartimenten an einer Mikrokanalver-zweigung. Bei gleichen DrDcken in den Auslasskan�len spalten sichdie ursprDnglichen Ovalkompartimente in etwa gleich große TrApfchenauf (Mitte). Bei unterschiedlichen DrDcken in den Auslasskan�lenkommt es zu einer unsymmetrischen Aufspaltung (rechts). Als Trans-portflDssigkeit diente Perfluordecalin (PFD). Wiedergabe aus Lit. [1].


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Zugabe von Reporterfarbstoffen, deren Konzentrationen mitden Reagentien in den Tr pfchen korreliert sind. UmWechselwirkungen der Reporterfarbstoffe mit der chemi-schen Reaktion auszuschließen, kann man die Reaktionsbe-dingungen indizieren, indem man die Tr pfchen paarweise sozusammenfasst, dass in einem Tr pfchen die Reaktion ab-l�uft, w�hrend das andere Tr pfchen die Information trans-portiert (Abbildung 16).[33,41] Mithilfe dieser Tr pfchenpaare

wird die Information �ber die Reaktionsbedingungen r�um-lich organisiert. Ein Tr pfchen des Paares enth�lt das Reak-tionsgemisch, das zweite Tr pfchen enth�lt die Farbstoffe,deren ratiometrische Intensit�t dem Verh�ltnis der Reagen-tien im ersten Tr pfchen entspricht.[33,41]

Tr pfchen in Mikrokan�len k nnen mit alternierenderZusammensetzung (XYXY…) erzeugt werden. Ein Tr pf-

chenpaar besteht aus einem Tr pfchen mit der Zusammen-setzung „X“ und einem mit der Zusammensetzung „Y.“ DieBildung alternierender Tr pfchen in Mikrokan�len wurde alsFunktion der Kapillarzahl und der Str mungsgeschwindig-keiten der w�ssrigen Phase und der Transportfl�ssigkeit un-tersucht.[41] (Ein in den Hintergrundinformationen hinter-legtes Video illustriert die Bildung alternierender Tr pfchenin einem Mikrokanal.)

2.7. Analyse von Tr�pfcheninhalten

Es gibt zwei Methoden, um die Zusammensetzung desReaktionsgemischs und den Reaktionsfortschritt in Tr pf-chen zu analysieren: entweder jedes Tr pfchen einzeln oderviele Tr pfchen zusammen in einer Messung.

Die Einzelanalyse von Tr pfcheninhalten erfordert dieHandhabung kleiner Probenvolumina, meist im Bereich vonFemto- und Mikrolitern. Am h�ufigsten werden Fluores-zenzmethoden f�r Analysen in Mikrofluidikeinheiten einge-setzt, wobei der Inhalt eines einzelnen Tr pfchens mithilfeeines fluorogenen Substrats erfasst wird. Bei integriertenMikrofluidikeinheiten wurde ein elektrophoretisches Ver-fahren angewendet.[51] K�rzlich wurde MALDI-Massen-spektrometrie zur halbquantitativen Charakterisierung vonDesacetylierungen in nanolitergroßen Ovalkompartimenteneingesetzt.[126] Mikrospulen-NMR-Spektroskopie wurde zurAnalyse von kleinen Proben genutzt.[171] Auch R ntgenbeu-gung wurde eingesetzt, um einen einzelnen Proteinkristall ineinem Ovalkompartiment zu analysieren.[34]

Im zweiten Fall besteht die M glichkeit, gesammelteTr pfchen außerhalb oder innerhalb der Mikrofluidikeinheitzu analysieren. F�r eine externe Analyse k nnen die Tr pf-chen in Gef�ßen gesammelt werden, bis das Volumen f�r einevollst�ndige Analyse ausreicht. Diese Methode wird typi-scherweise bei der Synthese von Nanopartikeln verwendet,wo Absorptionsmessungen, Rasterelektronenmikroskopieund �hnliche Verfahren erforderlich sind. F�r On-Chip-Analysen lassen sich zeitaufgel ste Messungen aus einzelnenortsaufgel sten Fluoreszenzmikrophotographien (wie in Ab-bildung 11b gezeigt) erhalten.[1,44] Die Fluoreszenzintensit�tist linear an die Bildung des Reaktionsprodukts gekoppelt.Da keine Dispersion auftritt, l�sst sich die Menge des zumZeitpunkt t gebildeten Produkts aus der im Abstand d zumMikrokanal gemessenen Fluoreszenzintensit�t bestimmen(Abbildung 17). Mit dieser Methode lassen sich kinetischeMessungen im Millisekundenbereich bei Reagensmengen imNanoliterbereich realisieren.[44]

3. Anwendungen von Mikrofluidiktr�pfchen

Die oben beschriebenen Techniken wurden f�r vieleArten von Reaktionen mit paralleler und serieller Reakti-onsf�hrung angewendet. Die Reaktionen teilen wir in f�nfKategorien ein: 1) Enzymkinetik, Enzymassays und DNA-Analyse; 2) Proteinkristallisation; 3) Synthese von Molek�-len; 4) Synthese von Nano- und Mikropartikeln und kolloi-dalen Systemen; 5) Erzeugung von Reaktionsnetzwerken.

Abbildung 16. Konzentrationen in TrApfchen kAnnen durch Erzeugungalternierender TrApfchen in Mikrokan�len indiziert werden.[41] Die ge-zeigte Mikrofluidikeinheit erzeugt TrApfchenpaare R und D ; die TrApf-chen R enthalten die Reagentien und die TrApfchen D die Farbstoffezur Indizierung. Die StrAmungsgeschwindigkeiten von Reagens A undFarbstoff A bzw. von Reagens B und Farbstoff B sind miteinander ge-koppelt (angedeutet durch die gestrichelten Linien). a) Die Konzentra-tionen der Reagentien A und B in R1 sind mit den Konzentrationender Farbstoffe A und B in D1 korreliert, sodass mithilfe der Farbstoff-konzentration in D1 die Reagenskonzentration in R1 indiziert werdenkann. b) Array alternierender TrApfchen. Wiedergabe in ver�nderterForm aus Lit. [41]. Copyright 2004 American Chemical Society.

Abbildung 15. Vereinigen von TrApfchen mithilfe elektrischer Kr�fte.[170a]

a) Durch Anlegen einer elektrischen Spannung an die beiden w�ssri-gen StrAmungen werden TrApfchen mit entgegengesetzten elektrostati-schen Ladungen erzeugt. b) Ohne elektrisches Feld sind Frequenz undZeitpunkt der TrApfchenerzeugung an den beiden KanalmDndungenselbst bei gleicher Infusionsgeschwindigkeit voneinander unabh�ngig.In Gegenwart eines Tensids vereinigten sich die TrApfchen beim Zu-sammenfluss der beiden StrAmungen nicht (Skalierung 100 mm).c) Bei einer angelegten Spannung von 200 V (Abstand der MDndun-gen: 500 mm) werden die TrApfchen gleichzeitig an den KanalmDndun-gen ausgelassen und vereinigen sich beim Zusammenfluss. Wiederga-be in ver�nderter Form aus Lit. [170a].




3.1. Enzymkinetik, Enzymassays und DNA-Analyse in Tr�pfchen3.1.1. Enzymkinetik in Tr�pfchen

Aufgrund mehrerer Vorz�ge, wie schnelle Durchmi-schung (Abschnitt 2.3), biokompatibles Grenzfl�chenverhal-ten (Abschnitt 2.4) und kein Auftreten von Dispersion, wurdedie tr pfchenbasierte Mikrofluidik als bevorzugte Methodef�r Messungen der Einzelumsatzkinetik des Enzyms Rib-onuclease A (RNase A) mit Millisekundenaufl sung ausge-w�hlt (Abbildung 18).[44] Mit der Methode der On-Chip-Verd�nnung (Abschnitt 2.2.2) wurden serielle kinetischeMessungen des RNase-A-Umsatzes bei drei Substratkon-zentrationen ausgef�hrt (Abbildung 18b). Um einen Satzkinetischer Daten zu erhalten, wurde jeweils eine Aufnahmemit zeitlich gemittelten Fluoreszenzintensit�ten analysiert(Abschnitt 2.7); dabei wurden f�r jedes Fluoreszenzbild ca.66 nL der Probel sung ben tigt. Mit der gleichen Methodewurde auch der Umsatz von alkalischer Phosphatase inOvalkompartimenten mit Millisekundenaufl sung kinetischuntersucht.[43] Durch Anwendung eines Schlaglochmischers(Abbildung 12a) gelang es, die Luciferase-Aktivit�t inTr pfchen viskoser L sungen in Millisekundenaufl sung zumessen.[45] Durch Kontrolle der Dispersion konnten Enzym-reaktionen in Ovalkompartimenten auf langsameren Zeit-skalen (im Bereich von Sekunden �ber Minuten bis Stunden)ausgef�hrt werden. Ein Mehrstufenassay zur Messung derBlutgerinnungszeit wurde f�r die tr pfchenbasierte Mikro-fluidik entwickelt, wobei Fibrinkl�mpchen in den Tr pfchendurch den Mikrokanal transportiert wurden, ohne die W�ndezu kontaminieren oder mit ihnen in Kontakt zu kommen.[132]

Ein Enzym-Screening wurde ausgef�hrt, indem mit Enzymenbeladene Ovalkompartimente aus einer Kartusche (Ab-schnitt 2.2.1) mit einer Substratstr mung vereinigt wurden(Abbildung 6).[42]

Mikroreaktoren f�r die In-vitro-Expression von Protei-nen wurden zur gerichteten Proteinevolution eingesetzt. DieGene und das Proteinsubstrat k nnen im gleichen Mikrore-aktor enthalten sein, sodass eine simultane Expression undFunktionspr�fung des Proteins m glich ist.[61,149] In einemMikrofluidiksystem wurden mit zwei w�ssrigen Str mungenTr pfchen mit Subpikolitervolumen erzeugt (Ab-schnitt 2.2.2), die die Komponenten f�r die GFP-Expression –GFP-Codierungsvektor, RNA-Polymerase, Aminos�uren,Nucleotide und ATP – enthielten (GFP = gr�n fluoreszie-rendes Protein).[149] Nach Inkubation bei 37 8C wurde dieExpression von GFP durch hochempfindliche Epifluores-zenzmikroskopie nachgewiesen (Abbildung 19).[149] DiesesVerfahren, das eine einfache Kontrolle der Reagenskonzen-trationen in einer großen Zahl von Tr pfchen erm glicht(Abschnitt 2.2.2), belegt das Anwendungspotenzial von Mi-krofluidiktr pfchen f�r die gerichtete Evolution von Protei-nen.

3.1.2. Verkapselung von Makromolek�len und Zellen in Tr�pfchen

Mit der tr pfchenbasierten Mikrofluidik lassen sichZellkulturen in großem Umfang parallelisieren, wie am Bei-spiel von C.-elegans-Embryonen[172] und mikrobiellenZellen[162, 173,174] gezeigt wurde. Wenn man den Aufenthalteiner Zelle auf ein einzelnes Tr pfchen beschr�nkt, gelingt es

Abbildung 18. Kinetische Analyse des RNase-A-Umsatzes in Ovalkom-partimenten im Millisekundenbereich.[44] a) Links: experimentellerAufbau; rechts: Fluoreszenzmikrophotographie (Falschfarbenbild) derzeitlich gemittelten Intensit�t (Belichtungszeit 2 s) der w�ssrigen Oval-kompartimente und der TransportflDssigkeit. b) Diagramm der experi-mentellen kinetischen Daten fDr drei Substratkonzentrationen bei 0.8(~), 3.3 (&) und 5.8 mm (*); die Daten wurden aus der Analyse vonMikrophotographien, wie in (a) gezeigt, erhalten. Ebenfalls gezeigt istdie Mischungskurve (rechte Koordinatenachse, !), die mit dem Fluo-4/Ca2+-System in der gleichen Mikrofluidikeinheit erhalten wurde. Diedurchgezogenen Linien sind Angleiche an den Reaktionsverlauf, wobeidie Durchmischung miteinbezogen wurde. Wiedergabe mit Genehmi-gung aus Lit. [44]. Copyright 2003 American Chemical Society.

Abbildung 17. Kinetische Messungen durch Analyse einer einzelnenMikrophotographie von TrApfchen, die durch einen Mikrokanal trans-portiert werden.[44] Die roten Punkte entsprechen Zeitpunkten tn, unddas blaue Rechteck markiert den Bereich der Fluoreszenzmikrophoto-graphie. Die zu untersuchende Reaktion in den TrApfchen sollte eineQnderung der Fluoreszenz zur Folge haben (wie in Abbildung 11b).Der zeitliche Ablauf der Reaktion wird erhalten, indem man in der Mi-krophotographie die Fluoreszenzintensit�t an den einzelnen Positionen(rote Kreise) bestimmt. Mithilfe der angegebenen Gleichung kAnnendie zeitlichen Differenzen zwischen den einzelnen Zeitpunkten berech-net werden; Dtn [s] ist das Zeitintervall zwischen tn und tn+1 (n=1–8,entsprechend den einzelnen Mikrokanalabschnitten im Sichtfeld derMikrophotographie), m=1.5, l=0.9 mm, U=106 mms�1. Wiedergabemit Genehmigung aus Lit. [44]. Copyright 2003 American Chemical So-ciety.


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relativ leicht, geringste Mengen von Molek�len nachzuwei-sen, die von der Zelle abgegeben werden.

Durch die Verkapselung von einzelnen Zellen in Tr pf-chen konnten Enzymassays von einzelnen Zellen durchge-f�hrt werden.[175] Hierbei lassen sich mithilfe spezieller T-Kan�le Tr pfchen mit einem festgelegten Femtolitervolumenerhalten. Vor der Tr pfchenbildung wird eine einzelne Zelleaus der w�ssrigen L sung ausgew�hlt und mithilfe einer op-tischen Falle zur Grenzfl�che der w�ssrigen Transportfl�s-sigkeit bewegt.[175] Die Zelle wird dann im sich bildendenTr pfchen verkapselt. Shnliche selektive Verkapselungengelangen auch mit Polystyrolk�gelchen und einzelnen Mito-chondrien.[175] In einem Beispiel wurde eine einzelne Mast-zelle in einem Tr pfchen verkapselt, das ein fluorogenesSubstrat enthielt (Abbildung 20a). Unter dem Fluoreszenz-

mikroskop erschien das Tr pfchen dunkel (Abbildung 20b),solange die Zelle nicht photolysiert wurde. Nach der Photo-lyse (Abbildung 20c) wurde das intrazellul�re Enzym b-Ga-lactosidase freigesetzt, das das Substrat spaltet und so dieFluoreszenz des Tr pfchens ausl st (Abbildung 20d).[175] Ineiner Mikrofluidikeinheit mit integrierten Heiz- und K�hl-elementen wurden auch Zylinderkompartimente zur Zelllyseund zum Nachweis der transienten Antworten des MAPK-Signalwegs eingesetzt.[176]

K�rzlich wurden Mikrofluidiktr pfchen auch zur Erzeu-gung von Lipidvesikeln genutzt, in denen biologische Ma-kromolek�le oder Zellen verkapselt wurden. Zun�chstwurden w�ssrige Tr pfchen erzeugt, wobei Nls�ure, in derPhospholipide gel st waren, als Transportfl�ssigkeit (konti-nuierliche Phase) diente.[177] Diese Wasser-Lipid-Emulsionwurde in eine EtOH/H2O-L sung gegeben, wobei die Nl-

s�ure extrahiert wurde und die Phospholipide Vesikel bilde-ten.[177] Zur Verkapselung von biologischen Molek�len oderZellen wurden f�r die anf�ngliche Tr pfchenerzeugungw�ssrige L sungen verwendet, die die zu verkapselndenObjekte enthielten (Abbildung 21).[177] Zellen, die mit dieserMethode in Vesikeln verkapselt wurden, blieben f�r 2 h le-bensf�hig.[177] Dieses Verfahren ist ein einstufiger Prozess undkommt ohne toxische L sungsmittel aus.[177]

3.1.3. DNA-Analyse

Die Verwendung von Zylinderkompartimenten als Mi-kroreaktoren wird durch die Entwicklung eines integriertenDNA-Analysators illustriert.[51] Mit einem solchen Analysa-tor k nnen nanolitergroße Proben in Zylinderkompartimen-ten gehandhabt und analysiert werden. Ein hydrophiler Mi-krokanal mit einem hydrophoben Abschnitt auf der Ober-fl�che wird durch Kapillarkr�fte mit einer w�ssrigen L sungder Probe oder des Reagens gef�llt, bis die L sung den hy-drophoben Abschnitt erreicht (Abbildung 22).[51, 178] Dannwird durch Druck eine Luftblase erzeugt, die ein Zylinder-kompartiment mit einem Nanolitervolumen erzeugt unddurch den Kanal transportiert (Abbildung 22). Schließlichwerden die Zylinderkompartimente, die die Probe enthalten,mit den Zylinderkompartimenten der Reagensstr mungvereinigt und in der Reaktionskammer erhitzt. Nach demEnde der Reaktion werden die Zylinderkompartimentedurch Druck zum Elektrophoresekanal transportiert, wo eineOn-Chip-Trennung und Detektion durchgef�hrt wird. AuchDNA-Polymerasekettenreaktionen wurden in Zylinder-[148a,b]

und Ovalkompartimenten[148c] ausgef�hrt.

Abbildung 20. Ein Enzymassay fDr eine einzelne Mastzelle in einemTrApfchen.[175] a, c) Hellfeldaufnahmen; b,d) Fluoreszenzaufnahmen.Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit. [175]. Copyright 2005 AmericanChemical Society.

Abbildung 21. Fluoreszenzmikrophotographien von a) fluoreszierendenGFP-Proteinen, die in DOPC-Vesikeln verkapselt wurden, b) einer ein-zelnen HeLa-Zervixkarzinomzelle (Durchmesser 10 mm), die in einemDOPC-Vesikel verkapselt wurde, und c) einer MCF7-Brusttumorzelle ineinem DMPC-Vesikel. Wiedergabe aus Lit. [177]. Copyright 2006 Ameri-can Chemical Society. DOPC = Dioleoylphosphatidylcholin, DMPC =Dimyristoylphosphatidylcholin.

Abbildung 19. In-vitro-Translation von GFP in TrApfchen.[149] a) Fluores-zenzmikrophotographie der TrApfchen nach der GFP-Expression. DieTrApfchen wurden in einer Mikrovertiefung gesammelt. b) Fluoreszenz-spektren von GFP; gestrichelte Linie: kommerziell erh�ltliche Protein-probe in w�ssriger LAsung, durchgezogene Linie: einzelnes TrApfchennach In-vitro-Expression. Wiedergabe aus Lit. [149].

Abbildung 22. Optische Mikrophotographie des Injektionsteils einesintegrierten DNA-Analysators. Wiedergabe aus Lit. [51]. Copyright 1998AAAS.




3.2. Proteinkristallisation in Mikrofluidiktr�pfchen

Ein wichtiger Schritt bei der Strukturaufkl�rung vonProteinen durch R ntgenbeugung ist das Z�chten von Kris-tallen hoher Qualit�t. Normalerweise werden Kristalle mitder Mikrobatch- oder Dampfdiffusionsmethode gez�chtet.Bei den Mikrobatchmethoden wird ein mikrolitergroßerTropfen, der die Proteinprobe und die F�llungsreagentienenth�lt, unter einer Nlschicht inkubiert. Bei den Dampfdif-fusionsmethoden wird ein mikrolitergroßes Tr pfchen, dasdie Proteinprobe und die F�llungsreagentien enth�lt, nebeneinem Reservoir platziert, das ein Trockenmittel in hoherKonzentration enth�lt. Das Trockenmittel entzieht demTr pfchen Wasser, sodass sich die Jbers�ttigung im Tr pf-chen erh ht und so die Keimbildung und das Kristallwachs-tum beschleunigt werden.

Proteinproben stehen meist nur in einer begrenztenMenge zur Verf�gung; daher wurden Strategien zur Minia-turisierung von Kristallisationsverfahren entwickelt, die ent-weder auf Robotortechnik[179, 180] oder Mikrofluidiksystemenmit Mikroventilen[24–26] beruhen. In Mikrofluidikkan�lenk nnen nanolitergroße Tr pfchen erzeugt werden, sodass ca.10 mL einer Proteinprobe gen�gen, um 1000 Kristallisations-proben anzusetzen. Im Folgenden werden wir diskutieren,wie sich mit Mikrofluidiktr pfchen sowohl Mikrobatch- alsauch Dampfdiffusionsmethoden realisieren lassen, wie manR ntgenbeugungsmessungen auf einem Chip durchf�hrenkann und wie sich der Einfluss der Durchmischung auf dieKeimbildung und das Kristallwachstum von Proteinen un-tersuchen l�sst.

3.2.1. Proteinkristallisation durch Sparse-Matrix- undGradientenscreening

Die Z�chtung eines Proteinkristalls verl�uft bei der Mi-krobatchmethode in zwei Schritten. Zuerst m�ssen sehr vieleKristallisationsreagentien (eine bestimmte Kombination ausPuffer, F�llungsreagentien und Polymerl sung) zusammenmit dem Protein getestet werden, um eine geeignete Kombi-nation von Reagentien zu finden, mit der sich Proteinkristalleerzeugen lassen (Sparse-Matrix-Screening). Danach folgt f�rjedes Reagens der vorselektierten Kombination ein Fein-screening, um Kristalle in Beugungsqualit�t zu erhalten(Gradientenscreening).

Sparse-Matrix-Screenings wurden mithilfe der tr pf-chenbasierten Mikrofluidik ausgef�hrt, indem die Protein-probe zu einem Array aus Kristallisationsreagentien gegebenwurde, das in einem Kartuschenmodul (Abschnitt 2.2.1) vor-bereitet war.[42] Die Kartusche enthielt 48 Ovalkomparti-mente mit unterschiedlichen Kristallisationsbedingungen, die�ber eine T-Kreuzung mit dem Protein Thaumatin versetztwurden. Die resultierenden Ovalkompartimente wurden ineine Glaskapillare transportiert, versiegelt und zur Kristall-z�chtung inkubiert. Die Proben konnten in der Glaskapillare�ber ein halbes Jahr aufbewahrt werden, ohne dass Ver-dampfung auftrat.[42] Die gebildeten Proteinkristalle in derKapillare wurden mit einem Hellfeld-Polarisationsmikroskopdetektiert.

Gradientenscreenings mit computergesteuerten Str -mungsgeschwindigkeiten der Reagentien wurden mithilfeeines Tr pfchenarrays ausgef�hrt (Abbildung 23).[128] DieReagenskonzentrationen werden �ber die Str mungsge-schwindigkeiten ver�ndert (Abschnitt 2.2.2), und f�r denScreeningvorgang werden die Reagensstr me angehalten unddie Tr pfchen zur Bestimmung der optimalen Kristallisati-onsbedingungen inkubiert.

3.2.2. Proteinkristallisation durch Dampfdiffusion in Tr�pfchen

Bei der Dampfdiffusionsmethode wird mithilfe einesReservoirs, das die L sung eines Trockenmittels enth�lt (z.B.eine konzentrierte Salzl sung), die Diffusion von Wasser-dampf aus dem kristallisathaltigen Tropfen beschleunigt. ZurAnwendung dieser Methode in der tr pfchenbasierten Mi-krofluidik wurden Paare mit alternierenden Ovalkomparti-menten erzeugt (Abschnitt 2.6), wobei ein Tr pfchen dasProtein und die F�llungsreagentien und das andere Tr pfcheneine konzentrierte Salzl sung enthielt (Abbildung 24).[34] Bei

Abbildung 23. Verwendung von TrApfchen fDr ein Gradientenscreeningvon Proteinkristallisationsbedingungen.[128] a–c) Die Konzentrationender Kristallisationsreagentien (PEG, Puffer, Protein und NaCl) wurdenDber die relativen StrAmungsgeschwindigkeiten der Reagentien variiert.d) Experimentelle Charakterisierung des Gradientenscreenings: Pro Se-kunde wurden zwei TrApfchen mit einem Volumen von 7.5 nL erzeugt,und jeder Datenpunkt entspricht einem TrApfchen. Wiedergabe mitGenehmigung aus Lit. [128]. Copyright 2003 American ChemicalSociety.

Abbildung 24. Alternierende TrApfchen kAnnen fDr die Dampfdiffu-sionsmethode zur Proteinkristallisation eingesetzt werden.[34] Mikro-photographien eines Paares alternierender TrApfchen 0 h (links) und24 h (rechts) nachdem die TrApfchen in die Kapillare transportiertwurden. Nachdem das Volumen des TrApfchens mit der ProteinlAsungum 50% abgenommen hatte, bildete sich ein Proteinkristall. Die ge-strichelten Linien kennzeichnen die Grenzfl�che zwischen den w�ssri-gen TrApfchen und der TransportflDssigkeit. Wiedergabe aus Lit. [34].


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der Erzeugung der Ovalkompartimente wurde eine wasser-permeable Transportfl�ssigkeit verwendet, um den Wasser-austausch zwischen den Tr pfchen zu erm glichen.

3.2.3. Bestimmung von Proteinstrukturen durch On-Chip-R�ntgenbeugung und In-situ-Strukturaufkl&rung

F�r R ntgenbeugungsmessungenm�ssen die Kristalle derProteinl sung entnommen, mit einem Frostschutzmittel be-handelt, gefroren und schließlich auf das R ntgendiffrakto-meter montiert werden. Da die Handhabung der Kristalle oftschwierig ist, wurde versucht, eine In-situ-Methode zu ent-wickeln. Tats�chlich gelang es, durch Kristallz�chtung inOvalkompartimenten innerhalb r ntgendurchl�ssiger Kapil-laren direkte Beugungsbilder von Thaumatin-Kristallen zuerhalten (Abbildung 25).[34]

Da Kristalle durch die R ntgenstrahlung besch�digtwerden, ist es kaum m glich, von einem einzelnen Kristalleinen vollst�ndigen Satz von Beugungsdaten zu erhalten,ohne den Kristall einzufrieren. Ein vollst�ndiger Datensatzl�sst sich jedoch erhalten, wenn man viele Kristalle in derMikrofluidikkapillare z�chtet und die Daten der einzelnenKristalle aufsummiert. Dieses Konzept der In-situ-Struktur-aufkl�rung[181] wurde an Modellproteinen in Ovalkomparti-menten demonstriert.[182] Ob die Methode als allgemeinesVerfahren zur Strukturaufkl�rung von Proteinen geeignet ist,bleibt als wichtige Frage zu kl�ren.

3.2.4. Einfluss der Durchmischung auf die Proteinkristallisation

Eine unzureichende Durchmischung wurde als m glicheUrsache von Unstimmigkeiten bei Batch-Kristallisationen

vermutet. Unter typischen Laborbedingungen l�sst sich dieDurchmischung nicht einfach steuern, und mit konventio-nellen Pipettiermethoden ist der Einfluss der Durchmischungschwierig zu untersuchen. In Mikrofluidiktr pfchen kannman dagegen die Durchmischung gut kontrollieren (Ab-schnitt 2.3), und der Einfluss der Durchmischung auf dieKeimbildung von Proteinkristallen wurde entsprechend inOvalkompartimenten untersucht (Abbildung 26).[183] Mit zu-nehmender Jbers�ttigung (gemessen an den Konzentratio-nen von Protein und F�llungsreagens) nimmt die Keimbil-dungsgeschwindigkeit stark zu (quadratisch exponentiell). DaF�llungsreagentien (meist kleine Molek�le oder Salze)schneller als das Protein diffundieren k nnen, ist die Jber-s�ttigung an den Grenzfl�chen zwischen der Proteinl sungund der F�llungsreagensl sung gr ßer als die Jbers�ttigungin der L sung nach der Durchmischung. In Ovalkomparti-menten konnte die Lebensdauer der Grenzfl�che zwischenProtein- und Salzl sung �ber die Durchmischung gesteuertwerden. Bei langsamer Durchmischung ergab sich eine langeLebensdauer der Grenzfl�che und somit eine verst�rkteKeimbildung (Abbildung 26b), wohingegen eine schnelleDurchmischung zu einer kurzen Lebensdauer und wenigerKeimbildungen f�hrte (Abbildung 26c).

3.3. Synthesen in Mikrofluidiktr�pfchen3.3.1. Organische Molek�le

Organische Synthesen wurden in der Mikrofluidik sowohlin Oval- als auch in Zylinderkompartimenten ausgef�hrt,wobei die Vorteile der Miniaturisierung und eines einfachenW�rme- und Massetransfers im Vordergrund standen. Bei-spiele f�r einstufige Reaktionen in Ovalkompartimenten sinddie Nitrierung von Benzol,[184–186] die Extraktion von S�ureaus Kerosin,[187] die Fluorierung von Aromaten,[49] die Bro-mierung von Alkenen[188] und F�llungsreaktionen.[189] In einerzweistufigen Reaktion wurden Monomer- und Novolak-Azofarbstoffe in Ovalkompartimenten synthetisiert.[47] DieSegmentierung von Proben in Zylinderkompartimenten ver-besserte die Hybridisierungseffizienz auf DNA-Mikroar-rays.[190]

Abbildung 25. On-Chip-RAntgenbeugung an einem Thaumatin-Kristallin einer Kapillare.[34] Wiedergabe aus Lit. [34].

Abbildung 26. Der Einfluss der Durchmischung auf die Keimbildungvon Proteinkristallen wurde mithilfe von MikrofluidiktrApfchen unter-sucht.[183] a) Experimenteller Aufbau. b) Bei niedriger StrAmungsge-schwindigkeit wurde F�llung beobachtet (oberes Bild). Ausmaß derF�llung und GrAße der Mikrokristalle nahmen in den Ovalkomparti-menten zu (unteres Bild). c) Bei hAherer StrAmungsgeschwindigkeitwurden weniger und grAßere Kristalle beobachtet (unteres Bild). Wie-dergabe mit Genehmigung aus Lit. [183]. Copyright 2005 AmericanChemical Society.




Bei heterogenen Reaktionen zwischen mehreren Phasenist der Stofftransport von entscheidender Bedeutung. Re-produzierbare Str mungsmuster in der tr pfchenbasiertenMikrofluidik erm glichen einen wirksamen und gut kontrol-lierbaren Stofftransport zwischen den Phasen.[96] Dies machtdie Mikrofluidik zu einer geeigneten Methode, um den Ein-fluss des Stofftransports bei heterogenen Reaktionen zu un-tersuchen. Ein Beispiel ist die katalytische Hydrierung un-ges�ttigter Aldehyde, an der drei Phasen beteiligt sind: diew�ssrige Phase mit dem [RuII(tppts)]-Katalysator (tppts =

Triphenylphosphantrisulfonat), die organische Phase mit denunges�ttigten Aldehyden und die Gasphase bestehend ausH2. In den Kapillaren wurden alternierend (Abschnitt 2.6)w�ssrige Tr pfchen und H2-Bl�schen in einem organischenSolvens erzeugt, das als Transportfl�ssigkeit diente (Abbil-dung 27).[191] Der Stofftransport zwischen den Phasen wurde

�ber die Str mungsgeschwindigkeiten und den Kapillar-durchmesser gesteuert. Die Studie zeigte, dass der Stoff-transport der geschwindigkeitsbestimmende Faktor der Re-aktion ist.[191]

Ein wichtiger Aspekt bei der Optimierung von Reaktio-nen mit wertvollen Substraten ist die Verringerung des Sub-stanzverbrauchs. Indem die Reaktionen in Ovalkomparti-menten ausgef�hrt werden, l�sst sich der Substratverbrauchpro Reaktion auf den Nanoliterbereich reduzieren. Zur Op-timierung einer organischen Reaktion[126] wurde eine Kartu-sche mit unterschiedlichen Reaktionsbedingungen verwendet

(Abschnitt 2.2.1) (Abbildung 28), und die Ovalkomparti-mente aus der Kartusche wurden mit der Substratl sungvereinigt (Abschnitt 2.2.3). Bei der selektiven Desacetylie-rung des Substrats Hexaacetylouabain (Ac6-OUA) wurdenweniger als 1 mg Ac6-OUA pro Reaktion ben tigt. Anders alsbei einem Screening mit Mikrotiterplatten ben tigt das Mi-krofluidiksystem nur zwei Injektionspumpen f�r die Steue-rung der Str mungen. Zudem tritt keine Verdampfung auf.Zur Analyse der nanolitergroßen Tr pfchen wurde dieMALDI-Massenspektrometrie als halbquantitative Detek-tionsmethode eingesetzt (Abbildung 28b).[126]

3.3.2. Synthese monodisperser Nanopartikel

Bei der Synthese von monodispersen Polymeren undNanopartikeln ist die Kenntnis der kinetischen Parametersowie eine genaue Kontrolle der Reaktionszeit erforderlich.Die Kompartimentierung und schnelle Durchmischung (Ab-schnitt 2.3) in einem Mikrofluidiksystem stellt einen defi-nierten Reaktionsbeginn und eine enge Verteilung der Ver-weildauer sicher. Auf diese Weise gelang z.B. die Synthesevon Kieselgelpartikeln mit einheitlicher Gr ße in fl�ssigenZylinderkompartimenten.[192] Durch Variieren der Str -mungsgeschwindigkeit und damit der Verweildauer konntedie Gr ße der Nanopartikel eingestellt werden (Abbil-dung 29).[48,129,192] Eine reproduzierbare Synthese von CdSe-Nanopartikeln bei erh hten Temperaturen gelang mit Mi-krofluidikeinheiten in Oval-[116a] und Zylinderkompartimen-ten.[116b]

Eine mehrstufige Synthese von CdS- und CdS/CdSe-Kern-Schale-Nanopartikeln wurde in den Ovalkomparti-

Abbildung 27. Katalytische Mehrphasenreaktion zur Hydrierung unge-s�ttigter Aldehyde durch Anwendung alternierender TrApfchen/Gas-bl�schen.[191] Photographie einer Kapillare (Durchmesser 750 mm), diealternierend H2-Bl�schen und w�ssrige TrApfchen enth�lt. Ein organi-sches LAsungsmittel (Toluol oder Hexan) bildet die kontinuierlichePhase, in der der unges�ttigte Aldehyd gelAst ist. Wiedergabe ausLit. [191].

Abbildung 28. Test organischer Reaktionsbedingungen in Ovalkompar-timenten mit nachfolgender Analyse mit MALDI-MS.[126] a) Aufbau fDrdie serielle ZusammenfDhrung von Ovalkompartimenten, die die Rea-gentien enthalten, mit der StrAmung der SubstratlAsung. „PEEK Tee“ist ein kommerziell erh�ltliches T-StDck. b) Zur Analyse werden dieOvalkompartimente, in denen die Reaktion abl�uft, auf eine MALDI-Platte pipettiert. Wiedergabe aus Lit. [126]. Copyright 2006 AmericanChemical Society.

Abbildung 29. Synthese monodisperser Kieselgelpartikel in einem Re-aktor mit segmentierter StrAmung (segmented-flow reactor, SFR).[192]

Unterschiedliche Verweilzeiten t [min] fDhrten zu Kieselgelpartikeln mitunterschiedlichen mittleren Durchmessern davg [nm]. Abgebildet sindRasterelektronenmikroskopie(REM)-Aufnahmen fDr a) t=9 min,davg=407 nm und b) t=14 min, davg=540 nm. c) REM-Bild der in (b)gezeigten Probe mit geringerer VergrAßerung. d) Standardabweichungs des mittleren Durchmessers als Funktion von t fDr Partikel, die miteinem SFR oder einem Batch-Reaktor erzeugt wurden. Wiedergabe mitGenehmigung aus Lit. [192]. Copyright 2004 American ChemicalSociety.


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menten einer PDMS-Mikrofluidikeinheit ausgef�hrt. Eswurden mehr Nanopartikel erzeugt, wenn ein Abfangreagens�ber einen Seitenkanal zugegeben wurde (Abschnitt 2.2.3)(Abbildung 30).[129] Auch die Synthese von Partikeln mitKern-Schale-Struktur wurde durch die Zugabe eines Ab-fangreagens erm glicht.

3.3.3. Synthese von Mikropartikeln mit maßgeschneiderterMorphologie

Die M glichkeit, Mikropartikel mit einheitlich maßge-schneiderter Morphologie herstellen zu k nnen, ist einewichtige Voraussetzung f�r Anwendungen im Wirkstoff-transport, in elektro-optischen Funktionseinheiten und in derKatalyse.[193] Die meisten Methoden zur Herstellung solcherPartikel[117,194] sind entweder teuer oder speziell auf eine be-stimmte Partikelsorte zugeschnitten und nicht allgemeineinsetzbar.[195] Da Tr pfchen in Mikrofluidikeinheiten miteinheitlicher Gr ße und Form erzeugt werden k nnen,wurden sie als Mikroreaktoren zur Selbstorganisation vonGel-Emulsionen[196] und von Kolloidpartikeln in dreidimen-sionalen[197] und periodischen zweidimensionalen[198] Struk-turen untersucht. Das „Einfrieren“ dieser einheitlichenTr pfchen durch Grenzfl�chenpolymerisation oder Verfesti-gung der Volumenphase ist eine erfolgversprechende Me-thode f�r die Synthese von Mikropartikeln mit maßge-schneiderten Formen.

Mit einer Mikrofluidikeinheit zur axialsymmetrischenStr mungsfokussierung wurden einheitliche Kapseln synthe-tisiert (Abbildung 31a). Dabei bestand die disperse Phase auseiner w�ssrigen L sung von 1,6-Hexandiamin und die konti-

nuierliche Phase aus Hexadecan mit Adipoylchlorid.[117] Beider Polymerisation von 1,6-Hexandiamin und Adipoylchloridan der Grenzfl�che zwischen der w�ssrigen und der Hexa-decan-Phase wurde eine semipermeable Membran (Abbil-dung 31c) aus Nylon-6,6 gebildet, die die Tr pfchen derw�ssrigen Phase umgab.[117] Durch Justierung der Str -mungsgeschwindigkeiten der dispersen und der kontinuierli-chen Phase konnte der Durchmesser der Kapseln eingestelltwerden. Es ist m glich, die Kapseln zu funktionalisieren,indem Mikro- oder Nanopartikel der dispergierten Phasezugesetzt werden. Zum Beispiel wurden superparamagneti-sche Eisenoxid-Nanopartikel der w�ssrigen L sung zugesetzt,und die erhaltenen Kapseln konnten dann mit einem Mag-netfeld angesteuert werden (Abbildung 31b).[117] Semiper-meable Polyamidkapseln wurden mithilfe einer tr pfchen-erzeugenden Einheit synthetisiert, die ohne Mikrofabrikati-onsmethoden hergestellt wurde.[112] Hefezellen wurden inTr pfchen verkapselt, indem f�r die Kapselbildung die�ußere Schale der Tr pfchen polymerisiert wurde.[199]

Feste Partikel mit maßgeschneiderter Form k nnen inzwei Schritten hergestellt werden, indem zuerst in Mikro-fluidikeinheiten einheitliche Tr pfchen mit der gew�nschtenForm erzeugt werden und dann der Inhalt der Tr pfchenverfestigt wird. Diese Methode l�sst sich allgemein zur Her-stellung von Mikropartikeln verschiedener Materialien ein-setzen, denn dieMorphologie der Tr pfchen wird nur von denphysikalischen Eigenschaften der Fl�ssigkeiten und von denBetriebsbedingungen (Str mungsgeschwindigkeiten undGeometrie der Mikrofluidikeinheit) bestimmt. Wenn dieStr mungsgeschwindigkeit erh ht wird, nimmt das Tr pf-chenvolumen zu, und die Tr pfchenform ver�ndert sich voneiner kugelf rmigen zu einer asph�rischen Form, die dieW�nde des Mikrokanals ber�hrt. Die Verfestigung der

Abbildung 30. Mehrstufige Synthese von Nanopartikeln in Mikroflui-diktrApfchen im Millisekundenbereich.[129] a) Experimenteller Aufbau.b) UV/Vis-Spektren von vier Arten von CdS-Nanopartikeln; Synthese-bedingungen: 1) CdCl2/Na2S 20:1, Abfangreagens Methylpropions�ure(MPA) (schwarz); 2) CdCl2/Na2S 10:1, Abfangreagens MPA (rot);3) CdCl2/Na2S 1:1, Abfangreagens Na2S (blau). 4) CdS/CdSe-Kern-Schale-Nanopartikel, synthetisiert mit CdCl2/Na2S 1:1 und Abfangrea-gens Na2Se (grDn). Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit. [129].Copyright 2004 The Royal Society of Chemistry.

Abbildung 31. Herstellung von Nylon-beschichteten w�ssrigen TrApf-chen durch Grenzfl�chenpolymerisation an der FlDssig-flDssig-Grenz-fl�che der TrApfchen.[117] a) Kapseln mit einer engen GrAßenverteilungwurden mithilfe einer Mikrofluidikeinheit mit axialsymmetrischer StrA-mungsfokussierung hergestellt. b) Es kAnnen Kapseln hergestelltwerden, die magnetische Partikel enthalten, die sich im Magnetfeldausrichten. c) Mit NaCl versetzte Kapseln werden bei Zugabe vonEthanol dehydratisiert (Bild 1). Wenn Ethanol gegen Wasser ausge-tauscht wird, beginnt die Membran zu quellen (Bilder 2–4). Nach 30 sist die Kapsel vollst�ndig gequollen (Bild 4). Wiedergabe aus Lit. [117].




Tr pfchen erfolgt durch photoinduzierte Polymerisation,thermisch induzierte Gelbildung oder Fl�ssig-fest-Phasen-�berg�nge. Mit dieser Vorgehensweise wurden monodispersePartikel mit verschiedenen Morphologien (sph�risch, zylin-drisch und st�bchenf rmig) hergestellt (Abbildung 32).[194]

Mit �hnlichen oder modifizierten Methoden wurden mono-disperse Polymerpartikel mit unterschiedlichen Funktionali-t�ten erzeugt, z.B. Partikel mit asph�rischen Formen,[200]

molekular gepr�gte Polymerk�gelchen,[201] Kern-Schale-Strukturen,[195] Partikel, die immobilisierte Biokatalysatorenenthielten,[202] zweifarbige K�gelchen[203,204] und Partikel ausbiologisch abbaubaren Mikrogelen.[205]

Tr pfchen, die wiederum kleinere Tr pfchen enthalten,werden als Doppelemulsionen bezeichnet; sie finden vielf�l-tige Anwendungen in Bereichen wie der Lebensmitteltech-nologie bis zur Pharmazeutik.[206] Monodisperse Doppel-emulsionen und Kern-Schale-Strukturen mit verschiedenenGr ßen und Zusammensetzungen wurden mithilfe dertr pfchenbasierten Mikrofluidik hergestellt.[206–208] Doppel-emulsionen, deren Tr pfchen jeweils zwei Tr pfchen mitunterschiedlichem Inhalt enthielten, wurden mithilfe alter-nierender Tr pfchenstr me erzeugt (Abschnitt 2.6) (Abbil-dung 33).

3.4. Aufbau funktionaler Reaktionsnetzwerke

Viele biologische Funktionen (z.B. Selbstregulation,Energieumwandlung und Signalverst�rkung) beruhen aufNetzwerken aus miteinander wechselwirkenden enzymati-schen Reaktionen. Solche funktionalen Netzwerke aus che-mischen Reaktionen sind Nichtgleichgewichtssysteme, undihr Aufbau ist ein interessantes und schwieriges Problem.Mikrofluidiktr pfchen bieten eine M glichkeit, Reaktionenfern vom Gleichgewichtszustand zu halten, indem �ber dieFl�ssigkeitsstr mungen Reagentien zugef�hrt oder Produkteentfernt werden. Auch k nnen Reaktionen so gesteuertwerden, dass sie „zur rechten Zeit am rechten Ort“ ablaufen.

Ein Reaktionsnetzwerk, das eine Signalverst�rkungs-funktion mit einem Schwellenansprechverhalten aufweist,wurde mithilfe von Mikrofluidiktr pfchen realisiert. Dazuwurde eine autokatalytische Reaktion in unterschiedlicheOvalkompartimente aufgeteilt, die dazu dienten, die Wech-selwirkungen zwischen den Reaktionen zu kontrollieren. DieOxidation eines Co3+-Komplexes mit KHSO5 erzeugt Co

2+-Ionen, die die Reaktion und damit ihre eigene Bildung ka-talysieren (Abbildung 34a).[163] Hierbei f�hrt die Oxidationdes Liganden zur Dissoziation des Komplexes und zur Frei-setzung des instabilen Co3+-Ions, das durch die Nebenpro-dukte der Ligandenoxidation reduziert wird. Ohne Co2+-Ionen verl�uft die Reaktion mit einer sehr geringen An-fangsgeschwindigkeit, allerdings ist die Reaktionsmischungnicht im Gleichgewicht. Da die Reaktion autokatalytisch ist,f�hrt ein allm�hlicher Anstieg der Konzentration [Co2+] aufein bestimmtes Niveau zu einer raschen Beschleunigung derReaktion und zu einer vollst�ndigen Umsetzung innerhalbeiner kurzen Zeit. Die Zeit, die f�r die vollst�ndige Umset-zung des Co3+-Komplexes zu Co2+-Ionen ben tigt wird,nimmt daher mit zunehmender Anfangskonzentration von[Co2+] ab.

Das Netzwerk wurde mit zwei aufeinander folgendenStufen aufgebaut, wobei sowohl der Zufluss als auch derAuslass L sungen von Co2+-Ionen enthielten (Abbil-dung 34b).[163] In der ersten Stufe wurden kleine Ovalkom-partimente erzeugt, in denen die Co2+-haltige Zuflussl sungmit einer KHSO5-L sung und einer L sung des Co3+-Kom-plexes kombiniert wurde (Abbildung 34b, linke Mikropho-tographie). Die Ovalkompartimente wurden f�r eine festge-legte Zeitdauer durch einen kleinen Mikrokanal transpor-tiert, der in einen zweiten, gr ßeren Mikrokanal m�ndet. Indem zweiten Mikrokanal befinden sich große Ovalkompar-timente, die aus zus�tzlichen Str mungen mit L sungen desCo3+-Komplexes und KHSO5 erzeugt wurden. Mehrere derkleinen Ovalkompartimente aus dem ersten Kanal wurdenmit einem großen Ovalkompartiment aus dem zweiten Kanalvereinigt (Abschnitt 2.5). Die zweite Stufe der Reaktionwurde in den großen Ovalkompartimenten beobachtet, diedurch den zweiten Kanal transportiert wurden (Abbil-dung 34b, rechte Mikrophotographie). Die Str mungsge-schwindigkeit im ersten Mikrokanal und dessen L�nge be-

Abbildung 32. Monodisperse Partikel mit maßgeschneiderter Formund GrAße, die in MikrofluidiktrApfchen erzeugt wurden (Mikroskop-aufnahmen).[194] a) Polymermikrokugeln, b) Kristall aus Polymermikro-kugeln, c) Polymerst�bchen, d) Polymerscheiben, e) Polymerellipsoide,f) Agarosescheiben, g) Ellipsoide aus Bismutlegierung. Wiedergabeaus Lit. [194].

Abbildung 33. Erzeugung von Doppelemulsionen durch Verkapselungalternierender TrApfchen.[206] Alternierende rote und blaue TrApfchenwurden erzeugt (a,b) und durch einen Mikrokanal (c) zu einer weite-ren Kreuzung transportiert, an der die DoppelemulsionstrApfchen ge-bildet werden, die jeweils ein rotes und ein blaues TrApfchen enthalten(d). Wiedergabe mit Genehmigung aus Lit. [206]. Copyright 2004 Ame-rican Chemical Society.


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stimmten die Zeitdauer, nach der die kleinen Ovalkompar-timente mit den großen Kompartimenten vereinigt wurden.Dieses Reaktionsnetzwerk zeigte ein Schwellenantwortver-halten hinsichtlich der Anfangskonzentration von [Co2+]: Nurdie [Co2+]-Anfangskonzentrationen, die oberhalb eines be-stimmten Schwellenwertes lagen, wurden verst�rkt (Abbil-dung 34c).[163]

Dieses Netzwerk ist eine Nachbildung von biochemischenNetzwerken,[163] die der Verst�rkung des Sehverm gens undder Signal�bertragung dienen. Die zugrundeliegenden Prin-zipien �hneln denen von biochemischen Netzwerken: 1) einmetastabiler, kinetisch eingefrorener Zustand; 2) ein

Schwellenansprechverhalten, das diesen Nichtgleichge-wichtszustand stabilisiert, solange die Anfangskonzentrationdes Autokatalysators unterhalb des Schwellenwertes liegt,sodass das Netzwerk unempfindlich gegen Konzentrations-rauschen ist; 3) mehrfache Verst�rkungsstufen zur Vergr -ßerung der Gesamtverst�rkung. Die Anwendung der tr pf-chenbasiertenMikrofluidik war ein entscheidender Faktor f�rdie Realisierung dieses Systems, denn sie erm glichte sowohldie Zuflusskontrolle der Reagentien f�r die Implementierungdes ersten Prinzips als auch die Zeitkontrolle f�r die Imple-mentierung des zweiten und dritten Prinzips. Praktische An-wendungen dieses Netzwerks k nnten in der Detektion vonautokatalytischen Spezies und m glicherweise in der Steue-rung der Keimbildung bei der Proteinkristallisation liegen.

4. Schlussfolgerungen und Ausblick

F�r chemische Reaktionen in Tr pfchen wurden eineReihe von Techniken entwickelt, mit denen die Zugabe, dieDurchmischung und der Transport von Reagentien, dieKontrolle des Grenzfl�chenverhaltens der Tr pfchen und dieAnalyse der Reaktionen m glich ist. Auf der Grundlagedieser Techniken wurden viele Arten von Reaktionen undProzessen miniaturisiert, darunter Enzymassays, Protein-kristallisationen, organische Synthesen und Partikelsynthe-sen. Speziell zur Herstellung von Partikeln wurden einigebesondere Eigenschaften von Tr pfchen genutzt, z.B. ihreeinstellbare Morphologie.

Es gibt gen�gend Spielraum f�r weitere Verbesserungenin der tr pfchenbasierten Mikrofluidik, sowohl was denAufbau der Funktionseinheiten als auch die Fluidsteuerungbetrifft. Einige Punkte betreffen das gesamte Gebiet derMikrofluidik. Beispiele sind die Entwicklung neuer Materia-lien f�r Funktionseinheiten mit bestimmten Eigenschaften,die Entwicklung von Techniken zur Oberfl�chenmodifizie-rung und f�r Analysen mit h herer Empfindlichkeit undGenauigkeit sowie der Entwurf von integrierten Mikroflui-dikeinheiten. Andere Aufgaben betreffen speziell die Tr pf-chenhandhabung, z.B. eine automatisierte Steuerung sehrvieler Tr pfchen.

Zu den aktuellen Fortschritten z�hlen Methoden, diemithilfe von Elektrobenetzung (electrowetting on dielectric,EWOD)[71–74] und dielektrophoretischen[167] und elektrischenKr�ften[170] eine aktive Kontrolle der Tr pfchen erm glichen.Ein Beispiel f�r neue Materialien in der Mikrofluidik ist„fl�ssiges Teflon“.[209] Diese Entwicklungen werden weitereAnwendungen erm glichen. Insbesondere werden neueAnalysemethoden mit hoher r�umlicher und zeitlicher Auf-l sung eine wesentliche Voraussetzung f�r die Untersuchungvon Reaktionen und Reaktionsnetzwerken sein.[210]

Die grundlegenden Eigenschaften von Tr pfchen sind seiteinigen Jahren gut verstanden, allerdings kann ihr Verhaltenauch schnell kompliziert werden.[35,99,211] Ein besseres Ver-st�ndnis dieser Ph�nomene ist das Ziel laufender For-schungsarbeiten.[143,163,183,212] Neue tr pfchenbasierte Techni-ken werden f�r viele Wissenschaftsbereiche von Nutzen sein.Hier diskutierte Beispiele umfassen funktionale Reaktions-netzwerke[163] und die Untersuchung des Einflusses der

Abbildung 34. Signalverst�rkung durch ein Reaktionsnetzwerk, das aufeinem trApfchenbasierten Mikrofluidiksystem beruht.[163] a) Autokataly-tische Bildung von Co2+ aus einem Co3+-Komplex 1. b) Aufbau der Mi-krofluidikeinheit fDr eine zweistufige Verst�rkung. Die erste Stufe derReaktion l�uft in den engeren Kan�len und die zweite Stufe in denbreiteren Kan�len ab. Links: Mikrophotographie der Kreuzung, an derdie kleineren TrApfchen, die eine rote LAsung enthalten, mit den grA-ßeren TrApfchen vereinigt werden. Rechts: Mikrophotographie derOvalkompartimente, die die autokatalytische Reaktionsmischung ent-halten. Der plAtzliche Farbwechsel zeigt die Umwandlung des violettenCo3+-Komplexes 1 zu den farblosen Co2+-Ionen an. c) Solange die Kon-zentration [Co2+]0 unter einem Schwellenwert liegt (110 nm und darun-ter) reicht die Zeit nicht aus, um in der ersten Stufe in den Ovalkom-partimenten in den kleineren Kan�len weitere Co2+-Ionen zu bilden.Die Eingangskonzentration [Co2+]0 wird daher in der ersten Stufe nichtverst�rkt und bei der zweiten Vereinigung durch VerdDnnung weiterverringert. In diesem Fall wird in der zweiten Stufe kein Antwortsignalbeobachtet (blaue Symbole). Liegt die Konzentration [Co2+]0 oberhalbeines Schwellenwerts (280 nm oder grAßer), l�uft die Reaktion in denkleinen TrApfchen der ersten Stufe ab, wobei genDgend Co2+-Ionen ge-bildet werden, um die Reaktion in der zweiten Stufe zu initiieren,sodass dort ein Antwortsignal beobachtet wird (rote Symbole). Wieder-gabe mit Genehmigung aus Lit. [163]. Copyright 2004 American Che-mical Society.




Durchmischung auf die Keimbildung bei der Proteinkristal-lisation.[183] Diese und zahlreiche weitere Beispiele – wie dieAnalyse von Druck�nderungen, die durch den Transport vonunterschiedlichen Zellen durch Mikrofluidikkan�le verur-sacht werden,[212,213] die Herstellung asph�rischer Bl�schenmithilfe „kolloidaler R�stungen“[214] und das Verst�ndnis dernichtlinearen Dynamik in einem Bl�schengenerator[99] –legen nahe, dass auf Mikrofluidiktr pfchen basierendeTechniken auch weiterhin zu wissenschaftlichen Fortschrittenf�hren werden.

Addendum (16. Oktober 2006)

Reaktionen in Tr pfchen in Mikrokan�len etablieren sichzusehends als Standardverfahren der Mikrofluidik,[215–217] undseit Einreichen dieses Aufsatzes wurden einige weitere Bei-tr�ge ver ffentlicht. Diese Publikationen befassen sich mitneuen Techniken und Funktionseinheiten wie der Tr pf-chenbildung,[218–221] der Tr pfchensteuerung,[222] dem Ver-schmelzen von Tr pfchen,[223,224] Mikrofluidik-Viskosime-tern[225] und Messger�ten f�r die Grenzfl�chenspannung[226]

und der Analyse von Tr pfchen mit Raman-Spektrosko-pie.[227, 228] Die neuen Anwendungen reichen von der Synthesevon Mikropartikeln[229–231] und -kapseln[232–234] �ber die Be-schleunigung von Reaktionen[235] bis hin zur Steuerung vonKeimbildung und Wachstum von Proteinkristallen.[236]

Grundlegende Untersuchungen zum Druckabfall beimTr pchenfluss [237] und zu den physikalischen Gesetzm�ßig-keiten der Bildung[238] und Organisation[239] von Bl�schenfallen auch in diesen Zeitraum.

Die Forschungsarbeiten in unserem Laboratorium wurdendurch die NIH (National Institute for Biomedical Imaging andBioengineering R01 EB001903 und National Institute of Ge-neral Medical Sciences R01 GM075827), das Beckman YoungInvestigator Program und den DuPont Young ProfessorAward unterst(tzt. Wir danken Joshua D. Tice f(r die Bilder inAbbildung 9 und allen Mitarbeitern unserer Arbeitsgruppe f(rihre hier beschriebenen Arbeiten. Unseren Kollegen im Be-reich der tr�pfchenbasierten Mikrofluidik danken wir f(r die@berlassung von Abbildungen und wertvolle Hinweise.

Eingegangen am 19. April 2006,ver�nderte Fassung am 4. Juli 2006Jbersetzt von Dr. Christian Bahr, Schildow

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