Reducción de Etanol en Vinos

7/26/2019 Reducción de Etanol en Vinos

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Reducción de etanol en vinos

¿Qué ocurre cuando la biotecnología interviene en la enología?

Por Raúl Andrés Cuello1, 2 e Iván Francisco Ciklic2 1Corporación Vitivinícola Argentina, Domingo Faustino Sarmiento 199, 5500 Mendoza (0261) 420-38772INTA EEA-Mendoza, San Martín 3853 Luján de Cuyo-Mendoza, Argentina. 0054-261-4963020 (317)

INTRODUCCIÓN

LA BIOTECNOLOGÍA LLAMA A LA PUERTAuestro trabajo se desarrolla en el marco de lo que hemos denominado“biotecnología enológica”1. Este concepto lejos ser moderno o innovadorencuentra correspondencia con la historia de la enología desde sus orígenes. Podría

decirse que el vino es una de las empresas biotecnológicas más antiguas en la cuallos humanos han estado involucrados por más de 7000 años [3]. Desde las primitivas yrudimentarias formas de vinificación en los primeros tiempos, pasando por los postulados deLouis Pasteur sobre la fermentación como un proceso realizado por levaduras en condicionesde anaerobiosis, y hasta la utilización de levaduras seleccionadas por sus característicasdistintivas, se han presenciado cambios significativos en los resultados y en el conocimiento delproducto final. En el caso particular del vino existe un gran potencial para la aplicación de lasherramientas de la ingeniería genética y la ingeniería genética de levaduras es un buenejemplo para ilustrarlo. Específicamente, hay que destacar que la levadura Saccharomyces cerevisiae

es uno de los organismos mejor estudiados (e.g. fue el primer organismo eucariota secuenciado

y se dispone de la secuencia completa de los 6.000 genes ya desde 1996) lo que lo haconvertido en uno de los organismos más importantes en Biotecnología.En primera instancia y antes de abordar el tema que da origen a este trabajo queremos echarluz sobre el concepto de ingeniería genética, sus ventajas y limitaciones

¿Qué es la ingeniería genética? [4]Cuando hablamos de ingeniería genética, nos referimos al conjunto de técnicas derivadas del ADN recombinante. Es decir, aquellas técnicas que nos permiten la manipulación del ADNposibilitando la aislación de genes o fragmentos de genes que luego pueden ser insertados enun organismo determinado. La ingeniería genética se ha desarrollado enormemente, y en la

actualidad existen un sinfín de aplicaciones como pueden ser, el desarrollo de nuevas vacunas,la obtención de moléculas mejoradas como la insulina recombinante, la creación de semillastransgénicas resistentes a plagas, la producción de proteínas a gran escala y a bajo costomediante el uso de microorganismos transgénicos etc. De todas maneras aún existe una

1“Wine Biotechnology”: Término que aparece en el reciente trabajo: At the cutting-edge of grape and winebiotechnology [1] Además se hace referencia sobre “Biotecnología enológica” en el resumen presentado al últimoXXXVII congreso de la OIV [2].

N



limitación importante con respecto al uso de la ingeniería genética en la industria vitivinícola,ya que en ese ámbito aún subsiste una fuerte resistencia al uso de GMOs 2 especialmente porparte de los países del viejo mundo. La percepción negativa del público general hacia losGMOs a menudo se debe a las consecuencias de una mala difusión, como así también a lasfallas en la educación de los consumidores con respecto a los beneficios de los Organismos

Genéticamente Modificados para el consumidor [5]. En la actualidad existe un movimientoimpulsado por algunas empresas e institutos de investigación denominado “iniciativa

intragénica” que pretende promover la aceptación de la utilización de GMOs mediante una

estrategia que hace hincapié en la utilización de variabilidad genética intraespecie o proveniente

de organismos cercanamente emparentados[6]. Algunos autores proponen resaltar los efectosbenéficos de los productos derivados haciéndolos más atractivos para los consumidores yrecalcando que no sólo el productor es el único beneficiado en la venta de estos productos[5].

El calentamiento global y el aumento del contenido alcohólico de los vinosLa cosecha de uvas en su punto óptimo de madurez fenólica, sumado a los condicionamientosque genera el cambio climático, han contribuido a la tendencia actual de obtener vinos conelevada concentración de etanol [7]. Esto genera complicaciones con el mercado deexportación considerando la creciente demanda de vinos más ligeros. Por otro lado cabedestacar que existe una fuerte campaña nacional que fomenta la idea de reducir el consumo dealcohol por razones de seguridad y saludhttp://www.msal.gov.ar/. Dentro de este marcocontingente se ha intentado solucionar este problema mediante diversos enfoques.En dicho escenario aparece Saccharomyces cerevisiae como la principal levadura encargada dellevar a cabo la fermentación alcohólica en el vino y por lo tanto el principal objeto de estudio(o de aplicación) [8]. Si bien esta problemática puede ser abordada desde distintos enfoques

como son la aplicación de prácticas alternativas de viticultura, o la implementación de métodosfísicos de desalcoholización del vino, la utilización de estrategias microbiológicas es unaalternativa muy atractiva por su fácil implementación y bajo costo[9]. En este contexto ya sehan realizado varios trabajos con el objetivo de obtener cepas genéticamente modificadas parala producción de vinos con niveles reducidos de etanol. Revisando la bibliografía sobre el tema

2 De las siglas en inglés“Organismos Genéticamente Modificados”. Se considera GMO a un organismo que hasido modificado genéticamente mediante herramientas de ingeniería genética.

http://www.msal.gov.ar/





se puede concluir que el recurso más explotado para obtener levaduras con una producciónatenuada en etanol se ha llevado a cabo mediante la desviación de parte del flujo de carbono,desde la vía principal de etanol hacia vías metabólicas secundarias como la del glicerol [10]. Porejemplo, se han logrado reducciones de etanol sobreexpresando los genes de la vía de glicerolGPD1 y/o GPD2 , [11,12], o mediante la disminución de la expresión y actividad de la enzima

alcohol deshidrogenasa Adh1p [13]. Aunque el aumento en la producción de glicerol permitereducir la de etanol, esto trae aparejado consigo un desequilibrio rédox en el interior de lacélula. En estos casos, tal excedente es compensado mediante la sobreproducción decompuestos oxidados como ácido acético, acetoína, 2,3-butanodiol o succinato, de los cuales,principalmente el primero presenta un impacto negativo en las cualidades organolépticas del vino [8]. El redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol nos ha planteado elobjetivo de construir una levadura mutante que disminuya la producción de etanol, cuyascualidades no vayan en detrimento del correcto funcionamiento del metabolismo de S. cerevisiae y que además preserve la calidad del vino.

ARMANDO EL ROMPECABEZAS¿Cómo se construyeron los mutantes?En nuestro laboratorio se diseñaron y realizaron una serie de mutaciones en regionesfuncionales estratégicas del gen PDC2 de S. cerevisiae , el cual codifica para un factor detranscripción que regula la disponibilidad de la enzima piruvato decarboxilasa ( PDC1 ) en lalevadura. Para llevar esto a cabo, la hipótesis de trabajo que adoptamos propone que una variante mutante del factor de trascripción Pdc2ppuede ejercer un control positivo atenuadosobre PDC1 y PDC5 , obteniéndose en consecuencia niveles de expresión reducidos de ambasenzimas con una caída en la actividad enzimática y eventualmente un redireccionamiento del

flujo de carbono desde la vía principal del etanol, hacia la vía alternativa del glicerol. Latransformación se realizó eliminando aproximadamente un tercio ( Δ344 ) y dos tercios ( Δ5 19 )de la proteína, en cepas haploides (una copia del gen) y diploides (dos copias del gen). Luegode esto se corroboraron las mutaciones mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa).Contando ya con las levaduras mutantes se estudió su cinética de crecimiento. Posteriormentese llevaron a cabo tres fermentaciones a escala de laboratorio, en donde se compararon lascepas mutantes con sus respectivos controles donde se midió el porcentaje de etanol, acidez volátil y azúcares reductores. De todas las cepas, la que produjo menos etanol en todos loscasos fue Δ519 (diploide) y fue también en todos los casos la cepa más ineficiente3. Ladiferencia de etanol que hubo entre esta cepa y su control en una de las fermentaciones fue de

un 7%, lo que representa 1° alcohólico menos para un vino con un alcohol potencial de 15% v/v, siendo significativamente distinta. En el resto de las fermentaciones se mantuvo asimismola tendencia de ser la cepa que menos alcohol produjo. Cabe destacar además que no hubodiferencias entre esta cepa y el resto con respecto a la producción de ácido acético. Esto fue undato alentador ya que, se especulaba con que deleciones tan grandes sobre el gen PDC2 podrían haber acarreado algún efecto negativo sobre el metabolismo. Los resultados positivos

3 Se calcula la eficienciacomo los gramos de azúcar necesarios para producir un grado alcohólico.



obtenidos en estas fermentaciones dieron pie a una cuarta, tomando como referencia la cepadiploide control y las cepas diploides Δ344 y Δ519 . Esto se realizó por quintuplicado para darlemayor rigor estadístico a los resultados y se midieron los mismos parámetros que en lasfermentaciones anteriores. Luego del análisis de los datos, Δ519 nuevamente demostró sersignificativamente la cepa con menor producción de etanol, reduciendo en un 7,4% el grado

alcohólico, sin presentar diferencias en cuanto al consumo de azúcar, haciendo de esta cepa lamenos eficiente de todas y donde la producción de ácido acético fue la más baja comparadacon al resto. En cuanto a la producción de glicerol, no se verificaron diferencias entre las cepascontroles y las mutantes. Actualmente se está evaluando realizar una quinta fermentación en lacual se puedan determinar otros subproductos como piruvato, succinato, acetoína y 2,3-butanodiol además de glicerol, para poder definir hacia donde se está redirigiendo elmetabolismo de la levadura.Paralelamente a esto se está trabajando con un fragmento de gen sintético con los residuos deinterés mutados en el sitio de unión a ADN de PDC2 . Ya se clonó el fragmento mutantecompleto (1086bp) en Escherichia coli y se tienen programados dos clonaciones más con las dos

fracciones separadas del extremo C-terminal de PDC2, para clonarlas asimismo en E. coli . Una vez obtenidas estas clonaciones programadas se pasará a la siguiente etapa de transformaciónen la levadura ΔPDC2 (cepa que no posee el gen PDC2 ) para efectuar a continuación losensayos con fermentaciones a escala de laboratorio.

Composición del equipo de trabajoDesde el año 2009, mediante el programa de Recursos Humanos para la RadicaciónInvestigadores en Áreas Tecnológicas Prioritarias (PRH-FONCyT) y con apoyo y el aval delINTA y de la Dra. Mariana Combina, se efectuó la incorporación del Dr. Iván FranciscoCiklic4 a la E.E.A. INTA Mendoza. A partir de ese año comenzó a gestarse el área debiotecnología enológica de microorganismos, con la implementación de la ingeniería genéticade levaduras. En el año 2010 se termina de construir el edificio que albergará al Laboratorio de

biotecnología . Luego de ese momento y con fondos de Agencia Nacional de Ciencia y Técnica, secomienza a equipar el laboratorio de biotecnología que cuenta con tecnología de punta para

investigaciones referidas a la disciplina. El primer proyecto “Mejoramiento genético de cepasnativas de Saccharomyces cerevisiae para optimización de procesos enológicos y bio-etanol” se

pone en marcha. En este periodo se inicia también la formación de recursos humanosmediante la incorporación de dos becarios para la realización de sus respectivas tesis de grado ypostgrado: Karina Flores Montero, estudiante de Licenciatura en Biología de la Universidad

4 Iván Ciklic recibió el título de Doctor rerumnaturalium , título impartido por la UniversitätOsnabrück de Alemania.



Nacional de Cuyo; y Raúl Andrés Cuello, Licenciado en Enología y estudiante de la Maestríaen Viticultura y Enología de la misma Universidad.

AgradecimientosQueremos agradecer a la Corporación Vitivinícola Argentina, que mediante su programa de

becas permite a jóvenes investigadores la continuidad de sus estudios de postgrado y eldesarrollo de I+D a nivel local. Es menester recalcar el interés que ha prestado elObservatorio Vitivinícola Argentino por la divulgación de la ciencia. No es menosimportante resaltar nuestro compromiso con la Estación Experimental AgropecuariaINTA Mendoza, que nos brinda todas las herramientas para el desarrollo de nuestradisciplina. Una mención especial también para el Centro de Estudios Enológicos y elDepartamento de Microbiología Enológica a cargo de la Dra. Mariana Combina.

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13. Drewke, C., Thielen, J. & Ciriacy, M. Ethanol formation in adh 0 mutants reveals theexistence of a novel acetaldehyde-reducing activity in Saccharomyces cerevisiae .Journal ofbacteriology 172, 3909 – 17 ( 1990 ).

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