TEMA PROIECTULUI:

ACIDUL LACTIC

2008

1

CUPRINS

1. Introducere …………………………………………………………………….. 3

2. Proprietăţi fizice ale acidului lactic ……………………………………………. 4

3. Domenii de utilizare a acidului lactic şi derivaţilor ……………………………. 5

4. Metode de obţinere a acidului lactic……………………………………………. 7

4.1. Sinteza chimică a acidului lactic …………………………………...…….. 7

4.2. Obţinerea acidului lactic prin fermentaţie ………………………...……….. 8

5. Microorganisme şi enzime implicate în biosinteza acidului lactic ……………… 9

6. Bacterii modificate genetic pentru obţinerea de acid lactic ………………….... 11

7. Materii prime utilizate la obţinerea acidului lactic …………………………….. 12

8. Procedee şi instalaţii de obţinere a acidului lactic prin fermentaţie ……………. 13

BIBLIOGRAFIE ………………………………………………………………. 16

2

1. INTRODUCERE

Acidul lactic a fost descoperit în anul 1780 de chimistul suedez Carl Wilhelm Scheele

intr-o mostră de lapte acru si a reuşit o primă dar destul de impură izolare a acestuia;

producerea acestuia la nivel comercial a început abia în anul 1881, în Littleton (Massachusetts,

SUA). Acesta este motivul pentru care această substanţă care face obiectul cercetărilor la nivel

mondial a primit denumirea de acid lactic.,

Acidul lactic (denumire standard IUPAC: acid 2-hidroxipropanoic), este cunoscut

popular şi ca “acid laptic”. Acesta este un acid carboxilic cu formula chimică brută C 3H6O3 şi

formulă structurală CH3-CH-(OH)-COOH,. Are grup auxiliar hidroxil ataşat grupării

carboxilice, ceea ce îl încadrează în categoria acizilor alfa-hidroxilici (uneori cunoscuţi ca

AAH). În soluţie, ca orice acid acid monobazic, pierde un proton producând ionul lactic,

CH3CH(OH)COO−.

Acidul lactic este chiral şi are doi izomeri optici. Unul este cunoscut ca L-(+)-acid lactic

ori (S)-acid lactic iar celălalt, imaginea sa în oglindă, ca D-(-)-acid lactic sau (R)-acid lactic.

Acid lactic L-(+)- este izomerul cu cea mai mare importanţă biologică.

Acesta este un acid organic slab, care joacă un anumit rol în anumite procese

biochimice şi se găseşte în mod natural în anumite produse alimentare. Acidul lactic are un rol

decisiv în anumite procese de fermentaţie, cum ar fi pregătirea silozului pentru animale, sau (în

industria laptelui) la producerea produselor din lapte, iaurt, chefir, urdă, brânză etc. În

metabolismul animal, ia naştere în orice masă musculară supusă efortului, fiind unul din

cauzele principale ale febrei musculare.

3

2. PROPRIETĂŢI FIZICE ALE ACIDULUI LACTIC

Acidul lactic este solubil în apă şi solvenţi organici miscibili cu apa şi dezvoltă o

volatilitate scăzută. Alte proprietăţi fizice importsnte sunt:

- masa moleculară: 90.08 g/mol,

- punct de topire: L: 53 °C, D: 53 °C, D/L: 16.8 °C,

- punct de fierbere: 122 °C la 14 mmHg şi 82oC la 0,5 mm Hg,

- constanta de disociere: 1,37 x 10-4,

- căldura de combustie: 1361 KJ/mol,

- căldura specifică la 20oC: 190 J/mol x K.

Acidul lactic are doi izomeri optic activi, respectiv:

4

3. DOMENII DE UTILIZARE A ACIDULUI LACTIC

ŞI DERIVAŢILOR

Acidul lactic poate fi pus în evidenţă calitativ şi cantitativ prin intermediul NAD+

lactatdehidrogenazei, prin intermediul unor metode colorimetrice, prin cromatografie de gaze,

cromatografie în fază lichidă (poate fi utilizată şi pentru separarea izomerilor optici).

Acidul lactic este utilizat ca şi agent de acidulare, aromatizant, tampon de pH sau

înhibant al dezvoltării unor bacterii în produsele alimentare. Este un agent excelent de

conservare şi saramurare. Prin adaosul de soluţii de acid lactic în carnea de pui sau peşte

ambalată se poate mări durata de conservabilitate. Esterii acidului lactic se pot utiliza ca şi

agenţi de emulsifiere la fabricarea produselor de franzelărie (stearil-2-lactilat, gliceril

lactostearat, gliceril lactopalmitat). Producerea acestor emulsifianţi se realizează cu acid lactic

stabil termic.

Acidul lactic cu puritate tehnică se utilizează ca şi acidulant în procesele de tabăcire a

pieilor. De asemenea se mai utilizează la reglarea pH-ului în procesele de obţinere a celofanului

utilizat la ambalarea produselor alimentare, la obţinerea răşinilor fenol-formaldehidice,

răşinilor alchid modificatoare, la formularea adezivilor şi detergenţilor, în băile de

electrolustruire etc.

Acidul lactic are aplicaţii multiple în farmacie şi cosmetică, la formularea unor loţiuni,

soluţii antiacneice, umectanţi, soluţii parenterale, agenţi anticarii etc. Lactatul de calciu poate fi

utilizat în cazul deficienţelor de calciu. Polimerii săi biodegradabili au aplicaţii medicale:

suturi, implanturi ortopedice, eliberare controlată de medicamente etc.

Polimerii acidului lactic sunt termoplastici şi biodegradabili, sunt transparenţi iar

degradare lor poate fi controlată prin ajustarea compoziţiei şi masei moleculare. Acesţia au

proprietăţi asemănătoare cu materialele plastice derivate din petrol. Esterii acidului lactic

precum etil/butil lactatul pot fi utilizaţi ca şi solvenţi ecologici. Aceştia au un punct de topire

ridicat, sunt degradabili şi nu sunt toxici.

Acidul poli L-lactic cu grad scăzut de polimerizare poate contribui pozitiv la eliberarea

controlată a unor substanţe benefice solului (agricultură).

În Tabelul 1 sunt prezentate câteva caracteristici ai polimerilor acidului lactic, derivaţi

ai acidului lactic cu multiple utilizări în industrie şi agricultură.

5

Tabel 1. Caracteristicile unor polimeri ai acidului lactic obţinuţi prin policondensare directă sau

urmată de extensia lanţului

Dimensiunea lanţului

obţinut (kDa)

Monomer/Monomeri Agent de cuplare Forma

macromoleculară

Masă molară mică sau

medie (<70 kDa)

Acid lactic (L-) - Homopolimer linear

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (L-) HMDI Homopolimer linear

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (L-) Dipentaeritriol Homopolimer în

formă de stea

Lanţ cu dimensiune

moleculară mică (<20 kDa)

Acid lactic (L-) cu acid

6-hidroxicaprinic

-

Copolimer linear

Acid lactic (L-) cu

caprolactonă

HMDI

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (-) cu

butandiol,

Acid lactic (-) cu acid

mandelic

HMDI, IPDI Copolimeri

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (-) cu

butandiol, acid 4-

hidroxibenzoic

HMDI, IPDI Copolimeri

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (-) cu

butandiol, acid 4-

acetoxibenzoic

HMDI, IPDI Copolimeri

Lanţ cu dimensiune

moleculară mare

(> 70kDa)

Acid lactic (-) HMDI, IPDI Copolimeri

6

4. METODE DE OBŢINERE A ACIDULUI LACTIC

În general, acidul lactic se poate obţine prin două metode:

- sinteză chimică,

- pe cale biochimică (fermentarea carbohidraţilor).

4.1. SINTEZA CHIMICĂ A ACIDULUI LACTIC

Procesele industriale de obţinere a acidului lactic prin sinteza chimică au la bază

utilizarea lactonitrilul. În prima etapă are loc obţinerea lactonitrilului prin reacţia dintre

acetaldehidă şi acid cianhidric. Această reacţie are loc în fază lichidă la presiuni ridicate.

Lactonitrilul brut format este recuperat şi purificat prin distilare. Produsul rezultat astfel este

hidrolozat cu acid sulfuric sau acid clorhidric concentrat pentru a se obţine sarea

corespunzătoare de amoniu şi acid lactic. Ulterior acidul lactc este esterificat cu metanol pentru

a obţine metil-lactatul care este distilat şi hidrolizat cu apa în prezenţa unui catalizator acid. Se

obţine astfel acidul lactic purificat şi metanol, care va fi recirculat. Metoda de sinteză chimică

conduce la obţinerea unui amestec racemic de acid lactic.

Reacţiile care au loc la obţinerea acidului lactic prin sinteză chimică sunt următoarele:

7

Dintre companiile care produc acid lactic prin această metodă se enumeră

MUSASHINO (Japonia) şi STERLING CHEMICALS INC. (SUA).

În afară de metoda cu lactonitril există şi alte posibilităţi de obţinere a acidului lactic:

degradarea zaharurilor catalizată de o bază, oxidarea propilenglicolului, reacţia cu acetaldehidă,

monoxid de carbon şi apă la temperaturi şi presiuni ridicate, hidroliza acidului

clorohidropropionic, oxidarea propilenei cu acid azotic etc.

4.2. OBŢINEREA ACIDULUI LACTIC PRIN FERMENTAŢIE

Prin fermentarea carbohidraţilor se pot obţine acizi stereospecifici. Obţinerea acidului

lactic prin fermentare la nivel industrial cuprinde mai multe etape, respectiv:

După etapa de fermentare a glucidului se obţine o masă care conţine lactat de calciu;

aceasta se filtrează pentru îndepărtarea microorganismelor, se tratează cu carbon activ, apoi se

evaporă şi se acidifică cu acid sulfuric. Se obţine acid lactic şi sulfat de calciu. Sulfatul de

calciu insolubil este îndepărtat prin filtrare iar acidul lactic se obţine prin hidroliză, esterificare,

distilare şi din nou hidroliză.

8

5. MICROORGANISME ŞI ENZIME IMPLICATE ÎN

BIOSINTEZA ACIDULUI LACTIC

Bacteriile lactice sunt printre cele mai studiate microorganisme. Au fost realizate noi

descoperiri în domeniul utilizării bacteriilor lactice în domenii ca rezistenţa la medicamente,

bacteriocine, osmoreglatori, bacteriofagi etc. De asemenea, s-au realizat progrese şi în

domeniul obţinerii de bacterii lactice modificate genetic utilizate în multe industrii.

Caracteristicile dezirabile a microorganismelor industriale constau în abilitatea lor de a

produce rapid şi ieftin fermentarea completă a unor materii prime, cu un necesar minim de

substanţe azotoase şi cu un randament ridicat în acid lactic stereospecific în condiţii de pH

scăzut şi temperatură ridicată precum şi obţinerea de cantităţi neglijabile de celule sau produşi

secundari.

Alegerea unui anumit microorganism depinde de substratul carbohidrat care se doreşte a

fi fermentat. Astfel, Lactobacillus delbreuckii, subspeciile delbreuckii, fermentează zaharoza,

Lactobacillus delbreuckii, subspeciile bulgaricus fermentează lactoza, Lactobacillus helveticus

fermentează atât lactoza cât şi galactoza, Lactobacillus amylophylus şi Lactobacillus

amylovirus fermentează amidonul, Lactobacillus lactis fermentează glucoza, zaharoza şi

galactoza iar Lactobacillus pentosus pot fermenta deşeurile sulfitice.

Pentru dezvoltare, Lactobacillus are nevoie de un anumit complex nutriţional.

Microorganismele de tipul Rhizopus oryzae au, de exemplu, necesităţi nutriţionale limitate şi

pot utiliza amidonul ca şi substrat. Acestea pot produce acid lactic L(+) pur.

În general, în timpul fermentării se formează un mediu acid în care acidul lactic format

poate difuza în membrana plasmatică a bacteriilor şi acidifia citoplasma. Celulele tind să

contracareze această acidifiere intracelulară prin menţinerea unui pH neutru, acest lucru având

consecinţe negative asupra activităţii metabolice şi viabilităţii celulelor. O serie de studii s-au

îndreptat şi în domeniul utilizării unor drojdii - Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces

lactis – pentru producerea de acid lactic L(+) pur datorită abilităţii acestora de a tolera foarte

bine concentraţii ridicate de ioni de hidrogen (ceea ce este de dorit în cazul biosintezei acidului

lactic).

Acidul lactic obţinut prin biosinteză este în general sub forma L(+), D(-) sau amestecul

ramecic al acestora. Microorganismele care formează forma L(+) sau D(-) au în componenţă

două lactatdehidrogenaze (LDH), care diferă din punct de vedere stereospecific. Există specii

9

de Lactobacillus care produc forma L(+), a cărei acumulare induce o racemază, care o va

converti în acid lactic D(-) până la atingerea echilibrului.

L-lactat dehidrogenaza din L. casei s-a dovedit a fi o enzimă alosterică cu fructoză 1,6

difosfat (FDP). În unele cazuri Mn2+ acţionează ca un cofactor. S-a determinat faptul că, căile

metabolice ale L. casei sunt controlate de carbohidraţii disponibili, care determină cantitatea de

FDP şi intermediari triozofosfat. Aceştia controlează activitatea LDH şi a altor enzime pentru a

produce metaboliţi (alţii decât acidul lactic). În cazul L. bulgaricus, FDP controlează,

independent, lactatdehidrogenaza. Când această bacterie se dezvoltă în culturi continue,

datorită deplasării pH-ului din domeniu acid în bazic, are loccatabolizarea zahărului prin

heterofermentaţie prin intermediul acţiunii fosfoketolazei. Această semnifică faptul că

lactacdehidrogenazele din bacteriile lactice nu sunt numai sub controlul efectelor alosterice.

10

6. BACTERII MODIFICATE GENETIC PENTRU OBŢINEREA

DE ACID LACTIC

Bacteriile lactice au fost utilizate iniţial la obţinerea unor produse alimentare

fermentate. Datorită faptului că, la nivel mondial, prioritar este utilizarea unor noi surse

alternative de producere a energiei, se studiază intens utilizarea biomasei la obţinerea de

energie. În acest sens, se încearcă utilizarea bacteriilor din specia Lactobacillus pentru

eliminarea barierelor limitative existente în cazul valorificării biomasei celulozice în special.

Se cunoaşte faptul că bacteriile lactice pot converti glucoza în acid lactic, în condiţii

optime obţinându-se randamente de peste 98% în cazul laptelui şi produselor lactate

fermentate. În cazul biomasei celulozice, care conţin glucide de tipul pentozelor (arabinoză,

riboză, xiloză), bacteriile lactice clasice nu pot degrada acest substrat. Astfel, cercetările actuale

sunt îndreptate în sensul izolării unor tulpini de Lactobacillus capabile să degradeze pentozele

în acid lactic. Acest tip de zaharuri sunt conţinute în special în deşeurile ierboase şi lemnoase

care ar putea fi utilizate cu succes ca şi surse alternative de energie.

Pentru degradarea unor carbohidraţi din clasa pentozelor sau zaharurilor complexe s-au

izolat o serie de tuplini de Lactobacillus modificate genetic, respectiv: L. delbruckii Mutant

Uc-3 (pentru degradarea celulozei şi celobiozei), L. Mont 4+ (pentru convertirea ribozei în acid

lactic), L. Mont 4+ pxvAB-mod (pentru convertirea xilozei în acid lactic).

Pentru îmbunătăţirea producţiei de acid lactic L(+) prin inginerie metabolică. În cazul L.

helveticus, inactivarea ldhD (gena D-lactatdehidrogenazei) conduce la creşterea cantităţii de

acid lactic L(+). Utilizând metoda înlocuirii genei, s-au obţinut două lanţuri ldhH negative

stabile de L. helveticus; în acest caz, activitatea L-lactatdehidrogenazei creşte de la 53% la

93%. Cele două D-lactat dehidrogenaze negative produc doar L(+) lactat.

Gena care codează L(+) lactat dehidrogenaza a fost izolată din Lactobacillus plantarum

şi clonată în Escherichia coli. Această genă a fost utilizată la obţinerea unor bacterii L.

plantarum modificate genetic.

Rhizopus oryzae conţine enzime etanol fermentative care permit fungilor să se dezvolte

pentru o scurtă perioadă de timp în lipsa oxigenului. În literatura de specialitate se regăsesc

metode de izolare a unui mutant care exprimă doar 5% din activitatea alcooldehidrogenazei în

lipsa oxigenului. Astfel, piruvatul este implicat în formarea acidului lactic.

11

7. MATERII PRIME UTILIZATE LA OBŢINEREA ACIDULUI

LACTIC

Pe parcursul timpului, cercetătorii au studiat un număr mare de carbohidraţi şi materii

azotoase pentru producerea de acid lactic. S-a încercat găsirea materiilor prime care să conducă

la obţinerea de randamente cât mai ridicate în acid lactic, o producţie optimă de biomasă,

neglijabilă în raport cu produsul format, un grad ridicat de fermentare, pretratamente cât mai

puţine, costuri scăzute. Alegerea materiei prime depinde de microorganismul utilizat precum şi

de produsul (produsele) care se doresc a fi obţinute.

Zaharoza (din siropuri, sucuri, melasă), lactoza (din zer), maltoza (rezultată de la

conversia enzimatică a amidonului), glucoza, manitolul etc.sunt utilizate pentru obţinerea

acidului lactic la nivel industrial. Melasa este o materie primă ieftină dar are randament scăzut

în acid lactic şi necesită o serie de proceduri de purificare costisitoare. Zerul este, de asemenea

ieftin, uşor disponibil, dar, ca şi melasa, necesită proceduri suplimentare de purificare.

Utilizarea acestora însă a stimulat dezvoltarea tehnologiilor moderne de ultrafiltrare şi

electroializă. Amidonul obţinut din porumb, cartofi, bumbat, grapefruit, ape reziduale sulfitice

se utilizează în tehnologiile moderne de obţinere a acidului lactic prin fermentare.

O serie de studii importante s-au realizat şi în domeniul producţiei de acid lactic L(+) de

R. oryzae utilizând amidon de porumb în bioreactoare air-lift şi bioreactoare cu strat fibros.

S-a studiat şi posibilitatea utilizării unor materiale azotoase precum permeatul de zer,

extractul de drojdie, de malţ, extract de iarbă, peptone, carne, hidrolizat de caseină, N-Z-amină,

hidrolizat din boabe de soia la obţinerea de acid lactic. Dintre acestea, extractul de drojdie pare

a fi cel mai eficient. În prezent se studiază intens influenţa înlocuirii extractului de drojdie cu

vantităţi variate de vitamina B.

12

8. PROCEDEE ŞI INSTALAŢII DE OBŢINERE A ACIDULUI

LACTIC PRIN FERMENTAŢIE

Se cunoaşte faptul că în urma fermentaţiei lactice se obţine un produs care inhibă

fermentaţia (o formă nedisociată de acid lactic). Studiile efectuate în această direcţie au

demonstrat că, prin utilizarea unor metode extractive de fermentaţie lactică pot da naştere la o

productivitate de 0,99 g/l acid lactic şi de peste 1,67g/l/oră în cazul unui reactor continuu

convenţional. În aceste cazuri, pentru separarea lactatului se utilizează răşini schimbătoare de

ioni de tipul Amberlite IRA-400. Deoarece temperaturile scăzute favorizează adsorbţia iar

temperaturile înalte favorizează producerea de acid lactic, se consideră că temperatura de 39oC

este optimă pentru producerea de acid lactic prin fermentaţie lactică extractivă.

Metoda schimbului de anioni se utilizează pentru recuperarea acidului lactic din soluţia

de acid lactic-glucoză printr-o membrană schimbătoare de ioni care se bazează pe sistemul de

fermentaţie extractivă.

Roychoudhury a descris diferite sisteme de fermentaţie extractivă. S-a demonstrat de

asemenea că ionul de hidrogen are o influenţă negativă asupra metabolismului celulelor de

Lactococcus lactis în timpul bioproceselor de electrodializă, în care, filtratul cultural circulă

prin compartimentul catodului; stimularea fermentaţiei lactice se poate realiza prin

electrodializă periodică.

Bioprocesele de electrodializă au fost studiate în cazul îndepărtării simultane a

lactatului şi acetatului ceea ce reduce inhibiţia produsului final. Ionii de hidrogen au un efect

inhibitor asupra metabolismului celulelor; astfel, prin utilizarea unui electrodializor standard,

filtratul cultural se poate circula prin compartimentul de dializă astfel încât culturile să nu intre

în contact cu catodul. Aceasta face posibilă consumarea completă a xilozei într-un timp cât mai

scurt.

În cazul utilizării unui bioreactor cu celulă de reciclare cu membrană se pot obţine

productivităţi ridicate (117 g/l/oră)

Prin împrospătarea populaţiei de celule cu culturi proaspete se asigură o puritate ridicată

a acidului lactic L(+).

Producţia de acid lactic poate fi îmbunătăţită şi prin utilizarea de celule sistem

imobilizate. Astfel, s-au realizat studii cu Lactobacillus delbreuckii imobilizată în straturi de

alginat de calciu şi utilizată în reactoare continue cu coloană; în acest caz se poate obţine o

13

producţie de 0,97 g/g acid lactic. Prin imobilizarea Lactobacillus delbreuckii într-un reactor cu

membrană “hollow fiber” se obţine o productivitate de 100kg/m3/oră lactat. Dezvoltarea

excesivă a celulelor microorganismelor reduce durata operaţiilor din reactorul sistem.

O productivitate ridicată în acid lactic se poate obţine utilizând un reactor cu membrană

şi recirculare.

Extracţia cu solvenţi este o metodă de purificare a acizilor carboxilici precum acidul

lactic şi succinic. Ca şi solvenţi, s-a demonstrat că alcooli cu catenă lungă (1-octanol, 1-

decanol) sunt mai puţin toxici faţă de solvenţii clasici.

Tehnologiile clasice de obţinere a acidului lactic prezintă dezavantajul costului ridicat

datorită proceselor de purificare a produsului final.

Prin utilizarea unui procedeu în care au loc simultan bioreacţiile şi separarea-

concentrarea produsului se pot reduce considerabil costurile. În Figura 1 este prezentată schema

procedeului de fermentare-separare simultană utilizând membrane „hollow-fiber”. Se observă

din figură utilizarea unui reactor biochimic discontinuu cu amestecare. Cu ajutorul acestui

reactor se pot optimiza cantităţile de nutrienţi, pH-ul în funcţie de tipul de bacterii utilizat

pentru obţinerea unui randament ridicat în acid lactic.

Figura 1. Instalaţie de Fermentare-Separare simultană cu membrană “hollow fiber”

14

Figura 2. Instalaţie de tip fed-batch de obţinere a acidului lactic prin fermentare

Recuperarea acidului lactic se realizează cu ajutorul membranelor asociate cu un

procesul de extracţie cu solvenţi. Separarea are loc fără a fi afectată negativ dezvoltarea

microorganismelor (bacteriilor lactice). Acest tip de reactor se utilizează în general pentru

obţinerea acidului lactic din lactoză.

În Figura 2 este prezentată schema unei instalaţii fed-batch de obţinere a acidului lactic

prin fermentaţie. Prin procedeul propun se asigură un randament ridicat în acid lactic şi poate fi

utilizat pentru diferite materii prime.

15

BIBLIOGRAFIE

1. Adsul, M. G., J. E. Ghule, R. Singh, H. Shaikh, K. B. Bastawde, D. V. Gokhale, and A. J.

Varma. 2004. Polysaccharides from bagasse: applications in cellulase and xylanase production.

Carbohydr. Polym. 57:67-72.

2. Adsul, M. G., K. B. Bastawde, A. J. Varma, and D. V. Gokhale. 2007. Strain improvement

of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production. Bioresour.

Technol. 98:1467-1473.

3. Adsul, M. G., A. J. Varma, and D. V. Gokhale. 2007. Lactic acid production from waste

sugarcane bagasse derived cellulose. Green Chem. 9:58-62.

4. Caminal, G., J. Lopez Santin, and C. Sola. 1985. Kinetic modeling of the enzymatic

hydrolysis of pretreated cellulose. Biotechnol. Bioeng. 27:1282-1290.

5. Carr, F. J., D. Chill, and N. Maida. 2002. The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit.

Rev. Microbiol. 28:281-370.

6. Elezi, O., Y. Kourkoutas, A. A. Koutinas, M. Kanellaki, E. Bezitrzoglou, Y. A. Bernett, and

P. Nigam. 2003. Food additive lactic acid production by immobilized cells of Lactobacillus

brevis on delignified cellulosic material. J. Agric. Food Chem. 51:5285-5289.

7. Kadam, S. R., S. S. Patil, K. B. Bastawde, J. M. Khire, and D. V. Gokhale. 2006. Strain

improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production. Process

Biochem. 41:120-126.

8. Luo, J., L. Xia, J. Lin, and P. Cen. 1997. Kinetics of simultaneous saccharification and lactic

acid fermentation processes. Biotechnol. Prog. 13:762-767.

9. Moldes, A. B., J. L. Alonso, and J. C. Parajo. 2000. Multi-step feeding systems for lactic

acid production by simultaneous saccharification and fermentation of processed wood.

Bioprocess Eng. 22:175-180.

10. Moldes, A. B., J. L. Alonso, and J. C. Parajo. 2001. Strategies to improve the bioconversion

of processed wood into lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation. J. Chem.

Technol. Biotechnol. 76:279-284.

11. Nakasaki, K., and T. Adachi. 2003. Effects of intermittent addition of cellulase for

production of l-lactic acid from wastewater sludge by simultaneous saccharification and

fermentation. Biotechnol. Bioeng. 82:263-270.

12. Parajo, J. C., J. L. Alonso, and A. B. Moldes. 1997. Production of lactic acid from

lignocellulose in a single stage of hydrolysis and fermentation. Food Biotechnol. 11:45-58.

16

13. Patel, M. A., M. S. Ou, R. Harbrucker, H. C. Aldrich, M. L. Buszko, L. O. Ingram, and K.

T. Shanmugam. 2006. Isolation and characterization of acid-tolerant, thermophilic bacterial

biocatalysts for effective fermentation of biomass-derived sugars to lactic acid. Appl. Environ.

Microbiol. 72:3228-3235.

14. Payot, T., Z. Chemaly, and M. Fick. 1999. Lactic acid production by Bacillus coagulans

kinetic studies and optimization of culture medium for batch and continuous fermentations.

Enzyme Microb. Technol. 24:191-199.

15. Ramos, L. P., and J. N. Saddler. 1994. Enzyme recycling during fed-batch hydrolysis of

cellulose derived from steam-exploded Eucalyptus vitaminalis. Appl. Biochem. Biotechnol.

45:193-207.

16. Senthuran, A., V. Senthuran, B. Mattiasson, and R. Kaul. 1997. Lactic acid fermentation in

a recycle batch reactor using immobilized Lactobacillus casei. Biotechnol. Bioeng. 55:843-853.

17. Venkatesh, K. V. 1997. Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to

lactic acid. Bioresour. Technol. 62:91-98.

18. Wyman, C. E., B. E. Dale, R. T. Elander, M. Holtzapple, M. R. Ladisch, and Y. Y. Lee.

2005. Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresour.

Technol. 96:1959-1966.

19. Zhang, Y. H. P., and L. R. Lynd. 2006. A functionally-based model for hydrolysis of

cellulose by fungal cellulase. Biotechnol. Bioeng. 94:888-898.

20. Zhang, Y. H. P., M. Himmel, and J. R. Mielenz. 2006. Outlook for cellulase improvement:

screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 22:452-481.

17