Upload
dangduong
View
327
Download
4
Embed Size (px)
Citation preview
Suharsono.2005. BTK505. IPB
REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS
• Fage/virus memanfaatkan perangkat sel inang untuksintesis DNA/protein
• Strategi memanfaatkan sel inang mensintesis 4 makromolekul:
1. RNA polimerase baru khusus mentranskripsikromosom virus
2. Subunit RNA pol baru berasosiasi dengan polimerasesel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus
3. Protein represor menghambat fungsi sel inang4. Protein aktivator mengatur ekspresi gen virus
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada fage T7
2 kategori gen:Gen awal (early genes): KlasI diekspresikan pertamaGen lambat (late genes): Klas II dan Klas III diekspresikan bila produkgen awal tersedia
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada fage T7
3 kelompok gen1.Produk gen awal
menghambat sintesis RNA inang
2.Produk gen metabolismeDNA (enzim untuk replikasikromosom virus & nukleaseuntuk degradasi kromosomsel inang nt bebas)
3.Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkuskromosom virus). Produkterakhir: lisozim lisis selinang + 250 fage
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Ekspresi T7
1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inangtranskrip panjang dipotong oleh RNaseIII dari selinang 5 mol mRNA translasi oleh ribosom dari selinangProduk:
• antirestriksi (0.3) melindungi kromosom virus daridegradasi oleh enzim restriksi sel inang
• protein kinase (0.7) modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresigen klas II dan III
• RNA polimerase T7 (1) transkripsi klas II dan III (80% genom virus T7)
• Ligase (1.3) menyambung fragmen DNA2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7
-replikasi DNA virus3. Gen-gen klas III
-morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Siklus fage T7
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada SPO1
• SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis
• 3 kelompok gen: early, middle, late1. Gen awal RNA pol sel inang (menghasilkan produk
gen 28)2. Gen tengah RNA pol sel Inang yang mengandung
produk gen 28 pada posisi faktor σ–Faktor σ mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1–Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1–Menghasilkan produk gen 33 dan 34
3. Gen akhir RNA pol sel inang yang mengandungproduk gen 33 dan 34
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada SPO1 (lanjutan)
Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gentengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi pada λ
Setelah menginfeksi E.coli, λ menempuh:1.Siklus litik sel inang lisis 100 fage2.Siklus lisogenik kromosom fage menyisip kedalam
kromosom E.coli
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Siklus litik atau lisogenik?
Protein-protein regulator yang disandi λ
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi selama siklus litik λ
Fase litik meliputi 3 fase: • Fase Immediate-early• Fase Delayed-early• Fase Late
Fase Immediate-earlyKromosom λ masuk, transkripsioleh RNA pol sel inang. Inisiasitranskripsi dimulai dari PR(transkripsi ke kanan) gen crodan PL (transkripsi ke kiri) genN. Protein N diperlukan untuktransisi dari immediate-early kedelayed early (seperti produkgen 28 pada SPO1)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi selama siklus litik λ
Fase Delayed-earlyDimulai saat protein N menstimulasi transkripsi gen-gendelayed- early, mengekspresikangen cII dan cIII (relevan untuksiklus lisogenik), gen O, P (untukreplikasi kromosom λ) dan Q(untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk gen 33dan 34 dari SPO1)
Fase LateDimulai saat protein Q menstimulasi transkripsi gen-genlate spt gen penyandi kepala, ekor dan faktor-faktor litik
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Transkripsi gen-gen immediate-early
RNA polimerase sel inang:Kanan: PR croKiri: PL N
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Transkripsi delayed-early
RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N)Kanan: PR cII, O, P, Q Kiri: PL CIII
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan lisogeni
• Siklus lisogeni memerlukan:
1. Protein represor λ menghambat ekspresi gen-genuntuk siklus lisis– Disandi oleh gen cI di bawah kontrol PRE
(promoter for repressor establishment)
2. Protein Int λ integrasi ke kromosom E. coli– Disandi oleh gen Int di bawah promoter PINT
3. PRE dan PINT: sekuensi mirip, memerlukan protein cIIdan cIII supaya RNA polimerase mengenalinya cIIdan cIII diperlukan untuk siklus lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Protein cII dan cIII
• Protein cII protein regulator (aktivator) seperti CAP mengikat daerah –35 dari PRE dan PINT
menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan
• Protein cIII menonaktifkan protease yang dapatmendegradasi protein cII ( menjaga stabilitas cII)
• CII dan cIII memerlukan protein N
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Mekanisme Lisogeni
• Represor λ mengikat operator (OL dan OR), mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol PR dan PL yaitu: gen N dan cro
• N dan CRO tidak stabil konsentrasi di dalam sel turun(rendah)
• N rendah menghambat transkripsi gen-gen delayed-early yang tergantung N, yaitu: O, P, Q
• Q rendah/tidak ada mencegah ekspresi gen-gen danlate tidak terjadi siklus lisis
• Protein Int perantara rekombinasi situs spesifikantara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasikedalam kromosom E. coli
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Strategi λ dalam memilih siklus
1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhipembacaan terminator lisis
2. Menghasilkan protein aktivator cII yang mengikatdaerah promoter dan memudahkan RNA pol menempelpada promoter lisogeni
3. Menghasilkan represor mengikat operator lisogeni
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Interaksi represor-operator
• Mutasi gen cI plak jernih (WT plak keruh: lisis & lisogeni)
• Mutasi cII- dan cIII- plak jernih• Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator
sebagai dimer• Mutan operator (OL
- dan OR-) virulen (represor normal
tapi tidak dapat mengikat operator tidak dapatmenempuh siklus lisogeni plak jernih (~lacOc)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
• Operator mempunyai 3 situs penempelan (OL1, 2, 3; OR1, 2, 3)
• Operator tumpang tindih dengan promoter• Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan
yang lain oleh daerah kaya AT• Setiap mutasi pada situs penempelan virulen
= mutasi virulen
Operator
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Lisis-Lisogeni
• Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cII, cIII, cI, dan cro
• Protein cro (control of repressor and other things)– paling menentukan terjadinya siklus lisis atau
lisogeni– diekspresikan segera setelah infeksi λ– tidak memerlukan protein N– ada sebelum produk cI (represor), cII dan cIII ada
di dalam sel– represor, dapat mengikat OR dan OL seperti represor
cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) tidakdapat menghambat secara penuh ekspresi gen-genN dan cIII (dibawah PL) dan cro, cII, O, P, dan Q (dibawah PR)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Mekanisme Lisis-Lisogeni
• Lisogeni memerlukan ekspresi gen cI perlu cII dancIII untuk mengaktifkan PRE
• Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen perluantiterminator N dan Q
• Transkripsi cI lebih sensitif terhadap penurunan cII/cIIIdaripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalamsiklus lisis terhadap penurunan N dan Q
jika cro banyak menempel pada OR dan OL cIIdan cIII rendah cI tidak diekspresikan ekspresiseluruh gen λ siklus lisisjika cro sedikit tidak kuat menempel pada OR danOL ekspresi cII dan cIII normal cIdiekspresikan siklus lisogeni
– tingkat produksi cro temperatur, keadaanmetabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipefage
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Keadaan E. coli lisogeni
• Bakteri lisogenik untuk λ (E. coli (λ)) kebal terhadapsuperinfeksi (+λ)
• E. coli (λ) + λ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisispada bakteri
• Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendahmenempel pada PROR dan PLOL pada profage (menjagakondisi lisogeni) dan PROR dan PLOL pada λ yang masuk(mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E. coli krn situs attB sudah ditempati) kromosom λberada di sitosol jumlahnya berkurang (hilang) bila E. coli mengalami pembelahan sel
Suharsono.2005. BTK505. IPB
• Transkripsi represor pada tingkat rendah di E. coli (λ) dikontrol oleh PRM (promoter for repressor maintenance) yang tidak memerlukan cII dan cIII (beda dengan PRE)
• Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI:Jika represor cI rendah PRM dirangsang transkripsicIJika represor cI tinggi transkripsi dari PRM dihambatoleh represor cI ( regulasi autogenous)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Induksi lisis dari keadaan profage
• Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapatmenghambat ekspresi operon dari profage λ
• Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosomE. coli jarang terjadi
Suharsono.2005. BTK505. IPB
1. Induksi zigotik
• Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik– Jika kromosom yang
mengandung profagemasuk ke sel resipientidak menemui protein represor transkripsidari PROR dan PLOL
siklus lisis– Tidak terjadi lisis jika sel
resipien adalah E. coli(λ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
2. Mutasi pada cI
• Mutan cI857 sintesis protein represor thermolabil(stabil pada 30oC, tidak aktif pada 42oC)
• E. coli (cI857) dipanaskan E. coli lisis
Suharsono.2005. BTK505. IPB
3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapatmerusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin, sinar X)
• Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS• Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan
replikasi, E. coli mensintesis protein RecAmemudahkan sintesis enzim SOS termasuk untukreplikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzimsistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam E. coli (λ).
• Jika DNA rusak sinyal untuk mensintesis protein RecA merusak represor λ profage terinduksiuntuk mengalami lisis
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi SV40Produk gen early• Antigen t (15kD)• Antigen T (96 kD)
Transkrip sama, bedasplicing
Produk gen late• Protein kapsid (VP1, VP2,
VP3) beda splicing– mRNA late splicing:• 16S mRNA VP1• 19S mRNA:
•VP2•VP3
Krn 2 kodon AUGArah transkripsi gen-gen earlyberbeda dengan gen-gen late
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Regulasi sintesis protein SV40
• Infeksi (8-10 jam) gen early (gen A penyandiantigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol danditranslasikan oleh ribosom sel inang
• Mutan tsA (antigen T thermolabile) tidak dapatmemulai replikasi kromosom virus & tidak dapatmemulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus
Antigen T protein pengatur early yang esensial(~ protein N pada λ)
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Promoter early (EI dan EII) dekatdengan ORI dan gen early ASitus penempelan antigen T (I, II, III) bebas transkripsi olehRNA pol dari EI
Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Inisiasi transkripsidari situs EII
Penempelan antigen T pada situsII transkripsi gen A berhentiekspresi gen-gen late
Mekanisme
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Kromosom SV40 menginfeksi sel inang: •RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsigenA sintesis antigen T
•Akumulasi antigen T (tetramer) mengikat situs I inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA polmenempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsiantigen T jumlah antigen T banyak mengikat semuasitus I, dan II transkripsi gen early berhenti, danreplikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai
Regulasi SV40
Suharsono.2005. BTK505. IPB
Kenapa terjadi early/late?
• Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA polpada gen A sangat intensif produk antigen T banyak
• Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early, sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen lateSintesis antigen T regulasi autogenous (~ represor λ~ trp)Mutan tsA antigen T thermolabile didegradasi (situs I dan II bebas) stimulasi 15x transkripsi gen early overproduksi protein mutan T