INSTITUTO SUPERIOR DE CINCIAS DA SADE EGAS MONIZ

Mestrado em Segurana Alimentar e Sade PblicaLaboratrio em Avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos

Relatrios de Contagem de Clostridium perfringens e Campylobacter spp.

Docente: Dr. Isabel Santos

Discentes: Camilla Bezerra n. 108138 Janana Moraes n. 108137

Dezembro de 2010

Mestrado em Segurana Alimentar e Sade Pblica

CONTAGEM DE Clostridium perfringens SEGUNDO A METODOLOGIA DA NORMA ISO 7937 (2004)

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OBJECTIVO

Verificar a presena e a contagem de Clostridium perfrigens, a partir da amostra de um prato do dia, Lombo de porco assado, utilizando o mtodo segundo a Norma ISO 7937 (2004). A colheita da amostra foi efectuada em uma unidade de Restaurao, como parte de um procedimento de verificao da implementao de um plano HACCP, por forma a se poder verificar ou no a segurana dos produtos oferecidos ao consumidor final. A amostra foi recepcionada pelo Laboratrio em Avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos do Instituto Superior de Cincias da Sade Egas Moniz, no dia 08 de Dezembro de 2010. INTRODUO

1. Clostridium perfringens As intoxicaes causadas por Clostridium perfringens, anteriormente designado por C. welchii, resultam da ingesto de alimentos contaminados com a enterotoxina produzida por um elevado nmero de clulas vegetativas deste organismo.

Caractersticas gerais C. perfringens uma bactria Gram-positiva pertencente famlia Bacillaceae. As clulas tm a forma de bastonetes (bacilos), formam esporos e so imveis. De acordo com a toxina que produzem esto definidos 5 tipos (A, B, C, D e E) de C. perfringens. Na origem da maioria dos problemas de segurana alimentar surge C. perfringens tipo A e, em muito menor escala, do tipo C. Pertence ao grupo dos sulfito redutores, uma vez que capaz de metabolizar sais de sulfito produzindo gs sulfdrico e sulfuretos.

As condies que permitem o seu crescimento e sobrevivncia so as seguintes:

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Temperatura C. perfringens pode crescer num intervalo de temperaturas que varia entre 12 e 50C e tem uma temperatura ptima de crescimento (temperatura qual a taxa especfica de crescimento mxima) entre 43 e 47C. Este microrganismo um dos que apresenta uma maior velocidade de multiplicao, correspondente a um tempo de duplicao inferior a 10 minutos para as temperaturas ptimas. A produo de enterotoxina ocorre a temperaturas entre 30 e 40C. As clulas vegetativas so facilmente destrudas por cozedura, mas os esporos so muito resistentes ao calor. Alguns esporos sobrevivem ebulio durante 1 hora. As clulas vegetativas so muito sensveis a temperaturas de refrigerao e de congelao. Os esporos sobrevivem tanto a temperaturas de refrigerao como de congelao. A enterotoxina de C. perfringens inactivada por aquecimento a 60C durante 10 minutos.

pH C. perfringens consegue crescer em ambientes com valores de pH entre 5,5 e 9,0 e apresenta uma taxa especfica de crescimento mxima em ambientes com valores de pH entre 6,0 e 7,0. A esporulao ocorre para valores de pH entre 6,0 e 8,0. As clulas vegetativas morrem aps alguns dias a pH inferior a 5,0 e superior a 8,3.

Actividade da gua (aw) O crescimento das clulas vegetativas de C. perfringens e a germinao dos seus esporos ocorrem para valores de aw mnimos compreendidos entre 0,93 e 0,97, dependendo do soluto. Os esporos so muito resistentes a baixas actividades da gua. Em ambientes com concentraes de NaCl de 6 a 8% o crescimento de C. perfringens inibido.

Relao com o oxignio C. perfringens uma bactria anaerbia estrita. No entanto, de acordo com os resultados de alguns estudos, a embalagem em ambiente com oxignio no Laboratrio em avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos

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suficiente para impedir o seu crescimento, pois poder crescer no interior dos alimentos, onde os nveis de oxignio so baixos. Radiao A resistncia dos esporos de C. perfringens radiao varia entre 1,2 e 3,4 kGy, dependendo da estirpe.

Principais fontes de contaminao C. perfringens encontra-se amplamente distribudo no ambiente, faz parte da flora normal do trato intestinal do Homem (os nveis em indivduos idosos saudveis podem ser muito elevados) e de muitos animais domsticos e selvagens. Os esporos do microrganismo persistem no solo, sedimentos, vegetao e em reas de poluio fecal humana e animal. Apesar de este microrganismo fazer parte da flora fecal normal do Homem, pensa-se que o manipulador de alimentos no constitui uma fonte de contaminao de alimentos significativa. No solo podem ser encontrados nveis de 10 at 10000 cfu/g de C. perfringens. Sendo um habitante normal do intestino dos animais, C. perfringens pode contaminar as carcaas durante o abate. Os alimentos de origem animal so os reservatrios mais comuns da bactria e, eventualmente, da toxina.

Alimentos mais frequentemente associados a intoxicaes por C. perfringens. C. perfringens encontrado numa grande variedade de alimentos crus, desidratados e cozinhados, prospera nos alimentos ricos em protena de origem animal tais como a carne e os produtos derivados de carne, os cozidos de carne, as sopas espessas, os molhos, tartes e o leite. Nas intoxicaes por C. perfringens esto normalmente envolvidas grandes quantidades de alimentos preparados com antecedncia e arrefecidos lentamente e /ou inadequadamente refrigerados. Rolos de carne e aves recheadas so alimentos que apresentam condies favorveis para a proliferao de C. perfringens. Devido s suas dimenses dificultam a penetrao de calor at ao seu interior durante a cozedura. O arrefecimento lento e as condies de anaerobiose destas zonas centraisLaboratrio em avaliao de Contaminantes e Perigos Biolgicos

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proporcionam as condies ideais para a germinao dos esporos e o crescimento de bactrias que podem atingir nmeros preocupantes. Vegetais crus, especiarias, massas, gelatina, farinha e protena de soja apresentam nveis aceitveis de C. perfringens. Especial cuidado necessrio com alimentos preparados com estes ingredientes especialmente po, produtos de pastelaria, sopas, molhos, etc. Os esporos encontram durante o arrefecimento as condies adequadas para a germinao.

Principais sintomas da intoxicao por C. perfringens Como atrs referido, a maioria das intoxicaes surge com C. perfringens produtor da enterotoxina do tipo A. Esta enterotoxina uma protena formada durante o processo de esporulao no interior do intestino, e interfere no transporte de gua, sdio e cloretos atravs da mucosa intestinal. Os sintomas clssicos desta intoxicao (gastroenterite) so dores abdominais agudas, diarreias com nuseas, febre, e, em casos raros, vmitos. Os sintomas surgem cerca de 6 a 24 horas (mais usualmente 8 a 12 horas) aps a ingesto do alimento contaminado com um nmero elevado de clulas vegetativas de C. perfringens (considera-se que a dose infecciosa superior 1000000 de clulas vegetativas por g de alimento). Estes sintomas persistem, geralmente, durante 24 horas, mas podem manter-se, de forma menos acentuada, durante 1 a 2 semanas. Outros sintomas mais raros so a febre, os arrepios e as dores de cabea. Esta intoxicao no de um modo geral grave, mas pode em situaes raras, resultar na morte do indivduo por desidratao e outras complicaes. As intoxicaes por C. perfringens do tipo C so raras, mas muito graves e so designadas enterites necrticas. Estas enterites caracterizam-se por dores abdominais agudas muito intensas, diarreia sanguinolenta, algumas vezes vmitos e inflamao necrtica do intestino delgado.

Grupos de risco Os sintomas so mais severos em crianas, em idosos e em indivduos imunodeprimidos.

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Preveno da contaminao A intoxicao por C. perfringens ocorre na maioria das situaes quando no controlada a temperatura aps a cozedura de alimentos. As clulas viveis de C. perfringens so facilmente destrudas pelo aquecimento a 60C, mas os esporos podem sobreviver por bastante tempo a temperaturas mais elevadas. Assim, para evitar a sua germinao e a possibilidade de produo de toxina necessrio que os alimentos preparados, que no vo ser consumidos de imediato, sejam mantidos a temperaturas superiores a 65C ou arrefecidos a temperaturas inferiores a 10C num perodo de 2 a 3 horas. No caso de grandes peas de carne, recomenda-se que estas sejam partidas para que o seu interior arrefea rapidamente. Antes de servidos, os pratos preparados com antecedncia devem ser reaquecidos a pelo menos 75C para garantir a destruio de formas vegetativas eventualmente presentes. Dado que este microrganismo tem uma distribuio ubiquitria, as boas prticas de manipulao e higiene pessoal so requisitos fundamentais para prevenir a contaminao de alimentos.

Confirmao laboratorial A partir do isolamento de > ou = 106 organismos/g nas fezes do doente ou demonstrao da enterotoxina nas fezes do doente ou isolamento > ou = 106 organismos/g do alimento epidemiologicamente aplicado 2. Meios de Cultura TSC O gar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) tradicionalmente utilizado na determinao de Clostridium perfringens em alimentos e tem sido avaliado para anlise desse microrganismo em gua de consumo humano, constituindo-se tambm numa excelente alternativa para a enumerao de outros clostrdios sulfito-redutores. A cicloserina proporciona seletividade ao meio suprimindo o crescimento de praticamente todos os anaerbios facultativos. Como caracterstica diferencial neste meio os clostrdios sulfito-redutores reduzem o

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sulfito a sulfeto, este reage com o ferro presente formando um precipitado de sulfeto de ferro e produzindo, conseqentemente, colnias pretas. Caldo de Tioglicolato um meio de enriquecimento sem indicador, que proporciona nutrientes adequados ao crescimento de Clostridium perfringens. As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem uma anaerobiose suficiente para microrganismos anaerbios exigentes. Para interpretao dos resultados verifica-se turvao na presena de crescimento e na ausncia o meio permanece inalterado. Caldo Sulfito Lactose Base

O Caldo Sulfito Lactose Base recomendado para deteco e contagem de Clostridium perfringens em produtos farmacuticos de acordo com

Farmacopia Europia. O Caldo Sulfito Lactose Base preparado de acordo com a frmula da Farmacopia Europia (3 edio). Este meio til em testes semiquantitativos para presena de Clostridium perfringens em produtos

farmacuticos onde o nvel destas espcies um critrio de qualidade. O meio contm casena enzimtica hidrolisada e o extrato de levedura, os quais fornecem compostos nitrogenados essenciais para Clostridium. A lactose serve como fonte de carbono e carboidrato fermentvel. O hidrocloreto de LCistina fornece condies redutoras. O metabissulfito de sdio e citrato frrico de amnio atuam como indicadores da reduo do sulfito, indicado pelo enegrecimento do meio. possvel avaliar os resultados depois de 24-48 horas Para interpretao dos resultados: Clostridium perfringens (12924) Abundante + +; +: Gs: produo de gs; + H2S: produo de H2S indicado pelo enegrecimento do meio;- H2S: sem produo de H2S.

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PROCEDIMENTO ANALTICO Enriquecimento Pesar 10g da amostra de lombo de porco em saco de homogeneizao estril Adicionar 90 ml de Triptona Sal (Obtm-se deste modo a suspenso me ou diluio 10-1) Colocar em homogeneizador peristltico (Stomacher) Isolamento Preparar o meio TSC, a partir de 150ml do Meio base e 0,6ml de Cicloserina.. A seguir com uma pipeta inocular 1ml da suspenso me para o centro de uma placa de Petri vazia Adicionar 15ml do meio TSC, mantido a 44 47C em banho de gua , e misturar com o inoculado atravs da rotao lenta da placa. Aguardar o meio solidificar na placa e adicionar uma segunda camada do Meio TSC (Incorporao - dupla camada). Deixar solidificar e Incubar, em estufa, as placas em condies de anaerobiose (em jarras de atmosfera modificada, ou outro tipo de recipiente adequado) a 37C 1C durante 20h 2 h Repetir o mesmo processo para as diluies decimais10-2 e 10-3 Identificao/Confirmao Aps o perodo de incubao proceder com a leitura das placas, com identificao das colnias caracterstica de C. perfringens Realizar a contagem das colnias (menor que 150 por placa) e realizar a confirmao das mesmas (confirmar 5 colnia/placa); Com uma ansa, inocular a colnia seleccionada para meio fludo de Tioglicolato (meio de passagem sem inibidores) Incubar sob condies de anaerobiose a 37C 1C durante 20h 2 h Com uma pipeta esterelizada, transferir 5 gotas da cultura em Meio de Tioglicolato para o Meio LS Lactose- Sulfito

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Incubar em condies aerbias, a 46 C 0,5C durante 24h 2 h, em banho de gua Observar os tubos quanto produo de gs e precipitado de cor negra INTERPRETAO DOS RESULTADOS o Crescimento de Colnias caractersticas: colnias negras o Em meio LS verificou-se a produo de gs e precipitado negro o Contagem de C. perfringens: Meio de Cultura Diluies N de Colnias 10-1 Incontvel TSC 10-2 Incontvel 10-3 70

Para contagem de colnias totais foram consideradas apenas a leitura de uma placa com uma diluio decimal. O clculo do nmero N de ufc, foi realizado com a ajuda da seguinte equao:

N = c / v x d 70 / 1 x 10 -3 70/ 0,00170000 7 x 10 4 ufc/g

CONCLUSO Baseado nos resultados analticos e comparando-os aos Valores Guia publicados pelo Laboratrio de Microbiologia dos Alimentos INSA, que constituem linhas de orientao para avaliao da qualidade microbiolgica dos produtos, demonstram que o Lombo de porco assado indica a presena em quantidades inaceitveis de microrganismos patognicos ou toxinas que podero constituir um risco para a sade. Tabela 2 Valores Guia para avaliao da qualidade microbiolgicacozinhados de alimentos

MicroorganismoSatisfatrio

Valores GuiaAceitvel No Satisfatrio Inaceitvel

Clostridium perfringens 10