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Este é um relatório de microbiologia, que aborda o tema testes bioquimos
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Testes Bioquímicos e Quantificação
Relatório de Microbiologia
Componentes do grupo: Giuseppina Provenzano, Juliana Marinho, Letícia Adão, Stephanie
Medeiros e Victória Bárbara.
Turma; QM 171
Professores: Bárbara e Eliezer.
I) Introdução
A identificação e quantificação dos micro-organismos em determinado material é de
extrema importância, principalmente para a saúde pública. Os micro-organismos patogênicos são
responsáveis por diversas doenças, e, portanto, tal controle de qualidade deve ser usado para
impedir a propagação das mesmas para humanos e animais, através de alimentos, remédios etc,
além de plantas.
O primeiro método usado para identificação de micro-organismos é a microscopia
eletrônica. Com isso, identifica-se a morfologia e fisiologia dos mesmos e selecionam-se testes
específicos para as possíveis espécies, através de cultivos em determinados meios contendo
nutrientes previamente definidos. A partir destes testes é possível definir características
metabólicas, e, consequentemente, fazer a identificação da espécie.
Com relação à quantificação, os métodos se dividem em duas classes: os que quantificam o
número total de células, ou seja, as mortas e vivas, e os que quantificam o número de células
viáveis, ou seja, só as vivas. A microscopia também é usada para quantificar os micro-organismos.
É um método de contagem do número de células totais, a não ser que seja utilizada uma técnica de
coloração especial. Porém, para quantificar, a microscopia pode não ser confiável.
Para realizar os testes quantitativos, a amostra a ser contada deve ser diluída quase sempre,
pois, contam-se colônias, e, portanto, esse número não pode ser muito elevado nem muito baixo,
entre 30 a 300 colônias. Faz-se, então, diluições seriadas da amostra, tendo cautela para se obter o
número de colônias apropriadas. Alguns métodos não se utilizam da formação de colônias para
fazer a quantificação, mas sim uma relação mássica.
II) Objetivos
Inoculação de bactérias na placa de petri para fins de quantificação e realização de testes
bioquímicos, comparando os resultados com os dados de literatura.
III) Materiais e Métodos
Materiais
- Alça bacteriológica
- Alça de drigaslki
- Béquer com álcool 70%
- 5 placas de petri com ágar
- 5 placas de petri sem meio
- 6 tubos pequenos vazios
- Tubo com cultura da bactéria Escherichia coli
- Tubo com cultura da bactéria Pseudomonas
- 2 tubos pequenos com meio contendo vermelho de metila(MR)
- 2 tubos pequenos com meio específico para teste de fermentação voges- proskauer(VP)
- 2 tubos pequenos contendo ágar SIM
- 2 tubos pequenos com ágar lisina de ferro(LIA)
- 4 tubos pequenos com meio OF para glicose, estando dois dentre estes com óleo
mineral
- 2 tubos pequenos com meio OF para manitol, estando um com óleo mineral
Métodos
Testes Bioquímicos
- Ensaio de MR e VP
Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica.
Flambou-se a alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de
cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de MR, com o auxílio do dedo mínimo, e passou para este tubo
a cultura. O mesmo procedimento foi feito para os tubos VP, a técnica foi aplicada para ambas as
culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.
- Ensaio com tubo ágar SIM
Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica.
Flambou-se a alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de
cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de ágar SIM, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a
alçada com a cultura até o fundo do tubo. A técnica foi aplicada para ambas as culturas de
Escherichia coli e Pseudomonas.
- Ensaio com tubo ágar LIA
Ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica. Flambou-se a
alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em
seguida, abriu-se o tubo de ágar SIM, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alça com a
cultura por cima do meio sólido, e posteriormente, colocou-se a mesma alçada dentro do ágar. A
técnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.
- Ensaio com meio OF glicose
Trabalhando-se dentro da zona de segurança microbiológica, flambou-se a alça bacteriológica,
esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo
de meio OF glicose, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alçada com a cultura até o fundo
do tubo. A técnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.
- Ensaio com meio OF manitol
Trabalhando-se dentro da zona de segurança microbiológica, flambou-se a alça bacteriológica,
esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo
de meio OF manitol, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alçada com a cultura até o fundo
do tubo. Este teste foi realizado somente para a bactéria Pseudomonas.
Quantificação Microbiana
Para as técnicas que se seguem foi realizada, previamente, uma diluição do meio de cultura da
bactéria. Foram feitas seis diluições a partir da solução mãe. Pegou-se 1 mL da solução-mãe passou
para o tubo de diluição 10-1 , avolumando o mesmo, e posteriormente agitando o tubo.
Para a segunda diluição de 10-2, retirou-se 1 mL da diluição de 10-1, e passou-se para outro tubo
avolumando o mesmo. Este procedimento foi repetido, até chegar na diluição de 10-6.
- Técnica de Pour-Plate
Tomou-se 1 mL da diluição de 10-4 e passou-se para uma placa de petri; em seguida, pegou-se
duas placas de petri e colocou-se 1 mL da diluição de 10 -5. Fez-se o mesmo procedimento, porém
agora usando a diluição de 10-6.
Posteriormente, colocou-se o meio recém preparado com ágar por cima das diluições de cada
placa, dando uma leve balançada na mesma antes do ágar se solidificar.
- Técnica de Spread Plate
Em uma placa de petri com ágar, colocou-se 0,1 mL da diluição de 10 -4. Pegou-se uma alça de
drigalski, que estava mergulhada em um béquer com álcool 70%, passou a mesma três vezes no
fogo e espalhou o líquido por sobre o ágar. O procedimento foi repetido, tomando 0,1 mL das
diluições de 10-5 e 10-6 e colocando em quatro placas com ágar, sendo duas para cada diluição.
IV) Resultados e Discussão
Resultados: Quantificação Bacteriana
4.1) Resultados: Testes Bioquímicos
Meio Bactéria
Escherichia coli Pseudomonas
MR VP
MP - A parte superior do meio
se tornou vermelho
VP - A parte superior do meio
se tornou preta
MP - Não houve alterações
VP - A parte superior do meio
se tornou preta
SIM O meio tornou-se vermelho na
parte superior e ficou turvoNão houve alterações
LIA O meio tornou-se roxo O meio tornou-se roxo
Meio OF Glicose
Com óleo - O meio tornou-se
laranja - amarelado
Sem óleo - O meio tornou-se
laranja - - amarelado
Com óleo - O meio tornou-se
laranja - amarelado
Sem óleo - O meio tornou-se
laranja - - amarelado
Meio OF Manitol X
Com óleo - O meio tornou-se
laranja
Sem óleo - O meio tornou-se
laranja - - amarelado
4.1.1) Vermelho de Metila e Voges-Proskauer (MR VP)
Este teste avalia a via fermentativa realizada pela bactéria e contém os testes vermelho de
metila e Voges-Proskauer.
O teste vermelho de metila é um teste qualitativo para identificar se a bactéria produz
ácidos fortes (ácido acético, fórmico e lático) a partir da glicose através da via de fermentação de
ácido mista. Como é produzido um ácido, isso fará que o pH do meio se torne ácido. O vermelho de
metila, possui coloração vermelha em pH abaixo de 4,4 e coloração amarela em pH acima de 6,2.
Os meios em que foram inoculadas as bactérias possuíam a coloração amarelo claro (figura
1) Portanto, o resultado é positivo se houver a alteração da coloração do meio para vermelho e, a
permanência da coloração, negativo.
Figura 1. Meio MR Figura 2. MR Pseudomonas Figura 3. MR E. coli
Dessa forma a E. coli obteve um resultado positivo para o teste pois houve a mudança da
cor do meio para o vermelho(figura 3). Assim, a glicose inicialmente foi convertida a ácido
pirúvico e este sofreu uma fermentação ácida mista, havendo assim a formação de ácido. Desta
forma, o pH do meio diminuiu e houve a alteração da cor do indicador para o vermelho. Já para a
Pseudomonas, o resultado foi negativo, uma vez que não houve a alteração da coloração(figura 2)
Já o teste de Voges Proskauer diferencia os micro-organismos que realizam a fermentação
pela via butilenoglicólica da glicose. Nesse teste, quando o ácido pirúvico passar pela fermentação
pela via butilenoglicólica haverá a formação de acetoína (acetilmetilcarbinol).
Para revelar o resultado do teste, primeiramente, há a adição de KOH. Pois a acetoína é
oxidada a diacetil, pelo oxigênio atmosférico em ambiente constituído basicamente por hidróxido
de potássio. Em seguida, há a adição de α-naftol, e com isso o diacetil será convertido há um
complexo vermelho. Dessa forma, o resultado é positivo quando houver alteração da coloração do
meio para vermelho(figura 4).
Figura 4. meio VP Figura 5. VP E. coli Figura 6. VP Pseudomonas
Com a análise dos resultados, poderia-se concluir que para ambas as bactérias o resultado
foi negativo, uma vez que não houve a formação da coloração vermelha, a coloração gerada é
resultado da mistura dos reagentes utilizados(figuras 5 e 6).
Porém o resultado do teste é inconclusivo uma vez que não se há certeza de que os reagentes
estavam em condições adequadas para o uso. Mas na literatura é dito que ambas bactéricas possuem
resultados negativos, como foi obtido no teste. Porém se a bactéria analisada possuísse resultado
positivo, poderia se obter através do teste um resultado errôneo devido à condição do reagente.
4.1.2) Meio SIM
O Meio SIM é um teste bioquímico com base na motilidade dos micro-organismos e
produção de sulfeto e indol.
A produção de sulfeto permite verificar se a bactéria é capaz de degradar tiossulfato devido
possuir a enzima tiossulfato redutase. Nesta redução dos compostos de enxofre, haverá a formação
de ácido sulfídrico, que é incolor, porém este reagirá com o indicador que é o ferro, formando um
precipitado preto, devido à produção de sulfato ferroso. Como pode se observar nas reações abaixo:
Desta forma, o resultado positivo para a produção de sulfeto é o aparecimento de precipitado
preto no meio. Assim, ambas bactérias analisadas possuem resultado negativo, uma vez que em
ambos os teste não houve a formação de precipitado(figuras 8 e 9).
O meio SIM também permite verificar se há produção de indol. A produção de indol será
decorrente da ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio, que pode ser
observado na reação abaixo:
Para ser identificada a produção de indol é adicionado o reagente de Kovacs, e o resultado
positivo será o aparecimento de uma coloração avermelhada.
Assim, a E. Coli possui resultado positivo (figura 8), uma vez que, o meio se tornou vermelho, o
que não ocorre com a Pseudomonas que teve o resultado para o teste negativo (figura 9).
A motilidade é observada através do aspecto do meio, em que verifica se a bactéria cresceu
apenas no local em que foi inoculada ou por todo o meio. Esse teste é verificado através da turbidez
do meio. A E. coli apresentou o meio turvo e a bactéria foi capaz de crescer por todo o meio,
possuindo portanto motilidade. Já a Pseudomonas teve resultado negativo, pois houve o
crescimento apenas no local aonde foi inoculada.
Figura 7. ágar SIM Figura 8. E. coli Figura 9. Pseudomonas
4.1.3) LIA (Lysine Iron Agar)
O meio LIA permite verificar se a bactéria possui a lisina descarboxilase (LDC). Esta enzima
atua descarboxilando a lisina presente nos aminoácidos. O meio contém o indicador púrpura de
bromocresol que apresenta coloração amarela em pH abaixo de 5,2 e roxo em pH acima de 6,8.
O meio inicialmente apresenta a coloração amarela, isso ocorre pois o meio contém glicose e com
isso há a fermentação da glicose e consequentemente a produção de ácido. Isso fará com que o pH
diminua e o meio apresente a coloração amarela.
Para a ação da enzima lisina descarboxilase é necessário que o meio esteja ácido, e isso é obtido
pela fermentação da glicose. As bactérias que possuem a enzima descarboxilam a lisina com a
formação de amina (cadaverina) que tornará o meio básico como se pode observar pelo esquema
abaixo:
Como o meio se tornará basico, haverá a viragem do indicador e o meio apresentará a coloração
roxa. Portanto, o resultado será positivo quando o meio apresentar a coloração roxa e negativo
quando este possuir a coloração amarela.
Figura 10. ágar LIA Figura 11. E. coli Figura 12. Pseudomonas
Dessa forma pôde-se observar que ambas as bactérias testadas conseguem descarboxilar a lisina, ou
seja, resultado negativo, pois ambas possuíam o meio com coloração roxa.
4.1.4) OF Glicose
O teste de fermentação de glicose tem por objetivo fazer a diferenciação bioquímica de
baseada na metabolização de carboidratos por via oxidativa ou fermentativa em sistema fechado
(com óleo, figura 14).
No tubo contendo E.coli (figura 15 e 16) a cor amarela do meio indica a mudança de pH do
meio de neutro (verde) para ácido (amarelo). A mudança no meio indica a formação de ácido
proveniente da degradação da glicose. A E.coli degradou a glicose tanto no tubo aberto quanto no
tubo selado com óleo impedindo a entrada de ar (figura 15 e 16). A partir destes resultados conclui-
se que a E.coli é anaeróbia facultativa, pois seu metabolismo funciona em ambientes com ou sem
oxigênio.
No tubo contendo a bactéria Pseudomonas observou-se o mesmo resultado, indicando que
esta também possui um metabolismo anaeróbio facultativo (figura 15 e 16).
Figura 13. meio OF Figura 14. OF com óleo Figura 15. OF E. coli Figura 16. OF com óleo
e Pseudomonas E. coli e Pseudomonas
respectivamente respectivamente
4.1.4) OF Manitol
O meio OF contendo manitol, tem por objetivo observar a capacidade de uma determinada
bactéria degradar este carboidrato tanto em ambiente aeróbio quanto anaeróbio (figuras 17 e 18).
A Pseudomonas apresentou capacidade de degradar este carboidrato tanto no tubo aberto
quanto no tubo selado com óleo, indicado pela cor amarela do meio indicando formação de ácido
(figura 19). Este resultado indica que a mesma é anaeróbia facultativa.
Figura 17. OF manitol Figura 18. OF Manitol com óleo Figura 19. Pseudomonas
4.2) Quantificação
A técnica de quantificação visa efetuar a contagem total de bactérias numa amostra. Para isto
são feitas diluições em série da amostra a ser inoculada no meio. No método “Pour-Plate” uma
alíquota de 1ml da amostra com os microrganismos é adicionada à uma Placa de Petri sem, o meio
de cultura, que será posteriormente por cima dos microrganismos na placa. Este método favorece o
crescimento de bactérias anaeróbias. Já na técnica “Spread-Plate” uma alíquota da amostra
contendo os microrganismos é adicionada ao meio de cultura e espalhada com o auxílio de uma alça
de Drigalski.
No método “Pour-Plate” realizado não foi possível quantificar o número de células
microbianas, uma vez que o estas cresceram muito próximas e aglomeradas, sendo portanto
considerado <300.
No método “Spread-Plate” também não foi possível quantificar o número de células
microbianas, pelo mesmo motivo citado acima. Portanto, o número considerado foi <300.
V) Conclusão
Não foi possível obter colônias isoladas em nenhum dos métodos aplicados e em nenhuma
das diluições efetuadas, sendo assim é necessário mais cuidado em relação a inoculação das placas,
evitando carregar e espalhar excesso de material microbiológico nesta.
Em relação aos testes bioquímicos, é muito importante correlacionar os dados experimentais
com os dados catalogados, para identificar se o microorganismo em questão. Todavia, alguns erros
podem ocorrer, uma vez que nem sempre os dados téoricos e experimentais vão coincidir. Caso isso
ocorra, deve-se averiguar a procedência dos reagentes e dos demais materiais e refazendo o teste
para tomar alguma conclusão.
VI) Bibliografia
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