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1
MECANISMOS PLÁSTICOS NO MODELO DE AUTISMO INDUZIDO PELA
EXPOSIÇÃO PRÉ-NATAL AO ÁCIDO VALPRÓICO.
Roberta Monterazzo Cysneiros
Programa de Pós-graduação em Distúrbios do Desenvolvimento. Laboratório
de Neurobiologia. Universidade Presbiteriana Mackenzie (UPM), São Paulo,
Brasil
*Autor para correspondência.
Roberta Monterazzo Cysneiros
Rua da Consolação, 930. Prédio 38.
CEP 01302-907. São Paulo, SP, Brazil.
Telefone: 55-11 211482
id20580359 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
2
ABSTRACT
It is well established that exposure to valproic acid in utero increases the risk for
developing autism spectrum disorders. The valproic acid model of autism
reproduces the core and associated symptoms of the human condition. It is
hypothesized that autism is due to brain desynchronization of neural networks
as a consequence of changes in number of neurons or density of synaptic
contacts. Post mortem pathological studies have identified increased density of
neurons in the hippocampal formation. In the valproic acid (VPA) model of
autism in rodents we investigate the morphological changes in the hippocampal
formation and prefrontal cortex and hipocampal neurogenesis, Female Wistar
received a single dose of valproic acid (VPA, 800 mg / kg, po) on the ninth day
of gestation. The controls received saline. At 30 days old male offspring of both
groups were administrated with BrdU, (50 mg/kg, ip., twice a day) for 5 days. At
60 days old offspring of both groups were perfused and brains processed for
immunohistochemistry. Rats exposed to VPA in utero showed a greater number
of parvalbumin positive neurons in CA1 and CA3 subfields, and NeuN, in the
hippocampal formation and prefrontal cortex, was well an increased number of
BrdU positive neurons in subgranular zone of dentate gyrus. Our results
suggest that VPA increased hippocampal neurogenesis which justifies, in part,
the enhanced neuronal density observed in rats exposed to VPA in utero. The
higher neuronal density may contribute to a deficit in neural networks
synchronization.
Key-words
Autism, valproic acid, neurogenesis, calcium-binding protein
3
Resumo
Está bem estabelecido que a exposição ao ácido valpróico in utero aumenta o
risco para o desenvolvimento dos transtornos do espectro autista. O modelo
experimental para estudo do autismo pela exposição valpróico (VPA) in utero
reproduz os sintomas centrais e associados da condição humana. Especula-se
que no autismo deve ocorrer déficit na sincronização de redes neurais devido a
alterações no número de neurônios e ou na densidade de contatos sinápticos.
Estudos patológicos post mortem têm identificado anormalidade celular em
várias estruturas do sistema límbico, incluindo a formação hipocampal, no qual
um aumento da densidade de neurônios tem sido relatado na camada piramidal
e no subiculum. O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de
um aumento da neurogênese e ou redução no processo de apoptose. No
modelo animal pela exposição ao ácido válpróico (VPA) in utero, investigamos
as alterações morfológicas na formação hipocampal e no córtex pré-frontal
utilizando imunohistoquímica para a parvalbumina, para o marcador de
neurônios pós-mitóticos (NeuN) e a neurogênese hipocampal. Fêmeas Wistar
receberam VPA (800 mg/kg, p.o.) no nono dia da gestação, e os controles,
salina. Aos 30 dias pós-natal, filhotes machos receberam (50 mg/kg, ip., duas
vezes ao dia) for 5 dias. Aos 60 dias, foram perfundidos e os cérebros
submetidos à imunohistoquímica para a parvalbumina, NeuN e BrdU. Ratos
expostos ao VPA in utero apresentaram maior número de neurônios reativos
para parvalbumina nas regiões CA1 e CA3 e para NeuN, em toda a formação
hipocampal e córtex pré-frontal, e maior número de neurônios positivos para
BrdU na zona subgranular, granular e molecular do giro dentado
comparativamente aos controles. Nossos resultados demonstraram que a
exposição ao VPA in utero aumenta a neurogênese hipocampal o que justifica
o aumento da densidade neuronal observada na formação hipocampal e córtex
pré-frontal. Futuros estudos devem ser conduzidos para investigar se a
redução na apoptose está relacionada com o aumento no número de neurônios
4e se a manipulação deste processo pode não somente modificar as alterações
do número de neurônios como reverter as alterações comportamentais autism-
like observadas no modelo.
Palavras chave: ácido valpróico, neurogênese, proteínas ligantes de cálcio,
autismo
Introdução
De acordo com o DSM-IV (Diagnostic and Statistic Manual of Mental
Disorders, Fourth Edition) e a CID 10 (Classificação Internacional das Doenças,
10ª edição), o termo transtorno global do desenvolvimento (TGD) compreende
um amplo espectro de distúrbios caracterizados pela presença de alterações
comportamentais de início precoce com uma grande variabilidade de
apresentações clínicas e graus de acometimento. Esses distúrbios têm em
comum diminuição ou perda das habilidades sociais, da comunicação e a
presença de interesses e comportamentos restritos e estereotipados (APA,
1994 e OMS, 1992).
A categoria TGD inclui as seguintes condições: Síndrome de Rett, transtorno
desintegrativo da infância, Síndrome de Asperger, transtorno invasivo do
desenvolvimento sem outra especificação (TID-SOE) e autismo (APA, 1994).
Apesar da patogênese do autismo permanecer desconhecida, vários estudos
mostram evidências que indicam a importância de fatores genéticos (Folstein e
Piven, 1991; Folstein e Rosen-Sheidley, 2001), e de fatores ambientais, como a
exposição às substâncias teratogênicas como a talidomida (Strömland e col.,
1994), ácido valpróico (Christianson, Chesler et al., 1994; Williams e Hersh,
1997; Williams, King et al., 2001) e etanol (Nanson, 1992). Devido à
complexidade dos sintomas dos indivíduos com autismo, acredita-se que várias
regiões cerebrais tenham alterações morfofuncionais que justificam a
diversidade fenotípica dos pacientes com autismo (Mercadante, Cysneiros et
al., 2008). Neste sentido, estudos experimentais têm buscado desenvolver
5modelos em roedores na tentativa de reproduzir alguns dos sintomas centrais
do autismo (Crawley, 2007). Ainda que modelos em roedores não possam
replicar fielmente os transtornos do espectro autista em humanos, são úteis
para o entendimento das bases neurobiológicas e na investigação da interface
entre as bases bioquímicas, moleculares, anatômicas e genéticas da condição
humana.
O ácido valpróico (VPA) é reconhecido como um fator ambiental
envolvido com a etiologia do autismo (Christianson, Chesler et al., 1994;
Williams e Hersh, 1997; Williams, King et al., 2001; Dean, Hailey et al., 2002;
Rasalam, Hailey et al., 2005). Em ratos, uma única injeção intraperitoneal de
VPA durante a gestação em um período correspondente ao fechamento do
tubo neural produz nos filhotes um fenótipo comportamental e anatômico
similar à condição humana. Os filhotes exibem redução no número de células
de Purkinje no cerebelo, prejuízo na interação social, comportamentos
repetitivos e estereotipados, limiar aumentado para estímulos nociceptivos,
sensibilidade aumentada para estimulação sensorial, déficit cognitivo, aumento
da ansiedade e do medo (Rodier, Ingram et al., 1996; Rodier, Ingram et al.,
1997; Schneider e Przewlocki, 2005; Schneider, Turczak et al., 2006; Markram,
Rinaldi et al., 2008), todos os sintomas que são comuns no autismo. No
entanto, estudos histopatológicos são escassos neste modelo.
Tem sido proposto que o autismo é devido a déficit na sincronização de
redes neurais como resultado do desbalanço entre a sinalização excitatória e
inibitória, em conseqüência de alterações no número de neurônios e ou na
densidade de contatos sinápticos. Estudos patológicos post mortem têm
identificado anormalidade celular em várias estruturas do sistema límbico,
incluindo a formação hipocampal, no qual um aumento da densidade de
neurônios tem sido relatado na camada piramidal e no subiculum (Bauman e
Kemper, 1985). O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de
um aumento da neurogênese e ou defeito no processo de apoptose.
(Mercadante, Cysneiros et al., 2008) postularam que alteração na neurogênese
pode um mecanismo neurobiológico relevante no autismo e (Snow, Hartle et
al., 2008) sugeriram que redução no mecanismo de poda pode igualmente
relevante.
6 Estudos de associação e citogenéticos revelam a presença de mutação
na região q11-13 do cromossomo 15 responsável pela expressão das três
subunidades do receptor GABAA, (Cook, Courchesne et al., 1998; Shao,
Cuccaro et al., 2003), realçando a importância do sistema GABAérgico na
neuropatologia do autismo. O ácido gama aminobutírico (GABA) é o principal
neurotransimissor inibitório do cérebro adulto, e excitatório no cérebro em
desenvolvimento. Durante o desenvolvimento, as sinapses gabaérgicas são
formadas mais precocemente que as sinapses glutamatérgicas (Deng, Yao et
al., 2007), o que confere ao GABA um papel central como um regulador que
capacita os novos ou imaturos neurônios a se integrarem dentro de um circuito
neural (Akerman e Cline, 2007). No período embrionário e peri-natal do
desenvolvimento, os receptores GABAA medeiam efeitos despolarizantes que
resultam na ativação de processos de sinalização sensíveis ao cálcio que são
importantes para diferenciação do cérebro (Deng, Yao et al., 2007;
Galanopoulou, 2008). A resposta despolarizante mediada pelo GABA exerce
um fator chave no desenvolvimento do circuito neural uma vez que a ativação
do receptor GABAA ativa canais de cálcio e sódio dependentes de voltagem e
reduz o bloqueio, mediado pelo magnésio, no receptor glutamatérgico do tipo
NMDA. Estes efeitos influenciam a atividade neuronal e também deflagram
processos de sinalização que controlam a proliferação, migração e
diferenciação neuronal (Ben-Ari, 2007; Ben-Ari, Gaiarsa et al., 2007;
Galanopoulou, 2008). Na formação hipocampal encontra-se uma população
heterogênea de interneurônios GABAérgicos que expressam diferentes tipos
de proteínas ligantes de cálcio, dentre estas, a parvalbumina. A expressão da
parvalbumina tem sido utilizada para avaliação da densidade de interneurônios
GABAérgicos, e sua expressão já foi bem caracterizada no cérebro de
roedores.
A proposta de trabalho foi investigar se a exposição ao VPA in utero
promove alterações morfológicas na formação hipocampal e no córtex pré-
frontal utilizando imunohistoquímica para a parvalbumina, para o marcador de
neurônios pós-mitóticos (NeuN) e neurogênese hipocampal.
MÉTODOS
7Os procedimentos experimentais utilizados neste trabalho foram aprovados
pelo Comitê de Ética da Universidade Presbiteriana Mackenzie.
Animais
Ratos adultos Wistar fêmeas, procedentes do biotério central da Universidade
Federal de São Paulo, pesando entre 200-250 g foram alojadas no Biotério da
Universidade Presbiteriana Mackenzie e mantidos em ciclo claro-escuro (12 h),
com temperatura controlada (22 OC) e com livre acesso à água e comida. No
nono dia da gestação o grupo experimental recebeu uma única dose de ácido
valpróico (800 mg/kg, p.o.), e o grupo controle, salina (1mL/250 g).
Grupos experimentais
Em P21, imediatamente após o desmame, os filhotes machos foram divididos
em dois grupos: Grupo controle (CTRL, 5 animais ) e ácido valpróico (VPA, 5
animais), aleatoriamente escolhidos de 3 ninhadas. Em PN30 todos os animais
receberam bromodeoxiuridina (BrdU) 50 mg/kg, 2 vezes ao dia, durante 5 dias.
MÉTODO
Animais
Ratos adultos Wistar fêmeas, procedentes do biotério central da Universidade
Federal de São Paulo, pesando entre 200-250 g foram alojadas no Biotério da
Universidade Presbiteriana Mackenzie e mantidos em ciclo claro-escuro (12 h),
com temperatura controlada (22 OC) e com livre acesso à água e comida.
Após controle do ciclo estral, as fêmeas foram acasaladas. No nono dia da
gestação o grupo experimental recebeu uma única dose de ácido valpróico
(800 mg/kg, p.o.), e o grupo controle, salina (1mL/250 g).
Grupos experimentais
Os filhotes machos foram divididos em dois grupos: Grupo controle (CTRL) e
ácido valpróico (VPA). Os grupos CTRL e VPA foram formados por 3 animais
aleatoriamente escolhidos de 3 ninhadas.
Imunohistoquímica
8
Em PN60, os animais foram perfundidos e os cérebros retirados para
posterior análise histológica. Para a perfusão, os animais foram anestesiados
com pentobarbital sódico 75 mg/kg (ip) e submetidos à perfusão transcardíaca
com tampão fosfato salina (PBS pH 7,4). A seguir, essa solução foi substituída
por Paraformaldeído 4%. Os cérebros foram removidos imediatamente e
deixados por 24 horas em solução fixadora de paraformaldeído 4% e, a seguir,
colocados em uma solução de sacarose 30%. Após 24 horas, os cérebros
foram cortados em vibrátomo em fatias de 50m. As fatias foram processadas
para marcação com BrdU, Parvalbumina e NeuN.
Para imunomarcação para BrDU, as fatias foram incubando-se com
formamida 50%, 280 mM NaCl e 30 mM de citrato de sódio a 65oC por 2 horas
e a seguir com HCl 2M em PBS a 37oC por 30 min e posteriormente lavadas
com ácido bórico 0.1M, pH 8,5 à temperatura ambiente por 10 min, para
neutralizar a reação anteriormente citada. Posteriormente, as fatias foram
incubadas com peróxido de hidrogênio 3% em PBS por 15 min, em seguida
pela solução bloqueadora (soro de cabra 2%, triton X-100 0,3% e BSA 0,1%
em PBS) por 2 horas a temperatura ambiente. A seguir as fatias foram
incubadas com 2 ug/mL anticorpo monoclonal camundongo a 4 0C �overnight�.
As fatias foram lavadas com PBS, incubadas com anticorpo secundário
biotinilado (1:200, Vector) por 2 horas a 25 0C, lavadas e incubadas com Kit
ABC por 1 hora, lavadas e reveladas com diaminobenzidina (DAB) (0.05%) em
Tri-HCl 0,05 M pH 7,6 e peróxido de hidrogênio (0.03%). Por fim, as fatias
foram montadas, desidratadas, diafanizadas e cobertas com lamínulas,
usando-se entelan, analisadas e fotografadas em microscópio óptico.
Para imunomarcação da parvalbumina e NeuN, as fatias foram
incubadas em solução contendo os anticorpos primários na concentração
adequada - Parvalbumina 1:5000 e NeuN 1:1000 por 24 horas e 48 horas à
40C, respectivamente. Após remoção do anticorpo primário, as fatias foram
lavadas 3 vezes com PB e incubadas com o anticorpo secundário por 2 horas à
temperatura ambiente. Após remoção do anticropo secundário e lavagem com
PB, as fatias foram incubadas com o Kit ABC por 90 minutos, lavadas e
reveladas com diaminobenzidina em Tri-HCl 0,05 M pH 7,6 e peróxido de
hidrogênio. Por fim, as fatias foram montadas, desidratadas, diafanizadas e
9cobertas com lamínulas, usando-se entellam. As lâminas foram analisadas em
microscópio óptico e fotografadas. Foram utilizadas 12 fatias por animal e 5
animais para cada grupo.
Resultados e Discussão
Imunorreatividade para PV foi observada no soma e na arborização
axonal e dentrítica dos interneurônios (Fig1). A maioria dos neurônios
imunomarcados com parvalbumina (PV+) foram encontrados no stratum
piramidale e oriens das regiões CA1, CA2 e CA3 e adjacente do stratum
granulosum do giro dentado. A inspeção visual sugeriu aumento dos PV+ nas
regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal dos animais do grupo VPA
comparativamente ao grupo controle (Fig 1). Nossos dados são corroborados
por (Lawrence, Kemper et al., 2010) que relataram aumento da imunomarcação
para parvalbumina nas regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal de
indivíduos com autismo quando comparados com controles. Nossos dados
reforçam a observação de (Bauman e Kemper, 1985) que relataram uma maior
densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com autismo, e realçam o
papel do sistema GABAérgico no autismo e em particular no hipocampo.
_ Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.
Observa-se aumento no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da
formação hipocampal do grupo VPA
Em roedores, a densidade de neurônios imunorreativos para as
proteínas ligantes de cálcio é maior nos estágios precoces do desenvolvimento,
reduzindo na vida adulta (Jiang e Swann, 1997)
que o ácido valpróico, por mecanismos epigenéticos, estimulou uma maior
proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda.
contexto, (Snow, Hartle et al.
de ratos adultos expostos ao VPA
dendritos apicais das células piramidais do córtex motor em comparação aos
controles. Os dados sugeriram que o processo de poda está comprometido
neste modelo sendo consistente com as teorias de desenvolvimento anormal
Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.
no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da
formação hipocampal do grupo VPA
Em roedores, a densidade de neurônios imunorreativos para as
proteínas ligantes de cálcio é maior nos estágios precoces do desenvolvimento,
(Jiang e Swann, 1997). Nossos dados permitem supor
que o ácido valpróico, por mecanismos epigenéticos, estimulou uma maior
proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda.
et al., 2008) avaliando a arborização dendrítica cortical
de ratos adultos expostos ao VPA in utero observaram maior complexidade nos
dendritos apicais das células piramidais do córtex motor em comparação aos
controles. Os dados sugeriram que o processo de poda está comprometido
neste modelo sendo consistente com as teorias de desenvolvimento anormal
10
Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.
no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da
Em roedores, a densidade de neurônios imunorreativos para as
proteínas ligantes de cálcio é maior nos estágios precoces do desenvolvimento,
. Nossos dados permitem supor
que o ácido valpróico, por mecanismos epigenéticos, estimulou uma maior
proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda. Neste
avaliando a arborização dendrítica cortical
ervaram maior complexidade nos
dendritos apicais das células piramidais do córtex motor em comparação aos
controles. Os dados sugeriram que o processo de poda está comprometido
neste modelo sendo consistente com as teorias de desenvolvimento anormal
11no autismo. Adicionalmente, (Fukuchi, Nii et al., 2009) demonstraram em
cultura de neurônios corticais que o VPA de forma dose-dependente inibe a
histona deacetilase associada com a regulação epigenética da expressão
gênica. Os autores demonstraram que o VPA aumentou a expressão do RNAm
do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em neurônios cultivados.
Tem sido mostrado que os níveis de BDNF afetam a transmissão GABAérgica.
A imunorreatividade para parvalbumina é aumentada pelo BDNF em muitas
estruturas cerebrais e células em cultivo (Berghuis, Agerman et al., 2006;
Arango-Gonzalez, Cellerino et al., 2009). Por outro lado, camundongos BDNF�
/� apresentam redução da imunomarcação para parvalbumina e calbindina nos
neurônios do neocórtex e do hipocampo (Jones, Farfiias et al., 1994).
Curiosamente, alguns estudos relatam hiperatividade do BDNF em indivíduos
com autismo (Tsai, 2005). No entanto, não há uma evidência direta que o
mesmo de aplica in vivo no modelo animal de autismo pela exposição ao ácido
valpróico in utero.
O papel fisiológico das proteínas ligantes de cálcio não é claro, porém
estudos conduzidos em camundongos deficientes em parvalbumina mostram
que baixo nível de parvalbumina nos axônios terminais resulta em aumento da
liberação de GABA, sugerindo que esta modula a liberação de GABA
dependente de cálcio (Vreugdenhil, Jefferys et al., 2003). As proteínas de
ligantes de cálcio tamponam o cálcio livre intracelular. A redução do sistema de
tamponamento de cálcio dentro das células pode refletir um prejuízo funcional
dos interneurônios GABAérgicos tornando-os mais vulneráveis aos estímulos
excitatórios provenientes das fibras musgosas e assim, o aumento da liberação
de GABA seria um mecanismo compensatório. Por outro lado, o aumento da
expressão destas proteínas, pode aumentar o sistema de tamponamento ao
cálcio e consequentemente a viabilidade dos interneurônios GABAérgicos e
assim facilitando o controle inibitório sobre os estímulos excitatórios
provenientes do giro dentado em direção as células piramidais da região CA3.
A facilitação da transmissão GABAérgica pode contribuir para o desequilíbrio
entre a transmissão excitatória e inibitória a qual vem sendo especulado como
um mecanismo neurobiológico importante do autismo e adicionalmente
contribuir para disfunção no processo de aprendizagem. Neste sentido,
(Dumas, Powers et al., 2004) demonstraram que a superexpressão de
proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para
deficiência na memória espacial de roedores. Corroborando com estas
informações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA
apresentaram déficit na memória viso
Mackenzie et al., 2009) demonstraram que camundongos expostos ao VPA
utero apresentaram redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)
na região CA1 e giro dentado da formação hipocampal e no córtex
somatossensorial. Esta proteína faz parte de uma importante classe de
moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sináp
chamadas neurexinas no terminal sináptico. Estas desempenham um papel
fundamental para a formação, maturação e estabilidade das sinapses
excitatórias glutamatérgicas
nesta proteína reduz e a conectividade e a eficiência das sinapses excitatórias
resultando em um desequilíbrio na integração dos impulsos sinápticos.
Recentemente, estudos genéticos em indivíduos com au
mutação nos genes das neuroliginas, levando a hipótese que prejuízos na
função sináptica causada por essas mutações estão relacionados à
fisiopatologia do autismo (Jamain, Quach
Para verificar se o aumento de número de neurônios era restrito aos
interneurônios GABAérgicos, realizo
da maioria dos neurônios pós
aumento da densidade neuronal na região cortical e em toda a formação
hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esse
dados corroboram com os resultados de Bauman e Kemper (1985) que
relataram uma maior densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com
autismo.
proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para
deficiência na memória espacial de roedores. Corroborando com estas
ações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA
apresentaram déficit na memória viso-espacial. Nesta linha,
demonstraram que camundongos expostos ao VPA
redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)
na região CA1 e giro dentado da formação hipocampal e no córtex
somatossensorial. Esta proteína faz parte de uma importante classe de
moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sináp
chamadas neurexinas no terminal sináptico. Estas desempenham um papel
fundamental para a formação, maturação e estabilidade das sinapses
excitatórias glutamatérgicas (Cline, 2005). Consequentemente, deficiência
nesta proteína reduz e a conectividade e a eficiência das sinapses excitatórias
resultando em um desequilíbrio na integração dos impulsos sinápticos.
Recentemente, estudos genéticos em indivíduos com autismo identificaram
mutação nos genes das neuroliginas, levando a hipótese que prejuízos na
função sináptica causada por essas mutações estão relacionados à
(Jamain, Quach et al., 2003).
Para verificar se o aumento de número de neurônios era restrito aos
interneurônios GABAérgicos, realizou-se imunohistoquímica para um marcador
da maioria dos neurônios pós-mitóticos (NeuN) . A inspeção visual revelou
aumento da densidade neuronal na região cortical e em toda a formação
hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esse
dados corroboram com os resultados de Bauman e Kemper (1985) que
relataram uma maior densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com
12proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para
deficiência na memória espacial de roedores. Corroborando com estas
ações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA in utero
(Kolozsi,
demonstraram que camundongos expostos ao VPA in
redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)
na região CA1 e giro dentado da formação hipocampal e no córtex
somatossensorial. Esta proteína faz parte de uma importante classe de
moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sinápticas
chamadas neurexinas no terminal sináptico. Estas desempenham um papel
fundamental para a formação, maturação e estabilidade das sinapses
. Consequentemente, deficiência
nesta proteína reduz e a conectividade e a eficiência das sinapses excitatórias
resultando em um desequilíbrio na integração dos impulsos sinápticos.
tismo identificaram
mutação nos genes das neuroliginas, levando a hipótese que prejuízos na
função sináptica causada por essas mutações estão relacionados à
Para verificar se o aumento de número de neurônios era restrito aos
se imunohistoquímica para um marcador
mitóticos (NeuN) . A inspeção visual revelou
aumento da densidade neuronal na região cortical e em toda a formação
hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esses
dados corroboram com os resultados de Bauman e Kemper (1985) que
relataram uma maior densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com
Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para
NeuN. Observa-se aumento no número d
CA3 da formação hipocampal do grupo VPA
No entanto, aumento da densidade neuronal não se restringiu às estruturas do
sistema límbico, como o hipocampo, aumento da densidade neuronal foi
também verificado em diversas regiõ
límbico(PrL), infra límbico (IL), cingulado (Cg1), órbito
agranular ventral (AIV), insular agranular dorsal (AID), insular granular (GI),
somatossensorial primário (SiJ) e motor primário (M1) (Fig 3)
comparativamente ao grupo controle.
Fig 3. Fotomicrografia do córtex pré
Observa-se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais
(PrL=pré-límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agr
ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ= somatossensorial primário e M1= motor primário.
O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um excesso de
neurogênese e ou defeito no processo de apoptose.
al., 2008) postularam que alteração na neurogênese pode um mecanismo
neurobiológico relevante no autismo e
redução no mecanismo de poda igualmente relevante.
aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento da
neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal.
neurogênese, um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante
toda a vida, é claramente demonstrada no cérebro adulto na zona
Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para
se aumento no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e
CA3 da formação hipocampal do grupo VPA
No entanto, aumento da densidade neuronal não se restringiu às estruturas do
sistema límbico, como o hipocampo, aumento da densidade neuronal foi
também verificado em diversas regiões pré-fontais, como córtex pré
límbico(PrL), infra límbico (IL), cingulado (Cg1), órbito-frontal (LO), insular
agranular ventral (AIV), insular agranular dorsal (AID), insular granular (GI),
somatossensorial primário (SiJ) e motor primário (M1) (Fig 3)
omparativamente ao grupo controle.
Fig 3. Fotomicrografia do córtex pré-frontal com imunomarcação para NeuN.
se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais
límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agr
ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ= somatossensorial primário e M1= motor primário.
O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um excesso de
neurogênese e ou defeito no processo de apoptose. (Mercadante, Cysneiros
m que alteração na neurogênese pode um mecanismo
neurobiológico relevante no autismo e (Snow, Hartle et al., 2008)
redução no mecanismo de poda igualmente relevante. Considerando que
aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento da
neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal.
um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante
toda a vida, é claramente demonstrada no cérebro adulto na zona
13Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para
e neurônios PV+ nas regiões CA1 e
No entanto, aumento da densidade neuronal não se restringiu às estruturas do
sistema límbico, como o hipocampo, aumento da densidade neuronal foi
fontais, como córtex pré-
frontal (LO), insular
agranular ventral (AIV), insular agranular dorsal (AID), insular granular (GI),
somatossensorial primário (SiJ) e motor primário (M1) (Fig 3)
frontal com imunomarcação para NeuN.
se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais
límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agranular ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ=
O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um excesso de
(Mercadante, Cysneiros et
m que alteração na neurogênese pode um mecanismo
, 2008) sugerem
Considerando que
aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento da
neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal. A
um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante
toda a vida, é claramente demonstrada no cérebro adulto na zona
14subventricular dos ventrículos laterais (ZSV) e na zona subgranular (ZSG) do
giro dentado. Para a análise da formação de novos neurônios, a incorporação
da bromodeoxiuridina (BrdU) nas células em divisão, mais precisamente na
fase S do ciclo celular tem sido amplamente utilizada. (Fig4).
Figura 4. Fotomicrografia do giro dentado de ratos. Imunohistoquímica para
BrdU. As setas indicam novos neurônios reativos para BrdU. Observe aumento
da imunorreatividade nos animais expostos ao VPA in utero
No grupo controle a imunorreatividade para BrdU foi praticamente
restrita à zona subgranular (ZSG, setas pretas) do giro dentado. Algumas
poucas células BrdU+ foram localizadas camada granular (GL, seta vermelha)
no grupo controle. No grupo VPA observa-se aumento no número de células
BrdU+ na ZSG comparativamente aos controles e extensa marcação nas
camadas granular (GL, seta vermelha) e molecular (ML, seta verde).
O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento de
proliferação e ou redução no processo de apoptose. Laeng, Pittis et al. (2004)
estudando a neurogênese em culturas de células embrionárias corticais de
ratos demonstraram que o VPA aumentou a proliferação de células
progenitoras neurais derivadas de células tronco e que a maioria dos novos
neurônios eram do tipo Gabaérgicos. Está bem estabelecido, que no início da
neurogênese, ocorre morte celular maciça e que mais de 50% das células são
eliminadas por apoptose juntamente com a diferenciação neuronal. A apoptose
15ocorre não somente nos neurônios, mas também nas células progenitoras
neurais e nos neuroblastos. Sendo assim, redução no processo de apoptose
também poderia aumentar a imunorreatividade para o BrdU observada no
nosso estudo. Go, Seo et al. (2011) estudaram o efeito do VPA sobre a
apoptose em células progenitoras neurais cultivadas de cérebros embrionários
de ratos. O VPA protegeu as células progenitoras neurais da morte celular por
meio da degradação do Ikappa B alfa e da ativação do NF-kappa B que levou
ao aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-XL. Ambos os
estudos sugerem que o VPA aumenta a neurogênese em consequência da
redução no processo de apoptose das células progenitoras neurais. Estudos
posteriores neste modelo precisam confirmar se os mesmos mecanismos
ocorrem in vivo. A presença de células BrdU+ na camada molecular do grupo
VPA é sugestivo de migração aberrante. Estes novos neurônios podem
contribuir para a formação de circuitos neurais desorganizados e não seletivos
acarretando em perda do sincronismo intra-hipocampal e entre o hipocampo e
córtex comprometendo a função fundamental frontal de interpretar e integrar
informações e fornecer um feedback complexo, rico em contexto que seja
capaz de orientar ações apropriadas (Courchesne e Pierce, 2005). Até o
presente, não há uma única teoria para explicar como as alterações
neuroanatômicas estão relacionadas aos prejuízos comportamentais, em parte
porque os estudos no cérebro post mortem de autistas são escassos e, além
disso, não se tem encontrado anormalidades grosseiras. O modelo animal de
autismo pela exposição ao VPA in utero tem-se mostrado uma ferramenta útil
para explorar áreas cerebrais potenciais na neurobiologia do autismo e
avaliação de possíveis intervenções. Nossos resultados demonstraram que a
exposição ao VPA in utero aumenta a neurogênese hipocampal o que justifica
o aumento da densidade neuronal observada na formação hipocampal e córtex
pré-frontal. Futuros estudos devem ser conduzidos para investigar se a
redução na apoptose está relacionada com o aumento no número de neurônios
e se a manipulação deste processo pode não somente modificar as alterações
do número de neurônios como reverter as alterações comportamentais autism-
like observadas neste modelo.
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