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REMODELADO MITOTICO DEL REPLICON Y DE LA ESTRUCTURA CROMOSOMICA
Jean-Marc Lemaitre,1 Etienne Danis,1 Philippe Pasero,2 Yegor Vassetzky,1 and Marcel Me´ chali1,*
Petignat, Camila
Rochi, Lucía
Sampayo, Rocío
Toro, Ayelén
•Se trabaja en Xenopus esperma en extracto de huevo de Xenopus, se reconstituye núcleo
• Se usan espermas se observa que el núcleo está organizado en loops cortos
antes de la fertilización
Permite Replicación rápida
• Núcleos adultos diferenciados No se adaptan bien a condiciones de
replicación
Se organiza el núcleo. DNA se replica.
TRANSFERENCIA NUCLEAR
Permite clonación de animales y obtención de CÉLULAS MULTIPOTENTES de
tejidos ya diferenciados
Suele ser ineficiente ya que en núcleo adulto ya diferenciado es más complicada la replicación
Se quiere identificar qué factores están involucrados en la remodelación
Baja eficiencia de clonación
Organización cromosómica del núcleo adulto no se adapta bien a las condiciones necesarias para que
haya replicación
OBJETIVOS
Determinar qué factores permiten que núcleo adulto
se adapte a eventos de desarrollo temprano
(Replicación rápida).
DEMUESTRAN
La MITOSIS es crucial en la reorganización nuclear en células adultas
(que permite adaptarse a los patrones de replicación embrionarios)
RESULTADOS
Para que núcleo adulto pueda replicar es necesario paso previo por mitosis.
Análisis de focos de inicio de replicación en eritrocitos:
Aumenta número de focos con paso previo por mitosis
¿Remodelación mitótica afecta el tamaño del replicón?
DNA combing (BrdUTP)
Eritrocitos en extracto fase S la distancia entre los orígenes varía entre 30 y 230 Kbp
El 97% de los replicones son mayores a 30 Kbp
La lenta replicación observada en núcleos de eritrocitos se debe a una baja frecuencia de inicios de replicación
En eritrocitos previamente expuestos a extracto en fase M el 74% de los replicones es menor a 30 Kbp
El pasaje por la mitosis acortó las distancias entre los orígenes, siendo ahora similares a lo observado en esperma.
Organización del nucleosoma
Igual nivel de proteinas del complejo pre-RC
Estas proteinas no se pegan a la cromatina durante la mitosis
La organización del nucleosoma es similar
La acetilación de histonas puede contribuir a la modificación de los orígenes de replicación
TSA: inhibe desacetilasas
CTPB: activa acetiltransferasas
AA: inhibe acetiltransferasas
Acetilación de histonas no necesaria para replicación
nivel de acetilación del extracto es suficiente para la máxima replicación
AA disminuye la repliación
CTPB restituye la replicación
La acetilación de histonas es necesaria para la rápida replicación observada durante el desarrollo temprano y el nivel de acetilación en el huevo es suficiente para obtener el máximo de replicación.
La acetilación de las histonas influye en la replicación de los eritrocitos, siempre y cuando hayan sido expuestos primero a un extracto en fase M, de manera que se permita la formación de los cromosomas mitóticos.
Entonces…¿El remodelado del replicón en fase M podría deberse a una reorganización de la cromatina?
LIS: extracción de DNA sin histonas ni otras proteínas, pero mantiene los sitios de anclaje del DNA a la matriz nuclear
Sondas de DNA para hibridar en geles de agarosa
N. Eritrocito incubado en extracto M o S o en solución control
En los geles corren 5 fragmentos de DNA, producidos por clonado en plásmidos, de regiones de DNA codificante para ribosomas (rDNA) varias copias en el genoma de Xenopus + posibilidad de hibridar
Plásmido
Sondas de DNA
Sonda: DNA total de eritrocito (digerido) Sondas: MARs
Ctrol. plásmido
En solución control: sólo se asocia a matriz rDNA de región “1”
S: no modifica la organización nuclear del rDNA
M: los 5 dominios de rDNA se detectan = los 5 se asocian a matriz M produce reorganización de sitios de anclaje del rDNA a matriz
Para explicar estos resultados se investigó si M afecta el tamaño de los “loop” de DNA (en los dominios de rDNA)
Medición del tamaño de los “loop” por la técnica de Radio del Halo de Máxima Fluorescencia (MFHR)
Buffer: [sales]
Loop size = 2x MHFR
Tamaño DNA lineal: 1um = 2.3kbp
Tinción + radiación UV
DNA loops forman halo fluorescente rodeando al esqueleto nuclear residual
Se distingue el halo del esqueleto nuclear ubicando a éste último por inmunolocalización
N. Eritr. a) Solución control b) Extracto S (interfase) c) Extracto M Ca++
N. Esperma d) Extracto S (interfase)
N. Eritr. tiene un tamaño promedio de loop ≈ otras células somáticas
S: no cambia el tamaño medio del loop
M: disminuye el tamaño medio del loop! ≈ tamaño del N.esperma en S
…Por lo tanto, hasta ahora sabemos que:
pasar por fase M (mitosis) induce 2 tipos de rearreglos en el N. eritrocito:
Reduce el tamaño medio de los loop de DNA (esto sería consistente con una mayor cantidad de sitios de anclaje a la matriz nuclear)
en proporciones paralelas Reduce el espacio medio entre orígenes de replicación
Y, en ambos casos ≈ N.esperma en fase S
Esperma + ovocito en M Condensan cromosomas (metafase)
Entonces, ¿Condensación cromosómica en M (vía topII) está involucrada en el reseteo del N.eritrocito?
N.eritr. 45’ M con ICRF(inhhib. topoisom. II) S
M S
Esperma
N.eritr.45’ M S
Esperma 45’ M con ICRF S
rápida
rápida
rápida
lenta
lenta
Ca ++ Ca ++
Ca ++
Ca ++
o directamente transferencia
topoisom II
Eritr. requiere topII = condensación cromosómica
Medición de actividad de H1-kinasa Extractos con ICRF estaban en mitosis
Esperma desmembranados, incubados en extracto M +
N. Eritr ICRF; tinción de DNA con Hoechst
¿Organización cromosómica dependiente de topoisomerasa II controla eficiencia del reclutamiento de ORC a la cromatina?
Esperma 45’ M purif.cromatina + PAGE de
proteínas: IB con ac.anti-ORC2
N. Eritr45’ M + ICRF S purif.cromatina + PAGE de
proteínas: IB con ac.anti-ORC2
Ca ++ 30’
ORC2 no se recluta
ORC2 no se recluta en ICRF +
ORC2 se recluta en ICRF + y -
Remodelado en M dependiente de topo.II se requiere, en eritrocitos, para el reclutamiento de ORC en S
Se alcanza el máximo reclutamiento de ORC2 con 25ng de DNA
Con 50ng de DNA aún no se alcanzó el máximo reclutamiento de ORC2
Reclutamiento de factores de iniciación no sólo es proporcional a la cantidad de cromatina disponible; también depende de la naturaleza de la misma
Esperma (a distintas conc. de DNA) 30’ S purif.cromatina + PAGE de N.eritr. proteínas: IB con ac.anti-ORC2
Xenopus sp. Se va acumulando DNA en las sucesivas divisiones, en estos extractos in vitro
¿Qué elementos producirían la reorganización de la cromatina en el remodelado mitótico, hasta ahora?
• Disminución de los espacios entre replicones (inter-orígenes).
• Disminución en el tamaño del DNA loop por acción de la Topoisomerasa II; relacionado con un aumento del numero de sitios de anclaje no específico (random) del DNA a la matriz nuclear.
• Reclutamiento de factores de iniciación dependiente de la estructura cromosómica.
Estos mismos, ¿ocurrirán durante el desarrollo temprano de los embriones ?!!!!!IN VIVO
Remodelado de la estructura cromatínica por el ciclo celular en embriones tempranos de Xenopus.
Cariomeros en transición anafase-telofase e iniciando replicación del DNA antes de la reconstrucción del núcleo.
Extracción de DNA manteniendo los sitios de anclaje a la matriz nuclear.
Sondas de DNA (post-R/pre-R) para hibridar con dominios de rDNA.
Núcleos POST-R de embriones.Núcleos PRE-R de embriones (CARIOMEROS).
Remodelado de la estructura cromatínica por el ciclo celular en embriones tempranos de Xenopus.
Dominio rDNA de Xenopus.
Electroforesis en geles de agarosa. Bromuro de etidio/ membranas de nylon. Hibridizado con DNA sonda total de Xenopus o MARs de cariomeros o MARs de núcleos post-replicativos de embriones.
IN VIVO también se observa la reorganización de la
estructura cromatínica luego de pasar por mitosis.
Y ocurre en cada división del embrión temprano.
Existen un gran nº de puntos de anclaje, aleatorios y espaciados cercanamente, entre la cromatina y la matriz nuclear que están involucrados en la rápida replicación del DNA en éste estadio de Xenopus.
Entonces, mitosis reduce el tamaño del DNA loop. Cromatina está preparada para la fase S…. ¿?
Medición del DNA-loop por técnica del máximo halo fluorescente (MFHT)
Similar a Eryt + M + CaCl2
Existencia de un proceso de REMODELADO POST- REPLICATIVO, que aumenta el espacio entre los sitios de anclaje a la matriz nuclear y se evidencia en el aumento del tamaño del DNA-loop.
Similar al tamaño de replicón.
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Si la disminución del tamaño del DNA-loop (mitotic resetting of chromatin) fuese esencial para tasa
de replicación.
Núcleos POST-R que NO pasaron por MITOSIS
tasa de replicación del DNA.
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Similar al núcleo de Eritrocitos en
fase S.
Se confirma BAJA T. de REPLICACIÓN.
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
• Sperm N: Shift a valores de alto PM.
La unión del DNA replicado de REPLICONES adyacentes.
Replicones MUY CERCANOS
• Post-R N: no se observa shift.
Replicones ESPACIADOS
Unión del replicón y ORC2 en núcleos de esperma o núcleos POST-R de embriones.
La tasa de replicación del DNA durante el desarrollo temprano, depende de la organización del cromosoma y NO de la cantidad absoluta de ORC.
Esto es lo que estaría pasando IN VIVO …
¿El aumento del tamaño del Loop, es un evento post-
replicativo u ocurre durante la síntesis del DNA?
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Aumento gradual del tamaño del Loop durante fase S.
Si incubamos los núcleos POST-R de embriones de Xenopus en
extractos mitóticos…
¿Se reseteara el tamaño del Loop?
Remodelado mitótico de los dominios Loop de la cromatina ocurre durante las fases S y M.
Tamaño Loop se reduce sin inhibidor de la Topoisomerasa II.
Núcleos diferenciados (eritrocitos)
MITOSIS
Disminuye tamaño del DNA Loop
RESETEO DE LA CROMATINA
Núcleos POST-R de embriones de
Xenopus
DISCUSIÓN
Organización dinámica de estructuras nucleares para replicación del DNA durante desarrollo
• Remodelado mitótico (RM) ocurre en ausencia de ORC, o sea, independientemente del pre-RC.
• El éxito de la clonación aumenta con “serial transfer”, los resultados obtenidos en este trabajo apoyan eso ( formación de cromosomas mitóticos permiten rápida replicación).
• RM provoca disminución del tamaño del Loop, permitiendo aumento del reclutamiento de ORC a la cromatina.
• Mayor nº de sitios de unión de ORC, se corresponde con mayor nº de sitios de anclaje a la matriz. Podría explicar el aumento en la densidad de orígenes de replicación.
(En Xenopus ORC se asocia preferentemente a regiones ricas en A-T, que coinciden con los sitios de asociación a la matriz).
• Modelo antes propuesto: reloj citoplasmático de Xenopus, las células se dividen cada 30 min. Núcleos sin reprogramación genética no siguen ritmo del ciclo celular.
•Reseteo de la organización del núcleo dado por el pasaje por Metafase (45 min) y no por la transición de Metafase a Anafase. Relacionado con la organización de los cromosomas en esa etapa (disminuye el tamaño del loop y del espacio interorigen; no afecta la cantidad de factores pre-RC; topoisomerasa II necesaria para reclutamiento de ORC).
En Xenopus: Núcleo de esperma y ovocito se replican antes de cariogamia, tienen que estar preparados para una rápida replicación, antes de la primer división mitótica.
Esto indica que son los huevos no fertilizados los capaces de preparar núcleos diferenciados para el desarrollo
De hecho, antes de la fertilización …
el núcleo del ovocito está bloqueado en metafase y sus cromosomas mitóticos organizados el núcleo de esperma está organizado en Loops cortos
