Upload
others
View
8
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
TABLE RONDE TECHNOLOGIQUE
«Ta Cathy t’a kitté »
NAD, NADH Michel Rigoulet (Bordeaux)
ATP, ADP et AMP. Renée Ventura-Clapier (Châtenay-
Malabry)
La glycolyseGlucose extracel
mitochondries
Lactate
Dégradation du glycogène
NADH
NAD+
O'Rourke, B. et al. Physiology 2005;20:303
Production d’ATP par les mitochondries
Cr
PCr
Signalisation énergétique
TABLE RONDE TECHNOLOGIQUE
«Ta Cathy t’a kitté »
NAD, NADH Michel Rigoulet (Bordeaux)
Dosage NAD+, NADH
Comme toujours 2 questions:que veut-on réellement mesurer?Quelle information attend-on de la mesure?
1) un exemple de kit
Protocole promega
La méthode même prudemment appliquée ne permet pas:
On peut cependant sur certains types cellulaires l’appliquer après une étape de séparation rapide cytosol/mitochondries
Pour la mesure du rapport des formes libres (NAD+/NADH) Dans les différents compartiments, il faut appliquer la bonnevieille recette des marqueurs enzymatiques…..
de connaître les fractions liées et libres;
leur compartimentation cellulaire;
donne un rapport NAD+/NADH peu instructif
CytosolMatrice
Wilson D.F. et al, B.J. (1974) 140, 57‐64
• Si on veut estimer les changements d’états rédox du couple NAD+/NADH en direct et « localement » il existe d’autres méthodes semi-quantitatives:
• Fluorescence par exemple….
TABLE RONDE TECHNOLOGIQUE
«Ta Cathy t’a kitté »
Renée Ventura-Clapier (Châtenay-Malabry)
ATP, ADP et AMP
Kits de mesure ADP/ATP
• Abcam. Ab65313. ADP/ATP Ratio AssayKit (Bioluminescent)
• BioAssay Kit de mesure ADP/ATP• ApoSENSOR™ ADP/ATP Ratio
Bioluminescence Assay Kit• Sigma-Aldrich Assay kit ADP/ATP
Description
The changes in ADP/ATP ratio have been used to differentiate the different modes of cell death and viability. Increased levels of ATP and decreased levels of ADP have been recognized in proliferating cells. In contrast, decreased levels of ATP and increased levels of ADP are recognized in apoptotic cells. The decrease in ATP and increase in ADP are much more pronounced in necrosis than apoptosis.
Principe du test
• The assay involves two steps. In the first step, the workingreagent lyses cells to release ATP and ADP. In the presence of luciferase, ATP immediately reacts with the Substrate D-luciferin to produce light. The light intensity is a direct measureof intracellular ATP concentration.
ATP + D-luciferin + O2 ⇒ oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + light
• In the second step, the ADP is converted to ATP through an enzyme reaction. This newly formed ATP then reacts with the D-luciferin as in the first step. This non-radioactive, homogeneous cell-based assay is performed in microplates.
AMP-Glo™ Assay
Interférence avec l’ATP
Régulation des ATPases
• La réaction ATPasiqueMgATP + H2O ⇒ MgADP + Pi + H+
• Régulation cinétiquePotentiel de phosphorylation Pp = [ATP] /[ADP] + Pi cœur normal > 300 mM-1
• Régulation thermodynamiqueEnergie libre d’hydrolyse d’ATPΔG~ATP= ΔG0
~ATP – RT ln [ATP]/[ADP].[Pi]Cœur normal 60-70 kJ/mol selon les substrats
ΔGATP ex: le cœur
Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher 2002
Compartimentation des nucléotides
ATPase
ATP ADP
mito
mitochondries
Créatinekinase
complexes glycolytiques
cytosol
Adenylatekinase
Méthodes de mesure des nucléotides
• Dosages enzymatiques• HPLC • Luminescence, kits• 31P Résonance magnétique nucléaire
Comment mesurer les nucléotides
• Rapide«Freeze clamp» des tissus (secondes)• Conserver à -80°C (stable pour ~ 3 ans)• Homogénéiser les tissus dans l’azote liquide• Extraction à l’acide (perchlorique) pour
dénaturer les protéines• Prélever le surnageant et le neutraliser
Mesure des nucléotides par HPLC
colonnes Partisil SAX. Détection à 254 nm
Normalisation par:poids frais, poids sec, protéines tissulaires, volume d’eau intracellulaire
Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher 2002
Mesure des nucléotides par spectrophotométrie
– PCr et ATPATP + Glucose ⇒ Glucose 6 phosphate
HexokinaseGlucose 6 phosphate + NADP ⇒ gluconate 6Phosphate + NADPH
Glucose 6P dehydrogénasePCr + ADP ⇒ ATP + Créatine
Creatine kinase- ADP et AMP
ADP + PEP + ⇒ ATP + pyruvatePyruvate kinase
Pyruvate + NADH + H+ ⇒ lactate + NAD+LDH
AMP+ATP ⇒ 2ADPAdenylate kinase
– CréatineCréatine + diacetyl a-naphtol = réaction colorée rouge
– PiPi + Ascorbate + molybdate = réaction colorée bleue
Bergmeyer HU Methods of enzymatic analysis. Academic Press 1974
340 nm
340 nm
520 nm
820 nm
Luminescence
Luminescence de la luciférase
ATP + D-luciferin + O2 ⇒ oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + light
Myokinase pour mesurer l’ADP2ADP ⇔ ATP + AMP
Mesure des nucléotides par RMN 31P
[H]+ [Mg]++
[sucres P]
[Phosphateinorganique]
[PhosphoCréatine]
[ATP]
βαγ
Pi
PCr
γ -A
TP
α -A
TP
β -A
TP
SP
-20 ppm-10010
O2
PERFUSAT
SONDE
Jauge de pression
PCr, ATP, Pi
Pas l’ADP ni l’AMP
Mesures d’ADP, AMP, Pi• Mesurer dans des extraits n’est pas fiable, pourquoi?
• Pour l’ADP: surtout dans les tissus musculaires, l’ADP est lié à de nombreuses macromolécules
• ADP mesuré = ADP actif + ADP lié
• C’est identique pour l’AMP
• AMP mesuré = AMP actif + AMP lié
• Pour le Pi: problème de la labilité de la PCr ou ATP
ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP ADP
Filament d’actine
Contenus mitochondriaux• Dans le cœur 30-40% du volume est mitochondrial
• Les mitochondries de foie contiennent une forte proportion de nucléotides adényliques
Joubert et al Biochemistry 2001, 40, 2129-2137
Détermination des nucléotides métaboliquement actifs dans le muscle
• Les valeurs ATP, PCr, PI, sont données par 31P RMN ou spectrophotométrie
• L’ADP est calculé par la réaction CKPCr + ADP + H+ ⇔ Cr + ADP
[ADP] = [ATP].[Cr]/Keq[PCr].[H+]
• L’AMP est calculé par la réaction AK ou myokinase
2[ADP] ⇔ [ATP] + [AMP][AMP] = [ADP]2 / [ATP].Keq
Comparaison des mesures par HPLC et RMN
Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher 2002
ΔGATP ex: le cœur
ischémie
RMN + calculsΔGATP = -58,7 kJ/mole11 mM ATP40 µM ADP5 mM Pi
Valeurs HPLC/spectroΔGATP = -49,3 kJ/mole11 mM ATP1,5 mM ADP5 mM Pi
RMN ischémieΔGATP = -43 kJ/mole3,4 mM ATP1,9 mM ADP41 mM Pi
HPLCspectroRMN
[Nucléotides] dans le coeur
Ingwall JS ATP and the heart. Kluwer academics publisher
1,17ADPtotal0.040.22ADP free
0.0064 (0.2)ADPf/ATP
0,231.4AMPtotal0.00020.0014AMPfree
0.04*10-3 (0.04)AMP/ATP
634ATPmMnmol/mg protein
Zhang L et al. AJP 2007;293:H457-H466
Sensibilité de l’AMPK à l’AMP
• Total [AMP] par HPLC: 350 µM. [AMP] cytosolique par RMN: 0,4 µM
L’activité de l’AMPK corrèle avec le contenu en AMP cytosolique
alors que l’ AMP total et le rapport AMP/ATP ne changent pas.
Cyt AMP Total AMP
totalAMP/ATP cytAMP/ATP
Km=2 µM
Frederich, Balschi JBC 2002;277:1928-32
AMP kinase et hypertrophie cardiaque
Tian R et al. Circulation 2001 104(14):1664-9
Dans la littérature coeur• The Journal of Biological Chemistry
Abcam assay kit.
ADP/ATP ratio 0.82 ± 0.28
• Antioxidant & Redox SignalingATP assay kit (Bioluminescence assay kit HS II; Roche)
40 µM ATPATP
Dans « Cell metabolism » muscle et foie
(kit Roche)
ATP5 µM
(HPLC)
Dans le muscle
Dans le foieATP
13000 mMATP
0.12µM
tissu hépatocyte
tissu C2C12
ATP0.33 µM
tissu
tissu
Calculer les nucléotides dans le foie
• On utilise les réactions de la glycolyse àl’équilibre pour calculer l’ADP
• Et l’adénylate kinase pour calculer l’AMP
2[ADP] ⇔ [ATP] + [AMP][AMP] = [ADP]2 / [ATP].Keq
Conclusions
• Les nucléotides sont compartimentés.• Les [] métaboliquement actives d’ADP et
AMP sont << concentrations totales• Les nucléotides sont très labiles• Aucune méthode ne mesure les
concentrations métaboliquement actives• Elle ne peuvent qu’être calculées• Dans tous les cas, vérifier les valeurs
absolues!!!!!!