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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO- UFMT
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO BACHAREL EM BIOMEDICINA
ALICE SANTOS DA SILVA
REPERCUSSÕES MATERNAS DA ASSOCIAÇÃO DO
DIABETE E DE DIETA HIPERCALÓRICA NA PRENHEZ DE
RATAS
Barra do Garças-MT
2019
I
ALICE SANTOS DA SILVA
REPERCUSSÕES MATERNAS DA ASSOCIAÇÃO DO
DIABETE E DE DIETA HIPERCALÓRICA NA PRENHEZ DE
RATAS
Monografia apresentada à banca
examinadora do Curso de Biomedicina do
Instituto de Ciências Biológicas e da
Saúde, Campus Universitário do Araguaia
– UFMT, como requisito parcial, para
obtenção do título de Bacharel em
Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato
Coorientadora: Mestranda Vanessa Caruline Araujo da Silva
Barra do Garças-MT
2019
IV
DEDICATÓRIA
Dedico essa monografia à minha mamãe Alzira, pelo incentivo e apoio nas
minhas decisões, por me ensinar a persistir nos desafios e batalhar para ter um bom
futuro. Você é o melhor exemplo de mulher que tenho!
Ao meu papai José Arimathéia, por ter incentivado e investido nos meus
estudos, por ser o melhor professor de física e biologia, e por ter sido o responsável
em despertar em mim o amor pela ciência. Você é a minha inspiração!
A todos os professores que participaram da minha formação, desde a pré-
escola até a faculdade. Obrigada por todo conhecimento que me passaram, sem ele
eu não teria chegado até aqui.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sempre estar comigo, me dando forças e guiando o meu
caminho. Pelas bênçãos e oportunidades que coloca em minha vida e por ser o meu
refúgio nos momentos difíceis.
Aos meus pais, Alzira e José Arimathéia, por tudo que fazem por mim e por
me apoiarem. Amo vocês!
Agradeço meu noivo Renan Diego pelo companheirismo, amizade, por me
apoiar e por estar sempre disposto a me ajudar. Que Deus abençoe o nosso
casamento!
Às pessoas da minha família que me apoiam e torcem pelo meu sucesso. Em
especial meus avós maternos, Joana e Gelson, e avós paternos, Alice e Jurandir por
serem essas pessoas guerreiras no qual eu me espelho.
À família do meu noivo, por terem me acolhido e terem se tornado a minha
segunda família.
A todas as pessoas que fazem parte da minha vida e que de alguma forma
me ajudam a prosperar.
A Lisa, Pati, Marie, Laurinha e Pingo por serem meus companheiros, minha
felicidade e por me trazerem paz.
Aos amigos de longa data, obrigada pelo apoio e pela amizade.
À minha melhor amiga, Yohanna, por ser minha companheira e estar comigo
em todos os momentos me animando e me apoiando. Obrigada por seus conselhos
e por sempre tentar me ajudar com meus problemas.
À minha querida amiga e companheira de experimento, Andressa Lourenço,
por seu jeitinho espontâneo de ser que tornou as tarefas mais divertidas. Obrigada
pela ajuda e palhaçadas.
À Ana Carla, por ser uma amiga incrível. Sempre lembrarei das suas histórias,
conselhos e dos seus resumos que ajudavam na época das provas.
A vocês meninas, Ana Carla e Andressa Lourenço, as amigas que a
faculdade me deu, obrigada pelos momentos de risadas e descontração, por
estarmos juntas e ajudando umas às outras sempre que preciso.
VI
Ao meu orientador Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato, pela confiança e
oportunidade de iniciação científica. Obrigada pela paciência e ensinamentos ao
longo desse período.
Agradeço à minha coorientadora Vanessa Caruline pelos ensinamentos e por
me guiar na produção desse trabalho.
Aos membros da banca, Prof. Dr Kleber Eduardo de Campos e Cristielly
Barbosa, obrigada por aceitarem avaliar meu trabalho.
Ao pessoal da família FisioTox, pelo respeito, paciência, ensinamentos, a
união de vocês é linda! Agradeço principalmente aos alunos do Prof. Gustavo. Em
especial, Vanessa Liones e Catarina. Tenho muito carinho por vocês meninas.
Ao CNPq pela bolsa de Iniciação Cientifica.
Aos animais que participaram do experimento, sem eles essa pesquisa não
existiria.
VII
“Bem-aventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que produz
conhecimento. ”
Provérbios 3:13
VIII
RESUMO
Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica caracterizada por defeitos na
produção e/ou secreção e ação da insulina. O consumo de alimentos gordurosos e
açucarados podem ser um agravante no organismo materno diante essa
fisiopatologia. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar, os efeitos da associação
do diabete e dieta hipercalórica na prenhez de ratas. Para isso, foi administrado
Streptozotocin no 1º dia de vida de ratas. Na vida adulta (90 dias), após confirmação
do diabete, as ratas foram distribuídas em quatro grupos experimentais: Controle
com dieta padrão (C); Controle com dieta alterada (CA); Diabético com dieta padrão
(D) e Diabético com dieta alterada (DA). Os grupos dieta alterada receberam ração
hiperlipídica e água contendo 5% de sacarose. Aos 120 dias de vida, as ratas foram
acasaladas e após diagnóstico positivo de prenhez, as ratas foram submetidas ao
teste oral de tolerância à glicose (TOTG) no dia 0 de prenhez. Peso corpóreo,
ingestão hídrica e consumo alimentar foram medidos semanalmente. No 21º dia de
prenhez, as ratas foram anestesiadas e em seguida foi realizada a laparotomia.
Coração, fígado, pâncreas, baço, rins, gordura periovariana e visceral foram
removidos e pesados e o útero gravídico e ovários foram removidos para avaliação
do desempenho reprodutivo materno. As ratas dos grupos diabéticos apresentaram
glicemia aumentada durante o TOTG em relação aos grupos controles. Os grupos
com dieta inadequada apresentaram alteração na ingestão hídrica e consumo
alimentar. O grupo D apresentou aumento dos rins. O grupo DA apresentou
aumento do pâncreas, baço, gordura visceral e periovariana. Os grupos D e DA
apresentaram aumento das perdas pré e pós-implantação. O grupo DA apresentou
diminuição no ganho de peso materno e peso do útero gravídico. Portanto, esse
estudo demonstrou que a associação da dieta hipercalórica e diabete levam a
alterações sistêmicas e prejudicam a performance materna.
Palavras-chave: diabete, ração hiperlipídica, prenhez, performance materna.
IX
ABSTRACT
Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease characterized by defects in insulin action,
production and/or secretion. The seek for high-fat and high-sugar foods can be an
aggravating factor in the maternal organism in face of this pathophysiology.
Therefore, the objective of this study was to evaluate the effects of hypercaloric diet
and diabetes status association diabetic pregnant rats. For this, was administered
Streptozotocin on the 1st day of life of rats. In adulthood (90 days), after confirmation
of diabetes, the rats were divided into four experimental groups: Control with
standard diet (C); Control with modified diet (AC); Diabetic with standard diet (D) and
Diabetic with modified diet (DA). The modified diet groups received hyperlipid chow
and water containing 5% sucrose. At 120 days of age, the rats were mated and after
positive diagnosis of pregnancy, the rats were submitted to the oral glucose tolerance
test (OGTT) on day 0 of pregnancy. Body weight, water intake and food consumption
were measured weekly. On the 21st day of pregnancy, the rats were anesthetized
and then realized the laparotomy. Heart, liver, pancreas, spleen, kidneys, periovarine
and visceral fats were removed and weighed and the gravid uterus and ovaries was
removed for evaluation of maternal reproductive performance. Inadequate diet
groups presented alteration in food and water consumption. Group D had increased
kidneys. The DA group presented increase of the pancreas, spleen, visceral and
periovarian fat. The DA group presented increase in pre and post-implantation
losses. The DA group had a decrease in maternal weight gain and weight of the
gravid uterus. Therefore, this study demonstrated that the association of the
hypercaloric diet and diabetes lead to systemic alterations and impair maternal
performance.
Keywords: diabetes, hyperlipidic chow, pregnancy, maternal performance.
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 ˗̶ Rata Wistar...............................................................................................16
Figura 2 ˗̶ Desenho experimental do estudo.............................................................17
Figura 3 ˗̶ Ração padrão...........................................................................................19
Figura 4 ˗̶ Ração hiperlipídica...................................................................................19
Figura 5 ˗̶ Células queratinizadas e presença de espermatozoides.........................20
Figura 6 ˗̶ Teste Oral de Tolerância a Glicose (TOTG) ............................................22
Figura 7 ˗̶ Peso (g) de ratas dos grupos Controle, Controle Alterado, Diabético e
Diabético Alterado......................................................................................................23
Figura 8 ˗̶ Ingestão hídrica (mL) de ratas dos grupos Controle, Controle Alterado,
Diabético e Diabético Alterado...................................................................................24
Figura 9 ˗̶ Consumo alimentar (g) de ratas dos grupos Controle, Controle Alterado,
Diabético e Diabético Alterado...................................................................................25
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1˗̶ Composição da ração experimental oferecida para ratas não-diabéticas e
diabéticas antes e durante a prenhez.................................................................... 19
Tabela 2 ̶ Peso relativo dos órgãos de ratas não diabéticas e diabéticas submetidas
ou não a dieta alterada........................................................................................... 26
Tabela 3 ̶ Desempenho reprodutivo materno de ratas não diabéticas e diabéticas
submetidas ou não a dieta alterada........................................................................ 27
XII
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2- OBJETIVOS ................................................................................................. 18
2.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 18
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 18
3- MATERIAIS E MÉTODO ................................................................................ 19
3.1 Animais .................................................................................................... 19
3.2 Sequência experimental ......................................................................... 19
3.3 Indução do diabete ................................................................................. 20
3.4 Grupos experimentais ............................................................................ 21
3.5 Tratamento com dieta padrão ou alterada ............................................ 21
3.6 Acasalamento.......................................................................................... 23
3.7 Período de prenhez ................................................................................. 24
3.8 Obtenção de dados do desempenho reprodutivo materno ................ 24
3.9 Análise estatística................................................................................... 24
4- RESULTADOS ............................................................................................... 25
5- DISCUSSÃO ................................................................................................ 31
6-CONCLUSÃO .................................................................................................. 34
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 35
13
1- INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica em que o pâncreas não produz
insulina suficiente, e/ou a insulina produzida não consegue ser utilizada de forma
eficaz pelo organismo, resultando em níveis elevados de glicose no sangue
(INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION - IDF, 2017). Devido a DM e suas
complicações terem um impacto significativo na qualidade de vida, faz-se necessário
intervenções, como prévio diagnóstico, tratamento para redução das complicações e
prevenção da morte precoce (WORLD HEALTH ORGANIZATION - WHO, 2016;
(AMERICAN DIABETES ASSOTIATION - ADA, 2019).
O aumento da prevalência de DM é um problema de saúde crescente, sendo
responsável por 10,4% da mortalidade global (IDF, 2017). Segundo a Organização
Mundial da Saúde, 422 milhões de adultos possuíam diabete em 2014 e, nos últimos
10 anos, o número aumentou nos países de baixa e média renda (WHO, 2016). No
Brasil, havia mais de 12 milhões de pessoas com DM em 2017, e estima que para
2045 esse número alcance aproximadamente 20,3 milhões (IDF, 2017).
A deficiência nos mecanismos de produção e ação da insulina acarreta em
complicações sistêmicas ao longo prazo (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES
- SBD, 2017). Essas complicações incluem doenças cardíacas, nefropatia,
neuropatia e retinopatia, induzidas pelo microambiente pró-inflamatório e estresse
oxidativo criado pelo diabete. Além disso, cetoacidose diabética, aterosclerose e
acidente vascular encefálico (AVE) podem ser observados como consequência
dessa patologia (PAPATHEODOROU et al., 2016; IDF, 2017; ISLAM et al., 2018).
Com isso, o DM tem um relevante impacto econômico, tanto para os portadores da
doença, quanto para o sistema de saúde, decorrente dos gastos com medicamentos
essenciais e maior uso dos serviços de saúde para tratar suas complicações (SBD,
2017).
O DM pode ser classificado em DM tipo 1, caracterizado pela destruição
autoimune das células β-pancreáticas, DM tipo 2, no qual a secreção de insulina se
torna deficiente e também há perda de sensibilidade dos tecidos à insulina,
causando quadros de resistência, e DM causada por outros fatores, como síndrome
monogênica do diabete, doenças que afetam o pâncreas exócrino e drogas que
induzem um quadro de hiperglicemia como efeito colateral. Além desses tipos há o
14
DM gestacional (DMG), definida como uma condição temporária de diabete
diagnosticada no segundo ou terceiro trimestre de gravidez sem a preexistência de
DM tipo 1 ou 2 (ADA, 2019).
Durante a gestação ocorrem adaptações no metabolismo materno como o
aumento da glicose seguido de maior sensibilidade dos tecidos à insulina,
preparando o organismo materno para as demandas energéticas durante a gravidez
e promoção do crescimento fetal (ANGUEIRA et al., 2015). A medida que a
gestação progride ocorre o aumento de alguns hormônios como o estrogênio,
progesterona, cortisol, lactogênio placentário e hormônio de crescimento placentário,
que juntos causam diminuição na sensibilidade à insulina, promovendo um estado
de resistência (PLOWS et al., 2018). Entretanto, se a mulher não consegue
responder adequadamente à insulina para compensar a resistência que ocorre
normalmente, o DMG se desenvolve (KAMPMANN et al., 2015; SOMA-PILLAY et al.,
2016).
A prevalência global de DMG varia entre 1% a 28% (HOD et al., 2015). As
estimativas populacionais de diabete gestacional no Brasil são divergentes, porém
sabe-se que no Sistema Único de Saúde (SUS), a prevalência de DMG é
aproximadamente 18% (SBD, 2017). A SBD (2017) aponta que um dos fatores de
risco para o desenvolvimento e aumento dos casos de DMG é a obesidade. Além da
obesidade, a chance de DMG aumenta com o histórico familiar e idade avançada
(WHO 2016; IDF, 2017).
Algumas complicações podem ocorrer devido ao DMG, afetando tanto a mãe
quanto o feto. Para mulheres com DMG, as chances de desenvolver pré-eclampsia,
indução de parto pré-maturo e aborto espontâneo aumentam, além de estarem mais
suscetíveis a infecções (VEERASWAMY et al., 2012; PLOWS et al., 2018; SUN et
al., 2018). Sabe-se que a DMG compromete o desenvolvimento da placenta,
afetando sua função de transporte nutrientes e oxigênio (LAPPAS et al., 2011). Além
disso, mulheres com DMG tem 7 vezes mais chances de desenvolver diabete no
pós-parto e estão predispostas a adquirir uma cardiopatia no futuro (BAO et al.,
2015; MOON et al., 2017; SHOSTROM et al., 2017; TOBIAS et al., 2017). Em
relação ao feto, a DMG aumenta o risco de hipoglicemia, obtida devido ao excesso
de insulina como resposta à hiperglicemia materna no útero (KC et al., 2015). Devido
ao comprometimento da placenta ocasionado pelo DMG, a passagem de nutrientes
para o feto é afetada e com isso pode se observar restrição de crescimento
15
intrauterino (ORNOY, 2011). Outros fatores também podem ser vistos, como
quadros de hiperglicemia e resistência à insulina, predisposição do feto a uma futura
obesidade, desenvolvimento de síndrome metabólica e DM tipo 2 (SBD, 2017;
PLOWS et al., 2018).
Para o tratamento do diabete, é indicado o uso de fármacos como
hipoglicemiantes orais e insulina. Além disso, a prática de exercícios físicos aliados
a um planejamento alimentar balanceado associados a esses medicamentos podem
contribuir para a melhora do quadro hiperglicêmico (SBD, 2017; ADA, 2019). De
acordo com a OMS (2016), uma dieta saudável inclui o consumo de frutas, vegetais,
legumes, cereais integrais e substituição de ácidos graxos saturados por ácidos
graxos poli-insaturados. Porém, a urbanização e o desenvolvimento econômico
impulsionaram grandes transformações nos hábitos alimentares por todo o mundo
(COLCHERO et al., 2019). As mudanças nos padrões alimentares envolvem a busca
por alimentos industrializados, que geralmente são calóricos e gordurosos. Além
disso, é alto o nível de ingestão de bebidas açucaradas, que são enriquecidas com
açúcar refinado, como refrigerantes e sucos (HU, 2011; POPKIN 2015;
FRANCISQUETI et al., 2017). Essa transição nutricional pode estar ligada ao fato de
que comidas processadas são mais acessíveis e principalmente mais palatáveis
(POPKIN et al., 2012; DARMON & DREWNOWSKI, 2015). Diante disso, nos últimos
anos o impacto do estilo de vida na saúde tem demonstrado interesse pelos
pesquisadores (FARHUD, 2015).
Para avaliar os efeitos de um estilo de vida inadequado, estudos têm
demonstrado as repercussões de dietas hiperlipídicas e água adoçada em modelos
animais. Em estudo feito por Roza et al. (2016), ratas Wistar receberam dieta
hiperlipídica por 8 semanas e apresentaram hiperglicemia e diminuição da secreção
de insulina. Wu et al. (2015) mostraram que ratas alimentadas com dieta
hiperlipídica durante a prenhez desenvolveram intolerância à glicose e resistência à
insulina. Em outro estudo, ratos Wistar foram alimentados com ração hiperlipídica e
água com 25% de sacarose durante 20 dias, estes apresentaram obesidade,
dislipidemia, hipertrigliceridemia, intolerância à glicose e resistência à insulina
(FERRON et al., 2018). Água na presença de 20% e 25% de frutose administrada
durante 21 semanas induziu hipertensão, dislipidemia e hiperglicemia associada
com resistência à insulina em ratos Wistar (DUPAS et al., 2017).
16
Devido a razões éticas e variáveis incontroláveis presentes na vida humana,
como estilo de vida, fatores genéticos e nutricionais, faz-se necessário o uso de
animais na pesquisa científica. Os animais desempenham papel importante no
estudo e tratamento de doenças e suas complicações, como o diabete (LÓPEZ-
SOLDADO & HERRERA, 2003; BEQUER et al., 2016). Existem diversos modelos de
indução de diabete descritos na literatura que reproduzem as manifestações clínicas
da doença, como procedimentos cirúrgicos e manipulação genética (QUINA &
BADWAN, 2015). Dentre esses modelos, destaca-se o método de indução química
através das drogas β-citotóxicas, aloxana e streptozotocin (STZ) (LEZEN, 2007).
A aloxana e a STZ são análogas da glicose e ambas inibem secreção de
insulina, porém por vias diferentes (LEZEN, 2008). Devido a aloxana ser um um
composto instável e de meia-vida curta, sua dose diabetogênica é próxima da dose
tóxica, podendo ser letal para os animais (SKUDELSKI, 2001; IGHODARO et al.,
2017). Em contrapartida, a STZ mostra-se mais eficaz e com maior reprodutibilidade
devido sua estabilidade, permitindo um maior intervalo de doses (LENZEN, 2008;
ELEAZU et al., 2013).
A dose para indução do diabete depende de alguns fatores como, intensidade
hiperglicêmica desejada, via de administração, espécie e idade do animal (ELEAZU
et al., 2013). De acordo com a literatura, a administração de STZ por via intravenosa
na dose de 40 mg/kg durante a vida adulta do animal induz um quadro severo da
doença com glicemia superior a 300 mg/dL (DAMASCENO et al., 2002; VOLPATO et
al., 2008; KISS et al., 2009). O diabete moderado (glicemia entre 120 e 300 mg/dL)
mimetiza o DMG e DM tipo 2 (KISS et al., 2009; SINZATO et al., 2012) e sua
indução pode ser feita durante o período neonatal através da via subcutânea na
dose de 100 mg/kg (KISS et al., 2013; DAMASCENO et al., 2014; BEQUER et al.,
2016).
Diante disso, há poucos relatos experimentais que avaliem uma alimentação
imprópria em ratas prenhes e com diabete gestacional. Levando em consideração as
complicações maternas que uma dieta inadequada e o diabete podem acarretar, faz-
se necessário pesquisas para elucidar as consequências da combinação dessas
condições no organismo materno e desempenho reprodutivo. Portanto, a hipótese
deste trabalho é que ratas diabéticas submetidas a uma dieta hiperlipídica e água
com 5% de sacarose, antes e durante a prenhez, apresenta alterações sistêmicas e
18
2- OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar, sobre o organismo materno, os efeitos da associação de dieta
hipercalórica e estado diabético na prenhez de ratas.
2.2 Objetivos Específicos
Comparar os efeitos do consumo de uma dieta alterada em ratas prenhes
diabéticas e não-diabéticas em relação:
Perfil glicêmico no TOTG;
Peso corpóreo (Ganho de peso materno);
Consumo de ração;
Ingestão hídrica;
Peso relativo dos órgãos;
Pontos de implantação e reabsorção;
Número de corpos lúteos;
Taxas de perda pré-implantação e pós-implantação
Número de fetos vivos e mortos.
19
3- MATERIAIS E MÉTODO
3.1 Animais
Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Wistar (Figura 1) em
idade reprodutiva (em torno de 90 dias de vida) obtidos do CEMAE (Centro de
Manutenção de Animais Experimentais) - Campus Universitário do Araguaia (CUA)
da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Os procedimentos e manuseio
dos animais foram realizados de acordo com as orientações fornecidas pelo
Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
As ratas foram aclimatadas durante 7 dias no Laboratório de Fisiologia de
Sistemas e Toxicologia Reprodutiva (FisioTox) da Universidade Federal de Mato
Grosso. Ficaram em gaiolas de polietileno com cama de maravalha, contendo no
máximo 4 animais, sob temperatura (21 ± 3°C), umidade (50 ± 10%) e fotoperíodo
(ciclo claro/escuro de 12 horas) controlados. Água e ração foram oferecidas ad
libitum.
Figura 1 - Rata Wistar. Fonte: Fisiotox
3.2 Sequência experimental
É mostrado o desenho experimental deste estudo contendo as principais
etapas envolvendo a experimentação animal (Figura 2).
20
Figura 2. Desenho experimental do estudo. Fonte: Do autor.
3.3 Indução do diabete
O diabete foi induzido nas fêmeas recém-nascidas no primeiro dia de vida (24
horas pós-nascimento), por administração subcutânea de Streptozotocin (SIGMA
Chemical Company®), diluída em tampão citrato (0,01M, pH 4,5), na dose de 100
mg/Kg de peso corpóreo. As ratas dos grupos controle receberam, pela mesma via
de administração, somente o tampão citrato (JAWERBAUM & WHITE, 2010;
DAMASCENO et al., 2011; SINZATO et al., 2011). Após a indução do diabete, as
fêmeas recém-nascidas continuaram com suas mães por todo o período de
amamentação (21 dias), tendo no máximo 8 filhotes por mãe devido o número de
tetos funcionais para aleitamento. Após desmame, estas ratas ficaram sob as
mesmas condições estabelecidas no período de adaptação até a padronização pelo
critério de inclusão.
No 90º dia de vida, as ratas foram submetidas ao teste oral de tolerância à
glicose (TOTG) para a definição dos critérios de inclusão e de exclusão frente à
indução do diabete. Após seis horas de jejum, foi coletada uma gota de sangue por
punção venosa na cauda das ratas para a determinação glicêmica (tempo zero). Em
seguida, as ratas receberam solução de glicose (0,2 g/mL) via intragástrica (gavage)
na dose de 2,0 g/kg de peso corpóreo. Decorridos 30, 60 e 120 minutos após a
21
administração da solução de glicose, as glicemias foram determinadas com o uso de
glicosímetro convencional (SINZATO et al., 2012).
Como critério de inclusão, foram consideradas ratas com diabete moderado
aquelas que apresentaram glicemia acima de 140 mg/dL em pelo menos dois pontos
do TOTG. Foram excluídas do estudo as ratas que não atingiram glicemia acima de
140 mg/dL em pelo menos dois pontos da curva. Foram incluídas nos grupos não-
diabéticos as ratas que, na vida adulta, apresentaram TOTG normal (pontos com
glicemias inferiores a 140 mg/dL), sendo excluídas as ratas que apresentaram
TOTG alterado (SANTOS et al., 2015).
3.4 Grupos experimentais
Considerando os quatro grupos experimentais e baseado nos experimentos
anteriores realizados em nosso laboratório com poder de 90% e confiabilidade de
95%, o tamanho amostral mínimo foi de 11 ratas por grupo. As ratas foram
distribuídas de maneira aleatória para a composição dos quatro grupos
experimentais:
Controle (C): Ratas prenhes não-diabéticas que receberam ração padrão e
água filtrada.
Controle Dieta Alterada (CA): Ratas prenhes não-diabéticas que
receberam ração hiperlipídica e água com 5% de sacarose.
Diabético (D): Ratas prenhes diabéticas que receberam ração padrão e
água filtrada.
Diabético Dieta Alterada (DA): Ratas prenhes diabéticas que receberam
ração hiperlipídica e água com 5% de sacarose.
3.5 Tratamento com dieta padrão ou alterada
As ratas dos grupos CA e DA com 90 dias de vida (após o TOTG) começaram
a receber a dieta alterada, os grupos C e D continuaram recebendo a dieta padrão.
A dieta padrão consiste em ração padrão (comercial) e água filtrada. É constituída
por: Milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, óleo vegetal, carbonato de
cálcio, fosfato bicálcico, cloreto de sódio (sal comum), vitamina A, vitamina D3,
vitamina E, vitamina K3, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12,
niacina, pantotenato de cálcio, ácido fólico, biotina, cloreto de colina, sulfato de ferro,
22
sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de cobre, iodato de cálcio, selenito de
sódio, sulfato de cobalto, lisina, metionina, BHT (hidroxitolueno butilado) (Figura 3).
A dieta alterada é constituída por ração hiperlipídica (FRANCISQUETI et al.,
2017- modificado) e água com 5% de sacarose comercial tipo cristal. A dieta
hiperlipídica foi preparada na Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da
Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp. Para preparo da ração hiperlipídica,
foram utilizados os seguintes ingredientes: farelo de soja, sorgo, casca de soja,
amido de milho, açúcar refinado, banha de porco, minerais: ferro, biotina, vitamina
B12, vitamina D, vitamina B6, vitamina E, vitamina A, selênio e potássio) e sal. Estes
ingredientes foram moídos, misturados e oferecidos na forma de pellets. Depois do
preparo, a ração foi mantida sob refrigeração até o momento do consumo dos
animais (Figura 4). A tabela com a análise bromatológica é apresentada abaixo
(Tabela 1):
Tabela 1. Composição da ração experimental oferecida para ratas não-
diabéticas e diabéticas antes e durante a prenhez.
Compostos
Ração
Padrão Hiperlipídica
Matéria Seca 92,55% 96,35%
Proteína Bruta 27,83% 27,78%
Lipídeos 3,77% 15,77%
Fibra Bruta 47,14% 47,17%
Figura 3. Ração padrão.
Fonte: Fisiotox UFMT - CUA
Figura 4. Ração hiperlipídica. Fonte: LAPGO Unesp – Botucatu
23
3.6 Acasalamento
As ratas com 120 dias de vida foram distribuídas quatro a quatro em gaiolas
de polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho sem
intervenção durante o período noturno. Na manhã subsequente, foi realizado
esfregaço vaginal para análise do material citológico em microscopia de luz. A
presença de espermatozoides e células queratinizadas que são características da
fase estro do ciclo estral confirmaram o diagnóstico de prenhez e este foi
considerado o dia zero de prenhez. O procedimento para acasalamento consistiu em
15 dias consecutivos, que compreende cerca de três ciclos estrais e foi realizado até
a obtenção do número amostral. As fêmeas que não acasalaram neste período
foram consideradas inférteis e removidas do estudo (VOLPATO et al., 2008).
Figura 5 - Fase estro com células queratinizadas e presença de espermatozoides.
Fonte: DAMASCENO et al., 2008 – Anomalias Congênitas: Estudos Experimentais
24
3.7 Período de prenhez
O peso corpóreo, ingestão de água e consumo de ração foram avaliados nos
dias 0 (início da prenhez), sete (início do período organogênico), 14 (final do período
organogênico) e 21 da prenhez (término da prenhez). O ganho de peso materno foi
calculado pela diferença entre os pesos corpóreos observados nos dias 0 e 21 da
prenhez.
Na manhã do 21º dia de prenhez, as ratas foram anestesiadas via
intraperitoneal com tiopental sódico (Thiopentax®) na dose 120 mg/Kg. Em seguida,
as ratas foram submetidas à laparotomia com exposição dos cornos uterinos.
Posteriormente, foram retirados e pesados coração, fígado, baço, rins, pâncreas e
gorduras visceral e periovariana para obtenção do peso relativo de cada órgão, pela
equação: peso relativo do órgão = (peso do órgão / peso final) x 100, em que o peso
final corresponde ao peso da rata no 21º dia menos o peso da ninhada. O resultado
foi então expresso em gramas/100 gramas de peso vivo (g/100g p.v.).
3.8 Obtenção de dados do desempenho reprodutivo materno
Foram observados e contados os pontos de implantação, reabsorção (morte
embrionária) e números de fetos vivos e mortos. Os ovários foram retirados para
observação e contagem de corpos lúteos, como parâmetro indireto do número de
ovulações. A porcentagem de perda pré-implantação (taxa de perda de embriões no
período que antecede a implantação) foi calculada pela seguinte equação: (Número
de Corpos Lúteos – Número de Implantações / Número de Corpos Lúteos) x 100.
Também foi calculada a porcentagem de perda pós-implantação (morte dos
embriões após a implantação) pela equação: (Número de Implantações – Número
de Fetos Vivos / Número de Implantações) x 100 (VOLPATO et al., 2015).
3.9 Análise estatística
Após aplicação do teste de normalidade, os dados foram analisados por
Análise de Variância (ANOVA) seguido do pós-teste de Comparações Múltiplas de
Tukey para comparação dos valores médios. Para a comparação das porcentagens,
foi utilizado o teste Exato de Fisher. As diferenças foram consideradas
estatisticamente significativas quando p<0,05.
25
4- RESULTADOS
Como observado no TOTG no dia 0 de prenhez, as ratas do grupo D
apresentaram aumento na glicemia comparado ao grupo CA nos momentos 30 e 60
min. e ao grupo C nos momentos 30, 60 e 120 min. O nível glicêmico no momento 0
aumentou no grupo DA comparado aos demais grupos, e nos momentos 30, 60 e
120 min. em relação aos grupos C e CA. Todos os grupos apresentação elevação
na glicemia nos momentos 30 e 60 min. comparados ao momento 0 (Figura 6).
Figura 6- Médias e respectivos desvio-padrão da glicemia (mg/dL) do teste oral de
tolerância a glicose (TOTG) nos tempos 0, 30, 60 e 120 minutos de ratas não-
diabéticas e diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
ap<0,05 em comparação ao momento 0; *p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05
comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado com o grupo D (ANOVA seguida de teste de
Tukey).
26
A Figura 7 mostra o peso corpóreo nos dias 0, 7, 14 e 21. O ganho de peso
corpóreo materno não apresentou diferença significativa entre os grupos
experimentais. O peso foi progressivo durante toda a prenhez.
Figura 7 - Médias e respectivos desvio-padrão do peso (g) de ratas não-diabéticas e
diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
p>0,05 (ANOVA seguida de teste de Tukey).
27
A ingestão hídrica do grupo CA foi maior nos dias 0, 7, 14 e 21 comparado ao
grupo C. O grupo DA mostrou menor ingestão no dia 0 em relação ao grupo CA e
maior consumo nos dias 7, 14 e 21 em relação aos demais grupos (Figura 7).
Figura 8- Médias e respectivos desvio-padrão da ingestão hídrica (mL) de ratas não-
diabéticas e diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
*p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado
com o grupo D (ANOVA seguida de teste de Tukey).
28
Os animais do grupo CA obteve menor consumo alimentar em relação ao
grupo C em todos os momentos analisados. O grupo D apresentou maior consumo
de ração no dia 7 comparado ao grupo C. O grupo DA diminuiu o consumo em
relação ao grupo D nos dias 0, 7, e 14 e no dia 14 em relação ao grupo C (Figura 8).
Figura 9- Médias e respectivos desvio-padrão do consumo alimentar (g) de ratas
não-diabéticas e diabéticas submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
*p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado
com o grupo D (ANOVA seguida de teste de Tukey).
29
A Tabela 2 mostra o peso relativo dos órgãos maternos. O grupo DA
apresentou maior peso do baço em relação ao grupo CA e maior peso do pâncreas
comparado ao grupo C. A massa renal do grupo D foi maior que do grupo CA. A
gordura periovariana dos grupos CA e DA foi maior em relação ao grupo C. O
grupo DA teve aumento da gordura visceral em relação ao grupo C.
Tabela 2. Peso relativo dos órgãos de ratas não-diabéticas e diabéticas submetidas
ou não a dieta hipercalórica.
Peso relativo (g/100g)
Grupos
C CA D DA
Coração 0,31 0,03 0,31 0,07 0,30 0,02 0,30 0,04
Fígado 4,1 0,23 3,62 0,31 3,89 0,55 3,88 0,60
Baço 0,20 0,03 0,17 0,02 0,23 0,02 0,24 0,06#
Pâncreas 0,20 0,02 0,25 0,05 0,25 0,05 0,27 0,07*
Massa renal 0,57 0,03 0,53 0,04 0,62 0,07# 0,56 0,07
Gordura periovariana 0,37 0,09 0,86 0,19* 0,79 0,25 1,09 0,40*
Gordura visceral 3,05 0,53 3,98 1,47 3,89 0,87 5,45 1,84*
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
*p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado
com o grupo D (ANOVA seguida de teste de Tukey).
30
Em relação aos parâmetros reprodutivos maternos os grupos D e DA
apresentaram aumento da perda pré e pós-implantação e diminuição do peso do
útero gravídico em relação ao grupo C. O grupo DA apresentou diminuição do peso
materno em relação ao grupo C. Além disso, houve diminuição do número de fetos
vivos e do peso do útero gravídico, além de aumento das taxas de perdas pré e pós-
implantação do grupo DA em relação ao grupo CA (Tabela 3).
Tabela 3: Desempenho reprodutivo materno de ratas não-diabéticas e diabéticas
submetidas ou não a dieta hipercalórica.
Legenda: C – Controle; D – Diabético; A – Dieta hipercalórica.
Dados mostrados como média desvio-padrão (DP) (ANOVA seguida de teste de Tukey) e
proporções (%) (Teste Exato de Fisher).
*p<0,05 comparado com o grupo C; #p<0,05 comparado ao grupo CA; $p<0,05 comparado
com o grupo D.
Grupos
C CA D DA
Prenhez a termo (N) 13
11
10
11
Corpo lúteo Total (N)
Média DPa
170
13,08 1,19
150
13,64 1,36
133
13,30 1,57
14
13,27 1,68 Implantações
Total (N)
Média DPa
157
12,08 1,44
142
12,91 2,39
112
11,20 2,35
124
11,27 1,79
Fetos vivos Total (N)
Média DPa
147
11,46 1,81
131
11,91 2,30
95
9,50 2,99
102
9,27 1,79# Fetos mortos
Total (N)
Média DPa
1
0,08 0,29
2
0,17 0,58
1
0,10 0,32
1
0,08 0,29 Reabsorções
Total (N)
Média DPa
10
0,83 0,94
9
0,75 0,96
16
1,33 1,67
21
1,75 1,21 Perda pré-implantação (%)b
7,65
5,33
15,79*
15,07*#
Perda pós-implantação (%)b
6,37
7,75
15,18*
17,74*#
Ganho de peso materno - GPM (g) a
116,69 13,31
110,82 16,64
90,75 42,27
79,85 39,98* Peso do útero gravídico - PUG(g) a
82,28 13,23
82,86 12,98
66,33 20,28*
65,78 12,35*# GPM menos o PUG (g) a
34,41 13,06
28,07 17,85
35,48 14,98
31,60 13,40
31
5- DISCUSSÃO
O DMG acarreta algumas complicações para a mãe e o feto, e a crescente
busca por alimentos gordurosos e açucarados pode piorar esse quadro (POPKIN et
al., 2015). Devido a isso, pesquisadores têm demonstrado interesse em avaliar o
impacto do estilo de vida na saúde (FARHUD, 2015). Nesse estudo, tanto o diabete,
quanto a dieta hiperlipídica/água com 5% de sacarose, foram capazes de alterar
perfil sistêmico e reprodutivo de ratas.
Para avaliação da resposta fisiológica da insulina seguida de uma carga de
glicose, utiliza-se o TOTG como método de referência para determinação de
intolerância à glicose (BORAI et al., 2011). Devido a plasticidade do pâncreas, ratos
expostos a indução do diabete pela administração de STZ no período neonatal
apresentam regeneração parcial das células β-pancreáticas, ocasionando quadros
de hiperglicemia na vida adulta (PORTHA et al., 1974; GALLEGO et al., 2018). Os
animais dos grupos diabéticos apresentaram hiperglicemia na vida adulta,
confirmando a eficácia da droga e o modelo de indução de diabete empregado neste
estudo.
A gravidez é caracterizada pelo aumento progressivo do peso corpóreo,
resultante do crescimento fetal e seus anexos, além de adaptações que ocorrem no
organismo materno durante este período (IESSI et al., 2010). Neste estudo, o peso
corpóreo dos animais aumentou gradualmente e não houve diferença estatística
entre os grupos. Corroborando estudo de Sheludiakova et al. (2012), no qual ratos
Hooded Wistar receberam água com 10% de sacarose e água 10% frutose/sacarose
durante 56 dias, não foi observado aumento no ganho de peso corpóreo. Do mesmo
modo, em estudo realizado por Gancheva et al. (2015), ratos Wistar que receberam
uma dieta rica em gordura e frutose durante 8 semanas não tiveram diferença no
peso corpóreo em relação aos grupos que receberam dieta padrão.
Os grupos que receberam água acrescida de açúcar apresentaram maior
ingestão hídrica comparado aos grupos que receberam água filtrada, apontando a
preferência pelo gosto adocicado proporcionado pela água com sacarose (CONY et
al., 2016). Em relação ao consumo alimentar, os animais que receberam a dieta
alterada apresentaram menor consumo de ração, sugerindo a intervenção de
processos fisiológicos de controle quando há aumento de ingestão energética. Desta
32
forma, a alta ingestão calórica estimula a saciedade, diminuindo o consumo de
alimentos mais palatáveis, como aqueles gordurosos (DÍAZ-URBINA et al., 2017).
Um parâmetro para avaliar sinais de toxicidade é a alteração do peso relativo
dos órgãos (DE JONG & VAN LOVEREN, 2007). Em estudo de Yan et al. (2006), no
qual ratos Wistar receberam ração com 2% de colesterol e 10% de banha durante
20 semanas, foi observado acúmulo de tecido adiposo ao redor do pâncreas e no
interior das células pancreáticas. Diante disso, o aumento do peso relativo do
pâncreas, mostrado no grupo DA, sugere que a ração hiperlipídica induziu o
acúmulo de tecido adiposo no pâncreas. Em relação ao baço, o aumento visto no
grupo DA indica que a obesidade, ocasionada pela dieta hipercalórica, pode levar a
esplenomegalia através da dilatação de capilares e depósitos intracelulares ou
extracelulares de lipídeos nesse órgão (ALTUNKAYNAK et al., 2007). O aumento da
massa renal verificado no grupo D aponta a tentativa dos rins em eliminar o excesso
de glicose provocado pelo diabete, através da hipertrofia das células do túbulo renal
(ZAFAR & NAQVI, 2010). Além do aumento de peso corpóreo, existem outros
biomarcadores para avaliação de obesidade, como acúmulo de tecido adiposo
(SOARES et al., 2017). O acúmulo de gordura observada nos grupos CA e DA pode
estar relacionada com a capacidade de expansão do tecido adiposo, com a
hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos (SILVESTRI et al., 2019; AMENGUAL-
CLADERA et al., 2012). Além disso, Oliveira et al. (2014) concluiu que uma dieta rica
em gordura e sacarose leva a alterações nos adipócitos, como a hipertrofia dessas
células.
Para uma implantação bem-sucedida, uma série de eventos complexos e
sincronizados ocorrem entre o útero e o embrião (STAUN-RAM & SHALEV, 2005). A
taxa de implantação é associada ao número de corpos lúteos, que são indicadores
de sucesso da implantação do blastocisto no endométrio (SANTOS et al., 2016). Os
processos apoptóticos são importantes nas fases de pré e pós implantação para
eliminação de células com potencial anormal ou prejudicial, além do controle do
número de células embrionárias (FABIAN et al., 2005). O aumento na taxa de perda
pré-implantação, visto nos grupos D e DA, sugere o aumento da incidência de
apoptose nos blastocistos. Kubandová et al. (2014) observou em camundongos que
esse aumento ocorre através da multiplicação de processos não fisiológicos nos
embriões, induzidos por distúrbios homeostáticos materno como o aumento da
gordura corporal e níveis elevados de glicose e insulina no sangue.
33
As alterações metabólicas, como a hiperglicemia, causadas pelo diabete na
mãe têm um impacto relevante na embriogênese (ERIKSSON et al., 2003). Além
disso, mulheres com diabete não-controlado podem apresentar abortos frequentes
(VOLPATO et al., 2008). O aumento de perda pós-implantação embrionária está
relacionado com a presença de hiperglicemia no meio intrauterino (BEQUER et al.,
2018; GALLEGO et al., 2018). Além disso, alterações nas concentrações de
citocinas durante uma gestação diabética está relacionada com o comprometimento
no desenvolvimento embriofetal, esses danos podem ser confirmados pelas falhas
na pré-implantação e perdas pós-implantações (SINZATO et al., 2011). As taxas de
perda embrionária pós-implantação foram maiores nos dois grupos diabéticos deste
estudo.
O estado nutricional e adequado ganho de peso materno são condições
importantes para um bom desenvolvimento da gravidez (NOMURA et al., 2012). No
entanto, tanto o ganho de peso materno quanto o peso do útero gravídico
diminuíram no grupo DA, pois fatores como diminuição no consumo alimentar,
aumento das perdas pré e pós-implantação e diminuição do peso fetal podem
contribuir para a diminuição do ganho de peso materno (DAMASCENO et al., 2012;
SOARES et al., 2017).
Então, como verificado neste estudo, tanto o estado diabético, quanto uma
alimentação com excesso de nutrientes podem afetar a gestação, causando
prejuízos maternos e fetais. Assim, mais estudos são necessários visando o
entendimento dos mecanismos fisiopatológicos desencadeados por essa
associação.
34
6-CONCLUSÃO
O estado hiperglicêmico associado com uma dieta hipercalórica prejudicou de
maneira mais pronunciada o peso relativo dos órgãos e desempenho reprodutivo
materno. Assim, esse estudo demonstrou que essa associação provocou em maior
número os danos causados pelo diabete e a dieta separadamente.
35
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