Resumo e Comunicação

Workshop Plantas Medicinais e Fitoterapêuticas nos Trópicos. IICT /CCCM, 29, 30 e 31 de Outubro de 2008

Investigação de plantas medicinais anti-maláricas usadas na medicina tradicional de S.Tomé e Príncipe

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INVESTIGAÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS ANTIMALÁRICAS USADAS NA MEDICINA TRADICIONAL DE S. TOMÉ E PRÍNCIPE

Maria do Céu de Madureira Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz,

Monte da Caparica, Portugal [email protected]

Resumo Tendo em conta o elevado número de casos de malária por P. falciparum resistente à cloroquina em São Tomé e Príncipe (STP), pretendemos dar o nosso contributo para a melhoria das condições de saúde da população, através da Investigação da Actividade Antimalárica de plantas medicinais usadas na Medicina Tradicional, e através do desenvolvimento de novos compostos que possam ser usados para o controlo da malária, nomeadamente compostos activos contra Plasmodium falciparum resistente à cloroquina. Levou-se a cabo um estudo etnofarmacológico de 13 plantas medicinais usadas pelos terapeutas tradicionais de STP no tratamento de malária e/ou febres. Este estudo corroborou o uso tradicional da maioria das plantas medicinais, e a sua actividade farmacológica foi comprovada laboratorialmente. Foram igualmente realizados estudos fitoquímicos biodireccionados e ensaios de toxicidade nas plantas que apresentaram melhores resultados de actividade antimalárica. A planta Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray foi submetida a Ensaios Fitoquímicos, por ser a que apresentou os melhores resultados de actividade antimalárica e simultaneamente apresentar garantias de inocuidade, relativamente aos resultados de toxicidade, pelo que poderá servir de base para um futuro desenvolvimento de novos fármacos antimaláricos.

Palavras-chave: Plantas Medicinais; Malária; Medicina Tradicional; Tithonia diversifolia.

1. INTRODUÇÃO

A malária é a mais importante doença parasitária das regiões tropicais. Nas últimas

décadas tem-se vindo a assistir a um aumento e a uma disseminação alargada da resistência

aos fármacos antimaláricos mais comuns, o que se torna ainda mais grave devido ao custo

proibitivo de fármacos mais eficazes, para a grande maioria das populações destas áreas.

Há uma necessidade urgente de novos compostos terapêuticos, facilmente acessíveis e

de baixos custos (WHO, 2005). Uma das possíveis fontes destes tratamentos mais acessíveis

poderá advir do estudo e desenvolvimento de medicamentos à base de plantas, utilizados

localmente na medicina tradicional. De facto, o uso de plantas para o tratamento de malária é

uma prática que se estende ainda actualmente, em pelo menos três continentes, estando

registado o uso de mais de 1200 espécies de plantas para o tratamento de malária e/ou febres

(WILLCOX & BODEKER, & RASOANAIVO, 2004). No entanto, há ainda poucos dados

que documentem o uso destes preparados tradicionais nos sistemas de saúde destes países, e

que comprovem a eficácia e segurança dos mesmos. O reconhecimento e a validação de

práticas de medicina tradicional e a procura de agentes terapêuticos derivados de plantas,

pode levar ao estabelecimento de novas estratégias no controlo da malária. Uma vez que

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alguns dos principais fármacos antimaláricos actuais, tal como o quinino e a artemisinina, são

moléculas obtidas a partir de plantas, torna-se essencial que se investiguem outras plantas

medicinais utilizadas tradicionalmente como antimaláricas, de modo a comprovar a sua

eficácia e segurança e a determinar as suas potencialidades como novos fármacos

antimaláricos (GESSLER et al., 1994). De forma a ultrapassar os problemas mais comuns

nesta área de investigação, tais como a identificação correcta do material vegetal e a possível

variabilidade da composição química de remédios tradicionais, propusemo-nos avaliar a

actividade antimalárica de algumas das plantas medicinais usadas pelos terapeutas

tradicionais de S. Tomé e Príncipe, país onde mais de dois terços da população vive em

regiões onde a malária é endémica (LOUREIRO et al., 1996).

2. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE PLANTAS USADAS COMO ANTIMALÁRICOS NA

MEDICINA TRADICIONAL DE S. T. P.

Como foi referido anteriormente, a existência de uma situação problemática no

controlo da malária em São Tomé e Príncipe, e o uso elevado de plantas medicinais por parte

da população local, determinou a necessidade de avaliar cientificamente os medicamentos

usados como antimaláricos, na medicina tradicional destas ilhas (Projecto

PRAXIS/PSAU/P/SAU/38/96). Pretendeu-se avaliar a actividade antimalárica e a toxicidade

de extractos das plantas medicinais mais utilizadas pelos terapeutas tradicionais de S. Tomé e

Príncipe, para o tratamento da malária e febres, de forma a identificar as plantas mais eficazes

para estudos fitoquímicos posteriores.

Para o estudo da actividade antimalárica de extractos de plantas, a escolha recaiu sobre

o uso de testes in vitro com P. falciparum (estirpes sensíveis e estirpes resistentes à

cloroquina) e de testes in vivo com o modelo roedor Balb C / P. berghei, no que se refere à

fase sanguínea do ciclo de vida do parasita, tendo-se usado testes in vitro com esquizontes

hepáticos de P. berghei ANKA desenvolvidos em células Hep G2, relativamente à fase

hepática ou exoeritrocitária.

Para os testes de toxicidade utilizaram-se metodologias que estão de acordo com o que

se encontra preconizado pela Organização Mundial de Saúde, para este tipo de extractos de

plantas (WHO, 1996; 2000).

Com a verificação e o reconhecimento da actividade farmacológica das plantas

medicinais poder-se-á também contribuir para uma melhoria da eficácia do sistema actual de

saúde através da integração de algumas destas plantas no sistema médico das ilhas, em

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particular no que diz respeito aos cuidados de saúde primários e ao controlo da malária. Este

objectivo, vem ao encontro de propostas da OMS (WHO, 1997) que tem vindo a recomendar

aos governos de países em vias de desenvolvimento para que seja dada prioridade na

utilização da medicina tradicional e na integração de medicamentos tradicionais validados nas

regulamentações e nos sistemas nacionais de saúde.

2.1. PLANTAS SELECCIONADAS PARA O ESTUDO

Das 325 espécies de plantas recolhidas da flora da São Tomé e Príncipe foram

escolhidas 13 para pesquisa de actividade antimalárica (MADUREIRA et al., 2002a). A

selecção foi feita com base no facto de estas plantas serem utilizadas pelos terapeutas

tradicionais locais para o tratamento de quadros clínicos de paludismo (febres, cefaleias),

tendo também sido efectuada de acordo com dados obtidos na literatura e foram ainda tidas

em consideração características químicas e biológicas de espécies aparentadas. A

identificação científica de cada uma foi realizada no Instituto Botânico da Universidade de

Coimbra (COI).

Tabela 1 - Lista das plantas seleccionadas para o estudo de actividade antimalárica

ExtractoN.º

Nome da planta (Família) Nome Vernáculo Partes utilizadas Nº Voucher (COI)

1 Struchium sparganophora (Asteraceae) Libô-d’áua Parte aérea MM 125 2 Vernonia amygdalinaa (Asteraceae) Libô-qué Folhas MM 114 3 Vernonia amygdalinab (Asteraceae) Libo-mucambu Folhas MM 21 4 Ageratum conyzoides (Asteraceae) Fiá-malé-muálá Parte aérea MM 28 5 Cinchona succirubra (Rubiaceae) Pó-quina Casca MM 25 6 Aloe humilis (Aloeaceae) Áliba-babosa Suco da folha MM 354 7 Tithonia diversifolia (Asteraceae) Girassol Caule MM 625 8 Cedrela odorata (Meliaceae) Cidlela Casca MM 321 9 Premna angolensis (Verbenaceae) Pó-ama Casca MM 619

10 Pycnanthus angolensis (Myristicaceae) Pó-cassom Casca MM 426 11a Morinda lucida (Rubiaceae) Gligô Casca MM 26 11b Morinda lucida (Rubiaceae) Gligô Folhas MM 26 12 Cestrum laevigatum (Solanaceae) Coedano Folhas MM 102 13 Canna indica (Cannaceae) Salaconta Raízes MM 14

Nota: Vernonia amygdalinaa,b – Plantas distintas para os Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como sendo a mesma espécie.

2.2. PREPARAÇÃO DOS EXTRACTOS E FRACCIONAMENTO

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O material vegetal foi seco, sendo posteriormente pulverizado e submetido a uma

extracção com etanol a 70%, seguido de evaporação e liofilização. Os materiais frescos foram

homogeneizados e macerados posteriormente em etanol a 70%, tendo sido também

evaporados e liofilizados (extractos nº7 e nº13). Esta primeira extracção foi denominada de

extracto bruto (EB).

Para conseguir uma separação prévia de grupos de constituintes bioactivos, recorreu-se à

técnica de partição líquido-líquido, tendo o extracto bruto de cada amostra vegetal sido

inicialmente dissolvido em metanol:água (1:2), extraído com solventes de diferentes

polaridades, tendo-se obtido quatro fracções: éter de petróleo (EP), diclorometano (DM),

acetato de etilo (AE) e metanol/água (MA). Todas as fracções foram evaporadas num

evaporador rotativo, liofilizadas e congeladas a - 20ºC.

Foram preparadas soluções stock, de cada uma das fracções (EB, EP, DM, AE e MA),

com uma concentração final de 5 mg/ml em RPMI 1640 (Gibco BRL, ref. 51800-035) e 1%

etanol (Merck, ref. 1.00983.2511).

2.3. ENSAIOS DE DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTI-MALÁRICA

Três tipos diferentes de ensaios foram utilizados: ensaios in vitro com Plasmodium

falciparum para estudo da actividade antimalárica esquizonticida para parasitas na fase de

desenvolvimento eritrocitário (TRAGER & JENSEN, 1976; VASCONCELOS and

ROSÁRIO, 1983; FISK et al, 1989; CARVALHO and KRETTLI, 1991; JURG et al, 1991;

COUTO et al, 1993;), ensaios in vitro para estudo da actividade antimalárica durante o ciclo

hepático, utilizando Plasmodium berghei ANKA (CALVO-CALLE et al, 1994;

HOLLINGDALE et al, 1983a,b; SINDEN et al, 1990, 1991; HULIER and RENIA, 1996;

KARNASUTA, 1995; MILLET et al., 1986, 1988) e, finalmente, ensaios in vivo em modelo

de Plasmodium berghei ANKA infectando murganhos Balb C, também para a fase eritrocitária

(CARVALHO and KRETTLI, 1991; PETERS, 1987; PHILLIPSON, 1991).

2.3.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos testes in vitro sobre a actividade destes extractos contra a estirpe de

P. falciparum resistente à cloroquina (Dd2) são apresentados na tabela 2 (MADUREIRA et

al., 2002b). Foi calculada a concentração capaz de inibir o crescimento de 50% dos parasitas

(IC50) na fase sanguínea, em comparação com os controlos.

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Os extractos de Aloe humilis (AE), Cedrela odorata (DM), Cestrum laevigatum (DM)

e Canna bidentata (DM) demonstraram possuir uma actividade antiplasmódica moderada,

com valores de IC50 ≤ 50 μg/ml. Seis outros dos extractos em estudo apresentaram uma

evidente actividade antiplasmódica contra o P. falciparum resistente à cloroquina, com

valores de IC50 ≤ 10 μg/ml: Struchium sparganophorum (EP), Vernonia amygdalinab (AE),

Cinchona succirubra (EB e todas as fracções), Tithonia diversifolia (EP, DM), Pycnanthus

angolensis (EB) e Morinda lucida (EB).

Comparando os valores obtidos para este grupo de plantas com os valores de IC50

obtidos para a Artemisia annua (3,9 μg/ml) e para a Azadirachta indica (10 μg/ml), estamos

perante resultados bastante promissores (PHILLIPSON and O’NEIL, 1986). No entanto, é

preciso não esquecer que, muito frequentemente, plantas que são utilizadas tradicionalmente

como antimaláricos em diversos países, não apresentam actividades elevadas nos testes in

vitro. Estes casos podem ser parcialmente explicados, devido ao facto de, muitas das plantas

usadas tradicionalmente no tratamento da malária, poderem ter outras acções terapêuticas, que

não a actividade sobre o parasita, tais como acção antipirética ou imunomoduladora.

Tabela 2 – Actividade antimalárica in vitro de extractos de plantas (P. falciparum, Dd2)

Nº

Nome Botânico

Valores médios de IC50 (μg/ml)

EB EP DM AE MA 1 Struchium sparganophorum 180 <10 100 100 240 2 Vernonia amygdalinaa 120 170 235 500 n.d. 3 Vernonia amygdalinab 340 200 80 10 n.d. 4 Ageratum conyzoides 150 110 55 220 n.d. 5 Cinchona succirubra <10 <10 <10 <10 <10 6 Aloe humilis 260 150 150 25 500 7 Tithonia diversifolia 15 <10 <10 140 500 8 Cedrela odorata 190 110 50 n.d. n.d. 9 Premna angolensis 180 250 250 250 n.d. 10 Pycnanthus angolensis <5 100 100 100 n.d. 11a Morinda lucida casca) <10 50 50 100 500 11b Morinda lucida (folhas) 10 130 60 500 125 12 Cestrum laevigatum 100 100 50 150 135 13 Canna bidentata 500 130 25 245 500 EB-extracto bruto etanólico; EP – fracção éter de petróleo; DM – fracção diclorometano; AE – fracção acetato de etilo; MA – fracção remanescente metanol e água; n.d. – não determinado. IC50 (cloroquina) = 0.094 μg/ml Nota: a, b – Plantas distintas para os Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como sendo a mesma espécie.

Em duas das plantas medicinais (Pycnanthus angolensis e Morinda lucida) os

extractos brutos apresentaram uma elevada actividade contra o parasita, mas as fracções têm

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todas muito menor actividade. Uma explicação simples para esta situação, pode dever-se ao facto

de existirem possíveis sinergismos entre os diferentes compostos presentes na complexa mistura dos

extractos brutos, sinergismo esse que se perderá no decorrer do fraccionamento. Uma outra hipótese

é a possível instabilidade das moléculas fraccionadas ou purificadas, que nos extractos brutos

poderão estar protegidas por outros compostos.

Relativamente aos ensaios in vitro de actividade antimalárica, na fase hepática do

Plasmodium berghei (HepG2 cells), e aos testes de viabilidade celular (hepatotoxicidade) dos

extractos de plantas, os resultados encontram-se descritos na Tabela 3 (GOMES, 1999;

MADUREIRA et al., 2002b). Onze dos extractos e fracções em estudo revelaram actividade

esquizonticida na fase hepática do ciclo de vida do parasita, em concentrações abaixo dos

respectivos valores de MLD (Dose Mínima Letal – que inibe 30% do desenvolvimento celular

dos hepatócitos): Struchium sparganophorum (EB e MA), Aloe humilis (AE), Tithonia

diversifolia (EP e AE), Cedrela odorata (EB), Pycnanthus angolensis (EP e AE), Morinda

lucida – casca (EB e EP) e Morinda lucida – folhas (EP). De entre estas, quatro plantas

demonstraram possuir uma elevada actividade esquizonticida com valores de IC50 entre 5 a 34

μg/ml: Struchium sparganophorum, Tithonia diversifolia, Pycnanthus angolensis e Morinda

lucida (casca).

Tabela 3 – Actividade antimalárica exoeritrocítica e citotoxicidade de extractos de plantas contra Plasmodium berghei in vitro (Hep G2)

Extracto

Nº Nome Botânico Citotoxicidade

MLD (μg/ml)Concentrações

testadas Actividade

esquizonticida (μg/ml) IC50 (μg/ml) 1 Struchium sparganophorum 50 50 / 25 24 1EP Struchium sparganophorum 100 100 / 50 n.d. 1DM Struchium sparganophorum 25 25 / 10 35 1AE Struchium sparganophorum 50 50 / 25 78 1MA Struchium sparganophorum 500 500 / 250 482 2 Vernonia amygdalinaa 250 250 / 100 n.a. 3 Vernonia amygdalinab 250 250 / 100 305 4 Ageratum conyzoides 100 100 / 50 135 5 Cinchona succirubra 250 250 / 100 n.a. 6 Aloe humilis 500 500 / 250 n.a. 6EP Aloe humilis 100 100 / 50 n.a. 6DM Aloe humilis 10 10 / 1 19 6AE Aloe humilis 500 500 / 250 354 6MA Aloe humilis 100 100 / 50 344 7 Tithonia diversifolia 100 100 / 50 287 7EP Tithonia diversifolia 50 50 / 25 18 7DM Tithonia diversifolia 10 10 / 1 n.a. 7AE Tithonia diversifolia 250 250 / 100 117 7MA Tithonia diversifolia 500 500 / 250 n.a.

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Extracto

Nº Nome Botânico Citotoxicidade

MLD (μg/ml)Concentrações

testadas Actividade

esquizonticida (μg/ml) IC50 (μg/ml) 8 Cedrela odorata 250 250 / 100 158 9 Premna angolensis 500 500 / 250 n.a. 10 Pycnanthus angolensis 250 250 / 100 n.a. 10EP Pycnanthus angolensis 100 100 / 50 34 10DM Pycnanthus angolensis 500 500 / 250 n.a. 10AE Pycnanthus angolensis 25 25 /10 22 11a Morinda lucida (casca) 500 500 / 250 415 11aEP Morinda lucida (casca) 10 10 / 1 5 11aDM Morinda lucida (casca) 10 10 / 1 n.d. 11aAE Morinda lucida (casca) 50 50 / 25 137 11aMA Morinda lucida (casca) 500 500 / 250 n.a. 11b Morinda lucida (folhas) 50 50 / 25 76 11bEP Morinda lucida (folhas) 250 250 / 100 103 11bDM Morinda lucida (folhas) 100 100 / 50 167 11bAE Morinda lucida (folhas) 500 500 / 250 n.a. 12 Cestrum laevigatum 250 250 / 100 n.a. 13 Canna bidentata 500 500 / 250 n.a. MLD (Dose mínima letal) – dose que inibie 30% do crescimento celular; EB-extracto bruto etanólico; EP – fracção éter de petróleo; DM – fracção diclorometano; AE – fracção acetato de etilo; MA – fracção remanescente metanol e água; n.d. – não determinado; n.a. – não activo. IC50 (primaquina) = 0.003 μg/ml. MLD (primaquina) = 0.1 μg/ml. Nota: a, b – Plantas distintas p/Terapeutas Tradicionais, mas identificadas como sendo a mesma espécie.

Os extractos e as fracções das plantas que apresentaram uma actividade significativa nos

ensaios in vitro, foram seleccionadas para os ensaios in vivo de actividade antimalárica

(Struchium sparganophorum, Cinchona succirubra, Tithonia diversifolia, Cedrela odorata e

Pycnanthus angolensis). No entanto, esta selecção não exclui a possibilidade de outros

extractos, aparentemente menos activos in vitro, poderem ser agentes terapêuticos eficazes,

quando administrados por via oral, em ensaios in vivo.

De uma forma geral, os extractos testados apresentaram uma actividade parcial contra o

parasita da malária de roedores, tendo os extractos de Cinchona sido os únicos que

demonstraram uma quimiosupressão total da parasitémia de murganhos infectados com P.

berghei. No entanto, ressaltamos ainda os resultados obtidos com dois extractos brutos

(Struchium sparganophorum e Cedrela odorata), que evidenciaram uma inibição significativa

(P <0,05) do desenvolvimento do parasita (85% e 73%, respectivamente), numa concentração

de 1000 mg/Kg/dia.

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A parasitémia (média ± desvio-padrão) do grupo controlo infectado, no final do dia 4 era

de 10,34% ± 2,11%; no caso dos ratos tratados com Struchium sparganophorum a parasitémia

era de 1,54% ± 1,38% e para o grupo tratado com Cedrela odorata a parasitémia era de

2,84% ± 0,99%. Foi calculado o tempo médio de sobrevivência dos animais infectados e

tratados, comparativamente ao grupo de controlo (23 ± 3 dias), tendo uma das plantas

aumentado este valor em 35% (Cedrela odorata) – ver Fig 1.

0 , 0

5 , 0

1 0 , 0

1 5 , 0

2 0 , 0

2 5 , 0

3 0 , 0

3 5 , 0

T (d

ays)

K i 1 E P I 1 E P I I 5 I I 7 D M I 7 D M I I 8 I 8 I I 1 0 I 1 0 I IP l a n t e x t r a c t s

Ki (ratos infectados, não tratados) I – (1000 mg/Kg/dia) 8II (Cedrella odorata); 5II (Cinchona ) II – (500 mg/ Kg/ia)

Fig. 1 – Taxa de sobrevivência dos murganhos (MADUREIRA et al., 1998a,b)

2.4. ESTUDOS DE TOXICIDADE

De forma a poderem ser desenvolvidas as formulações mais apropriadas para a

produção local de medicamentos à base de plantas, não interessa só comprovar

cientificamente a sua eficácia, mas também demonstrar a sua total segurança. Segundo as

directivas da OMS, o passo seguinte para validar um medicamento à base de plantas, neste

caso um antimalárico, baseado na medicina tradicional, será o de determinar os respectivos

níveis de segurança através de estudos toxicológicos (WHO, 1998).

Foram efectuados dois tipos de ensaios de toxicidade de curta duração: testes de

genotoxicidade in vitro – Teste de Ames (MORTELMANS et al., 2000) e testes de toxicidade

aguda in vivo (TOLEDO et al., 2000; MARKOUK et al. 2000; ALEXANDRE-MOREIRA et

al., 1999; CYTED, 1995). O primeiro foi realizado numa parceria do Centro de Malária e

Outras Doenças Tropicais com o Centro de Investigação de Genética Humana da Faculdade

de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa, e o segundo, com a colaboração do

Biotério do Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Estes testes encontram-se entre as

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primeiras opções nos protocolos da Organização Mundial de Saúde e da RITAM (Research

Iniciative on Tradicional Antimalarials) para a validação de plantas medicinais como

medicamentos tradicionais à base de plantas (WHO, 1996; BODEKER & WILLCOX, 2000).

2.4.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir de ensaios de Genotoxicidade in vitro, realizados com a estirpe de Salmonella

tiphimurium TA98, foi feito um primeiro rastreio quanto à mutagenicidade de extractos de

plantas usados como antimaláricos em São Tomé e Príncipe (SANTOS, 2001).

Os extractos/fracções EB, EP e DM, das plantas Tithonia diversifolia e Pycnathus

angolensis não apresentam sinais de genotoxicidade, para a estirpe TA98, nos ensaios com e

sem biotransformação. O mesmo acontece, na fracção AE das duas plantas, no ensaio sem

biotransformação. Verifica-se no entanto, que a fracção AE, de ambas as plantas, apresenta

uma fraca mutagenicidade, para a estirpe TA98, no ensaio com biotransformação. Uma vez

que a estirpe TA98 é sensível a mutagéneos de desfasamento (frame-shift), pode-se concluir

que a fracção de acetato de etilo (AE) das plantas Tithonia diversifolia e Pycnathus angolensis

contêm na sua composição compostos que podem induzir este tipo de mutação. Por outro lado,

o facto desta actividade mutagénica não se apresentar no extracto bruto das plantas parece

sugerir que existem sinergismos entre os diversos componentes, que anulam a potencial

mutagenicidade, ou provavelmente que os compostos obtidos na fracção de acetato de etilo, e

que são responsáveis pela mutagenicidade, encontram-se em concentrações baixas no extracto

bruto, não sendo estas suficientes para apresentar sinais de mutagenicidade.

Assim sendo, a partir deste estudo, fica confirmada a mutagenicidade da fracção de

acetato de etilo da planta Tithonia diversifolia e a fraca mutagenicidade da mesma fracção para

a planta Pycnathus angolensis.

Os resultados dos ensaios de Toxicidade Aguda in vivo, efectuados em roedores,

comprovaram a inocuidade dos extractos/fracções EB e EP de Struchium sparganophora, EB

de Tithonia diversifolia, AE de Pycnanthus angolensis, com DL50 > 15.000 (mg/Kg); foram

considerados ligeiramente tóxicas as fracções de diclorometano de Struchium sparganophora e

de Tithonia diversifolia, com DL50 de 3.501 e 4.453mg/Kg, respectivamente; os restantes

extractos/fracções não apresentam indícios de toxicidade até à concentração testada.

O facto de existirem fracções que apresentam alguma toxicidade (fracção DM de

Struchium sparganophora e DM de Tithonia diversifolia), e de os respectivos extractos brutos

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não apresentarem toxicidade aguda, poderá indicar a existência de sinergismos/antagonismos

entre compostos, que possam estar presentes no extracto bruto e que inibam a referida

toxicidade.

Com estes resultados, pode-se comprovar a relativa inocuidade dos extractos brutos de

todas as plantas ensaiadas, sendo estes a forma mais aproximada, em termos de composição

relativamente aos medicamentos tradicionais usados pelos curandeiros da República de São

Tomé e Príncipe.

Relacionando estes resultados obtidos nos testes de genotoxicidade, in vitro e os testes

de toxicidade aguda, in vivo, com os resultados obtidos anteriormente nos estudos de

actividade antimalárica (ver tabela 4), pode-se verificar que nas plantas estudadas (Struchium

sparganophora, Tithonia diversifolia, Cedrela odorata, Pycnathus angolensis e Morinda

lucida (casca)), os extractos e fracções mais activos, foram de uma forma geral os extractos

bruto e as fracções de éter de petróleo, com valores de IC50 < 10 μg/ml (na fase eritrocitária), e

na fase hepática com valores de DL50 para os esquizontes, inferiores à dose letal tóxica (na fase

hepática).

No entanto, é importante referir que, de uma foma geral, nos extractos/fracções que

demonstraram uma actividade antimalárica elevada, as concentrações activas são

consideravelmente mais baixas que os valores de concentrações que revelam alguma

toxicidade, nos diversos ensaios de toxicidade efectuados.

Assim, e a partir de todos os resultados disponíveis até ao momento, pode-se concluir

que os extractos brutos e as fracções de éter de petróleo das plantas Tithonia diversifolia e

Pycnathus angolensis, são os que apresentam os melhores resultados de actividade

antimalárica (na fase sanguínea e fase hepática) e simultaneamente apresentam garantias de

inocuidade, relativamente aos resultados de toxicidade, pelo que poderão servir de base para

um futuro desenvolvimento de novos fármacos antimaláricos, devendo ser as espécies a

seleccionar para a realização de estudos fitoquímicos que permitam o isolamento e a

identificação do(s) composto(s) responsáveis pela actividade antimalárica da planta.

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Tabela 4 – Resultados dos ensaios de toxicidade versus actividade antimalárica

de Plantas de STP

Espécie de planta

Extracto/fracção Mutagenicidade

Toxicidade aguda, in

vivo

Actividade Esquizontocida

eritrocitária

Actividade Esquizontocida

hepática Hepatotoxicidade

Estirpe TA98 IC50 (μg/ml) IC50 (μg/ml) MLD (μg/ml)

Struchium sparganophora

EB n.d R.I. 180 24 50 EP n.d R.I. <10 n.d 100 DM n.d L.T. 100 35 25 AE n.d R.I.* 100 78 50

Aloe humilis

EB n.d R.I.* 260 s.a 500 EP n.d n.d 150 s.a 100 DM n.d n.d 150 19 10 AE n.d R.I.* 25 354 500

Tithonia diversifolia

EB N.M. R.I. 15 287 100 EP N.M. R.I.* <10 18 50 DM N.M. L.T. <10 s.a. 10 AE M. R.I.* 140 117 250

Cedrela odorata

EB n.d R.I.* 190 158 250 EP n.d R.I.* 110 n.d n.d DM n.d R.I.* 50 n.d n.d AE n.d R.I.* n.d n.d n.d

Pycnanthus angolensis

EB N.M. R.I.* <5 s.a. 250 EP N.M. R.I.* 100 34 100 DM N.M. R.I.* 100 s.a. 500 AE F.M R.I. 100 22 25

Morinda lucida (casca)

EB n.d R.I.* <10 415 500 EP n.d R.I.* 50 5 10 DM n.d n.d 50 n.d 10 AE n.d n.d 100 137 50

CI – concentrações inibitória; DLM – dose letal mínima; DL – dose letal; n.d.- não determinado; s.a – sem actividade esquizontocida; M. – mutagénico; N.M. – não mutagénica para a estirpe TA98; F.M.- fracamente mutagénica; R.I. – relativamente inócuo; R.I.* - relativamente inócuo até a concentração testada. L.T. – ligeiramente tóxico

3. ESTUDO FITOQUÍMICO

Efectuou-se uma pesquisa bibliográfica aprofundada sobre as 2 espécies mais

promissoras para permitir reunir todos os dados existentes sobre os estudos realizados até ao

momento por outros investigadores. Desta pesquisa, resultou a selecção final da espécie

Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray. (Asteraceae), uma vez que não existiam quaisquer

registos sobre o seu uso tradicional como antimalárico, e o seu estudo fitoquímico iria

permitir identificar pela primeira vez o(s) composto(s) responsáveis pela actividade

antimalárica, por nós já comprovada.

11



___________________________________________________________________________________________________________

Fig. 2 – Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray

3.1. ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES ACTIVOS

3.1.1. COLHEITA, IDENTIFICAÇÃO E PREPARAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL

O material vegetal da planta seleccionada (caules, folhas e flores de Tithonia

diversifolia) foi colhido em Monte Café – S. Tomé, e seco à sombra, tendo sido depositado

um exemplar de herbário no Instituto Botânico da Universidade de Coimbra (Madureira &

Martins 626 (COI)).

As partes aéreas secas da planta foram pulverizadas e foram preparados dois extractos

brutos, um com éter dietílico e outro com metanol. A planta pulverizada foi macerada

separadamente nos dois solventes (120 g / 1 L), à temperatura ambiente, durante 18 horas,

sendo os solventes evaporados à secura num rotavapor, a uma temperatura inferior a 40ºC.

Foi igualmente preparada uma decocção da planta, de forma similar a uma das preparações

utilizadas pelos terapeutas tradicionais; esta decocção foi liofilizada. É de salientar o facto

desta planta também ser usada em fresco, ingerindo-se o suco das folhas mais jovens, que são

mastigadas. No entanto, na preparação dos extractos apenas foi utilizado material seco.

3.1.2. ISOLAMENTO BIODIRECCIONADO

Isolamento de compostos activos

Todos os extractos foram testados contra duas estirpes de Plasmodium falciparum

(FCA 20 Ghana, sensível à cloroquina e FCB1- Colômbia, resistente à cloroquina), de acordo

com a metodologia descrita anteriormente, e os resultados da actividade antiplasmódica

12



___________________________________________________________________________________________________________

serviram de guia para o fraccionamento e isolamento subsequente dos constituintes activos da

planta em estudo.

Assim, e tendo em conta os resultados obtidos com estes ensaios (Tabela 5),

seleccionou-se o extracto de éter dietílico para continuar os estudos fitoquímicos, uma vez

que este extracto foi o que apresentou a melhor actividade contra as estirpes de P. falciparum

(FCA - IC50: 0,75 µg/ml e FCB1 - 0,83 µg/ml).

Tabela 5 – Actividade antimalárica de extractos de Tithonia diversiolia

Extracto

IC50 (µg/ml) FCA

IC50 (µg/ml) FCB1

Éter Dietílico 0,75 0,83 Metanol 2,16 4,36

Decocção H2O 57 79 Cloroquina 0,01 0,07

Cromatografia líquido-sólido

O extracto etéreo evaporado (obtiveram-se 2,88 g a partir de 120 g de material vegetal

seco) foi separado numa coluna de cromatografia de sílica gel 60 (Si60 Merck), e foi usado

um gradiente de eluição com hexano / acetato de etilo (100:0; 95:5; 90:10; 86:14; 82:18;

80:20; 78:22; 76:24; 74:26; 72:28; 70:30; 68:32; 66:34; 64:36; 62:38; 60:40; 55:45; 50:50;

45:55; 40:60; 35:65; 30:70; 20:80; 10:90; 0:100); metanol e metanol 50%, tendo-se utilizado

alíquotas de 250 ml de cada eluente.

Com esta técnica pretendemos eluir e separar os vários componentes do extracto, em

função da sua polaridade crescente.

Cromatografia em Camada Fina (CCF e CPCF)

As fracções eluídas foram submetidas a CCF (placa de silica gel; hexano / acetato

etilo 80:20 e 40:60), e examinadas para verificar similaridades e diferenças do seu perfil

cromatográfico. Desta forma, combinaram-se os eluatos em 30 fracções conforme a sua

semelhança de perfil cromatográfico (Fracção I a XXX).

Efectuaram-se testes de actividade antiplasmódica nas 30 fracções, tendo-se verificado uma

maior actividade nas fracções XVI a XX, correspondentes à fase móvel hexano / acetato de etilo

70:30), com IC50 entre 0,37 µg/ml a 0,63 µg/ml na estirpe FCA.

A fracção mais activa (XVII, IC50: 0,37 µg/ml) foi purificada através de

Cromatografia Preparativa de Camada Fina (sílica gel; hexano / acetato de etilo 40:60),

13



___________________________________________________________________________________________________________

tendo-se obtido 80 mg de um composto maioritário (Rf 0,39; silica gel; hexano / acetato etilo

40:60). Este composto também estava presente nas fracções XVI a XX.

O composto assim obtido possui uma boa actividade antiplasmódica, tendo sido

determinado um IC50 de 0,33 µg/ml (0,95 µM) na estirpe sensível à cloroquina (FCA) e IC50

de 0,24 µg/ml (0,69 µM) e 0,25 µg/ml (0,72 µM) respectivamente, nas estirpes resistentes à

cloroquina FCB1 e W2.

Estes resultados parecem comprovar que este é o composto maioritariamente

responsável pela actividade antimalárica da planta Tithonia diversifolia.

3.1.3. IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DO COMPOSTO ACTIVO

A estrutura do composto activo, a lactona sesquiterpénica tagitinina C, foi

determinada recorrendo a métodos espectroscópicos e espectrofotométricos (UV, IV, MS e

RMN), tendo sido feita a comparação dos espectros obtidos com dados da literatura, uma vez

que esse composto já havia sido descrito anteriormente como fazendo parte da composição da

Tithonia tagitiflora Desf. (PAL R. et al., 1977) e da Tithonia diversifolia (BARUAH N.C. et

al., 1979).

Espectrometria UV – Visível

Os espectros de ultravioleta (UV) foram traçados em metanol, com um

espectrofotómetro HITACHI U-3300. A selecção desta solução baseou-se no trabalho de

BARUAH N.C. et al. (1979).

O composto activo isolado apresentava uma forte fluorescência a 254 nm nas placas de

cromatografia em camada fina com indicador de fluorescência. Por este motivo, iniciámos a

respectiva identificação começando por traçar o seu espectro UV (Fig. 3):

14



___________________________________________________________________________________________________________

Fig. 3 – Espectro UV do composto activo isolado

Podemos observar claramente no espectro obtido a existência de dois máximos de

absorção: um a 207 nm, clássico para lactonas sesquiterpénicas com um metileno exocíclico,

e um outro a 248 nm.

ε (207 nm) = 1,63 x 348 = 10554,3

1 x 0,063

ε (248 nm) = 1,26 x 348 = 8158,5

1 x 0,063

Este espectro não nos permite avançar muito relativamente à estrutura exacta do

composto. Podemos unicamente deduzir, dos dados obtidos, que o composto possui sistemas

de duplas ligações conjugadas, e que se trata muito provavelmente de uma lactona

sesquiterpénica com um metileno exocíclico.

Espectrometria de Infravermelho

Os espectros de infravermelho (IV) foram realizados no CERM (Centre de Recherche

sur les Macromolecules da Universidade de Liège) e foram traçados com um

espectrofotómetro PERKIN ELMER Spectrum GX ® FT-IR, equipado com um detector

MIRTGS. As soluções foram feitas em éter dietílico e em tetracloroetileno (C2Cl4).

Os espectros e os dados obtidos (Fig. 4) foram tratados com o programa informático

Spectrum V2.00 da Perkin-Elmer.

As informações mais marcantes e interessantes deste espectro são as 3 bandas intensas

observadas entre 1650 e 1800 cm-1, isto é, na região de vibração das duplas ligações dos

15



___________________________________________________________________________________________________________

carbonilos. Podemos igualmente observar algumas bandas na região de vibração de

alongamento das ligaçõe Csp2-H, típicas dos alcenos e um sinal a 3610 cm-1, correspondente

provavelmente à vibração de alongamento da ligação O-H.

De acordo com os dados existentes na literatura, uma molécula já descrita em

Tithonia diversifolia (BARUAH et al., 1979), e em Tithonia tagetiflora (PAL et al., 1977), a

lactona sesquiterpénica Tagitinina C, possui três grupos carbonilo com valores relativamente

próximos dos valores por nós observados, o que nos indica que o nosso composto activo

poderá ser esta mesma lactona sesquiterpénica.

Fig. 4 – Espectro IV do composto activo isolado

Espectrometria de Massa por impacto electrónico

Os espectros de massa foram obtidos no modo positivo e realizados no MS Lab

(Laboratório de Espectrometria de Massa da Universidade de Liége) e obtidos com um

aparelho FINNIGAN Polaris Q (GC-MS – EI/CI).

A espectrometria de massa permitiu-nos obter algumas informações mais e os

resultados obtidos corroboram perfeitamente a hipótese da presença de Tagitinina C, como

sendo o composto activo por nós isolado.

[M+Na]+

16



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17

[M-(HOOCCH(CH3)2+H]+

Fig. 5 – Espectro de Massa do composto isolado

Assim, e apesar de algumas diferenças detectadas no espectro obtido (Fig. 5),

comparativamente aos dados existentes na literatura, podemos constatar o seguinte:

- a massa da tagitinina C é de 348; no entanto, o espectro de massa apresenta um sinal

importante a 371 m/z; detectaram-se vestígios de Na (23) fixados à molécula, pelo que

podemos admitir a hipótese de estar na presença de um aducto de sódio sobre a molécula da

tagitinina C (348 + 23 = 371);

- observando os iões-filhos do sinal 371 (obtidos por MS/MS), detecta-se que se situam a 301

e a 283 m/z. Subtraindo o valor da massa do sódio (23), estes sinais situar-se-iam a 278 e 260

m/z, duas massas mencionadas na literatura (PAL et al., 1977) como sendo fragmentos da

tagitinina C; estes fragmentos são obtidos respectivamente pela perda de um COCH(CH3)2 e

de um HOOCCH(CH3)2;

- no espectro apresentado na figura 5, observam-se igualmente outros sinais a 261 e a 243

m/z. Trata-se de dois fragmentos da molécula da tagitinina C, que correspondem

respectivamente a uma perda de HOOCCH(CH3)2 do grupo éster e de HOOCCH(CH3)2- H2O

do grupo alifático da molécula.

Através da análise dos resultados obtidos com o espectro de massa, ficou ainda mais

fortalecida a hipótese do nosso composto activo isolado ser a tagitinina C.

Ressonância Magnética Nuclear (13C-RMN e 1H-RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear foram realizados no CREMAN

(Centre de Résonance Magnétique Nucléaire da Universidade de Liége) e foram traçados em

solução de CDCl3, usando o TMS com padrão interno, a 400 MHz (1H-RMN) e 100 MHz

(13C-RMN) num aparelho BRUCKER Avance DRX 400. Para melhor elucidação estrutural



___________________________________________________________________________________________________________

recorreu-se também a espectros bidimensionais de correlação homonuclear de protão (2D 1H-1H – COSY).

A técnica que melhor nos permite identificar a molécula isolada é incontestavelmente

a RMN. De facto, a análise conjunta dos espectros 1H, 13C e de espectros 2D, deixa muito

poucas dúvidas acerca da identidade da molécula.

Assim, pudemos constatar, por comparação com os valores obtidos por BARUAH et

al., em 1979 (coluna Tg C), que os espectros de protão e de carbono por nós obtidos

apresentam valores de deslocamentos químicos quase idênticos aos descritos anteriormente

na literatura para a tagitinina C (Tabelas 6 e 7):

Tabela 6 – Comparação dos deslocamentos químicos em RMN 1H (ppm)

Posição Composto Isolado

(em CDCl3) Tg C*

(em CDCl3)Δ

1 6,92 6,94 - 0,02 2 6,24 6,26 - 0,02 5 5,86 5,88 - 0,02 6 5,40 5,42 - 0,02 7 3,54 3,55 - 0,01 8 5,35 5,33 + 0,02 9ª 2,45 ≈ 2,40 ≈ + 0,05 9b 1,99 ≈ 2,00 ≈ - 0,01 13ª 6,34 6,36 - 0,02 13b 5,80 5,81 - 0,01 14 1,53 1,56 - 0,03 15 1,95 1,97 - 0,02 2’ 2,42 2,44 - 0,02 3’ 1,07 1,10 - 0,03 4’ 1,05 1,08 - 0,03

Tabela 7 – Comparação dos deslocamentos químicos em RMN 13C (ppm)

Posição Composto Isolado

(em CDCl3) Tg C*

(em CDCl3) Δ

1 159,95 160,49 - 0,54 2 128,98 129,57 - 0,59 3 196,78 196,85 - 0,07 4 138,95 188,84 + 0,11 5 ≈ 137,78** 137,14 ≈ + 0,54 6 ≈ 75,50** 76,05 ≈ - 0,55 7 47,40 47,05 + 0,35 8 ≈ 73,80** 74,11 ≈ -0,31 9 48,50 48,37 + 0,13

10 72,06 71,91 + 0,13 11 136,00 136,11 - 0,11 12 169,65 169,75 - 0,10 13 ≈ 124,50** 124,43 ≈ + 0,07 14 ≈ 28,50** 28,88 ≈ - 0,38 15 ≈ 19,00** 19,65 ≈ - 0,65

18



___________________________________________________________________________________________________________

Posição Composto Isolado (em CDCl3)

Tg C* (em CDCl3)

Δ

1’ 176,16 176,18 - 0,02 2’ 34,45 34,06 + 0,39 3’ 18,80 18,80 0,00 4’ 18,65 18,64 + 0,01

* Valores descritos na literatura para a tagitinina C (BARUAH et al., 1979) ** Alguns sinais confundem-se com o ruído de fundo, sendo difícil determinar o seu deslocamento com precisão

O espectro H1-H1 2D COSY (figura 6), que permite observar as correlações entre os protões

dos carbonos vizinhos, apresenta todas as correlações (anotadas pelos números dos

respectivos protões) correspondentes à estrutura da tagitinina-C.

Fig. 6 – Espectro H1-H1 2D COSY do composto isolado

19



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Em conclusão, a análise conjunta de todos os dados obtidos (UV, IV, MS-EI, 1H-

RMN e 13C-RMN) permitiu-nos confirmar definitivamente a estrutura da lactona

sesquiterpénica por nós isolada, e identificar deste modo a tagitinina-C, como sendo o

composto activo responsável pela actividade antimalárica da planta Tithonia diversifolia

(GOFFIN et al., 2002).

3.2. OUTROS ESTUDOS

Após a identificação da tagitinina C como sendo o composto maioritariamente

responsável pela actividade animalárica da planta medicinal Tithonia diversifolia, foram

posteriormente desenvolvidos por outros investigadores métodos laboratoriais que permitem

uma rápida quantificação deste composto activo em extractos obtidos com as partes aéreas da

referida planta (GOFFIN et al., 2003).

De acordo com dados existentes na literatura, a presença de tagitinina C varia bastante

consoante a origem do material vegetal. Assim, temos a presença de tagitinina C descrita para

plantas provenintes da Índia (BARUAH et al., 1979; BORDOLOI et al., 1996) e para a

espécie de África por nós estudada (GOFFIN et al., 2002), não estando esta lactona

sesquiterpénica descrita para a mesma espécie, em plantas originárias do Brasil (PEREIRA et

al., 1997), Costa Rica (SCHUSTER et al., 1992) e Taiwan (KUO & CHEN, 1998).

Quantificação da Tagitinina C por Cromatografia Líquida de Alta Resolução

(HPLC) em Fase Reversa (GOFFIN et al., 2003)

O sistema de HPLC utilizado consistiu numa bomba de gradiente LKB (Bromma,

Sweden) 2249-010 LC, um detector de Photodiodo-array Hewlett Packard (Palo Alto, CA,

USA), modelo 1040 M-série 2 (a operar a 254 nm), uma coluna Lichrospher 60 RP 18 Selet

B (250 x 4 mm; dimensão de partículas de 5 µM; VWR International).

A fase móvel usada foi acetonitrilo (solvente A) e sol. aquosa de acetato de sódio (0.1

M), ajustado a pH 4.8 com ácido acético a 10% (solvente B). A eluição foi isocrática com

A:B (45:55), e com um fluxo de 1.0 mL/min. Com estas condições cromatográficas, a

tagitinina C pura eluiu neste sistema aos 5.8 minutos.

20



___________________________________________________________________________________________________________

Fig. 7 – Cromatograma da tagitinina C em HPLC-fase reversa (254 nm)

Foram preparadas várias soluções-padrão com concentrações conhecidas de tagitinina

C (0,4; 0,2; 0,1 e 0,01 mg/ml), sendo estas injectadas em triplicado, e usadas para estabelecer

a curva de calibração, a 254 nm.

Foram analisadas diversas amostras, correspondentes a diferentes extractos preparados

com as partes aéreas da planta Tithonia diversifolia (500 mg de material vegetal em éter dietílico,

em diclorometano, em metanol e numa decocção aquosa), tendo os resíduos secos (8 mg de cada)

sido solubilizados numa mistura de 9 mL de acetonitrilo e 11 mL de tampão de acetato (pH 4.8) e

as soluções filtradas através de uma membrana HVLP de 45 µm.

Para cada amostra foi injectada no HPLC uma alíquota de 20 µL, tendo a área do pico

associado à tagitinina C sido integrada e usada para calcular a quantidade de tagitinina C

existente em cada amostra. Todo o procedimento foi realizado em triplicado.

Na tabela 8 são apresentados os valores calculados de tagitinina C existentes em cada

extracto analisado, com as correspondentes percentagens existentes nas diversas partes da

planta utilizada (partes aéreas, flores, folhas e caules).

Tabela 8 – Quantificação da tagitinina C por HPLC-fase reversa em vários extractos de Tithonia diversifolia

Parte da Planta

Extracto (solvente) Peso Extracto (mg)

Tagitinina C no extracto (%)a

Tagitinina C na Amostra (%)a

Partes aéreas Diclorometano 13.2 0.492 ± 0.015 (0.013 ± 0.001)* Partes aéreas Metanol 151.0 1.987 ± 0.012 (0.600 ± 0.004)* Partes aéreas Água (decocção) 91.5 0.492 ± 0.015 (0.090 ± 0.003)* Partes aéreas Éter dietílico 12.5 30.53 ± 0.65 0.763 ± 0.016 Flores Éter dietílico 12.5 5.080 ± 0.030 0.127 ± 0.001 Folhas Éter dietílico 18.6 30.85 ± 0.31 1.145 ± 0.012 Caules Éter dietílico 2.9 0.060 ± 0.005 0.00035±0 .00003

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a Média Valores (n=3) ± desvio-padrão; Valores em percentagem (m/m) * Valores não comparáveis, uma vez que foram usados solventes diferentes para extrair a tagitinina C

Como se pode observar pelos valores apresentados na tabela 8, é o solvente éter

dietílico que melhor extrai a tagitinina C da planta, obtendo-se um extracto com cerca de 30%

deste composto, quer através das partes aéreas secas, quer através das folhas secas.

Os restantes extractos preparados com os outros solventes (diclorometano, metanol e

a decocção em água) apresentam valores muito inferiores de tagitinina C.

As folhas apresentam a maior quantidade do composto activo, com um conteúdo

médio de tagitinina C de cerca de 1,15%, devendo ser o material da planta a ser utilizado

preferencialmente na preparação de medicamentos tradicionais.

Em S. Tomé e Príncipe, as formas tradicionais de preparação do medicamento

antimalárico à base de Tithonia diversifolia são a decocção em água das partes aéreas ou das

folhas secas, e as folhas frescas mastigadas.

De acordo com os resultados apresentados por estes investigadores, o uso da decocção

das partes aéreas secas da planta deveria ser desaconselhado, por ter um conteúdo muito

baixo do composto activo (0,492%), comparativamente com os 30,5% que se conseguem

extrair com éter dietílico, devendo por isso ser recomendado principalmente o uso tradicional

das folhas frescas mastigadas.

Estes resultados estão concordantes com a análise efectuada aos vários extractos da

planta para determinação da sua actividade antimalárica (tabela 5), em que a decocção em

água apresentava o valor mais baixo de actividade antiplasmódica contra o P. falciparum

(com um IC50 de 57 µg/ml), contra um valor de IC50 de 0,75 µg/ml para o extracto etéreo. No

entanto, não podemos deixar de salientar que estes são resultados de testes in vitro que,

independentemente da sua validade como técnica laboratorial, não podem ser directamente

extrapolados para o organismo humano. Um extracto bruto, tal como o é a decocão em água

desta planta, é uma mistura altamente complexa de compostos, que podem interagir entre si,

provocando sinergismos ou antagonismos, quer a nível da actividade terapêutica, quer a nível

da toxicidade de um composto.

Interessa ainda referir, a título de exemplo, e com todas as implicações daí

decorrentes, que foi identificado um composto análogo do ácido artemisínico em caules de

uma espécie indiana de Tithonia diversifolia (BORDOLOI et al., 1996).

22



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Nos ensaios de toxicidade realizados até ao momento no extracto bruto da planta

Tithonia diversifolia e em fracções deste extracto bruto, ficou confirmada apenas uma fraca

mutagenicidade de algumas fracções (acetato de etilo) e simultaneamente pode-se comprovar

a relativa inocuidade do extracto bruto da mesma planta, sendo este extracto (etanol 60%) a

forma mais aproximada, em termos de composição relativamente aos medicamentos

tradicionais usados pelos curandeiros de São Tomé e Príncipe (decocção em água). Estes

resultados podem indiciar, por um lado, a existência de sinergismos/antagonismos entre

compostos, que possam estar presentes unicamente no extracto bruto e que inibam a referida

toxicidade, e por outro lado, a maior concentração da tagitinina C nas fracções, uma vez que

este composto apresenta alguma citotoxicidade (IC 50 HTC-116: 0,706 μg/ml).

Face aos resultados dos ensaios de actividade antiplasmódica e de toxicidade

realizados, não podemos desaconselhar totalmente o uso da decocção como preparação

tradicional, uma vez que se desconhecem ainda os restantes compostos presentes na sua

composição e as respectivas funções.

Por outro lado, há que ter em conta que estes medicamentos tradicionais são utilizados

por diferentes sectores etários da população, podendo talvez recomendar aos terapeutas

tradicionais que continuem a usar a decocção para tratamento de crianças e de outros grupos

de risco (grávidas e idosos), mantendo a utilização das folhas frescas para adultos.

4. CONCLUSÕES

A resistência do P. falciparum à cloroquina e à maioria dos actuais fármacos

disponíveis, é actualmente um problema muitíssimo grave em S. Tomé e Príncipe, tal como

em muitos outros locais em África, o que intensifica a urgência de se desenvolverem novos

anti-maláricos.

Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam uma forte correlação entre o uso

tradicional de diversas plantas medicinais, utilizadas pelos terapeutas tradicionais de S. Tomé

e Príncipe no tratamento de febres e/ou malária, e a sua actividade farmacológica

comprovada laboratorialmente. A planta Tithonia diversifolia possui uma elevada actividade

antiplasmódica quer na fase eritrocitária do P. falciparum, resistente à cloroquina, quer na

fase hepática do desenvolvimento do parasita. A lactona sesquiterpénica tagitinina C foi

isolada e identificada como sendo o principal composto responsável pelo efeito anti-malárico,

23



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demonstrando uma boa actividade antiplasmódica (IC50: 0,33μg/ml), mas possuindo alguma

citotoxicidade (IC 50 HTC-116: 0,706 μg/ml).

Foram posteriormente desenvolvidas por outros investigadores metodologias que

permitem a rápida quantificação do composto activo (tagitinina C) em extractos etéreos de T.

diversifolia (GOFFIN et al., 2003). De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir

que a decocção em água parece ser o método menos adequado à preparação de um

medicamento tradicional, pois apresenta uma menor concentração de tagitinina C e uma

menor actividade antimalárica, in vitro.

As folhas apresentam a maior quantidade do composto activo, com um conteúdo

médio de tagitinina C de cerca de 1,15%, devendo ser o material da planta a ser utilizado

preferencialmente na preparação de medicamentos tradicionais.

Por último, parece-nos oportuno referir a importância que poderá ter uma investigação

genética da planta, uma vez que será útil determinar quais as causas das variações existentes

na presença ou ausência do composto activo, a tagitinina C, em espécies de origens

geográficas diferentes. Sobre este aspecto, muito poderá ainda ser feito, com vista à obtenção

de espécies mais adequadas quer a um uso tradicional, quer a um uso industrial.

Com efeito, apontamos um exemplo da interligação da investigação fitoquímica com a

biologia aplicada, na investigação levada a cabo por outros autores (MAGALHÃES, 1996;

DELABAYS, 1997), em que se conseguiu seleccionar uma espécie de Artemisia annua capaz

de produzir artemisinina em quantidade suficiente, para que possa ser utilizada com um nível

de eficácia adequada, numa forma de preparação tradicional (infusão), utilizada em vários

países do continente Asiático.

A T. diversifolia é certamente uma planta para continuar a estudar no futuro, quer no

que diz respeito à selecção da variedade mais adequada, quer no que concerne à determinação

de dosagens adequadas para um bom resultado terapêutico, e que garantam uma boa relação

eficácia / segurança de um extracto padronizado, de forma a permitir a produção local de um

antimalárico facilmente acessível e de baixos custos.

Os resultados obtidos até ao momento são promissores e constituem um exemplo de

como a etnofarmacologia pode indicar o caminho para novas terapêuticas e para o

desenvolvimento de novos fármacos.

Todos os resultados obtidos foram apresentados ao Ministério da Saúde da RDSTP,

antes da sua publicação ou apresentação em Congressos Internacionais, de forma a permitir

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uma futura utilização de medicamentos eficazes, seguros e economicamente viáveis, e

tentando garantir deste modo que os benefícios resultantes desta investigação possam ser

aproveitados e usufruídos pela população e pelos terapeutas tradicionais que forneceram os

conhecimentos tradicionais que serviram de base a este estudo.

Agradecimentos

Este trabalho foi feito em parceria com a Doutora Ana Paula Martins, e não teria sido possível

sem a colaboração do Ministério da Saúde de S. Tomé e Príncipe e dos terapeutas tradicionais

locais, entre os quais destacamos Sum Pontes e Sum Gino, a quem agradecemos a sua

generosidade e os seus preciosos ensinamentos.

Agradece-se igualmente a todas as instituições e respectivos investigadores que participaram

directamente na realização deste estudo: Prof. Jorge Paiva do Instituto Botânico da

Universidade de Coimbra; Prof. António Proença da Cunha e Prof. Lígia Salgueiro do

Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; Prof.

Doutor Virgílio do Rosário, Drª Miléne Gomes e Dr. Filipe Santos, do Centro de Malária e

outras Doenças Tropicais e do Departamento de Genética do Instituto de Higiene e Medicina

Tropical da Universidade Nova de Lisboa; Prof. Doutor Luc Angenot e Dr. Eric Goffin do

Laboratory of Pharmacognosy and Structural Chemistry, Natural and Synthetic Drugs

Research Centre University of Liège, Bélgica.

Nota: Este trabalho foi realizado no âmbito do Projecto “Validação de Medicamentos usados

como Antimaláricos na Medicina Tradicional de S. Tomé e Príncipe”, financiado pela

Fundação para a Ciência e Tecnologia (PRAXIS/PSAU/P/SAL/38/96).

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