244 Blood Transf 2003; 3: 244-65

Stealth erythrocytes: effects of polymer graftingon biophysical, biological and immunological parameters

Mark D Scott1, Amanda J Bradley1, Kari L Murad 2

1Canadian Blood Services & Department of Pathology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada2College of St. Rose, Albany, NY, USA

Correspondence:Mark D Scott,Canadian Blood Services and the Department of Pathology,University of British Columbia, Koerner PavilionRoom GF-401, 2211 Wesbrook Mall, Vancouver,BC V6T 2B5 Vancouver - Canada

Introduction

Despite the common perception of blood transfusionsas a "low tech" and relatively "risk-free" medical procedure,the red blood cell (RBC) remains an antigenically challengedcell even after ABO/RhD typing. Indeed, while theincidence of clinically noteworthy (i.e., mortality orsignificant morbidity) transfusion reactions is low (~0.017%of transfused individuals), less severe transfusion reactions(e.g., transient fever; malaise, premature donor RBCclearance) and alloimmunization are considerably morefrequent1-5.

Of particular importance in multiply transfused patientsis the risk of alloimmunization. Alloimmunization arises dueto the varying genetic frequencies of the hundreds of non-ABO blood group antigens, each of which is characterizedby an independent risk of immunization (Table I)6,7. Asignificant factor in the risk of alloimmunization is thevarying frequency of the non-ABO blood group antigensthat exist between differing ethnic and racial groups8. As aconsequence of this disparity, both alloimmunization andtransfusion reactions are most commonly encounteredwithin minority populations due to the antigenic disparitybetween the minority recipient and the typical donor pool.Within North America and Europe, this genetic variance isperhaps best characterized in patients with Sickle CellAnemia (Table II). Similar non-ABO antigenic differencescan be observed within Asian and Mediterraneanpopulations9-11.

Introduzione

Nonostante la comune sensazione che la trasfusione disangue sia una pratica medica a "bassa tecnologia" erelativamente "priva di rischi", il globulo rosso (RBC) restauna cellula antigenicamente impegnativa, al di là dellatipizzazione ABO/Rh. In realtà, mentre l'incidenza di reazionitrasfusionali clinicamente rilevanti (per esempio, mortalitào malattie significative) è bassa (~0,017% dei soggettitrasfusi), reazioni più lievi (quali, stati febbrili temporanei,sensazione di malessere, lisi precoce delle emazie deldonatore) e la frequenza di alloimmunizzazioni sonoconsiderevolmente più frequenti1-5.

Di particolare importanza è il rischio dialloimmunizzazione nei politrasfusi. L'immunizzazione èdovuta alle differenti frequenze geniche di centinaia diantigeni gruppoematici diversi dall'ABO, ognuno dei qualiè caratterizzato da un rischio diverso di alloimmunizzazione(Tabella I)6,7. Un fattore significativo in questo tipo di rischioè rappresentato dalle variabili differenze degli antigenigruppoematici non-ABO che si riscontrano nei diversigruppi etnici e razziali8. Come conseguenza di tali disparità,sia le alloimmunizzazioni che le reazioni trasfusionali siriscontrano più frequentemente fra le minoranze etniche inuna data popolazione in rapporto alle differenze antigenichefra un ricevente appartenente alla popolazione in minoranzae il pool dei donatori a disposizione. Sia nell'America delNord che in Europa, queste varianti genetiche sono, forse,meglio caratterizzate nei pazienti affetti da anemiadrepanocitica (Tabella II). Eguali diversità antigeniche non-ABO possono osservarsi fra le popolazioni asiatiche delbacino del Mediterraneo9-11.

In realtà, negli studi condotti sui pazienti affetti da β-talassemia, oltre il 20% di quelli sistematicamente trasfusiha evidenziato un'alloimmunizzazione non-ABO/RhD12,13.

Review

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Indeed, in studies on ß thalassemic patients, up to 20%of these chronically transfused individuals demonstrateevidence of non-ABO/RhD alloimmunization12,13. Rates inpatients with sickle cell anemia patients are even higher andare correlated with the number of transfusions received10.Often unappreciated is the fact that the amount of bloodtransfused into patients on an annual basis can be quitestaggering.

One study on ß thalassemia patients in Italy documentedthat each person, on average, received approximately 32 units(i.e., 14.4 liters) of blood/RBC per annum with each of thesetransfusions having a potential risk of both alloimmunizationand a mild to severe transfusion reaction14. As a result ofthe chronic transfusion therapy, some (e.g., sickle cell)patients become so heavily alloimmunized to "minor" RBCantigens that standard laboratory blood typing becomesinsufficient in determining a proper RBC match. In very rare

L'incidenza in pazienti falcemici è ancora più alta ed è indiretto rapporto con il numero delle trasfusioni ricevute10.Spesso non viene considerato che il numero delletrasfusioni ricevute ogni anno da questi pazienti èimpressionante. Uno studio condotto in Italia su pazientiβ-talassemici14 ha documentato che ogni soggetto ricevevaogni anno, approssimativamente, 32 unità di concentratieritrocitari (cioè, circa 14,4 litri di sangue), ognunatrasfusione possedendo un potenziale rischio sia diimmunizzazione che di reazioni trasfusionali più o menosevere. Alcuni pazienti (per esempio, i falcemici), qualerisultato di una terapia trasfusionale protratta, divengonocosì pesantemente immunizzati agli antigeni gruppoematicieritrocitari cosiddetti "minori" che le comuni tipizzazionieritrocitarie non sono in grado di individuare emaziecompatibili. In rarissimi casi, l'immunizzazione può esserecosì grave da cointroindicare la terapia trasfusionale10.

Interventi per prevenire l'alloimmunizzazionee le reazioni trasfusionali

Nel corso del tempo, sono stati effettuati diversitentativi per prevenire l'alloimmunizzazione agli antigeninon-ABO e le inerenti reazioni trasfusionali. Il piùimportante è stato l'uso di concentrati eritrocitarileucodepleti per rimuovere i leucociti, altamenteimmunogeni15.

Nonostante la leucodeplezione, le reazioni trasfusionalia specifici antigeni eritrocitari permane tuttora come unproblema di immunologia. Mentre la tipizzazione ABO/RhDè sistematicamente attuata sin dagli anni '40, la saltuariafenotipizzazione degli antigeni eritrocitari non-ABO/RhD,più frequentemente coinvolti, è pratica di queste ultime tredecadi. Comunque, l'utilità di questa politica, molto costosa,

Blood group Blood group Antigenic sites ImmunogenicitySystem Antigen per RBC Risk

ABO A,B 1x106 100ª

Rh D 10,000-35,000 50.00c 37,000-85,000 2.05E 450-25,600 1.69e 13,400-24,400 0.56C 42,000-56,000 0.11

Kidd Jka 14,000 0.07Jkb ? 0.03

Duffy Fya 7,000-13,000 0.23

Kell k 3500 1.50K 6000 5.00

MNS S >12,000 0.04s 12,000 0.03

Table I - Antigenic abundance and relative immunogenicity of selected blood group antigens6

Table II - RBC phenotypes of sickle cell patients and RBC donorpool10

Blood Group Patients Donor P(N =158) (N = 200) Value

Rh-DC 28 68 <0.001E 24 35 <0.01DuffyFya 15 67 <0.001Fyb 11 82 <0.001KellK 2 9 <0.001LewisLeb 45 72 <0.01KiddJkb 39 72 <0.001MNSS 26 55 <0.001

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cases, the alloimmunization may be so severe as tocontraindicate transfusion therapy10.

Clinical interventions for preventingalloimmunization and transfusion reactions

Historically, various interventions have been used inan attempt to prevent alloimmunization and non-ABOtransfusion reactions. The foremost of these is the use ofleukoreduced packed RBCs instead of whole blood thusremoving the highly immunogenic leukocytes15. Despiteleukoreduction, transfusion reactions to RBC specificantigens still remains an immunologic problem. While ABO/RhD typing has been used since the 1940's, the sporadicpractice of phenotyping a few of the more troublesomenon-ABO/RhD antigens has been in place for only the last3 decades. However, the utility of this expensive practice ishotly debated as, even with subtyping, a significant risk ofalloimmunization remains16.

Evaluating a patient's serum for the presence of anti-RBC antibodies has also been attempted for individualsidentified as at risk of alloimmunization or transfusionreactions17. Antibody screening tests typically involvesevaluating the patients serum against 2-3 reagent RBCs(screening cells) selected for the presence of the mostcommonly encountered and clinically important (i.e.,immunogenic) minor RBC antigens. These antigens include:D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, andJkb. Other blood group antigens can also be included whenparticular at risk populations are identified (e.g., U - relativelycommon in patients of African descent, Vel-, Yta-). However,even antibody screening assays do not identify patientsalloimmunized to the less common RBC antigens nor doesit prevent primary immunization.

Hence, despite the perception of blood transfusions asa mature (a polite term for boring) medical procedure,transfusion medicine has considerable opportunities forenhancements in safety and efficacy. Furthermore, there isa significant need for improved therapeutic interventionby which alloimmunization can be prevented or, in caseswhere patients are already allosensitized, for RBC productsthat can still be used despite pre-existing antibodies.

Stealth erythrocytes - Immunocamouflageof cells via membrane grafting of mPEG

To this end, we have pioneered the use ofimmunocamouflage of red blood cell membranes as a meansto diminish/abrogate the inherent immunogenicity andantigenicity of RBCs18-28. The immunocamouflage of cells

viene pesantemente messa in discussione, dato che rimanecomunque alto il rischio di immunizzazione16.

Anche lo studio del siero del ricevente per individuarela presenza di anticorpi antieritrocitari rappresenta untentativo per identificare soggetti a rischio di immunizzazionio di reazioni trasfusionali17. Lo studio si esegue cimentandoil siero del paziente con 2-3 campioni di emazie test scelteper la presenza degli antigeni eritrocitari più frequentementein causa: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P

1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb,

Jka e Jkb. Anche altri antigeni possono essere inclusi,quando si identificano particolari popolazioni a rischio (peresempio, soggetti U-negativi di discendenza africana, Velo Yta negativi). Comunque, anche la ricerca di anticorpinon identifica i riceventi alloimmunizzati ad antigenieritrocitari meno comuni né è in grado di prevenire unaalloimmunizzazione.

Perciò, nonostante la sensazione che la trasfusione siauna pratica medica assolutamente tranquilla (eufemismoper "noiosa"), la Medicina Trasfusionale può contemplarenumerose opportunità per aumentarne sicurezza ed efficacia.Inoltre, è necessario migliorare gli interventi per prevenirel'immunizzazione o per fornire emazie che possono esserecomunque impiegate anche in soggetti già sensibilizzati.

Emazie mascherate: camuffamento immuneper incorporazione di mPEG alla membranaeritrocitaria

A tale scopo, noi abbiamo utilizzato, per primi, ilmascheramento immunologico della membrana eritrocitaria,quale mezzo in grado di diminuire o abolire immunogenicitàe antigenicità delle emazie.18-28. Il mascheramento immuneviene prodotto attraverso l'incorporazione di mPEG (metil-Poli-Etilen-Glicole) alla membrana di globuli rossi intatti. Laformula strutturale dell'mPEG è CH

3-(CH

2CH

2)n-CH

2CH

2OH,

il cui terminale idrossilico è in grado di favorire il legame diun gruppo chimico che viene poi utilizzato per modificareproteine, carboidrati e lipidi29. Dato importante, l'unionedell'mPEG alle proteine non le denatura né impedisce illegame o il catabolismo di piccole molecole ma esclude,respingendole, le grosse molecole30-32.

Inoltre, i lavori pionieristici del gruppo di Abuchowskia metà degli anni '70 (e, poi, di altri) hanno dimostrato che leproteine legate al PEG presentano un'aumentata solubilità,una maggior longevità vascolare e, soprattutto, unadiminuita immunogenicità33-38. Basandoci sugli effettiprodotti dal PEG a carico di proteine purificate, abbiamoiniziato ricerche per determinare se cellule intatte potevanoessere trattate con PEG e mantenere nella norma struttura,funzioni e vitalità, mentre venivano attenuate le pertinenti

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is produced by the covalent grafting ofmethoxypoly(ethylene glycol) [mPEG] to the membranesurface of intact cells. The basic chemical structure of mPEGis CH

3-(CH

2CH

2O)

n-CH

2CH

2OH, where the terminal

hydroxyl group is available for attachment of a chemicallinker group which is then used to modify proteins,carbohydrates or to attach a lipid moiety29. Importantly,the grafting of mPEG to proteins does not result indenaturation or prevent the approach, binding, orcatabolism of small molecules but does exclude/repel largemolecules30-32. Moreover, pioneering work by Abuchowskiin the mid-1970's demonstrated that PEG-conjugatedproteins exhibited improved solubility, vascular longevityand decreased immunogenicity33-38. Based on the effectsof pegylation of purified proteins, we initiated studies todetermine if intact cells could be pegylated and retain normalstructure, function and viability, while attenuating theinherent antigenicity and immunogenicity of theantigenically challenged RBCs (Figure 1)18-28.

Biophysically the grafted mPEG confers itsimmunoprotective effect due to the rapid mobility andmolecular flexibility of the heavily hydrated PEG chains.As shown in figure 2, rigid linear molecules lack anysignificant radius of gyration (R

g) resulting in poor or absent

camouflaging (A) of membrane antigens. In contrast, whilemethoxypoly(ethylene glycol) is a linear molecule, it has ahigh degree of intra-chain flexibility due to the repeating,highly mobile, ethoxy units. Based on this intra-chainmobility, its R

g is very close to its linear length. As a result

of this intra-chain mobility as well as the heavy hydrationof the polymer chain itself, the grafted mPEG stericallyoccludes a large three dimensional (3D) volume (B) givingrise to the immunocamouflage of membrane proteins andcarbohydrates ("antigens" in figure 2). Hence, theimmunological efficacy of the grafted mPEG brush borderis dependent upon four major determinants: presence oftarget residues for grafting; density of polymer grafting;the length of the polymer chain; and the topography of themembrane surface itself.

The first two determinants, targeting sites and polymerdensity, are closely inter-related. To chemically graft mPEGto the membrane of cells, several different linker chemistries(i.e., glues) can be used which target proteins,carbohydrates or directly insert mPEG into the membranevia lipid tails24,25,27. Of these potential methodologies, themost commonly used technique is to modify proteinresidues; in large part due to the knowledge gained fromthe pegylation of the proteins used in enzyme replacementtherapy. To date, we have employed a number of differentlinker chemistries including: cyanuric chloride- (CmPEG),

antigenicità e immunogenicità dei globuli rossi trattati(Figura 1)18-28.

Dal punto di vista biofisico, l'assorbimento dell'mPEGconferisce il suo effetto immunoprotettivo alla rapidamobilità e alla flessibilità molecolare delle catene di PEGaltamente idratate. Come mostrato in figura 2, le molecolerigidamente lineari non posseggono una capacità dirotazione radiale (R

g) significativo, il che porta a modesti o,

addirittura, ad assenti camuffamenti (A) degli antigeni dimembrana. Al contrario, l'mPEG, pur molecola lineare, haun alto grado di flessibilità intracatene per la presenza diripetuti etossi-radicali altamente mobili. Data la flessibilitàintracatene, il suo R

g è molto vicino alla sua lunghezza

lineare. Come risultato di tale mobilità intracatene nonchédella notevole idratazione delle sue catene polimeriche,l'mPEG incorporato occlude stericamente grandi volumi (B)tridimensionali (3D), dando origine al camuffamento immunedi proteine e di carboidrati della membrana (antigens, infigura 2). Quindi, l'efficacia immunologicadell'incorporazione del guscio di mPEG dipende da quattroprincipali determinanti: presenza di residui-bersaglio perl'incorporazione; densità del polimero che si impianta;lunghezza delle catene polimeriche; topografia dellamembrana stessa.

I primi due determinanti citati, cioè residui-bersaglio edensità polimerica, sono strettamente interconnessi. Perinnestare chimicamente l'mPEG alla membrana cellularepossono essere utilizzati svariati prodotti chimici leganti(per esempio, le colle), che si collegano a proteine ecarboidrati o inseriscono direttamente il PEG attraverso leterminazioni lipidiche24,25,27. Di tutte le metodologie, quellapiù comunemente impiegata è la modificazione dei residuiproteici, in larga parte derivata dalla conoscenze acquisitecon il trattamento di proteine con PEG, metodo che si utilizzanella terapia enzimatica sostitutiva. Attualmente, usiamoun certo numero di differenti leganti chimici, compresi: ilcloruro di cianuro (che produce CmPEG), ilbenzotriazolilcarbonato (BTCmPEG), l'mPEG attivato conN-idrossisuccinimidilestere (SPAmPEG) e l'mPEG trattatocon tresilcloruro (TmPEG)24,27.

Tutti questi leganti chimici hanno come bersaglio iresidui di lisina e possono essere usati a pH fisiologici(<8,2). Come abbiamo documentato in precedenza conemazie umane e murine, BTCmPEG, SPAmPEG e CmPEGdimostrano eguale efficienza nelle modificazioni molecolarie nel mascheramento immune27. Al contrario, il TmPEGmodifica scarsamente le emazie e, quando utilizzato sucellule nucleate, si dimostra tossico25. Invece,l'incorporazione degli altri tipi di mPEG agli eritrociti, allecellule mononucleate del sangue periferico e a quelle delle

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Figure 1 - Covalent grafting of mPEG to the RBC membrane must yield a functionally and structurally normal cell characterized bynormal (or near normal) in vivo survival and reduced immunogenic and antigenic potential. Similarly, the modified cellsmust exert minimal toxicity to the recipient

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Figure 2 - Mechanism of immunocamouflage. As shown, rigid linear molecules have a small radius of gyration (Rg) and fail to

effectively camouflage (shaded area, a and b) cell surface proteins and carbohydrates ("antigens"). In contrast, the linear,but highly flexible, mPEG polymer yields a large zone of steric occlusion (shaded areas c and d). As noted, theimmunocamouflaged area effectively covers membrane antigens. The size of the area of protection is dependent up on thelength (L) of the polymer and its resultant R

g

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1-benzotriazolylcarbonate (BTCmPEG), N-hydroxysuccinimidyl ester (SPAmPEG) activated mPEG andtresylchloride mPEG (TmPEG)24,27. All of these linkerchemistries target lysine residues and can be used atphysiologically viable pH (<8.2). As we have previouslydocumented with human and murine cells, BTCmPEG,SPAmPEG, and CmPEG all demonstrate similar efficacy inderivatization and immunocamouflage27.

In contrast, the TmPEG only poorly derivatized RBCsand, when used on nucleated cells, proved to be quitetoxic to cells25. In contrast, the grafting of the other mPEGspecies to RBCs, peripheral blood mononuclear cells(PBMC) and pancreatic islets did not adversely affect cellstructure, function, or viability at immunoprotectivelevels23,25,28.

A third factor governing the efficacy ofimmunocamouflage is the length of the polymer itself. Thepolymer size and shape (e.g. side chains) will govern theR

g of the grafted chain and it is the combination of polymer

density and the Rg that primarily mediates the

immunocamouflage. Interestingly, polymer length alsoinfluences in vivo viability with longer polymers providingboth better immunocamouflage and improved circulatorylifespans in murine models21,24,27. Finally, the topographyof the membrane and surface antigens themselvesinfluences the efficacy of the immunocamouflage. As wehave previously demonstrated, RBC antigens close to themembrane surface such as RhD are readily camouflagedwhile antigen that extend far off the surface (e.g., Jka) areless effectively camouflaged with the lower molecularweight mPEG polymers27.

Importantly, the grafted mPEG also provides a meansby which appropriately modified (i.e., attenuatedimmunogenicity) RBCs can be separated from unmodifiedor under-modified (i.e., immunogenic) RBCs. Thisseparation and purification of the mPEG grafted cells isaccomplished using a two-phase partitioning system ofDextran and polyethylene glycol27.

Unmodified RBCs preferentially partition to the Dextranor interface region of the two phase partitioning systemwhereas pegylated RBCs preferentially partition to the PEGrich phase. As shown in figure 3, the isolation of thepegylated cells is governed by the ratio of PEG:Dextranseparation media (A), the density of grafted PEG (B), andthe size of the polymer bound to the RBCs24,27. As noted,less than 2% of 51Cr labeled control cells are found in thePEG layer whereas >97% of cells derivatized with 2.5 mMCmPEG are found in the PEG layer. The PEG layer is readilyremoved and the cells can then be recovered via simple

isole pancreatiche non altera struttura, funzioni e vitalità ditali elementi23,25,28.

Un terzo fattore che determina l'efficacia delcamuffamento immune è la lunghezza dei polimeri.Dimensione e forma (per esempio, presenza di catene laterali)dei polimeri regolano l'R

g della catena incorporata ed è la

combinazione fra la densità dei polimeri e l'Rg che medierà,

in prima istanza, il mascheramento immune. Datointeressante, la lunghezza dei polimeri influenza la vitalitàin vivo, poiché i polimeri più lunghi assicurano un migliorcamuffamento e una miglior sopravvivenza in circolo nelmodello murino21,24,27. Infine, anche la topografia dellamembrana cellulare e le caratteristiche degli antigeni disuperficie influenzano l'efficacia del mascheramento. Comeabbiamo precedentemente dimostrato, gli antigenieritrocitari più prossimi alla membrana, quale l'RhD,vengono prontamente mascherati con i polimeri di mPEG abasso peso molecolare, mentre gli antigeni che si sporgonodalla superficie (per esempio, l'Jka) lo sono menoefficacemente.

Altro elemento importante, l'mPEG incorporato fornisceanche un mezzo mediante il quale le emazie correttamentemodificate (ad attenuata immunogenicità) si possonoseparare da quelle non modificate o scarsamente modificate.La separazione e la purificazione dei globuli rossi con mPEGsi ottiene con un sistema di suddivisione a due fasi conDextran e PEG27. Gli eritrociti non modificati si associano alDextran o all'interfaccia, mentre quelli con mPEG siassociano alla fase ricca di polietileglicole. Come sievidenzia in figura 3, l'isolamento delle emazie con PEG èregolato dal rapporto PEG:Dextran nel mezzo (A), dalladensità del PEG incorporato (B) e dalle dimensioni delpolimero legato ai globuli rossi24,27. Come si può notare,meno del 2% delle cellule di controllo marcate con 51Cr siritrovano nello strato con PEG, dove si rinviene oltre il 97%delle cellule trattate con CmPEG 2,5 mM. Lo strato con PEGsi può prontamente rimuovere e le cellule possono esserericuperate con un semplice lavaggio. Dato rilevante, glistudi nel modello murino hanno dimostrato che questaprocedura non altera la sopravvivenza degli eritrociti invivo27. Infine, usando questa metodica e modificando ilrapporto PEG:Dextran, è possibile purificare la popolazionedi eritrociti con PEG entro una definita, stretta gamma dimodificazione (C). È possibile ottenere ciò raccogliendo,per primo, lo strato con PEG che contiene le emaziemodificate e, poi, variando il rapporto PEG:Dextran,raccogliendo l'interfaccia, con ciò escludendo le emazie chepossono aver subito una modificazione eccessiva ed esserestrutturalmente e funzionalmente alterate.

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washing. Importantly, murine studies have demonstratedthat this purification procedure does not adversely affectRBC survival in vivo27. Finally, by using this method andadjusting the PEG:Dextran ratios, it is possible to purify apegylated RBC population within a defined narrow rangeof derivatization (C).

This is accomplished by first collecting the PEG layercontaining the mPEG-modified cells and then, using asecond PEG:Dextran ratio, collecting the interface regionthereby excluding RBCs that may be over pegylated andstructurally and functionally impaired.

Conseguenze strutturali e funzionalidell'incorporazione di mPEG agli eritrociti

Il processo di modificazione di per sé non determina lisisignificativa degli eritrociti trattati né altera la loro morfologiaa livello del polimero integrato18-20. In realtà, la lisi è identicanei controlli (<1%) impiegando un trattamento concaratteristiche protettive (cioè, 5 mMol/L) e le emaziemodificate sono indistinguibili da quelle di controllo perquanto riguarda volume, contenuto in Hb, morfologia almicroscopio elettronico (Tabella III e Figura 4)19,20,22. Inoltre,

Figure 3 - A two phase partitioning system of Dextran and PEG is used for the separation of PEG-modified from unmodified, orpoorly modified cells. Panel A: Shown is a general schematic for a biphasic solution of Dextran (~ 500 kDa) and PEG(~8 kDa). Line A represents the phase separation line. The relative PEG or Dextran phase size is a function of this ratioas shown by the 3 test tubes in Panel A. Panel B: Unmodified cells preferentially partition to the Dextran or interfaceregion. The partitioning experiment in Panel B consisted of 0.75 mL of each of the Dextran (4.6%) and PEG (3.3%) phasesand 10 µL of 51Cr-labeled RBCs at 3.3 x 108 cells/mL. Panel C: The partitioning of pegylated cells via the two phasesystem is governed by the ratio of PEG:Dextran43. This allows for purification of cells with light (1), medium (2), orheavy (3) levels of derivatization (also shown in panel A)

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Structural and functional consequences ofmPEG grafting to RBCs

Importantly, the derivatization process itself does notlead to significant RBC lysis or altered RBC morphology atimmunoprotective levels of polymer grafting.18-28. Indeed,RBC lysis was identical to control cells (<1%) atimmunoprotective levels of derivatization (e.g., 5 mMol/L)and are morphologically indistinguishable from the controlcells as evidenced by cellular characteristics such as cellvolume, hemoglobin content, and scanning electronmicroscopy (Table III and Figure 4)19,20,22. Furthermore, assuggested by the normal RBC morphology, cation content(K+, Na+ and Mg2+) were unaffected following derivatizationand membrane pump activities were normal (Table III)22.This later point is important, since alterations in anion andcation homeostasis would likely result in impaired structuralstability and a rapid loss of viability within the circulation.The structural stability of the modified cells is furthersubstantiated by the virtually identical osmotic fragilitycurves of control and mPEG-modified RBC as well as normaldeformability profiles as assessed by ektacytometry(Table IV)20,22. Finally, as would be expected by theextracellular location of the grafted mPEG, Jeong and Byundemonstrated that the oxygen equilibrium curves ofpegylated RBC were physiologically normal39.

Interestingly, the grafted mPEG also influences cell-cellinteraction22,27. In vivo RBCs self-aggregate to formrouleaux (stacked RBCs) and, in effect, travel as smalloxygen freight trains. Rouleaux formation itself is mediatedby charge-charge interactions with individual RBCs beingstacked by interaction with serum fibrinogen forming a(RBC-fibrinogen-RBC-fibrinogen-)

n rouleaux. This

rouleaux formation underlies both the sedimentation rateof RBCs and plays an important role in blood viscosity. Ascan be seen in figure 4, mPEG grafting prevents normalrouleaux formation and consequent to this decreases boththe low shear blood viscosity and the RBC sedimentationrate27. Indeed, as shown in an excellent study by Armstronget al.40, blood viscosity is dramatically reduced under lowshear conditions (Figure 5); a finding that may havesignificant beneficial clinical utility. Also shown in figure 5(insert) is the effect that the loss of rouleaux formationhas on the RBC sedimentation rate where a CmPEG dose-dependent decrease in the sedimentation rate is noted.27

Indeed, at higher derivatization dosages an almost completeloss of sedimentation is noted even after 5 hours.

The mechanism underlying the loss of rouleauxformation is the camouflaging of membrane surface charge

come predetto dalla normale morfologia eritrocitaria, ilcontenuto in cationi (K+, Na+ e Mg2+) non subiscemodifiche dal trattamento e le attività della pompa disuperficie è normale (Tabella III)22. Quest'ultimo dato èimportante poiché i danni alla omeostasi di anioni e cationipossono determinare alterazioni nella stabilità strutturale econdurre a una rapida perdita di vitalità in circolo. La stabilitàstrutturale delle cellule trattate è ulteriormente confermatadalle curve di fragilità osmotica virtualmente identiche nelleemazie di controllo e in quelle modificate da mPEG edegualmente dai normali profili di deformabilità accertatimediante indice di diffrazione laser o ectacitometria (TabellaIV). Per finire, come ci si poteva attendere dalla localizzazioneextracellulare dell'mPEG incorporato, Jeong e Byun hannodimostrato che le curve di equilibrio di O

2 delle emazie

trattate con PEG sono fisiologicamente normali39.È interessante segnalare che l'mPEG introitato influenza

anche le interazioni fra cellule22,27. In vivo le emazie tendonoad aggregarsi per formare impilati (eritrociti a pila di monete)e, in realtà, lavorano come un piccolo treno merci chetrasporti O

2. La formazione di impilati è mediata da interazioni

con il fibrinogeno (emazie-fibrinogeno-emazie-fibrinogeno)per cariche elettriche diverse. La formazione di impilatiinfluenza anche la velocità di sedimentazione eritrocitaria egioca un ruolo importante nella viscosità sanguigna. Comesi può osservare in figura 4, l'incorporazione di mPEGimpedisce la normale formazione di impilati e, diconseguenza, fa diminuire sia la viscosità ematica incondizioni di basso flusso laminare che la VES. Comedimostrato da Armstrong et al.40 in un eccellente lavoro, laviscosità ematica è drammaticamente diminuita in condizionidi basso flusso laminare (Figura 5), reperto che può rivestireun notevole utilità clinica. In figura 5 (inserto) viene anchemostrato l'effetto che la perdita di formazione di impilati hasulla VES, la cui diminuzione è in diretto rapporto con ladose di CmPEG27. A dosi più alte, la quasi totale perdita disedimentazione permane anche dopo 5 ore.

Il meccanismo alla base della perdita di capacità diformare impilati è in relazione al mascheramento delle carichedi superficie da parte del guscio di polimeri altamente idratatie neutri. Ciò è stato documentato per la prima volta daScott et al.24 impiegando l'elettroforesi parcellare (Figura6). Nello studio è stato osservato che l'incorporazione dimPEG alla membrana eritrocitaria determina unadiminuzione, dose-dipendente, della mobilità elettroforeticadelle cellule modificate. Come si osserva nella figura 6A, lamobilità elettroforetica degli eritrociti modificati è diminuita,in maniera significativa, con l'uso di tutti i polimeri e i legantichimici esaminati. Inoltre, quando le emazie venivano

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Figure 4 - Shown are scanning electron micrographs (upper panels) and photomicrographs rouleaux formation (lower panels) ofcontrol and cmPEG-modified RBCs (1.2 mM). Data presented is modified from Scott et al,20 and Bradley et al.24,27

Table IV - Ektacytometric analysis of mPEG-derivatized RBC

CmPEG Derivatization Concentration

Control 0.6 mM 1.2 mM 2.4 mM 5 mM Normal ± SD

0min

144.4 144.4 144.4 144.4 144.4 139.8 ± 16DI

max0.44 0.41 0.39 0.39 0.34* 0.45 ± 0.08

0hyp.

405.6 408.3 393.1 391.7 397.2 405.8 ± 18.3

* Significantly different (p < 0.05) from Control

Table III - Effect of mPEG-derivatization on human RBC indices (N=3). RBC were derivatized with 0, 1.2 and 5 mM cyanuricchloride activated methoxypoly(ethylene glycol) at 4°C for 30 minutes in PBS (pH 9.2)

mPEG Concentration

Control pH Control 1.2 mM 5.0 mM

MCV (fL) 83.7 ± 0.6 83.7 ± 1.5 83.7 ± 0.6 83.7 ± 0.6MCH (pg) 29.7 ± 1.2 29.0 ± 1.0 30.3 ± 0.6 29.0 ± 0.0MCHC (g/dL) 35.4 ± 14.0 34.7 ± 1.7 36.1 ± 6.1 34.8 ± 4.0Potassium (mmol K+/l RBC) 90.5 ± 3.5 87.4 ± 5.0 83.9 ± 4.4 81.8 ± 3.5Sodium (mmol Na+/l RBC) 16.0 ± 1.4 19.3 ± 0.1 19.6 ± 0.8 23.7 ± 0.6*Magnesium (mmol Mg2+/l RBC) 2.1 ± 0.1 2.0 ± 0.1 2.0 ± 0.0 2.0 ± 0.0

* p < 0.05 in comparison to saline injected animals

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Figure 5 -Shown are scanning electron micrographs and photomicrographs rouleaux formation of control and cmPEG-modifiedRBCs (1.2 mM). Viscosity data was modified from Armstrong et al.40. RBC sedimentation data is modified from Bradleyet al.27

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by the heavily hydrated and neutral polymer brush border.This finding was initially demonstrated by Scott et al. usingparticle electrophoresis (Figure 6)24. This study observedthat mPEG grafting to the RBC membrane resulted in thedose-dependent decrease in the electrophoretic mobilityof the modified cell. As a shown in figure 6A, theelectrophoretic mobility of the modified RBCs issignificantly diminished with all the polymers and linkerchemistries tested.

Furthermore, when RBCs were modified using the 20kDa polymer, the electrophoretic mobility was completelylost at very low grafting concentrations27. It is consequentto the camouflaging of cell surface charge, that cell-cell (aswell as protein-protein) interactions (which are mediated,at least in part, by charge interaction) are effectively impairedby cellular pegylation (Figure 6B). Subsequent studies byourselves and others have further delineated the effects oflinker chemistry, polymer size and polymer shape on thecharge camouflage and, potentially, enhanced surfacedrag24,27,40 ,41.

In vivo viability of stealth RBCs

Initial studies on mPEG-modified murine RBCsdemonstrated that, at low levels of derivatization, no lossof in vivo viability was note.19-22. Furthermore, Murad et al.demonstrated that mice hypertransfused with pegylatedRBCs, such that >85% of their RBC mass were pegylatedcells, exhibited normal weight gain, activity, and nodifference in morbidity and mortality22. Similarly, no grossdifferences in organs (heart, liver, and spleen) were noted.However, Murad et al. also demonstrated that the higherlevels of mPEG-grafting necessary to immunocamouflageimportant RBC antigens such as RhD on human cellsresulted in a significant decrease in the in vivo viability ofsimilarly treated murine cells22.

This adverse finding was subsequently found to be arelated to the shorter 5 kDa polymer chain used in theseearlier studies. Subsequent work by Chen et al. and Bradleyet al. using RBC grafted with 20 kDa polymers demonstratednormal in vivo survival of the murine cells atimmunoprotective levels of grafting (e.g., 2 mM; Figure7)25,27.

Hence, these data suggest that grafting of mPEG to themembrane surface yields structurally sound cells thatexhibit normal in vivo viability leaving the question ofwhether the antigenicity (i.e., recognition by preformedantibodies) and immunogenicity (immunorecognition withthe de novo synthesis of new antibodies) are attenuated.

modificate utilizzando polimeri a peso molecolare di 20 kDa,tale mobilità era completamente perduta, anche a basseconcentrazioni di incorporante27. Conseguenza delmascheramento delle cariche di superficie, le interazionicellula-cellula (così come quelle proteina-proteina), chemediate, almeno in parte, da interazioni fra cariche elettriche,vengono effettivamente alterate dal trattamento con PEG(Figura 6B). Studi successivi, condotti da noi e da altri,hanno ulteriormente sottolineato il ruolo dei leganti chimicie della dimensione e forma dei polimeri sul mascheramentodella carica di superficie e, in potenza, sulla intensificazionedel camuffamento24,27, 40, 41.

Vitalità in vivo delle emazie trattate con PEG

I primi studi sugli eritrociti murini hanno dimostratoche, a livelli bassi di modificazione, non si nota alcuna perditadi vitalità in vivo19,22. Inoltre, Murad et al.22 hannodimostrato che topi ipertrasfusi con emazie trattate conPEG, in quantità tale che oltre l'85% della massa eritrocitariaera costituita da globuli rossi modificati, manifestavanonormali aumenti di peso, normale attività e nessunadifferenza per quanto riguarda incidenza di malattie omortalità. Egualmente, non si notavano differenzeimportanti negli organi (cuore, fegato e polmoni). Tuttavia,gli stessi Autori dimostravano anche che l'uso di alti livellidi mPEG, quali quelli necessari al mascheramento su emazieumane di antigeni importanti, come l'RhD, determinava unasignificativa diminuzione della vitalità in vivo delle emaziemurine così trattate22. È stato, poi, accertato che tali effettinegativi erano correlati alla catena polimerica più corta (5kDa) utilizzata in queste vecchie ricerche. I successivi lavoridi Chen et al.25 e di Bradley et al.27su emazie mascheratecon polimeri di 20 kDa hanno documentato una normalesopravvivenza in vivo delle emazie murine trattate a unlivello immunoprotettivo (cioè, a 2mM; Figura 7). Quindi,questi dati fanno ipotizzare che il trattamento dellamembrana eritrocitaria con mPEG mantenga strutturalmentesane le cellule, lasciando aperto il problema se ilriconoscimento da parte di anticorpi preformati el'immunogenicità (cioè lo stimolo alla sintesi ex novo dianticorpi) vengano attenuati.

Mascheramento immune: di più è meglio

Come discusso più sopra, il grado di mascheramentoimmune è regolato sia dalla densità che dalla lunghezza deipolimeri che vengono incorporati. La densità del guscio dipolimeri viene determinata dalla concentrazione dell'mPEG

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Figure 6 - Covalent attachment of mPEG significantly reduces RBC electrophoretic mobility. Mobility loss is mediated by thecamouflage of the inherent surface charge of the RBC and the increased drag arising from the grafted PEG polymers.Electrophoretic mobility was determined on a Rank Mark I electrophoresis apparatus equipped with a horizontalmicroscope with a water immersion lens. RBC (10/sample) were chosen randomly and manually timed to determine theirvelocity. The electrophoretic mobility = velocity of the particle (µm/sec)/ electric field strength (E) in volt/cm (where E =voltage/distance between the electrodes). Data modified from references 24 and 27

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Figure 7 - Derivatization of mouse RBCs with BTC-mPEG yields normal in vivo survival at grafting concentrations >2 mM. RBCsurvival was determined by labeling cells with PKH-26 and following cohort survival over 50 days. Each transfusionapproximated 8-10 percent of the total mouse RBC mass. Data modified from references 25 and 27

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Immunocamouflage: big is better

As previously discussed, the degree ofimmunocamouflage is dictated by both the density ofgrafting and the length of the grafted polymer. The densityof the polymer brush border is primarily determined by thederivatization concentration of the activated mPEG and theefficacy of the linker chemistries used. As shown in figures6 and 8, similar grafting efficacies are achieved over a broadrange of molar concentrations using differing three differentlinker chemistries which all target surface lysine residues27.As shown in figure 6, both BTCmPEG and SPAmPEGsimilarly modified the electrophoretic mobility of the graftedcells when using both the 5 and 20 kDa polymers. Similarresults were observed when the modified cells were purifiedusing the two-phase partitioning system. As shown infigure 8, the CmPEG, BTCmPEG and SPAmPEG all yieldedcomparable partitioning profiles. In contrast, a fourth lysinedirected linker chemistry, tresylated mPEG, was observedto only poorly derivatize cells and failed to protect againstantibody-mediated RBC agglutination (Figure 8)25.Furthermore, in studies not shown here, TmPEG was foundto be highly toxic to nucleated cells due to its trifluoroleaving group25. Hence, these data demonstrate that forthe CmPEG, BTCmPEG and SPAmPEG, the primary factordetermining the degree of immunocamouflage is thederivatization concentration and the size of the graftedmPEG polymer.

As predicted by the polymer size the larger mPEG chainsare the most effective in mediating the immunocamouflageof RBCs. As demonstrated in figure 6, the 20 kDa polymersmost effectively camouflaged cell surface charge yieldinga neutral brush border around the cell. The potential effectof this brush border is an impairment of receptor-ligand orantibody-antigen interactions which are mediated, at leastin part, by charge:charge interactions. Furthermore, thelarger polymers also improved the in vivo survival of murinecells at immunoprotective levels of derivatization (Figure7) and do not adversely affect human RBCs in vitro25,27.

Immunocamouflage: how stealthy are stealthcells

Studies by four independent research laboratories havedemonstrated that the covalent grafting of mPEG to theRBC membrane significantly diminishes and or blocks theantibody-mediated recognition of both the major (ABO/RhD) and minor (non-ABO/RhD) blood group antigens aswell as antigenic determinants on other cell types18-28,39,40,42.

attivato e dall'efficienza dei leganti chimici utilizzati. Comesi osserva nelle figure 6 e 8, efficienze similari diincorporazione si ottengono, in un'ampia serie diconcentrazioni molecolari, utilizzando tre differenti legantichimici, tutti indirizzati verso i residui di lisina presenti sullasuperficie cellulare27. In figura 6, sia BTCmPEG cheSPAmPEG modificano, in modo analogo, la mobilitàelettroforetica delle cellule trattate con polimeri sia di 5 chedi 20 kDa. Eguali risultati si osservano quando le cellulemodificate vengono purificate utilizzando il sistema disuddivisione in due fasi precedentemente citato. Come sinota in figura 8, sia CmPEG, che BTCmPEG, che SPAmPEGpresentano tutti profili di separazione paragonabili fra loro.Al contrario, un quarto legante chimico sempre direttocontro i residui di lisina, il TmPEG (mPEG trattato contresilcloruro), modifica solo scarsamente le cellule e nonprotegge contro l'agglutinazione eritrocitaria indotta daanticorpi (Figura 8)25. Per di più, il TmPEG, in ricerche nonpresentate qui, si è dimostrato altamente tossico per lecellule nucleate, in rapporto ai suoi residui di trifluorurati25.Tutti questi dati dimostrano, quindi, che, per CmPEG,BTCmPEG e SPAmPEG, il principale fattore determinante ilgrado di mascheramento riguarda concentrazione edimensioni dei polimeri di mPEG incorporati.

Come previsto, le catene di mPEG maggiori sono le piùefficaci a determinare il camuffamento degli eritrociti. Lafigura 6 dimostra che i polimeri di 20 kDa sono i più efficientinel mascherare le cariche di superficie formando un guscioneutro intorno alla cellula. L'effetto di questo guscio è unpeggioramento nelle interazioni legando-recettore oantigene-anticorpo, attraverso interazioni carica:carica.Inoltre, i polimeri di maggior dimensione migliorano, a unlivello protettivo di modifica, la sopravvivenza in vivo delleemazie murine e non influenzano negativamente le emazieumane in vitro25,27.

Camuffamento immune: quanto sonomascherate le cellule modificate?

Le ricerche di quattro laboratori indipendenti hannodimostrato che l'incorporazione covalente di mPEG allamembrana eritrocitaria diminuisce in maniera significativao blocca il riconoscimento immune da parte di anticorpi siadegli antigeni gruppoematici maggiori (ABO/RhD) che diquelli minori (non ABO/RhD), così come quello di alcunideterminanti antigenici su altri tipi di cellule18-28,39,40,42. Ciò èchiaramente illustrato in figura 9, dove si osserva ildecremento, dose-dipendente, dell'agglutinazione ABO/RhD indotto dall'mPEG. Sfortunatamente, utilizzando i

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Figure 8 - Effect of linker chemistry on aqueous two-phase partitioning of mPEG-modified RBC and antibody-mediated agglutination.Panel A: Shown is the phase partitioning of 5 kDa CmPEG, BTC-mPEG and SPA-mPEG demonstrating the equivalentderivatization of RBCs using the three linker chemistries. RBCs were derivatized as washed cells at a 12% hematocrit for1 hour at room temperature. Symbols show the mean data ± one SD for duplicate samples from 3 independent experiments.Panel B: However, not all linker chemistries are equal. In contrast to the CmPEG, BTCmPEG and SPAmPEG, studieswith tresylated mPEG (TmPEG) demonstrated that it poorly modified RBCs and completely failed to protect againstantibody mediated ABO agglutination even at very high levels of grafting. For comparison, CmPEG grafting completlyblocks anti-ABO agglutination.

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This decrease in antigenic recognition is readily illustratedin figure 9, where a mPEG dose dependent decrease in anti-ABO/RhD agglutination is observed. Unfortunately, usingthe existing derivatization chemistries the level of mPEG-grafting necessary to achieve complete camouflage of theA/B antigens has an adverse effect on RBC stability hencediminishing the immediate prospects of a universal redcell22,26.

In contrast, non-ABO antigens such as RhD are veryeffectively camouflaged (Figure 9B)18-28. Indeed, whengrafted with the 20 kDa mPEG polymer, RhD detectionreaches background levels. Importantly, the effectiveimmunocamouflage of the RhD could positively improveour utilization of an increasingly scarce resource-blood.For example, while type A blood constitutes ~40% of thedonor pool, more than 85% of these individuals are RhD+.Consequently, if an A+RhD

neg individual requires a RBC

transfusion, identification of an appropriate donor is oftenquite difficult as the estimated frequency of an A+RhD

neg

donor is < 6%. This critical supply problem can be greatlyexaggerated in rural areas, trauma wards and following man-made or natural disasters where appropriate donor bloodmay be very difficult to find or in short supply.

While the antigenic modulation of RBCs by mPEGgrafting has been well characterized, the effect of mPEG-derivatization on in vivo RBC immunogenicity has, to date,only been studied in our laboratory20-28. Studies ofxenogeneic, heterogeneic, as well as syngeneic bloodtransfusions in a murine model have demonstrated reducedto absent alloimmunization. As shown in figure 10, Balb/cmice transfused with H-2 disparate C57Bl/6 RBCdemonstrate a significant antibody response(alloimmunization) to the donor cells. As would be expected,this immunological response escalates with subsequentdonor cell transfusions. However, when transfused withpegylated donor cells, the alloimmunization response issignificantly blunted and remains drastically depressedeven after 3 transfusion events (each 14 days apart). Thedecreased immunogenicity of the mPEG-modified RBCs isderived in part by the failure of monocytes to effectivelyphagocytose the foreign cells (Figure 10 insert)20. As weshown, human monocytes fail to engulf sheep RBCderivatized with even very low levels of mPEG. As aconsequence, antigen processing and presentation is likelyaltered leading to the loss of immunogenicity noted in figure1020,23.

The future

In sum, the research done to date suggests that the

composti attualmente a disposizione, il livello di mPEGnecessario per ottenere il mascheramento completo degliantigeni A/B ha effetti negativi sulla stabilità delle emazie,impedendo attualmente la prospettiva di avere eritrociti"universali"22,26.

Invece, gli antigeni non-ABO, come l'RhD, vengonoeffettivamente mascherati (Figura 9B)18-28. In realtà, ilriconoscimento dell'antigene RhD è a livelli bassissimi,quando si incorporano polimeri di mPEG di 20 kDa.L'effettivo mascheramento dell'antigene RhD può migliorarel'impiego trasfusionale in situazioni di scarse riserve disangue. Per esempio, mentre il sangue di gruppo Arappresenta circa il 40% del pool di donatori, più dell'85%di questi è RhD+. Ne consegue, che se un soggetto digruppo A, RhD-negativo necessita di una trasfusione,trovare sangue compatibile può risultare assai difficile datoche soltanto il 6% di donatori A è RhD-negativo. La carenzadi disponibilità diviene ancora più critica nelle aree rurali,nei reparti di traumatologia o ancora in caso di disastrinaturali o di origine umana, allorché rinvenire donatori adattipuò risultare veramente difficile.

Mentre la modulazione antigenica degli eritrociti inseguito all'incorporazione di mPEG è stata bencaratterizzata, gli effetti del PEG sull'immunogenicitàeritrocitaria in vivo sono stati indagati soltanto nel nostrolaboratorio20-27. Gli studi su trasfusioni xenogeniche,eterogeniche e anche singeniche nel modello murino hannodimostrato ridotte o assenti alloimmunizzazioni. Come siosserva in figura 10, topi Balb/c trasfusi con eritrociti C57B1/6 differenti per H-2 si sono dimostrati significativamenteimmunoresponsivi con produzione di anticorpi. Come erada attendersi, la risposta immune aumentava con numerodelle trasfusioni. Tuttavia, quando venivano impiegateemazie trattate con PEG, la risposta immune era moltoattenuata e restava depressa anche dopo 3 trasfusioni(effettuate a distanza di 14 giorni l'una dall'altra). Il calo diimmunogenicità delle emazie modificate con mPEG deriva,almeno in parte, dalla incapacità dei monociti di fagocitareefficacemente le cellule estranee (Figura 10, inserto)20. Comeabbiamo documentato, i monociti umani non ingerisconocellule di pecora trattate anche con bassissimi livelli di mPEG.Viene probabilmente alterato il procedimento di elaborazionee di presentazione dell'antigene, il che porta alla perdita diimmunogenicità segnalata in figura 1020,23.

Il futuro

In conclusione, le ricerche condotte sinora indicanoche il camuffamento immune degli eritrociti del donatorepuò rappresentare uno strumento veramente potente per

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Figure 9 - Derivatization of RBCs with mPEG prevents antibody recognition of major and minor blood group antigens. Theimmunocamouflage is dependent on grafting density (a function of the derivatization concentration) and polymer size.Panel A) mPEG derivatization inhibits microaggregation in a dose-dependent manner as measure by a modified plateletaggregometer. Panel B: grafted mPEG effectively camouflages the human RhD antigen. Anti-RhD was quantitated byflow cytometry using commercial monoclonal (IgM) and polyclonal (IgG) antibodies (Gamma Biological, Houston, TX,USA)

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Figure 10 - Immunogenicity of allogeneic mouse blood is significantly attenuated by mPEG-modification (5 kDa-CmPEG). Mouseserum was collected 14 days following the last transfusion. IgG antibodies were detected by flow cytometry. Mice weretransfused with a blood volume approximating 10% of the total blood volume. Each group contained 8 mice. Shown arethe Mean ± SD. INSERT: Phagocytic uptake of mPEG-sheep RBCs (sRBCs) by human peripheral blood monocyteswas significantly decreased20. Background signal is the spontaneous ingestion of autologous human RBCs

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immunocamouflage of donor RBCs may prove to be a verypowerful tool in preventing alloimmunization and in thetreatment of patients already alloimmunized. Furthermore,research on leukocyte derivatization as well as modificationof donor tissues such as pancreatic islets, demonstratesthat immunocamouflage may have broader utility intransplantation medicine23-25,28. However, the developmentof this potential therapeutic modality still requires morerigorous testing in both animal models and human trialsbefore we can determine its full potential in transfusionand transplantation medicine.

Grant Acknowledgement

This work was supported by the Canadian BloodServices and the Canadian Institutes of Health Research.

prevenire l'alloimmunizzazione o per trattare pazienti giàimmunizzati. Inoltre, gli studi sulla modificazione di leucocitio di cellule dei tessuti, come le isole pancreatiche,dimostrano come tale mascheramento possa avere una piùampia utilizzazione in trapiantologia23-25,28. Tuttavia, losviluppo di questa potenziale modalità terapeutica richiedeancora indagini più rigorose sia in modelli animali che insperimentazioni umane prima di poterne determinare la pienapotenzialità in medicina trasfusionale e in quellatrapiantologica.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Servizio SangueCanadese e dagli Istituti Canadesi di Sanità.

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