Revised 12 Jun 2012 by Tirayut Vilaivan คู่มือการใช้ ... · คู่มือการใช้เครื่อง Varian Mercury+ 400 NMR Spectrometer

Revised 12 Jun 2012 by Tirayut Vilaivan

-1-

คมอการใชเครอง Varian Mercury+ 400 NMR Spectrometer (Jun 2012 revision)

1. การเตรยมตวอยาง 2. แนะน า VNMR, Glide และ ChemPack 3. ตรวจสอบสภาพของเครองกอนเรมตนท างาน 4. การ acquire, process และ plot 1D 1H และ 13C สเปกตรมแบบ automatic 5. การ acquire, process และ plot 2D สเปกตรมแบบ automatic 6. เมอเสรจการทดลอง 7. การ process และ plot 1D และ 2D สเปกตรมแบบ manual 8. การถายเทไฟลขอมลเพอน าไปปรบแตงและพมพบนเครอง PC 9. เครองนท าอะไรไดอกบาง ภาคผนวก 1: จะท าอยางไรดเมอเครอง NMR มปญหา ? ภาคผนวก 2: ค าแนะน าการท า manual lock และ manual shim (เมอ gradient autoshim ไมส าเรจเทานน) รายชอ NMR Staff รศ.ดร.สมใจ เพงปรชา หอง 1514 โทร 87636 กรณฉกเฉนโทร. 086 5888135 ผศ.ดร.ขนษฐา พดหอม หอง 1527/4 โทร 87639 กรณฉกเฉนโทร. 081 3714037 รศ.ดร.ธวชชย ตนฑลาน หอง 1541 โทร 87643 กรณฉกเฉนโทร. 085 1527701 รศ.ดร.ธรยทธ วไลวลย หอง 1340 โทร 87627 กรณฉกเฉนโทร. 083 9868772 TA ประจ าเครอง NMR นายธเนศวร นวลใย (ตอ) หอง 1339 ชน 13 กรณฉกเฉน โทร 081 4449908


-2-

1. การเตรยมตวอยาง (Sample preparation) การเตรยมตวอยางเปนสงส าคญยงยวดแตกลบไมไดรบความใสใจเทาทควร เครอง NMR สมรรถนะสงจะท างานไดไมดเทาทมนพงจะท าไดหากตวอยางทใชไมไดผานการเตรยมอยางถกตอง ดงนนกอนจะเตรยมตวอยางเพอรนบนเครอง NMR 400 MHz พงท าความเขาใจในประเดนตอไปน หลอด NMR ใชหลอด NMR ขนาด 5 mm ชนดมคณภาพดทสด ไมควรใชหลอด NMR ทปากหลอดแตกหรอมรอยราวเนองจากความเสยงตอการแตกของ sample ภายใน probe ตวท าละลาย ตวท าละลายทเหมาะสมคอ CDCl3, DMSO-d6, D2O, CD3CN, CD3OD, CD2Cl2, acetone-d6, pyridine-d5 และ benzene-d6 หากเปนไปไดกรณาหลกเลยงการใชตวท าละลายผสมหรอตวท าละลายอนนอกเหนอจากทระบขางตน เนองจากจะไมสามารถท า Autolock และ Autoshim ได สารตวอยาง สารตวอยางควรจะตองบรสทธปราศจากสงเจอปนอน โดยเฉพาะอยางยงตวอยางส าหรบการทดลอง 13C และ 2D experiments การท าการทดลองทใชเวลานานเหลานกบตวอยางทสกปรกเปนการใชเวลาของเครอง NMR อยางเปลาประโยชน ผลทไดออกมากน าไปใชประโยชนไมได ตารางท 1 ปรมาณสารตวอยางทเหมาะสมส าหรบการทดลองตางๆ (ขอมลค านวณจากมวลโมเลกลประมาณ 300 หากมวลโมเลกลมากกวานใหเพมปรมาณสารตามสดสวน)

การทดลอง ปรมาณทแนะน า ปรมาณต าสด 1H only 1-10 mg 1 mg

13C or 13C-detected experiments and DEPT 20-100 mg 10 mg (นาน !) 31P 20-50 mg 20 mg

2D 1H-detected experiments without 13C 10-20 mg 10 mg 2D 1H-detected experiments with 13C 20-50 mg 10 mg (นาน !)

ปรมาณสารตวอยางทเหมาะสมขนอยกบการทดลองทจะกระท าและมวลโมเลกลของสาร คาทแนะน าเปนดงแสดงในตารางท 1 โดยทวไปแลวหากมสารตวอยางมากพอใหใชสารปรมาณมากทสดทก าหนด อยางไรกตามการใสสารตวอยางเขมขนเกนไปเปนสงไมพงกระท าเนองจากจะท าใหลอกสญญาณดวทเรยมยากและยงท าใหเกด gain overflow ซงท าใหสเปกตรมทไดบดเบยวไปจากความจรงหรออาจไมสามารถรนสเปกตรมไดเลย แตถาหากสารตวอยางเจอจางเกนไปกจะท าใหไดสเปกตรมทม signal-to-noise ratio ไมด เสยเวลาในการสแกนมาก โดยเฉพาะอยางยง 13C และ 2D experiments ใหยดหลกการงายๆ วาความเขมขนทเหมาะสมของสารตวอยางส าหรบการทดลองเหลานคอ 0.1 M ซงเทยบเทากบประมาณ 20 mg ส าหรบสารตวอยางทมมวลโมเลกลประมาณ 300 ทความเขมขนนจะได 13C สเปกตรมทมคณภาพใชไดภายใน 256 สแกน (10 นาท) และ simple 2D experiments เชน HSQC ภายใน 30 นาทถง 1 ชวโมง (นานกวานนส าหรบ NOESY) แตถาหากมสารปรมาณจ ากด ปรมาณสารต าสดทจะท าการทดลองเหลานไดคอ 10 mg ซงจะตองใชเวลาของเครองประมาณ 6 ชวโมงส าหรบการรน 13C (10,000 สแกน !) และ 2D experiments อกการทดลองละประมาณ 2 ชวโมง (นานกวานนส าหรบ NOESY) ดงนนหากสละสารตวอยางไดกรณาใสเพมมาใหอกนด (หากสารมขวมากใช acetone-d6 หรอ CD3OD เปนตวท าละลายจะท าใหเอาสารกลบคนมางายกวา DMSO-d6 แมวาตวท าละลายเหลานจะคอนขางแพง


-3-

แตถาเทยบกบตวอยางอนมคาของทานนบวาเกนคม) หากไมสามารถเพมปรมาณสารตวอยางไดถง 10 mg กอาจตองรอ Nanoprobe (ยงไมไดตดตงใหบรการ) หรอไปใชบรการเครองอนท sensitive กวาน (probe ทเรามอยเปน indirect detection probe ซงจะให sensitivity ทดมากส าหรบโปรตอนและ 2D proton detected experiments ทงหมด และไมคอยดนกส าหรบ 13C และ nuclei อนๆ) เพราะถงจะฝนท าการทดลองไปกจะไมไดขอมลทเปนประโยชนคมคากบเวลาของเครองทเสยไป โปรดระลกไวดวยวาหากตองการให signal-to-noise ratio ดขน n เทาจะตองเพมจ านวนสแกน (และเวลาในการสแกน) เปน n2 เทา ดงนนหากรนคารบอนเกน 10000 สแกนแลวยงไมคอยเหนสญญาณชดเจนกนาจะเตรยม sample ใหมดกวาทจะเสยเวลาสแกนตอไปเพราะหากจะให signal-to-noise ratio ดกวาทเปนอย 2 เทาจะตองสแกนเพมอก 30000 สแกน (ใชเวลากวา 18 ชวโมง) ! การละลายตวอยาง ละลายสารตวอยางตามปรมาณทก าหนดในตวท าละลายปรมาตร 0.6 - 0.7 mL ซงจะไดระดบของตวท าละลายในหลอดสงประมาณ 5 cm หากระดบของตวท าละลายต ากวานอาจท าใหลอกไมส าเรจหรอถงลอกส าเรจกจะท าให sensitivity และ resolution ของเครองลดลงเนองจากการ shim ไมด (รปท 1) หากสารละลายไมหมดเกดเปนตะกอนควรจะกรองผานส าลกอน ดงนนจงควรละลายสารตวอยางในภาชนะอนเชนหลอดไวอลกอนทจะใสลงในหลอด NMR การใสหลอด NMR ใน spinning turbine เสยบหลอด sample ใน spinning turbine ดงรปท 2 ถารสกวาหลวมใหเปลยน spinning turbine หากฝนใชอาจท าใหหลอดแตกในเครองได หากรสกวาฝดแสดงวาดแลวอยาออกแรงดนมากเกนไปเพราะหลอดอาจหกคา sample turbine และบาดมอได ปรบระดบความลกของหลอด sample โดยวดเทยบกบ Sample Depth Indicator (เปนกระบอกโลหะสทอง) อยาใหกนหลอดต ากวาระดบ maximum sample depth mark หากความสงของตวอยางต ากวา 5 cm พยายามปรบใหจดศนยกลางของตวอยางอยภายใน receiving coil (แสดงดวยการแรเงาใน Sample Depth Indicator) เสรจแลวใชกระดาษทชชเชดหลอดดานนอกใหสะอาด หามปรบเปลยนสวนใดๆ ของ Sample Dept Indicator เปนอนขาด

รปท 1 (ซายมอ) ตวอยางสเปกตรมทระดบความสงของตวท าละลาย (จากบนลงลาง) 3, 4 และ 5 cm ตามล าดบ (sample เดยวกน รนใน automatic mode เหมอนกนทกประการ ตวท าละลายคอ CDCl3) รปท 2 (ขวามอ) การใสหลอด sample ใน spinning turbine


-4-

2. แนะน า VNMR, Glide และ ChemPack ซอฟตแวรทท าหนาทควบคมการท างานของเครอง NMR ทงหมดคอ VNMR 6.1C ซงท างานบนระบบปฏบตการ Solaris (เปนระบบปฏบตการแบบ UNIX แบบหนง) บนเครอง NMR Workstation หนาจอของโปรแกรมจะประกอบดวยหนาตางทแบงเปนสวนๆ ดงรปท 3 (ในบางขณะอาจแสดงไมครบทกหนาตางขนกบวาก าลงท างานอะไรอย และบางขณะอาจมหนาตางของโปรแกรมอนเชน Interactive acquisition window เพมขนมาอกกได)

Acquisition Status

window

Graphic window

Text window

/ Tcl-dg window

Glide I nterface

Menu buttonsI nput window

รปท 3 VNMR Display Screen สวนบนสดของจอภาพจะเปน Glide interface ซงเปนสวนทผใชจะตองเกยวของดวยมากทสดส าหรบการรน 1D สเปกตรมทวไป หาก Glide ก าลงท างานอย Input window ดานหลงจะถกบงไว (สามารถเลอนหนาตาง Glide หลบได หรอซอนหนาตาง Glide โดยการคลกปม Glide ทปมเมน [Glide]) สวนกลางของจอภาพทางดานซายมอจะเปน Graphic window ซงใชแสดงและปรบแตงสเปกตรม และสวนลางสดของจอภาพทางดานซายมอเปน Text window ซงจะเปนตวบอกตวแปร (parameter) ตางๆ ของการทดลองปจจบนและใช Set up การทดลองส าหรบ multiple experiments มมบนของจอภาพดานขวามอจะเปน Acquisition status window ซงจะเปนตวแจงขาวสารใหทราบวาเครองก าลงท างานอะไรอย


-5-

การท างานของผใชโดยปกตจะผาน Glide interface หรอ Tcl-dg ("ChemPack") Interface (หนาตางเดยวกบ Text window) นอกจากนยงสามารถท างานแบบ manual หรอ semi-automatic โดยการปอนค าสง (command line) ลงใน Text window โดยตรง หรอโดยผาน menu button ซงจะอยทบรเวณสวนบนของจอภาพ (รปท 4) มลกษณะเปนปมค าสง เมนหลกจะอยในแถวบน ซงปมค าสงทจะใชบอยมรายการดงตอไปน

รปท 4 Menu button ของ VNMR Abort Acq: Abort acquisition หากกดปมนจะหยดการทดลองทนท Glide: เรยก Glide ซงเปนซอฟตแวรทชวยใหท างานแบบอตโนมตขนมาใชงาน Main Menu: เปนเมนหลก ซงจะแบงยอยออกเปนเมนอนๆ ในบรรทดถดลงมาไดแก Workspace, Setup, AcqMenu, ProcMenu, DispMenu, Analyze, File และอนๆ ซงตามปกตในการใชงานในโหมดอตโนมตผาน Glide interface ผใชจะไมคอยไดยงกบเมนเหลานมากนกยกเวนเมน DispMenu เพอใชในการปรบแตงและพมพสเปกตรม (ดในหวขอ 7. การ process และ plot 1D

และ 2D สเปกตรมแบบ manual) Acqi: เมอกดปมน หนาตาง Interactive acquisition window จะปรากฏขนทดานขวามอทางดานลางของจอภาพ ซงเปนหนาตางทจะควบคมการใส sample, การลอก และ shim แบบ manual ผใชสามารถปดหนาตางนโดยการกดปม close และเรยกกลบมาใหมโดยผานเมน Acqi ปจจบนไมจ าเปนตองใชหนาตางนอกตอไปยกเวนเมอเสรจสนการรนและจะใส reference (ดหวขอ 6. เมอเสรจการทดลอง) โปรแกรมอกสวนหนงคอ Tcl-dg ("ChemPack") ซงจะซอนอยกบหนาตาง Text window ขางลาง เปนระบบ automatic อกสวนหนง ซงมความซบซอนมากกวา Glide ทขอบทางดานขวาของหนาตาง Text window จะมปม Submit, Setup Exp, Acq&Obs etc. อย เมอคลกทแตละปมกจะไปทแตละหนาตางซงมรายละเอยดแตกตางกนไป ส าหรบการใชงาน Tcl-dg เพอรน multiple 2D experiments และเทคนคพเศษอนๆ เชน 1D-NOE หรอ water suppression ใหดหวขอ 5 และ 9 อยาออกจากโปรแกรม VNMR หรอเรยกโปรแกรมอนขนมาใชงาน (เชน เลนอนเทอรเนตหรอเกม) โดยไมมเหตอนสมควร ในกรณทสงสยวาเครอง NMR Workstation, NMR Console หรอ VNMR ซอฟตแวรท างานไมปกตใหแจง NMR staff ทนท


-6-

3. ตรวจสอบสภาพของเครองกอนเรมตนท างาน หากผใชงานคนกอนทงเครองไวเปนเวลานาน Screen Saver จะท างานโดยหนาจอจะมดไป ใหขยบเมาสหรอคลก 1 ครง หากเครองถาม password ใหปอนลงไป (คยบอรดจะไมแสดงอาการตอบสนองการกด password) รอสกครจอภาพจะเปนดงรปท 3

เมอเขามาใน VNMR แลวใหตรวจสอบความเรยบรอยของเครอง โดยดท Acquisition status window (ทางมมขวาบนของจอภาพ) ตรง Status (บรรทดแรก) ควรจะเปนค าวา Idle หากเปนอยางอนแสดงวามผรน experiment คางอย ถาผรน experiment ไมไดแจงหมายเหตไวทเครองวาจะใหท าอยางไร ผใชทจองเวลาไวมสทธทจะยกเลกการทดลองโดยกดปม Abort Acq จาก Menu button ไดทนท

รปท 5 Acquisition status window ในสภาพพรอมรบค าสง เมอ Status ของ NMR console ใน Acquisition status window เปน Idle แลวแสดงวาเครองพรอมทจะเรมการทดลองใหมหาก Status ไมเปน Idle หลงจากกดปม Abort Acq หรอหากพบความผดปกตเกดกบเครองใหแจง NMR staff กอนกระท าการใดๆ ทงสน เนองจากขณะนระบบ autolock-autoshim ยงไมท างาน การควบคมการ Load/Eject Sample และการ Lock, Shim จะกระท าผาน acqi window (ดภาคผนวก 2) กอนทจะคลกปม setup ของ Glide


-7-

4. การ acquire, process และ plot 1D 1H และ 13C สเปกตรมแบบ automatic ส าหรบการรน basic 1D 1H และ 13C สเปกตรมจะท าไดสะดวกทสดโดยผาน Glide interface (จรงๆ แลวสามารถรน basic 1D 1H และ 13C สเปกตรมผาน Tcl-dg interface เชนเดยวกน แตเนองจากขนตอนการ Setup คอนขางยงยากเกนความจ าเปนส าหรบการทดลองงายๆ เพยง 1-2 การทดลองจงไมแนะน าใหใช Tcl-dg interface เพอวตถประสงคน) การเรยกใชงาน Glide หากบนหนาจอไมปรากฎหนาตางของ Glide อย (รปท 6) ใหคลกทปม [Glide] จากเมนของ VNMR เพอเรยกใชงาน Glide interface

รปท 6 หนาตาง Glide interface หากหนาตาง Glide interface มขนาดเลกเกนไปสามารถใชเมาสปรบขยายไดโดยการลากทบรเวณมมของหนาตางไดตามความเหมาะสม การเปลยน sample และตงคาเรมตน

รปท 7 หนาตาง SetUp ของ Glide เมอเหนหนาจอ Glide แลวใหคลกทปม Setup เพอตงคาเรมตน ซงจะแสดงหนาตาง Setup ส าหรบปอนขอมลดง รปท 7 หากไมเหนหนาตางสวนลางใหใชเมาสปมซายลากทขอบลางของหนาตางลงมาขางลางอก รายละเอยดของการ Setup มดงน Experiment: ระบการทดลองทจะท า โดยคลกเมาสปมซายตรงเครองหมายลกศร แลวเลอกการทดลองทตองการจาก pop-up menu เชน Proton 1D (รนโปรตอนอยางเดยว), Carbon 1D (รนคารบอนอยางเดยว) หรอ User Selected HCPF หากตองการรนทง 1H และ 13C หากตองการรน 2D experiments ดวยควรรนผาน Tcl-dg (ดหวขอ 5)


-8-

Solvent: ระบตวท าละลายทใช ในการเลอกใหคลกขวาดวยเมาสทชอตวท าละลาย จะม pop-up menu ขนมาซงสามารถเลอกตวท าละลายทตองการได ปจจบนยงไมไดตงคาตวแปรและปรบเครองมอเพอใหใชงานกบตวท าละลายอนนอกจาก CDCl3, DMSO-d6, D2O, CD3CN, CD3OD, CD2Cl2, acetone-d6, pyridine-d5 และ benzene-d6 หากเปนไปไดกรณาหลกเลยงการใชตวท าละลายผสมหรอตวท าละลายอนนอกเหนอจากทระบขางตนเนองจากจะไมสามารถท า Autolock และ Autoshim ได หากจ าเปนตองใชงานตวท าละลายนอกเหนอจากทระบไวโปรดปรกษา NMR Staff Sample: ควบคมการ Load Sample กด Sample:Eject เพอเปลยน sample จะไดยนเสยงลมและ sample เกาจะดดตวลอยขนมาจาก probe ซงอยใจกลางของ NMR magnet ดง spinning turbine พรอมกบหลอด sample เกาออก ใสหลอด sample ทเสยบกบ spinning turbine ใหมลงไปต าแหนงเดม ในขนนควรจะยงไดยนเสยงลมออกจากใจกลางของ magnet อย กลบมาทโปรแกรม VNMR กด Sample: Insert เสยงลมจะคอยๆ เงยบลงและ sample จะถกหยอนลงใน probe ตรวจสอบวา sample ถกหยอนลงเครองไปแลวจรงๆ (จะไดยนเสยงดงชดเจนและหลอด sample หายไปจากสวนบนของ probe) หากหลอด sample ยงคางอยใหรบกดปม Eject และกลบไปดง sample ออกจากสวนบนของ probe โดยเรวแลวท าซ ากระบวนการ Load sample ใหมอกครง อยาหยอนหลอด sample ลงใน probe หรอปลอยใหหลอด sample คาไวทสวนบนของ probe ในขณะทไมไดยนเสยงลมเปนอนขาด เนองจาก sample อาจหลนลงไปใน probe ในชวเสยววนาทใดวนาทหนง ซงถาเกดเหตการณเชนนขนจะตองท าการถอด probe ออกมาลางและ tune / ปรบ shim ใหมและเครองจะใชงานไมไดไปอกนานนบสปดาหในกรณทโชคด หรอในกรณทโชคราย probe ซงมราคานบลานบาท อาจเสยหายไปเลยกได AutoLOCK: การลอกสญญาณดวทเรยมแบบอตโนมต เนองจากขณะนระบบ autolock ยงไมท างานจงขอใหตงคานเปน NO และใหหาสญญาณลอกเองผาน acqi window (ดภาคผนวก 2) AutoSHIM: เปนการ shim เพอปรบ magnetic field homogeneity แบบอตโนมต เนองจากขณะนระบบ gradient autoshim ยงไมท างานจงขอใหตงคานเปน NO และให shim แบบ automatic ผาน acqi window (ดภาคผนวก 2) Directory: ปลอยวางไว Save As: ใสชอไฟล โดยใหใช initial (จะก าหนดใหโดย NMR Staff เมอตอน train ครงแรก) ตามดวยเลข 3 หลก เชน tv001, tv002 etc. หามใชตวอกษรประหลาดหรอใสชอไฟลยาวเกนไป ไฟลทไมตงชอตามขอก าหนดนจะไมไดรบการ Backup ถาท าหลายการทดลองในวนเดยวกนไมควรตงชอไฟลซ าเดม ซอฟตแวร VNMR จะเตมวนทท าการทดลองใหขางหลงโดยอตโนมต (และเวลาทท าการทดลองหากใสชอไฟลซ ากนในวนเดยวกน) Text: ใสค าอธบาย เชน ชอตวอยาง เมอตงคาทกอยางเสรจเรยบรอยคลกปม [Setup] ในหนาตาง Setup โปรดสงเกตวา sample จะถกรนแบบ non-spin เนองจากการท า Gradient Autoshimming จะท าในสภาพ non-spin และ resolution ของการ spin กบ non-spin กไมตางกนมากนก อยางไรกตาม หากจ าเปนตอง spin sample ใหใชหนาตาง acqi เพอ set spin rate ไดตามปกต (คาปกตคอ 15 Hz) แตตองท า manual lock และ manual shim ผาน Interactive acquisition windows [Acqi menu button] แทน และตงคา AutoLOCK กบ AutoSHIM ใน Glide Setup Menu ใหเปน No จะเหนวาขนตอนคอนขางยงยาก ดงนนหากไมไดตองการ resolution ทสงยงยวดขอแนะน าใหรนสเปกตรมแบบ non-spin จะดทสด สวน 2D spectrum จะตองรนแบบ non-spin อยแลว การปรบเปลยนตวแปรส าหรบการ acquire, process และ plot สเปกตรม


-9-

เมอเสรจสนกระบวนการ Setup ใตปม Custom ของ Glide interface จะแสดงเมนยอยเพอใหปรบเปลยนตวแปรของการ Acquire, Process หรอ Plot ตามตองการ(ใชเมาสปมขวาเปนตวเลอก) หากคลกทเมนยอย Acquire จะเหนเมนยอยแตกตางกนไปขนกบวาในขณะท Setup ไดเลอกการทดลองใดไว

รปท 8 Glide Custom Menu เมนยอย Acquire - ในกรณทเลอก Proton 1D experiment ในกรณทเลอก Proton 1D จะเหน Parameter dialogue box ดงรปท 9

รปท 9 Parameter dialogue box ของ Proton 1D experiment โดยปกตตวแปรทผใชจะเปลยนคอ PROTON Spectral Width ใหเลอกคาทเหมาะสม หากไมแนใจใหเลอกชวงทกวางทสดไวกอนคอ -2-14 ppm แตเวลา plot เครองจะพลอตคา default คอ 0-10 ppm หากไมไดบอกใหมน plot Full spectrum (ตงคาในเมนยอย Plot - ดขางลาง) อกตวแปรหนงทอาจจะเปลยนไดคอ PROTON Scans (nt) คา default คอ 8 แตสามารถเปลยนไดตงแต 8-32 สแกน หากตองการคานอกเหนอจากนใหคลกทหนาตาง Input window แลวปอนค าสง nt = xx เมอ xx เปนตวเลขทตองการ (ควรเปนเลข 2n เชน 64, 1024) เสรจแลวคลกทปม [Close] เมนยอย Acquire - ในกรณทเลอก Carbon 1D experiment ในกรณทเลอก Carbon 1D จะเหน Parameter dialogue box ดงรปท 10


-10-

รปท 10 Parameter dialogue box ของ Carbon 1D experiment โดยปกตตวแปรทผใชจะเปลยนคอ CARBON Spectral Width ใหเลอกคาทเหมาะสม หากไมแนใจใหเลอกชวงทกวางทสดไวกอนคอ -15-235 ppm (หากแนใจวาไมมหมคารบอนลชวง -10 - 200 กพอ) แตเวลา plot เครองจะพลอดคา default คอ 0-200 ppm หากไมไดบอกใหมน plot Full spectrum (ตงคาในเมนยอย Plot - ดขางลาง) อกตวแปรหนงทอาจจะเปลยนไดคอ CARBON Scans (nt) คา default คอ 256 ซงใหสเปกตรมทคณภาพยอมรบไดส าหรบสารตวอยางทเขมขนประมาณ 0.1 M แตสามารถเปลยนไดตามตองการขนกบความเขมขนของตวอยาง หากตองการคาอนทไมมในเมนใหเปลยนตวแปร nt จาก Input window เชนเดยวกบกรณของโปรตอน จ าไววาการสแกนคารบอนสเปกตรมจะใชเวลาประมาณ 10 นาทตอ 256 สแกน และหากตองการให signal-to-noise ratio ดขน n เทาจะตองเพมจ านวนสแกน (และเวลาสแกน) เปน n2 เทา หากมตวอยางนอยกวา 10 mg ไมสมควรจะน ามารนคารบอนบนเครองนเพราะจะเสยเวลามากเกนความจ าเปน สวน CARBON S/N TEST ใหเลอก [DO NOT TEST] เนองจาก sensitivity ของ probe นจะท าให signal-to-noise ratio ถง 100 ไดยากในการรนตามปกต (ถาลมตงคานกไมเปนไร เครองจะฟองเองวาไมมทางท า S/N ratio ทตองการได) เสรจแลวคลกทปม [Close] เมนยอย Acquire - ในกรณทเลอก User selected HCPF 1Ds experiment

รปท 11 Parameter dialogue box ของ HCPF 1D experiment ใหตงคาตางๆ เชนเดยวกบ Proton 1D experiment แตจะมชองใหเลอกการทดลองเพมเตมจาก Proton ใหเลอก [Carbon] จะม Parameter dialogue box ของ Carbon experiment มาใหตงคาเชนเดยวกบขางตน แมเครองนจะรน 31P NMR ไดแตหามเลอก [Phosphorus] จากเมนนโดยตรงเนองจากตองมการ tune probe และเปลยน filter กอน - โปรดปรกษา NMR Staff สวน 19F NMR ไมสามารถรนไดดวย probe น เมนยอย Process ไมมความจ าเปนตองเปลยนแปลงคาใดๆ


-11-

เมนยอย Plot เมอคลกทเมนยอย Plot ใตปม Custom ของ Glide interface จะเหน Dialogue box ดงรปท 12

รปท 12 Parameter dialogue box ของเมนยอย Acquire ควรเลอก Spectra Width เปน [Default] (0-10 ppm ส าหรบ proton และ 0-200 ppm ส าหรบ carbon) แตถามการตงคา spectral width (เมนยอย Acquire) ไวนอกชวงน ใหเลอก [Full Spectrum] สวน Plot Parameters ใหใชปมขวาของเมาสเลอก ปกตควรตงคาไวเปน [Plot Basic Parameters Upper Left] ซงจะมชอไฟลตดมาดวย ส าหรบ Integral ถาไมตองการใหเลอก [Off] เมอตงคาทตองการเสรจแลวคลก [Close Plot] (อยาคลก [Do Plot] เนองจากขณะนเครองยงไมไดเรมรนสเปกตรม ถาสงให plot เลยมนจะเอาสเปกตรมจากการทดลองกอนหนานมา plot ) เมอปรบเปลยนคาตางๆ เสรจแลวใหยบเมนยอยของ Custom menu โดยการคลกทเครองหมายลกศรใต Custom menu การ acquire สเปกตรมแบบ automatic ผาน Glide interface คลกทปม [Go] ของ GLIDE เพอเรมตนการรนสเปกตรม เครองจะท าการทดลองตามทเลอกไว โดยจะแจงขอมลใหทราบทาง Graphic window เชน Acquiring Proton, Acquiring Carbon etc. เมอเสรจสนการทดลอง เครองจะท าการเกบ FID, ท า Fourier transform, ปรบเฟส, ใสอนทกรล และ plot สเปกตรมใหโดยอตโนมต บน Graphic window จะขนค าวา Done เปนการเสรจสนหนงการทดลอง FID และตวแปรของการทดลองทงหมดจะถกเกบไวในฮารดดสก เครอง NMR จะอยในสภาพพรอมทจะเ รมการทดลองใหมไดทนท พยายามหลกเลยงการรบกวนเครอง NMR Workstation ทกรปแบบระหวางทยงไมขนค าวา Done บน Graphic windows ส าหรบ Carbon experiment ผใชสามารถตรวจสอบคณภาพของสเปกตรมทกๆ 64 สแกน หรออาจเปนตวเลขอนซงก าหนดโดยตวแปร bs (block size) โดยการพมพ wft (weight and Fourier transform) ในชอง Input window ตามดวย aph (ปรบเฟสแบบอตโนมต) หาก signal-to-noise เปนทนาพอใจอาจจะหยดการทดลองกอนไดโดยพมพ sa (stop acquisition) ระวง! หากหยดการทดลองดวยค าสง aa แทนค าสง sa ขอมลของการทดลองจะสญหายไป


-12-

หมายเหต ขณะนเครอง Varian มปญหา ยงไมสามารถท าการทดลองตามหวขอ 5 (แสดงดวยตวพมพจาง) ได หากตองการรนเทคนคอนทนอกเหนอจาก 1H, 13C โปรดใชเครอง Bruker หรอตดตอ TA 5. การ acquire, process และ plot 2D สเปกตรมแบบ automatic เรมตนใชงาน Tcl-dg Interface Tcl-dg ชวยการ submit หลายๆ การทดลองตอเนองกนโดยเฉพาะอยางยง 2D experiment บนตวอยางเดยวกน เมอเ รมใชงานครงแรกควรจะเหน Tcl-dg window ลกษณะดงรปท 13

รปท 13 Tcl-dg windows ในสภาพพรอมเรมการทดลองใหม หากหนาจอเปนแบบอนใหลงมาท Tcl-dg window เลอก [Submit] tab ทางดานขวามอ (ปมบนขวาสด) ควรจะเหนหนาจอลกษณะดงรปท 13 ตรวจสอบดวาเครองไมไดก าลงท างานอย โดยชอง STATUS: ใน Acquisition status window ควรจะเปน Idle หากเปนอยางอนควรรอใหการทดลองจบกอนหรอหยดการทดลองโดยการคลก [Abort Aquisition] จาก menu button แลวคลกท [NEW SAMPLE to ACQ] เพอเรมการทดลองใหม การ Setup experiments ใน Tcl-dg เมอคลก [NEW SAMPLE to ACQ] หนาจอของ Tcl-dg จะเปลยนไปเปนดงรปท 14 (ยงไมตอง Load sample ใหมในขณะน)

รปท 14 หนาจอ Tcl-dg windows หลงจากคลกท Setup>[NEW SAMPLE to ACQ]


-13-

เมอเหนหนาจอดงรปท 14 แลวใหเลอกตวท าละลาย ตรงชอง Solvent: (ใชเมาสปมซายเปนตวเลอก) และลงมาเลอก experiment ทตองการจากรายการขางลาง รายการของ experiment ทอยในเมนของ Tcl-dg เปนดงแสดงในตารางท 2 ตารางท 2 รายการ experiment ทเลอกไดจากเมนของ Tcl-dg

Basic 1D Other 1D Homo 2D*** Hetero 2D*** Solvent

Suppression Proton Carbon

P31* F19**

APT DEPT

gCOSY TOCSY

gDQCOSY NOESY ROESY

HMQC, gHMQC HSQC, gHSQC

gHMBC CIGAR

gHMQCTOXY gHSQCTOXY

HETCOR

PRESAT WET

watergate

* ไมสามารถรนไดทนท ตองมการ tune probe ใหเปน frequency ของ 31P กอน ** ยงไมสามารถใชงานได หามเลอกการทดลองน *** ตวยอ g ในการทดลองเหลานหมายถง gradient ในแงของผใชทวไปใหเลอกเฉพาะ experiment ทม gradient เสมอ การเลอก experiment ใน Tcl-dg ท าไดงายโดยการคลกในชองหนาชอการทดลองตามล าดบ ซงเมอคลกแลวจะม Parameter dialog box มาใหแกไขตวแปรตามตองการ ในการ submit experiment ผาน Tcl-dg ทกครงตองเรมตนดวย Proton 1D เปน experiment แรกเสมอ หากท า heteronuclear 2D experiment กตองตามดวย Carbon 1D เปน experiment ถดมา (หากไมท าตามนเครองจะไมสามารถหา 1D สเปกตรมมา plot ขางๆ 2D spectrum ได) ดงนนการทดลองแรกเรมตนดวยการคลกทหนา Proton จะเหน Parameter dialogue box คลายกบของ Glide แตมรายละเอยดแตกตางออกไปเลกนอย ดงรปท 15

รปท 15 Parameter dialogue box ของ Proton experiment ใน Tcl-dg ใหเลอกตงคาตวแปรตามตองการ ส าหรบ Minimize SW? หากไมตองการท าใหเลอก [No] หากเปน [Auto] เครองจะสแกนโปรตอนสเปกตรม 2 รอบ รอบแรกจะตง spectral width ตามทเราก าหนด รอบทสองจะลดขนาด spectral width ลงใหเหลอเพยงแคครอบคลมทกพก เมอเสรจแลวคลก [Save & Exit] จะกลบมาทหนาจอ Setup เหมอนเดม เครองจะแสดงเวลาของการทดลองทใชและเวลารวมทงหมดบนหนาจอ Graphic window


-14-

หากจะรน Carbon 1D ดวยใหคลกทชองหนา Carbon จะม Parameter dialogue box ส าหรบคารบอนขนมาดงรปท 16 แกไขตวแปรตามตองการเชนเดยวกบใน Glide จ านวน scan (และเวลาทใชในการสแกน) ขนกบความเขมขนของสาร หากตองการทราบเวลาใหเลอกจ านวนสแกนทคดวาจะท า คลก [Select] และ [Time] เครองจะแสดงเวลาใหบน Graphic window ตามปกต 256 สแกนจะกนเวลาประมาณ 10 นาท, 1000 สแกน ประมาณ 40 นาท, และ 10000 สแกนจะกนเวลานานกวา 6 ชวโมง โปรดเลอกจ านวนสแกนใหเหมาะสมกบปรมาณสารและเวลาททานมในการท าการทดลอง ! เมอเสรจแลวคลก [Save & Exit] เชนเดม

รปท 16 Parameter dialogue box ของ Carbon experiment ใน Tcl-dg จากนนจงเลอกการทดลองทตองการท าตามล าดบทตองการใหเครองท างาน ส าหรบพารามเตอรส าคญทตองเปลยนส าหรบแตละการทดลองสรปอยในตารางท 3 พรอมทงเวลาของการทดลองโดยประมาณ ตารางท 3 Standard Parameters ส าหรบ 2D experiments ทใชบอย

Experiments scans (nt) increment (ni) expt. time other parameters gCOSY 2 128 7 min - NOESY 8/16 256 4 hr mixing time 700 ms ROESY 8/16 256 4 hr mixing time 200-300 ms TOCSY 2/4 256 25 min mixing time 80 ms gHSQC 2/4 200 18-36 min J range 140 Hz (default) gHMBC 8/16 {32} 400 2 hr J = 8 Hz CIGAR 8/16 {32} 400 2 hr min J = 4 Hz; max J =12 Hz gHSQCTOXY 16/32 256 2 hr mixing time 80 ms

ตวแปรเหลานยอมแตกตางกนไปขนกบชนดและความเขมขนของตวอยาง ตวเลขทแสดงเปนคา typical ของสารตวอยาง 20 mg (ทมวลโมเลกลประมาณ 300) ส าหรบจ านวนสแกน (nt) และ increment (ni) ถายงตวเลขมากกจะท าใหไดสเปกตรมทมคณภาพดมากขน แตกจะท าใหเสยเวลาในการ acquire ขอมลมากและขนาดไฟลใหญมากตามไปดวย หากไมแนใจบางตวแปรวาเปลยนแลวจะมผลอยางไรกไมจ าเปนตองเปลยนใหใชคา default ทมอยใน parameter dialogue box หามปรบเปลยนตวแปรแบบ manual โดยผาน Input window เดดขาดเนองจากบางตวแปรหากตงคานอกชวงทจะรบไดอาจท าให probe หรอ spectrometer เสยหายได !


-15-

รปท 17 Parameter dialogue box ของ CIGAR experiment ใน Tcl-dg ตวอยาง parameter dialogue box ของ CIGAR experiment เปนดงรปท 17 เมอตงคาตวแปรเสรจเรยบรอยคลกท [Save&Exit] กจะกลบไปท Setup window อกครงพรอมทจะเพมเตม experiment ใหมเขาไปอก โดยเครองจะแสดงเวลาของการทดลองใหทราบทางหนาตาง Graphic window ทกครงทเพม experiment ใหมเขาไป หากตองการลบ experiment ใดออกจากควกท าไดโดยการคลกซ าทหนาการทดลองนน

รปท 18 Sample setup window ของ Tcl-dg เมอเลอกการทดลองเสรจเรยบรอยแลวจงคลกทปม [Setup Sample Now] เครองจะแสดงหนาตาง Setup sample ดงรปท 18 (ตางกบ Glide ตรงทเราตองเลอก experiment ใหเสรจกอนถงจะมาใสขอมลของ sample) ในหนาตางนเราสามารถเปลยน sample และตงคาตวเลอกเชนเดยวกบใน Setup window ของ Glide FID ของทกการทดลองจะถกบรรจอยในไดเรกทอรชอเดยวกบทเราใสไวใน Save As โดย FID จากแตละการทดลองกจะเกบไวตามชอการทดลองนน เชน PROTON_01.fid, gCOSY_01.fid, gHSQC_01.fid เปนตน ในชอง Autoplot ใหคลก [Yes] หากตองการให plot ผลอตโนมต หากไมตองการใหคลก [No] เมอตงคาตางๆ เสรจเรยบรอยแลวใหคลก [OK] เพอท างานตอจะสงเกตเหนการเปลยนแปลงท Tcl-dg window รอจนกระทงไมมการเปลยนแปลงอกตอไปจงคลกทชอง [Submit] ของ Tcl-dg window หนาจอจะเปลยนเปนดงรปท 19 จากนนคลก [Start Acq] เปนอนสนสดการทดลอง เครองจะด าเนนการทเหลอเองพรอมทงจดเกบไฟลให ซงทานสามารถดงไฟลกลบมา process ทหลงได


-16-

รปท 19 หนาจอ Submit ขณะพรอมเรมการทดลอง

รปท 20 ผลของการพมพค าสง explist ขณะทม experiment อยในคว หลกเลยงการรบกวนเครอง NMR Workstation ทกรปแบบในขณะทก าลงท า acquisition อยโดยเฉพาะอยางยงเมอเปนการทดลองของผอนเนองจากอาจท าใหการทดลองหยดท างานได หากตองการทราบวาม experiment อยในควกการทดลองใหพมพ explist ในชอง Input window เครองจะแสดงรายการใหดดงรปท 20 การหยดการทดลองท าไดโดยการพมพค าสง sa (stop acquisition) ใน Input window เครองจะขามไปการทดลองถดไปทนท หากตองการเพมการทดลองอนกบตวอยางเดยวกนหลงจากจบการทดลองทงหมดแลวใหคลก [More on This] tab ทางขวามอ (อยใต Submit) จะมรายการของการทดลองมาใหเลอกเพมเตม ใหเลอกรายการและแกไขตวแปรตางๆ ตามปกต (ยกเวนพวก selective 1D experiment เชน PRESAT, 1D-NOESY ตองเลอกพกทจะ irradiate กอน - กรณาปรกษา NMR Staff) เมอเสรจแลวใหคลก [Run this queue now] หากจะทงเครองไวกรณาฝาก instruction ไวกบผใชคนตอไปวาจะใหท าอยางไร หากไมมขอความใดๆสงไวผใชคนตอไปยอมมสทธทจะเรมตนการทดลองใหมไดทนท เมอหมดเวลาจองของทาน หรอเวลา 6 โมงเชาของวนรงขน (กรณ overnight) โดยไมจ าเปนตองค านงถงการทดลองของทานทท าไว โปรดเคารพสทธของผอนโดยการจ ากดการทดลองของทานใหอยในเวลาทจองไวเทานน


-17-

6. เมอเสรจการทดลอง - เปดหนาตาง Interactive acquisition window (คลกท ปม Acqi หากไมมปมนใหพมพค าวา acqi ใน Input window) จะเหนหนาตางใหมขนมาทางดานขวามอ จากนนเปด Lock window โดยการคลกทปม [Lock] จะเหนหนาจอดงรป 21 หากก าลง spin อยใหหยด spin โดยกดปม SPIN: off (หากไมมปม spin ใหกดแสดงวาขณะนนไมได spin) และ ปลดลอกโดยการกด LOCK: off

รปท 21 แสดงการ Lock reference ผานหนาตาง Interactive acquisition window - เตรยมหลอด reference ทเสยบไวกบ spinning turbine ใหพรอม กด SAMPLE: Eject เพอเปลยน sample เปนหลอด reference แลวกด SAMPLE: Insert ตรวจสอบวา reference ถกหยอนลงเครองไปแลว - ไมตอง spin ปรบ Z0 ใหเปนคาเรมตนตามชนดของตวท าละลาย ในทนหลอด reference เปน CDCl3 จงควรตง Z0 ไวท 312 กด LOCK: on หนาจอควรจะแสดงสญญาณลอกดงรปท 20 พรอมทงเหนตวอกษร LOCKED ขนเปนสเขยว หากลอกไมส าเรจ จะเหนตวอกษรสเหลองวา NOT LOCKED ใหกด LOCK: off ตรวจสอบ lockpower และ lockgain วาอยประมาณ 30 ทงค อาจลองปรบ Z0 เปนคาอนทใกลเคยงกนแลวลองลอกใหม อยาปรบเปลยนคา lockphase - คลก [Close] เพอปด Interactive acquisition window บนทกชอผใช ชวงเวลาทใชงาน การทดลองทท า จ านวนแผนกระดาษทใช และ comment อน (ถาม) ลงใน Log book เปนอนเสรจสนการใชงาน หากพบความผดปกตของเครองมอใหแจง NMR Staff ทนท อยาผลกภาระใหผใชคนตอไปมาพบความผดปกตทหลง


-18-

7. การ process และ plot 1D และ 2D สเปกตรมแบบ manual หากเปนสเปกตรมทเพงรนเสรจใหขามไปทหวขอการปรบแตง 1D หรอ 2D สเปกตรมไดเลย หากเปนสเปกตรมทรนเกบไวแลวให load FID ขนมากอน การ load และ process FID การ reprocess หรอปรบแตงสเปกตรมทรนไวเมอนานมาแลวจะตอง load FID ขนมากอน โดยกอนอนตองยาย working directory ไปยงททมไฟลของเราอย โดยการคลกท [Main Menu]>File>Set Directory คลกทชอ data directory ทตองการ (เปนชอเดยวกบทเราตงไวใน Save As ของ Glide Setup menu) แลวคลก [Change] (รปท 22) หากตองการยอนกลบไป parent directory ใหคลก [Parent] เมอยายเขาส data directory ทตองการส าเรจแลว คลก [Main Menu]>File จากนนจงคลกทชอไฟลนามสกล .fid ทตองการ เชน PROTON.fid, gHMBC.fid แลวคลก [Load] จะเปนการดง FID กลบมาท memory ของเครอง NMR Workstation จากนนใน Input window ส าหรบ 1D FID ใหพมพ wft (weight and Fourier transform) หรอเลอกจากเมน [Main Menu]>Process เพอเปลยน FID (time domain) ใหเปนสเปกตรม (frequency domain) สวน 2D FID ใหเลอก [Main Menu]>Process หรอ [Main menu]>ProcMenu>Full transform เมอเหนสเปกตรมหรอ contour plot บน Graphic Display แลวจงสามารถปรบแตงโดยใช Interactive display ได (ดขางลาง)

รปท 22 การเปลยน working directory ในระหวางทก าลง acquire สเปกตรมอยจะไมสามารถ load FID เพอมา process ไดใน experiment เดยวกน แตสามารถยายขามไป experiment อน แลว load FID ไวเพอ process และ plot จากทนนได อยางไรกตาม ไมแนะน าใหรบกวนเครองขณะทก าลง acquire สเปกตรมอย การปรบแตง 1D spectrum ไมแนะน าใหท าการปรบแตง 1D สเปกตรมบน NMR Workstation เนองจากจะเสยเวลาอนมคาของเครองไปโดยไมจ าเปน ควรจะเซฟไฟลขอมลไวและถายเทไฟลขอมลเพอน าไปปรบแตงและ plot บนเครอง PC โดยซอฟตแวรเชน MestRe-C จะท าใหใชเวลาของเครอง NMR ไดอยางมประสทธภาพมากกวา - ตามปกตเมอพมพ wft แลว VNMR จะเขามาท Interactive display menu (แถบเมนลางสดของรปท 22) โดยอตโนมต จากเมนนเราสามารถปรบแตงสเปกตรม เชน ใส integral, ขยายพก, เตม peak list หรอ label ได - หากไมไดอยท Interactive display menu อยแลวใหเลอก DispMenu จาก menu button (หากไมเหนเมน DispMenu ใหคลกท Main Menu กอน) (รปท 23) รายการเมนจะเปลยนเปน View, Interactive, Massage, Size, Reprocess, Plot, More ใหคลกท View เพอดสเปกตรม


-19-

รปท 23 การเลอกเมน DispMenu จาก menu button เพอการปรบแตง 1D spectrum - หากตองการปรบแตงสเปกตรมในแบบ Interactive Mode โดยใชเมาสเปนตวควบคมใหคลกทปม Interactive ในกรณของ 1D FID จะเหนสเปกตรมใน Graphic window และเมนจะเปลยนไปเปนดงน • Box/Cursor ใชปรบ cursor mode ระหวางเสนคกบเสนเดยว (เปน toggle menu) ซงใชในการก าหนดชวงของสเปกตรมหรอพกตามล าดบ ใน Box mode ปมซายคม cursor ตวซาย ปมขวาคม cursor ตวขวา ใน cursor mode ใชปมซายควบคม cursor ปมกลางใชในการปรบระดบความสงของ integral แตถา integral อยในโหมด no integral ปมกลางจะเปนตวปรบความสงของสเปกตรม (ใหชเคอรเซอรใหตรงกบพกทสงทสดในสเปกตรมแลวคลกหรอลาก ความสงของทงสเปกตรมจะปรบตาม อยาคลกหรอลากบรเวณทไมมพก) • Part/Full/No Integral ใชแสดง Integral แบบชวงเวนชวง/เตม หรอไมแสดงเลย หากแสดงอนทกรลเปน Part หรอ Full การคลกเมาสปมกลางจะเปนการปรบความสงของอนทกรลแทนทจะเปนพก • Full/Expand ใชแสดงสเปกตรมทงหมด/เฉพาะชวงทเลอกโดย Box Cursor • sp, wp ใชปรบจดเรมตนของสเปกตรม (sp) และความกวางของสเปกตรม (wp) ใชปมซายลากในแนวซาย-ขวาเพอปรบ sp และปมขวาลากขน-ลง หรอซาย-ขวา เพอปรบ wp (ไมควรปรบสเกลโดยวธนเนองจากการใช Box Cursor รวมกบเมน Full/Expand จะท าไดสะดวกกวามาก) • Phase ปรบเฟสโดยใชเมาสเปนตวควบคม (เลอกตอเมอการปรบเฟสแบบอตโนมตใหผลไมดเทานน) • Th ปรบ threshold ของพกทเตยทสดทตองการใหแสดง peak list • Resets ปรบแตง integral โดยใชเมาสเปนตวควบคม ตามปกตซอฟตแวรจะท าการเลอกตดชวงอนทกรลใหโดยอตโนม ต แตถาไมพอใจอาจท า manual integration โดยเลอก Integral mode ใหเปน Part กอน แลวใชปมซายในการตดอนทกรลและปมขวาในการเชอมอนทกรล บรเวณของอนทกรลทจะไมถกแสดงใน Part Integral mode จะปรากฎเปนเสนประ • Dscale แสดง/ไมแสดงสเกล (เปน toggle menu) • Lvl/Tlt ท า baseline correction ของ integral ใชเมาสเปนตวควบคม • Set Int ปรบคา integral value (ปอนคาทางคยบอรด) ตองใหเคอรเซอรอยบรเวณอนทกรลทสนใจกอน • Ref ตงคา reference ตองเลอกพก reference โดยใช cursor กอน แลวปอนคา reference ทางคยบอรด หนวยเปน ppm เชน ในกรณ CDCl3 ใหปอนคาเปน 7.24p • Return กลบไปเมนเดม


-20-

- เมอปรบสเปกตรมจนเปนทพอใจแลวใหคลก Return เพอกลบไปท Display เมน แลวคลก Plot จะเหนปมตางๆ ทส าคญไดแก Plot (สเปกตรม), Scale (สเกล), Params (Acquisition parameters), Peaks (Peak list - อยาลมก าหนดคา Th กอนเสมอ!) เครองพมพจะไมท างานจนกวาจะคลกทปม Page หรออาจสง plot โดยใช command line จาก Input window เชน pl ppa pscale pir page ( plot สเปกตรม plot สเกล plot acquisition parameter แบบยอ plot ตวเลขแสดงอนทเกรชน และ feed กระดาษ) หากตองการ plot acquisition parameter แบบเตมใช pap - การปรบแตงสเปกตรมบางอยางอาจท าไดสะดวกมากโดยใช command line ใน Input window แทนทจะใชเมน ค าสงทนาสนใจไดแก bc (baseline carrection), ppa (plot basic parameters - ใชรวมกบ plot เทานน), pir (plot numerical integral - ใชรวมกบค าสง plot เทานน), sp = xxp และ wp = xxp (ปรบความกวางของสเปกตรมโดย xx เปนตวเลขแสดงจดเรมตนและความกวางของสเปกตรมในหนวย ppm) ผสนใจควรจะศกษารายละเอยดจาก VNMR Command and Parameter Reference การปรบแตง 2D spectrum

รปท 24 การเลอกเมน DispMenu จาก menu button เพอการปรบแตง 2D spectrum - หากไมไดอยท Interactive display menu อยแลวใหเลอก DispMenu จาก menu button (หากไมเหนเมน DispMenu ใหคลกท Main Menu กอน) (รปท 25) รายการเมนจะเปลยนเปน Color Map, Contour, Image etc. ใหคลกท Contour เพอดสเปกตรม แถบเมนจะเปลยนไปและจะเหน contour plot ดงรปท 25

- โดยทวไปแลวสงทผใชจะกระท าไดในการปรบแตง 2D สเปกตรมคอการปรบ vertical scale และการขยายเฉพาะบางบรเวณ


-21-

รปท 25 Contour plot ของ 2D experiment ในสภาพทพรอมจะปรบแตงแบบ manual - การปรบ vertical scale ท าไดโดยการคลกทปม vs+20 % (เพม vertical scale หากเพมมากไปสเปกตรมจะม noise มาก) หรอ vs-20 % (ลด vertical scale หากลดมากไปจะไมเหน cross peaks บางต าแหนง) - การขยายเฉพาะบางบรเวณท าโดยใชเคอรเซอรซงเมอเรมตนควรจะอยในรป cursor mode โดยจะเหนเปนสองเสนตดกน ใชเมาสปมซายลากเคอรเซอรนไปทต าแหนงทตองการใหเปนมมลางซายของบรเวณทตองการขยาย แลวคลก [Box] เพอเปลยนใหเปน Box cursor mode จะเหนเคอรเซอรเพมขนมาอก 1 ชดใชเมาสปมขวาปรบเคอรเซอรชดทสองนไปทต าแหนงมมบนขวาของบรเวณทตองการขยาย ใน Box cursor mode หากต าแหนงของกรอบไมเหมาะสมใหปรบดวยเมาสปมซาย และหากขนาดของกรอบไมเหมาะสมใหปรบดวยเมาสปมขวาซงจะควบคมเฉพาะเคอรเซอรชดท 2 เมอเลอกบรเวณทตองการไดแลวคลก [Expand] - เมอปรบแตงสเปกตรมเสรจเรยบรอยแลวใหคลก [Autoplot] บน menu button เพอ plot 2D สเปกตรม ไมวาจะ plot โดยวธใด ในไดเรกทอรขอมลจะตองมไฟล PROTON_01.FID (และ CARBON_01.FID ในกรณ heteronuclear 2D experiments) อยดวยจงจะสามารถ plot 1D สเปกตรมไวขางๆ 2D สเปกตรมได


-22-

8. การถายเทไฟลขอมลเพอน าไปปรบแตงและพมพบนเครอง PC การถายขอมลจากเครอง PC ในหอง NMR ไปยง PC สวนตวของอาจารยหรอนสต ใหใชโปรแกรม Internet Explorer หรอ ws_ftp (download ไดจาก ftp://ftp.chula.ac.th) แลว connect ไปท IP address 10.115.254.88 (เครอง Linux) ปอน user name = vnmruser และ password = @chemie เสรจแลวควรจะ save password และท า bookmark ไว ขอมลจะอยในไดเรกทอร /NMRData โดยจะแยกเกบตามเดอน หามท า ftp หรอ telnet กบเครอง NMR โดยตรง !!! ผฝาฝนจะถกด าเนนการขนเดดขาด การถายขอมลจากเครอง NMR ไปยง PC ในหอง NMR ปกตจะกระท าโดย TA อยางสม าเสมอ (ไมเกน 2-3 วนหลงวนทรนสเปกตรม) ไมอนญาตใหผใชท าการถายโอนขอมลจาก NMR Workstation ไปยงเครอง Linux ดวยตนเอง ในกรณทตองการไฟลเรงดวนหรอเครอง server มปญหาโปรดตดตอ TA การน าไฟลขอมลไป process บนเครอง PC - ขอมล 1D สามารถน ามา process ในเครอง PC โดยใชโปรแกรม NMR processing software ตามความถนด หลายตวเป น Freeware ต วอ ย า ง เ ช น MestRe-C (Windows) ห รอ SwaN-MR (MacIntosh) (ดาวน โ หลด ไ ด จาก http://qobrue.usc.es/jsgroup/MestRe-C/MestRe-C.html) ก าหนด format ของไฟลเปน Varian และให open ไฟลชอ FID ซงจะอยในไดเรกทอร PROTON.fid อกทหนง รายละเอยดการใชงานของซอฟตแวรแตละชนดใหอางองถงคมอหรอ Help File ของซอฟตแวรนนๆ เปนทนาเสยดายวาไมมฟรซอฟตแวรบน PC ทเหมาะสมในการ process 2D และ 1D-arrayed experiment FID ได จงจ าเปนตองใช NMR Workstation ในการ process และ plot FID ดงกลาว กรณาจดการ process และ plot FID ดงกลาวโดยเรวทสดหลงเสรจการทดลองของทาน อยาทงไวเนองจาก NMR staff จะคอยลบขอมลจาก NMR Workstation อยางสม าเสมอ 9. เครองนท าอะไรไดอกบาง ยงมการทดลองอกมากมายท NMR เครองนสามารถท าได ตวอยางเชนการทดลองตามรายการขางลาง ผสนใจโปรดปรกษา NMR staff กอนเรมท าการทดลอง - temperature controlled experiment (ท าไดเฉพาะชวงอณหภม 20-80 oC เทานน) - kinetics (arrayed experiments) - 1D NOESY (selective NOE) - 31P และ 31P indirect detection (via HMQC) - 15N indirect detection (via HMQC) อยาท าการทดลองนอกเหนอจากทระบไวในขอ 4-5 ของเอกสารฉบบน รวมทงการทดลองทระบในขอ 9 ขางตนโดยไมปรกษา NMR staff กอนเปนอนขาดโดยเฉพาะอยางยงการทดลองทตองใช temperature และการทดลองทตองมการเปลยนตวแปรแบบ manual อนๆ


-23-

ภาคผนวก 1: จะท าอยางไรดเมอเครอง NMR มปญหา ? (June 2006 revision โดย ธรยทธ วไลวลย)

อาการ: เครองไมมอาการตอบสนองตอค าสง Acqi หรอ Eject สาเหต: เครองเบลอรเนองจากปอนค าสงซ าซอนในขณะทยงท างานเดมไมเสรจ หรอเปดหนาตาง acqi ทงไว วธแกไข: ออกจาก Glide (คลก Exit ใน Glide Menu) แลวพมพค าวา abortallacqs ใน command box กดปม Enter รอสกคร จะไดยนเสยงบบ พมพ su รอสกครจะไดยนเสยงบบอกครง จงเรมท างานตอตามปกต หากไมส าเรจโปรดแจง NMR staff อยาพยายามปดหรอ reset เครองโดยเดดขาด อาการ: เครองไมยอม autolock ให (ขน Status: Find Res คาง) หรอการท า autoshim ไมส าเรจ สาเหต: มหลายสาเหต เชนสารเขมขนเกนไป ระดบตวท าละลายไมเหมาะสม หรอการใชตวท าละลายผสม วธแกไข: หากการเตรยมตวอยางถกตองและเลอกตวท าละลายไมผดไมควรจะเกดปญหาน หากเปนเพราะใชตวท าละลายผสมใหท า manual lock และ manual shim แทนกอนทจะเรม Glide Setup และตงคา Autolock เปน No (ดค าแนะน าการท า manual lock และ manual shim ขางหลง)

อาการ: ปม Acqi หายไปจากเมน สาเหต: เครองเบลอรเนองจากปอนค าสงซ าซอนในขณะทยงท างานเดมไมเสรจ หรอเปดหนาตาง acqi ทงไว วธแกไข: พมพค าสง acqi เพอเรยก acqi window ขนมาแลวท างานตอไดตามปกต

อาการ: หลงจาก shim เสรจเครองไมยอมรนสเปกตรมใหและฟองวา autogain failure สาเหต: สารตวอยางเขมขนเกนไป วธแกไข: 1) เจอจางสารตวอยางลง หรอ 2) ลด pulse width โดยการกลบไปท Custom Menu ของ Glide แลวเลอก pulse angle เปนคาทนอยกวา 45 o (ตองลองผดลองถกด) หรอซอนเมน Glide กอนโดยคลกท Glide Button ตรง Menu Bar ของ VNMR แลวพมพ pw = 3 ใน command box กดปม Enter แลวเรยก Glide กลบมาใหมโดยคลกท Glide Button ซ าอกครง แลวกดปม Go ไดเลย (อยา Setup ใหม เพราะมนจะลางคาทตงไว) หากไมส าเรจลองลด pw ลงเรอยๆ ถง 1 (ตองลองผดลองถกดเชนกน)

อาการ: คณภาพสเปกตรมไมด เชนพกหวแตกหรอม line broadening มาก สาเหต 1: สารตวอยางม paramagnetic impurity หลอดสกปรก หรอระดบตวท าละลายไมถง 5 cm วธแกไข: เตรยมตวอยางใหม สาเหต 2: ผใชคนกอนปรบเปลยนคา shim setting ผดไปมาก วธแกไข: แจง NMR staff

อาการ: หลอด sample แตกในเครอง สาเหต: หากไมไดเกดจากการหยอนตวอยางลงเครองขณะทไมมเสยงลมกแสดงวาเกดจาก spinner ทเสยบหลอดหลวม หรออาจเปนความบกพรองของเครอง ซงพบบางเปนครงคราว วธแกไข: ตดปายหามใชเครองเดดขาด (หากมการแตกซ าสองจะเปนอนตรายตอ probe มาก) และแจง NMR staff โดยดวนทสด

หากการแกไขเบองตนไมส าเรจหรอกรณฉกเฉนกรณาตดตอ NMR Staff ส าหรบการปดหรอ reset เครอง NMR Workstation หรอ NMR console จะท าในกรณทเครองคาง ไฟดบ หรอ maintenance เทานน และตองปรกษา รศ.ดร.ธรยทธ วไลวลย (โทร. 083 9868772 หรอ 87627) หรอ รศ.ดร.สมใจ เพงปรชา (โทร. 086 5888135) ทกครง


-24-

ภาคผนวก 2: ค าแนะน าการท า manual lock และ manual shim (เมอ gradient autoshim ไมส าเรจเทานน) (June 2006 revision โดย ธรยทธ วไลวลย)

1. ตรวจสอบวาเครองอยในสถานะ Idle 2. คลกทปม Acqi ในเมนบาร หรอพมพ acqi ใน text input box 3. ในหนาตาง acqi คลกท [Lock] button จะเหนจอภาพดงน

- คลกปม [Lock] = off - คลกทปม Eject/Insert เพอเปลยน sample ปกตไมตองใช spin แตถาจะใช spin ใหตง spin=16 แลวรอจนไฟเขยวตด - เรมตนตงคา Z0 ตามทก าหนดของตวท าละลายแตละชนด ปรบคา Z0 ทละ +/- 1 หรอ +/- 4 หนวยจนกระทงสญญาณบนจอเปนเสนเรยบหรอมลกษณะคลายกบในรป แลวคลก [Lock] = on หากสญญาณเปนรปคลนแสดงวายงหา Z0 ไมถกตอง คา Z0 ไมควรจะตางจากคาทก าหนดเกนกวา +/- 10 หนวย - หากคลก [Lock] = on แลวไมขนตวสเขยววา Locked ใหปรบ lock power และ lock gain ขน แตไมใหคาทงสองเกน 80 % ของ maximum - เมอลอกส าเรจปรบปม lock power, lock gain จนได lock level ประมาณ 50 หามยงกบปมอน

4. คลกทปม [Shim] จะม option ใหเลอกวาเปน manual หรอ auto หากทราบวธการShim แบบ manual อาจทดลองปรบคา Z1, Z2, Z1C และ Z2C ได เพอใหได Lock level สงทสด (ดทตวเลข current lock level) หามปรบคาอนเปนอนขาด แตตามปกตควรใหเครองท า autoshim จะดกวา โดยคลก auto จะเหนหนาจอดงรป - ตรวจสอบทสองบรรทดลางของจอภาพวาเปน L>M และ Z1-Z2 ถาไมใชใหเลอกตงคาตามนโดยใชเมาสปมขวาคลกทเครองหมายลกศร - คลกปม [start] แลวรอสกครปมจะเปลยนเปน [stop] เครองจะ shim ให ระหวางการ shim การลอกอาจจะหลดไปได แตเมอ shim เสรจแลวจะกลบมาอยในสถานะลอกเหมอนเดมเอง เมอ shim เสรจหนาจอจะกลบมาเปนค าวา [start] เหมอนเดม 5. ปดหนาตาง acqi โดยคลกท [close] 6. เรยกใชงาน Glide ตามปกตโดยเลอกชนดของตวท าละลายทเหมาะสม ตงคา Autolock = No และ Autoshim = No จากนนท างานตอไดตามปกต

Documents

Revised 12 Jun 2012 by Tirayut Vilaivan คู่มือการใช้ ... · คู่มือการใช้เครื่อง Varian Mercury+ 400 NMR Spectrometer