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1
Riarrangiamento genico
2
3 quesiti per la comprensione
Ø l’esistenza della enorme variabilità (diversità) del sito combinatorio; il repertorio anticorpale è dato da tutte le specificità anticorpali disponibili in un individuo. Nell’uomo, diversità totale > 107.
Ø l’esistenza nello stesso anticorpo di una parte variabile ed una costante;
Ø l’esistenza di diversi isotipi con la stessa specificità nella regione variabile.
3
2 teorie
1. La teoria germinale (un gene per ciascuna diversa catena immunoglobulinica, repertorio in gran parte ereditato). Beadlee Tatum nel 1941
2. La teoria della variabilità somatica (modificazioni durante la vita di un individuo, partendo da un numero limitato di geni). Dreyer e Bennet nel 1965
4
- Sequenza di DNA codificante è generata dal riarrangiamento di un numero relativamente piccolo di segmenti genici ereditati.
- Diversificazione aumentata attraverso processo di ipermutazione somatica che avviene nelle cellule B mature attivate
geni Ig clonati: entrambe le teorie valide
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Tonegawa e Hozumi (1976)Susumu Tonegawa: Premio Nobel 1987 per la scoperta del meccanismo genetico alla base della diversità anticorpale
RE= enzimi di restrizione
Nelle cellule B, i geni delle Ig sono riarrangiati
Southern
6
Immunità umorale = immunità mediata dagli anticorpiMidollo osseo Organi secondari
BCR funzionale del linfocita maturo naïve
Gli anticorpi prodotti dalla plasmacellula hanno la stessa specificità antigenica di quelli espressi sulla
membrana della cellula B (BCR)
7
Fase Ag-indipendente
Fase Ag-dipendente
SELF NON - SELF
Stadi di maturazione dei linfociti
Ag non self
9
Meccanismi per determinare la diversità del repertorio
1. Diversità combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversità giunzionale
3. Diversità nell’associazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfoidi centrali
Organi linfoidi periferici
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Meccanismi per determinare la diversità del repertorio
1. Diversità combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversità giunzionale
3. Diversità nell’associazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfoidi centrali
Organi linfoidi periferici
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3
Geni Ig = famiglie multigeniche = diversi segmenti genici nell’uomo
Chromosoma 2 22 14
Regione Variabile110 aa
95-101 aa
~13 aa
Configurazione germinale del DNA per catene pesanti e leggere =famiglie multigeniche distinte, localizzate su cromosomi differenti
4
Organizzazione multigenica dei geni delle immunoglobulinesegmenti genici = molteplici sequenze codificanti separate da sequenze non codificanti.
VH: V, D, J
VL: V, J
Cl4Jl4
13
Riarrangiamento della catena pesante µ
LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40 JH 1-6
DNA germinaleDH1-25 Cµ
Ricombinazione DJEs: DH25-JH4
LH1 VH1 LH2 VH2 LH VH~40 CµJH4 JH5 JH6DH25
VH2LH2Ricombinazione V-DJEs: VH2-DJ
CµJH4 JH5 JH6DH25
RNA trascritto primarioCµVH2LH2 JH4DH25
AAA
mRNADJVL Cµ
AAA
Trascrizione
Splicing
14
Riarrangiamento genico o ricombinazione somatica della catena leggera K
DNA riarrangiato della catena K
JVL C
LK1 VK1 LK2 VK2 LK3 VK3 CKLK VK~40 JK 1-5
DNA germinale
Ricombinazione VJ Es: Vk1-Jk3
VK1LK1 CKJK3JK3 JK4 Jk5
JVL C
AAA RNA Trascritto primario
JVL C
AAA
Trascrizione
SplicingmRNA
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Meccanismi per determinare la diversità del repertorio
1. Diversità combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversità giunzionale
3. Diversità nell’associazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfoidi centrali
Organi linfoidiperiferici
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Sequenza nucleotidica delle RSS (Recombination Signal Sequence)
RSS a due giri RSS a un giro
eptamero eptamerononamero nonamero
RSS= eptameri e nonameri palindromici conservati
Sequenze spaziatrici= 12 o 23 paia di basi
Sequenze spaziatrici a 12 paia di basi= un giro dell’elica del DNA
Sequenze spaziatrici a 23 paia di basi= due giri dell’elica del DNA
Meccanismi della ricombinazione somatica
17
5
REGOLA 12/23
Localizzazione delle RSS nel DNA germinale delle Ig
5% Ac: D-D
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I segmenti genici della regione V sono riuniti grazie alla ricombinazione V(D)J
Azione di ricombinasi = RAG-1e RAG-2 (RecombinationActivating Genes)
KO nel topo = SCID (SevereCombined ImmunoDeficiency)
Mutazioni nell’uomo: sindromedi Omenn
Stesso orientamento trascrizionaleOrientamento trascrizionale in direzioni opposte (50% dei geni Vk nei confronti di Jk)Esoni V e J:
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Ricombinazione V(D)J
1. Sinapsi
2. Taglio
3. Apertura (delle hairpin) eprocessamento delle estremità
4. Unione
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Geni implicati nella recombinazione VDJ:
Ku70:Ku80
Proteina chinasi DNA dipendente (DNA-PK)
Artemis la cui inattivazione è responsabile di SCID nell’uomo
Tetramero di RAG-1 e RAG-2.RAG-1 taglia 1 filamento solo quando complessato a RAG-2Taglio tra eptamero e segmento genico
1 2
3
21
7.1
Proteina chinasi DNA dipendente (DNA-PK)
Artemis la cui inattivazione è responsabile di RS-SCID nell’uomo
3
4
Non svolge più nessun ruolo
22
8
Aggiunta dei nucleotidi N ad opera dell’enzima TdT (trasferasi deossinucleotidilterminale)
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Riarrangiamento produttivo
Riarrangiamento non produttivo
Flessibilità giunzionale
Due su tre riarrangiamenti non sono produttivi
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Meccanismi per determinare la diversità del repertorio
1. Diversità combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversità giunzionale
3. Diversità nell’associazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfoidi centrali
Organi linfoidiperiferici
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Fattori che contribuiscono alla generazione della diversità del repertorio anticorpale
catene
N° geni della linea germinale H k l
V 40 40 30D 25 0 0J 6 5 4
Ricombinazione 40 x 25 x 6 = 6000 40 x 5 = 200 30 x 4 = 120
Associazione catene H e L 6000 x (200 + 120) = 1,9 x 106
28
12
Cellule B Cellule TMeccanismo comune a Ig e TCR:
29
V J
I CDR sono collocati in anse che fuoriescono dalla struttura ripiegata e sono le regioni principalmente coinvolti nel legame all'antigene
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Meccanismi per determinare la diversità del repertorio
1. Diversità combinatoria (presenza di molti segmenti genici V, D, J nel DNA germinale)
2. Diversità giunzionale
3. Diversità nell’associazione tra la catena pesante e leggera
4. Ipermutazione somatica
Prime fasi di maturazione, negli organi linfatici centrali
Organi linfatici periferici
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Fase Ag-indipendente
Fase Ag-dipendente
La risposta umorale
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mIgM
sIgM
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L’ipermutazione somatica = diversificazione nella regione variabile
riarrangiata = aumento specificità
Le mutazioni somatiche aumentano con il numero di immunizzazione
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V J
CDRs show high variability and are mostlyresponsible for epitope binding
Le cellule B che producono Ac con affinità maggiore per l’Ag dopo ipermutazione somatica sono selezionate positivamente
Mancanza di CitidinaDeaminasiIndotta dall’Attivazione (AID) blocca l’accumulo di mutazioni somatiche
Frequenza ipermutazione somatica:
1 mutazione in 1000 bp di V(D)J per divisione cellulare (1000 volte superiore a quella di qualsiasi altro gene di mammifero) quindi circa 1 mutazione per regione variabile per divisione cellulare
36
21Diversificazione secondaria del
repertorio di anticorpi
No nell’uomo
Meccanismi tutti iniziati da AID(Activation InducedDeaminase) :citidina deaminasiindotta dall’attivazione
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Mancanza di AID blocca completamente l’ipermutazione somatica e lo scambio isotipico
ed è associato a immunodeficienza: sindrome da iper IgM di tipo 2.
Ruolo della citidina deaminasi indotta dall’attivazione (AID)
Nucleotide = nucleoside (base azotata + zucchero) + fosfato
Deaminazione del nucleoside: citidina in uridina
Attivazione meccanismi riparazione DNA : discordanza, escissione di base
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AID introduce mutazioni nei geni trascritti nelle cellule B
Pirimidina: T-C
Purina: G-A
regioni di scambio in 5’ degli esoni per le regioni costanti delle catene pesanti eccetto Cd
Riparazione di escissione di base
Creazione di un sito abasico
AID is essential for both somatic hypermutationand isotype switch
Mutations in AID lead to hyper-IgM syndrome (type 2)
The presence of Uridine at the previous C:G pair can trigger several types of DNA repair
Modificazioni nella struttura anticorpale durante la risposta umorale
mIgM
sIgM
AID essenziale
(regione V)
AID essenziale
(regioni S)
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27
Meccanismo dell’isotype switch = (S)cambio di classe
DSBR = Double Strand Break Repair
regioni S (1 to 10 Kb) presenti in 5’ degli esoni per le regioni costanti delle catene pesanti eccetto Cd
Es: da IgM a IgE
Generazione di trascritti sterili I
42
27.1
Cambio di classe: generazione di Ac con la stessa specificità antigenica ma funzioni effettrici diverse
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Isotype switch = (S)cambio di isotipo Locus murino
Ricombinazione tra sequenze S
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mIgM
sIgM
Variazioni strutturali delle regioni costanti
AID essenziale
(regione V)
AID essenziale
(regioni S)
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Ig di membrana e secretoria
Utilizzo degli esoni MC (membrane coding ) o SC (secretion coding) per splicing alternativo del RNA
CD79a/b
La coespressione di IgM e IgD avviene tramite alternative splicing
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Modificazioni dei geni dei linfociti: Ig per le cellule B, TCR per le cellule T
di classe