Research Collection

Doctoral Thesis

Ueber die d-Glucuronsäure und den Zuckerteil derGlyzyrrhizinsäure

Author(s): Spitz, Daniel

Publication Date: 1951

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000091279

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ETH Library

Prom. Nr. 1963

Über die D-Glucuronsäure und

den Zuckerteil der Glyzyrrhizin-säure

VON DER

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

IN ZÜRICH

ZUR ERLANGUNG DER WÜRDE EINES

DOKTORS DER TECHNISCHEN WISSENSCHAFTEN

GENEHMIGTE

PROMOTIONSARBEIT

VORGELEGT VON

Daniel SpitzDipl. Ing. Chem.

aus Straßburg

Referent : Herr Prof. Dr. V. Prelog

Korreferent: Herr Priv.-Doz. Dr. E. Hardegger

v )

Zürich 1951

Dissertationsdruckerei Leemanu AG.

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Meinen hochverehrten Lehrern,

Herrn Prof. Dr. L. RUZICKA,

unter dessen Leitung ich gearbeitet habe, und

Herrn P.-D. Dr. E. HARDEGGER,

der mir bei der Ausführung dieser Arbeit unermüdlich

beigestanden ist, möchte ich meinen herzüchsten Dank

aussprechen.

3

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Inhaltsverzeichnis

Theoretisoher Teil 7

Nomenklatur und Einleitung 7

Vorkommen der d-Glucuronsäure in Naturstoffen 9

Chemische Eigenschaften und Derivate der d-Glucuronsäure 18

Identifizierung und Nachweis der d-GIucuronsäure in Naturprodukten. 25

Herstellung und Synthesen der d-Glucuronsäure 27

Eigene Versuche 33

Experimenteller Teil 44

Derivate des a-Methyl-d-glucuropyranosids 44

Derivate des jS-Methyl-d-glucuropyranosids 50

Untersuchungen am Diuronid C15H21013 der Glyzyrrhizinsäure .... 55

Derivate der Trioxyglutarsäuren 63

Zusammenfassung 68

5

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Theoretischer Teil

Nomenklatur und Einleitung

Die Üronsäuren leiten sich von den Monosacchariden ab. Rein

formal kann jedes Monosaccharid (Hexose, Pentose usw.) in die

zugehörige Uronsäure dadurch umgewandelt werden, dass jenes end¬

ständige primäre Carbinol zum Carboxyl oxydiert wird, das von

der reduzierenden Gruppe des Monosaccharids am weitesten ent¬

fernt ist. Die Üronsäuren weisen somit die reduzierende Gruppeund alle asymmetrischen Kohlenstoffatome des zugehörenden Mo¬

nosaccharids auf. Von den Hexosen lassen sich insgesamt 24 op¬

tisch aktive Hexuronsäuren ableiten, nämlich 8 1- und 8 d-Formen

der Alduronsäuren und je 4 d- und 1-Formen der Keturonsäuren.

Die Nomenklatur der Alduronsäuren bereitet im allgemeinenkeine Schwierigkeiten; so ist es leicht ersichtlich, dass den sich von

d-Glucose (I), d-Mannose (II), d-Galactose (III) ableitendenÜron¬

säuren die Strukturformeln Ia (d-Glucuronsäure), IIa (d-Mannuron-

säure) und lila (d-Galacturonsäure) zukommt.

CHO

-OH

HO- HO-

OH

OH

CH2OH

I

CHO CHO

-OH HO

HO

-OH

-OH

COOH

Ia

CHO

HO-

HO-

-OH

-OH

CH2OH

II

CHO CHO

-OH -OH

HO- HO-

-OH HO- HO-

-OH -OH -OH

COOH CHaOH COOH

IIa III lila

7

Die Keturonsäuren sind in der älteren Literatur teilweise unrich¬

tig1) bezeichnet. Der von d-Fructose (IV) sich ableitenden d-Fruc-

turonsäure kommt die Formel IVa zu und nicht Formel IVb,

welche als Fructosonsäure zu benennen ist.

HO-

c

(

H,OH

:o

CH,OH

AoCOOH

1CO

— HO- HO-

-OH -OH -OH

-OH -OH -OH

CH2OH COOH CHaOH

IV IVa IVb

Grössere Schwierigkeiten ergeben sich in der Formulierung der

der Apiose (V) zugehörigen Uronsäure (Apiuronsäure), bei der vor¬

läufig nicht entschieden werden kann, ob ihr Formel Va oder Vb

zugeschrieben werden soll,

HOH,C-

CHO (3HO ()HO

-OH -OH -OH

-OH HOH2C- -OH HOOC- -OH

CH2OH COOH CH2OH

V \ra ,\Th

Es ist bekannt, dass z.B. die Hexosen in fünf verschiedenen

Formen Umsetzungen eingehen können, nämlich in der offenket-

tigen Form und in der pyranoiden bzw. furanoiden Halbacetal-

form mit a- oder ^-Konfiguration desjenigen Kohlenstoffatoms,

welches die reduzierende Gruppe trägt.Bei den Uronsäuren wird die Zahl der Isomeren noch weiter

erhöht, indem die Carboxylgruppe frei oder als y- bzw. 8-Lacton

vorliegen kann. Die Mannigfaltigkeit der Umsetzungen der Uron-

l) C. G. Andersen, W. Charlton, W. N. Haworth und V. St. Nicholson, Soc.

1929, 1337.

8

säuren wird dadurch noch grösser als jene der Aldosen und Ketosen,und auch die Carboxylgruppe kann an Umsetzungen teilnehmen.

Die Anzahl der praktisch möglichen Uronsäuren-Derivate ist aus

sterischen Gründen aber meist ziemlich beschränkt.

Uronsäuren sind besonders gegenüber Alkali und auch gegen

Mineralsäuren empfindlich und werden von beiden weitgehend zer¬

stört. Diese Empfindlichkeit der Uronsäuren erklärt die grossen

Schwierigkeiten ihrer Identifizierung und Isolierung aus Natur¬

stoffen. Bis heute wurden nur drei natürlich vorkommende Uron¬

säuren aufgefunden und genauer untersucht, nämlich d-Glucuron-,

d-Mannuron- und d-Galacturonsäure. Die übrigen Uronsäuren sind

wohl synthetisch herstellbar; einige sind auch in Form von Deriva¬

ten hergestellt, aber nicht genau erforscht worden.

Von den drei natürlich vorkommenden Uronsäuren ist die d-

Glucuronsäure am schwierigsten zugänglich. Sie scheint in meh¬

reren Naturstoffen enthalten zu sein, doch ist ihre Identifizierungbisher nur in wenigen Fällen geglückt (Zuckerrübensaponin, He¬

parin etc.).In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Herstellungs¬

weise der d-Glucuronsäure zu vereinfachen und zu verbessern und

ihre Identifizierung an Hand neuer leicht zugänglicher Derivate zu

erleichtern. Zu Vergleichszwecken wurden auch d-Galacturon- und

d-Mannuronsäure soweit nötig in die Untersuchungen einbezogen.Die an Glucuronsäure gesammelten Erfahrungen wurden zur Iden¬

tifizierung der noch unbekannten reduzierenden Säuren des Zucker¬

teiles der Glyzyrrhizinsäure verwertet.

Im theoretischen Teil meiner Dissertation gebe ich eine aus¬

führliche Zusammenfassung der Literatur über d-Glucuronsäure.

Vorkommen der d-Glucuronsäure in Naturstoffen

Die d-Glucuronsäure ist im Tier- und Pflanzenreich weit ver¬

breitet, kommt jedoch nie frei vor, sondern meist in glykosidischer

Bindung als Glucuronid oder als Polysaccharid; seltener findet sie

sich mit der Oxygruppe am G1 und organischen Säuren verestertvor.

9

A. Im animalischen Organismus

d-Glucuronsäure findet sich in gebundener Form in Mensch und

Tier als natürliches Stoffwechsel- und Ausscheidungsprodukt. Der

Harn eines gesunden Menschen enthält etwa 0,03 g gebundene d-

Glucuronsäure im Liter2). Wenn man dem Organismus phenolischeoder alkoholische Giftstoffe zuführt, so werden diese oft in Form

von Glucuroniden im Harn ausgeschieden. Die älteren Arbeiten

über diese „gepaarten Glucuronsäuren" sind in Abderhalden's Bio¬

chemisches Handlexikon3), ferner bei C. Oppenheimer*) und bei

C. Neuberg5) zusammengefasst.Als einfache Beispiele „gepaarter Glucuronsäuren" seien hier

erwähnt :

a) Das Phenol-d-glucuronid, welches nach Eingabe von Phenol

an Hunde im Harn ausgeschieden wird6). Phenol-d-glucuronidkonnte aus Acetobromglucuron und Phenolkalium synthetisch her¬

gestellt werden7). Das synthetische Präparat erwies sich identisch

mit dem natürlichen Ausscheidungsprodukt, welches somit als Phe-

nol-ß-d-glucuronid bezeichnet werden muss.

b) Der im Harn von mit Mango-Blättern gefütterten Kühen vor¬

kommende Farbstoff Indischgelb, Piuri oder Euxanthinsäure8), der

das Magnesiumsalz eines Euxanthonglucuronids darstellt. Das Prä¬

parat konnte aus Acetobromglucuron, Euxanthon und Kalium-

hydroxyd in Methanollösung ebenfalls synthetisch gewonnen

werden7).

c) (—)-Menthol-j8-d-glucuronid, das im Harn von Kaninchen

nach Verabreichung von (—)-Menthol ausgeschieden wird9).

2) J. Bénech, C. r. Biol. Ch. 15, 69 (1913).

3) Bd. II (Berlin 1911) S. 521; VIII (Berlin 1914) S. 275; X (Berlin 1923)S. 718.

4) O. Oppenheimer, Handbuch der Biochemie des Menschen und der

Tiere, II. Auflage (Jena 1924) Bd. I, 535; II 517, 607; V 568.

5) Der Harn (Berlin 1911) S. 437.

6) E. Külz, Z. Biol. 27, 247 (1890). C. Neuberg, Bio. Z. 2, 307 (1907).

') O. Neuberg und W. Neimann, Z. physiol. Ch. 44, 114 (1905).

8) O. Grabe, Ann. 254, 267 (1889); K. U. Lefèvre und B. Tollens, B. 40,

4519 (1909); A. Robertson und B. B. Waters, Soc. 1931, 1709.

9) C. Neuberg und S. Lachmann, Bio. Z. 24, 419 (1910); F. Ehrlich und

K. Behorst, B. 58, 1989 (1925).

10

Ferner werden nach neueren Untersuchungen10) auch aroma¬

tische Kohlenwasserstoffe nach vorgängiger Hydroxylierung im Or¬

ganismus, Sulfonamide, Salicylate und einige Sexualhormone als

Glucuronide im Harn ausgeschieden.Die Struktur der nach Fütterung mit Benzoesäure im Hunde-

harn neben Hippursäure auftretenden 1-Benzoyl-ß-d-glucuronsäurewurde durch Herstellung eines identischen Produktes aus Aceto-

bromglucuronsäuremethylester und Silberbenzoat sichergestellt11).Während die Rolle der Glucuronsäure als natürlich vorkommen¬

des Stoffwechselprodukt im Harn schon früher eingehend unter¬

sucht wurde, erkannte man erst in neuerer Zeit die Glucuronide

als Bausteine der Mucopolysaccharide12). Einige Mucopolysaccha¬ride enthalten etwas Protein chemisch gebunden. Sie zeigen in wäss-

riger Lösung eine grosse Viskosität und kommen in Speichel, Serum,

Magensaft, Auge, Knorpel, Bindegewebe, Gelenkflüssigkeit, Nabel¬

schnur, Haut, Nervenscheide, Gelenkkapsel, Sehne, Wänden der

Blutgefässe und in der interzellularen Zementsubstanz vor. Viele

andere Organe und Körpersäfte scheinen ebenfalls Mucopolysaccha¬ride als Bausteine zu enthalten. Einige der besser untersuchten

Mucopolysaccharide sind: die Hyaluronsäure, das Heparin und das

Chondroitinsulfat.

Die Hyaluronsäure wurde aus Bindegewebe, Gelenkflüssigkeit,Nabelschnur, Auge und Haut isoliert13). Als körpereigene Verbin¬

dung wirkt sie nicht als Antigen. Aus Untersuchungen von Meyerund Palmeru) geht hervor, dass die Hyaluronsäure ein Polysaccha¬rid darstellt, das aus gleichen Teilen N-Acetyl-glucosamin und

d-Glucuronsäure besteht.

10) Chem. and Eng. News, 28, 45 (1950).

u) A. J. Quick, J. biol. Ch. 69, 549 (1926), Biochem. J. 28, 403 (1934);J. Pryde und R. T. Williams, Biochem. J. 28, 1210 (1933); R. D. Hotchkiss

und W.F.Goebel, J. Biol. Ch. 115, 285 (1936); 122, 650 (1937).

12) W. W. Pigman und R. M. Ooepp, Chemistry of the Carbohydrates

(New York 1948), S. 602; M. Stacey, Advances in Carbohydrate Chemistry 2,

161 (1946); T. H. Evans und H. Hibbert, ibid. 2, 203 (1946); P. A. Levene,

Hexosamines and Mukoproteins (London 1926).

13) Vgl. Fussnote 12), und Y. Clement, Diss. E.T.H. (erscheint dem¬

nächst).

14) K. Meyer und J. W. Palmer, J. Biol. Chem. 107, 629 (1934).

11

Heparin ist ein natürlicher gerinnungshemmender Bestandteil

des Blutes und findet sich in Leber, Herz und Muskeln. Es wurde

von McLean 1916 entdeckt15) und von Howell und Holt Heparin

genannt16). Seine Struktur ist weitgehend aufgeklärt. Jorpes17) und

Wolfromls) zeigten, dass im Heparin der Schwefelsäureester eines

Polysaccharids vorliegt, das aus gleichen Teilen d-Glucosamin und

d-Glucuronsäure aufgebaut ist.

Chondroitinsulfat ist der Hauptbestandteil des Knorpelgewebes.

Levenew) und Bray20 versuchten, die Konstitution des Chondroitin-

sulfates aufzuklären, wobei es gelang, als Abbauprodukte des Poly¬saccharids Derivate der Glucuronsäure, N-Acetyl-chondrosamin und

Schwefelsäure zu isoHeren.

Physiologische und therapeutische Bedeutung der d-Glucuronsäure

bzw. ihres Lactons

Die Rolle der Glucuronsäure in Mensch und Tier als natürliches

Ausscheidungsprodukt und Entgiftungsmittel ist schon vor langerZeit beobachtet worden. Sie schützt die Zellen vor Vergiftung durch

Fremdstoffe21). Im Organismus wird sie nicht aus Glucose durch

endständige Oxydation erzeugt. Wahrscheinlich wird die Glucuron¬

säure je nach Bedarf aus den Mucopolysacchariden freigemachb.Wird der Ablauf des Entgiftungsmechanismus gestört, so kommt

es zu Krankheitserscheinungen.1947 wurde von einem amerikanischen Arzt22) die Meinung ge¬

äussert, dass die krankhafte Zerstörung des Knorpels und der Kno¬

chen einem Mangel an der vom Körperstoffwechsel benötigten Glu¬

curonsäure zuzuschreiben ist Diese Stoffwechselstörung würde

15) J. McLean, Ann. J. Physiol. 41, 250 (1916).

«) H. W.Howell und E.Holt, Ann. J. Physiol. 47, 328 (1928); 63, 434

(1923); 71, 553 (1925).

17) E. Jorpes, Biochem. J. 36, 203 (1942).

1S) M. L. Wolfrom und W. H. McNeely, Am. Soc. 67, 748 (1945); M. L.

Wolfrom und A. H. Rice, Am. Soc. 68, 532 (1946).

») P. A. Levene, J. Biol. Chem. 140, 267 (1941).

20) H. G. Bray, J. E. Gregory und M. Stacey, Biochem. J. 38, 142 (1944).

21) C. Oppenheimer, Biochemie der Menschen und der Tiere.

2Ï) E. A. Petermann, Journal-Lancet (1947), 451; vgl. dazu Chem. and

Eng. News, 28, 45 (1950); J.H.Hodas, Joutnal-Lancet (1947), 385.

12

Knorpelkrankheiten wie z.B. Arthritis verursachen, wobei jedochdie Gründe der primär vorhandenen Stoffwechselstörung noch un¬

bekannt sind. In Ausweitung dieser Theorie wurde nun die Arthri¬

tis als eine Mangelkrankheit mit d-Glucuron behandelt.

Ausgedehnte klinische Anwendungen von d-Glucuron konnten

60% der Arthritisfälle beeinflussen. 30% verliefen sehr gut, 25—

30% gut. Die übrigen Fälle blieben unverändert.

Weitere Eigenschaften als die Entgiftung im Körper scheinen

den niedrig molekularen Uroniden nicht zuzukommen. Im Gegen¬satz dazu weisen die Glucuronsäure enthaltenden Mucopolysaccha¬ride zum Teil höchst spezifische Funktionen auf, wie z.B. in der

Hemmung der Blutgerinnung, in der Abwehr von bakteriellen In¬

fektionen, in der Spezifität der Blutgruppen. Sie spielen auch eine

wichtige Rolle in der Befruchtung, in der Widerstandsfähigkeit der

Magenschleimhaut gegen Selbstverdauung, in der Impermeabilitätder Blutgefässe etc.

B. Im Pflanzenreich

Glucuronsäure ist bis jetzt ausschliesslich in glykosidischer Bin¬

dung, nie als Glucuronat und nie mit organischen Säuren verestert

aufgefunden worden. Bei den pflanzlichen Glucuroniden hat man

zu unterscheiden zwischen niedermolekularen, den Glykosiden ver¬

gleichbaren Substanzen und Verbindungen vom Typus der Poly¬saccharide. Alle bisher im Pflanzenreich aufgefundenen Glucuronide

sind nicht dialysierbar. Sie weisen demnach ein Molekulargewichtvon mindestens 500 auf und gehören ausschliesslich in die Gruppeder Saponine. Auf Grund der Literaturangaben sollen z.B. folgende

Saponine Glucuronsäure im Zuckerteil enthalten:

Das Zuckerrübensaponin23), welches aus 1 Mol Oleanolsäure und

1 Mol d-Glucuronsäure besteht; das Jegosaponin24), das Kastanien-

saponin25), das Githagin26) und das a-Taralin27). Unter den erwähn-

23) K. Rehorat, B. 62, 519 (1929).

a4) C. Mataunami, J. pharm. Jap. 1927, 87.

25) A. W. van der Haar, Rec. 1923, 1080.

29) E. Wedekind und R. Krecke, Z. physiol. Ch. 155, 122 (1926).

27) S. Kuwata, J. pharm. Jap. 51, 7 (1931).

13

ten Saponinen ist Glucuronsäure einzig aus Zuckerrübensaponin in

Form ihres Lactons isoliert worden, während sich in den übrigen

Saponinen ihr Nachweis auf wenig zuverlässige Farbreaktionen

stützt.

Die Anwesenheit der Glucuronsäure wurde ferner in der Glyzyr-rhizinsäure, dem kristallisierten glykosidischen Bestandteil des Süss-

holzes vermutet, dann wieder in Abrede gestellt. In den eigenen

Untersuchungen wurde der Zuckerteil der Glyzyrrhizinsäure ge¬

nauer untersucht, weshalb sich eine eingehendere Besprechungdieser Verbindung rechtfertigt.

Die Glyzyrrhizinsäure28)

Die Glyzyrrhizinsäure ist ein Glykosid, das im Süssholz vor¬

kommt und darin bis zu einer Menge von 5% enthalten sein kann.

Sie zeigt die meisten für die Saponine charakteristischen Eigen¬schaften; sie geliert in sehr verdünnten Lösungen, besitzt keinen

scharfen Schmelzpunkt und lässt sich nur schwer reinigen29)30).Die Glyzyrrhizinsäure verhält sich wie eine dreibasische Säure

der Bruttozusammensetzung C42H62016. Zu ihrer Charakterisierung

eignet sich ihr gut kristallisierter Trimethylester. Die freie Säure

kann unter geeigneten Bedingungen in kristallisierter Form erhal¬

ten werden31).Zur Gewinnung der Glyzyrrhizinsäure wird die Süssholzwurzel

mit Wasser extrahiert und der saure Extrakt in die Kalium-, Am¬

monium- oder Bariumsalze übergeführt.Bei der Freilegung der Säure aus ihren Salzen treten die für die

Saponine charakteristischen Hindernisse auf: die aus den Ammo¬

nium-, Kalium- oder Bariumsalzen mit Schwefelsäure freigelegten

28) Anmerkung bei der Korrektur: Nach Abschluss meiner Arbeit publi¬zierten B. Lythgoe und S. Tripett, Soc. 1950, 1983, ihre Untersuchung über

"The Constitution of the Disaccharide of Glycyrrhinic Acid". Das Disaccha-

rid besteht nach diesen Autoren aus 2 Mol D-Glucuronsäure, die in Stellung2-glykosidisch miteinander verbunden sind.

29) A. Tschirch und H. Cederberg, Arch. Pharm. 245, 97 (1907).

30) L. Koffer, Die Saponine, in 6. Klein, Handbuch der Pflanzenanalyse,II, 2, S. 1131, Wien (1932).

31) W. Voss, P. Klein und H. Sauer, B. 70, 122 (1937).

14

Präparate" sind mit anorganischen Bestandteilen noch stark ver¬

unreinigt32). Besser verläuft die Zerlegung des Kaliumsalzes in

wässrig-methanolischer Lösung mit PerChlorsäure, Abfiltrieren des

gebildeten Kauumperchlorats und erschöpfender Elektrodialyse der

Lösung. Am besten hat sich jedoch die Verwendung von Kunst-

harz-Ionenaustauchern, die ein völüg aschfreies Produkt liefern,

bewährt.

Spaltung in Aglukon und Zucker

Zucker- O

HCl

MeOH

/\C00H

I Glyzyrrhizinsäure

II Diuronid

C15H24OU

III Glyzyrrhetinsäure-methylester

C31H48O4

/^COOCH,

Das aus der Glyzyrrhizinsäure (I) 042H62016 erhaltene Aglucon

C30H46O4 wird als Glyzyrrhetinsäure bezeichnet. Bei der Methano-

32) Diss. J. Ringel, S. 8, Breslau (1939).

15

lyse wird die Glyzyrrhetinsäure in Form ihres gut kristallisieren¬

den Methylesters III erhalten.

Der Zuckerteil der Glyzyrrhizinsäure weist 2 Carboxyle auf33).Er setzt sich aus 2 Mol Dehydrohexonsäure C6H10O7 zusammen, die

noch nicht identifiziert werden konnten. Die ersten Versuche einer

sauren Hydrolyse der Glyzyrrhizinsäure durch Kochen mit ver¬

dünnter Schwefelsäure gehen auf A. Tschirch und 8. Gauchmann

zurück34). Auf Grund von wenig spezifischen Farbreaktionen, nicht

reproduzierbaren Versuchen und nicht analysierten Derivaten glaub¬ten diese Forscher, die Anwesenheit von 2 Mol d-Glucuronsäure im

Zuckerteil der Glyzyrrhizinsäure bewiesen zu haben.

Als erster äusserte F. Bergmann35) Zweifel an der Natur der

reduzierenden Säuren des Zuckerteils der Glyzyrrhizinsäure. Er

schloss auf Grund der Drehungswerte eines Bariumsalzes auf die

Anwesenheit von Mannuronsäure.

Es ist das Verdienst von Voss und Pfirschke36), die Vorgänge bei

der sauren Hydrolyse der Glyzyrrhizinsäure untersucht zu haben.

Während andere natürliche Glucuronide oder Polyuronide durch

Mineralsäuren hydrolysiert werden und aus den Produkten der Hy¬

drolyse die Uronsäure ohne grosse Zersetzung isoliert werden kann,bildet die Glyzyrrhizinsäure eine Ausnahme: sie wird wohl durch

1-proz. Schwefelsäure hydrolysiert, jedoch wird die enthaltene Uron¬

säure bis auf wenige Prozente zerstört, was sich an der Kohlen -

dioxydentwicklung quantitativ verfolgen lässt. Aus der Überlegung,dass allgemein durch Veresterung zersetzlicher Carbonsäuren deren

Zerfall unter Abspaltung von Kohlendioxyd verhindert wird, ver¬

suchten sie, die Spaltung der Glyzyrrhizinsäure bei niedriger Tem¬

peratur durch Methanolyse mit 3-proz. methanolischer Salzsäure

zu bewirken. In der Tat wird die Glyzyrrhizinsäure auf diese Weise

unter Zurückdrängung sekundärer Zersetzungen in kristallisierten

Glyzyrrhetinsäure-methylester (III) und Zuckerteil gespalten.

33) Vgl. die quantitativen Uronsäurebestimmungen, P. Karrer, W. Karrer

und J. C. Ghao, Helv. 4, 100 (1921).

34) A. Tschirch und S. Gauchmann, Arch. Pharm. 246, 554 (1908).

3B) F. Bergmann, Biochem. Z. 267, 304 (1933).

u) W. Voss und J. Pfirschke, B. 70, 132 (1937).

16

Aus dem Zuckerteil lässt sich etwa */3 in Form eines gut kri¬

stallisierenden Diuronids ( = Dihexuronsäure-dimethylester-methyl-glykosid) C15H24013 der Formel II abtrennen. Im Disaccharid II ist

die räumliche Anordnung der Hydroxyle, des Methoxyls und die

Annahme der disaccharidischen 1,4-Verknüpfung nicht bewiesen.

Die Identität der zwei Zuckerkomponenten des Diuronids II bleibt

unbekannt.

Die übrigen 2/3 der zuckerhaltigen Methanolyseprodukte sind

nicht kristallisiert. Die daraus nach Hydrolyse mit Mineralsäure

hergestellten Bariumsalze scheinen keine einheitlichen Verbindun¬

gen zu sein37).

Vorkommen der Glucuronsäure in pflanzlichen Polysacchariden

Glucuronsäure enthaltende Polysaccharide scheinen ebenso häu¬

fig in niederen Pflanzen (Bakterien) wie in den höher entwickelten

vorzukommen38). Während aber Galacturon- bzw. Mannuronsäure

die ausschliesslichen Bausteine der 1,4-verknüpften PolyuronidePektin bzw. Alginsäure darstellen, sind analog gebaute Polyglucuro-nide in der Natur bis jetzt nicht aufgefunden worden39). Die perio¬disch sich wiederholenden Bauelemente der Glucuronsäure enthal¬

tenden pflanzlichen Polysacchariden können auf 1 Mol Glucuron¬

säure 1 oder mehrere Mole anderer Zucker enthalten. Es ist kein

Polysaccharid bekannt, das zwei verschiedene Uronsäuren ent¬

hält40).Als Beispiele bakterieller Polysaccharide sind die spezifischen

Kohlenhydrate der Pneumokokken vom Typ III41) und Typ

VIII42), Friedländers Bazillenkohlenhydrat42), die Kapselpolysac-

37) Vgl. Fussnoten 31), 3a) und 36).

38) E. Anderson und L. Sand, Advances in Carbohydrate Chemistry, 1,

329 (1945).

39) Über die Herstellung von Polyglueuroniden auf chemischem Wege,

vgl. S. 32.

40) A. O. Norman, the Biochemistry of Cellulose, the Polyuronids,

Lignin (Oxford) 1937; S. Peat, Ann. Repts. Progress Chem. (Chenu Soc.

London) 38, 150 (1941); E. L. Hirst, J. chem. Soc. 70, (1942).

41) R. E. Reeves und W. F. Goebel, J. Biol. Chem. 139, 511 (1941).

42) W. F. Goebel, J. Biol. Chem. 74, 619 (1927); 110, 391 (1935).

17

charide von Azotobacter und Rhizobia43) und das „Cytophagae"-

Kohlenhydrat zu erwähnen, die sämtliche aus Glucuronsäure und

Glucose aufgebaut sind. Aus Glucuronsäure, Glucose und Ribose

besteht das spezifische Kohlenhydrat der Pneumokokken vom

Typus II.

Von Pflanzengummen und -schleimen enthält Gummi Arabicum

auf 3 Mol d-Galactose 3 Mol 1-Arabinose, 1 Mol 1-Rhamnose und

1 Mol d-Glucuronsäure44). Auch Damson-, Cherry- und Mesquite-

gum45) bestehen aus kompliziert gebauten Polysacchariden, die d-

Glucuronsäure enthalten.

Endlich ist d-Glucuronsäure noch als Bestandteil von vielen

Hemicellulosen ( = Cellulosebegleitstoffe) erwähnt. So wurde aus

Baumwollsamenhülsen ein Polysaccharid isoliert, das als Baustein

eine Aldobionsäure aus 1 Mol d-Xylose und 1 Mol d-Glucuronsäure

enthält46).In verschiedenen Hemicellulosen der Harthölzer kommt d-Glu¬

curonsäure als Monomethyläther mit Xyloseresten verknüpft vor47).

Chemische Eigenschaften und Derivate der d-Glucuronsäure

HO-OH

-OH

HO-

HC-OH

-OH 0

O

-OH

r

o

COOH

I

HC-OCH,

OH

-CO

II

o

-OCH, O

-OCH3

~CO

III

43) E. Schluchterer und M. Stacey, Biochem. J. 38, 154 (1944).

44) C.L.Butler und L. H. Cretcher, Am. Soc. 51, 1519 (1929); S.W.

Challinor, W. N. Haworth und E. L. Hirst, Soc. 1931, 258.

45) L. Hirst und N. Jones, Soc. 1938, 1174; 1939, 558, 1482; E. Anderson

und L. Otis, Am. Soc. 52, 461 (1930).

46) E. Anderson and S. Kinsman, J. Biol. Chem. 94, 39 (1931).

47) E. Anderson, B. B. Kaster und M. O. Seeley, 3. Biol. Chem. 101, 573

(1933); M. H. O'Dwyer, Biochem. J. 28, 2116 (1934).

18

Freie d-Glucuronsäure (I) kristallisiert aus ihrer kalten wässri-

gen Lösung als jS-Form, die bei 154—156£48); 165°49) schmilzt. Sie

zeigt in wässriger Lösung eine von +12° auf +36° ansteigendeMutarotation, was darauf hindeutet, dass die Halbacetalform der

Säure am Cxa- bzw. ^-Konfiguration aufweisen kann50).Beim Eindampfen der wässrigen Lösung geht die d-Glucuron¬

säure in ihr y-Lacton, das d-Glucuron (II) über, welches bei 175—-

178°45); 180^-52) schmilzt. Im Gegensatz zur d-Glucuronsäure zeigtd-Glucuron in wässriger Lösung die konstante Drehung von

+ 19,2° 53) und keine Mutarotation. Die beiden Formen, Säure I und

Lacton II, können gegenseitig leicht ineinander übergeführt wer¬

den52).d-Glucuron wurde früher als Pyranosid mit einem y-3,6-Lacton-

ring formuliert. In neuerer Zeit wurde gezeigt, dass das Trimethyl-

glucuron als ein 2,5-Dimethyl-methylglucurofuranosid (III) zu

schreiben ist54), was die frühere Ansicht von Reeves55) über die

Struktur des Glucurons bestätigt. Die Annahme eines Furanose-Rin-

ges im Glucuron steht in Übereinstimmung mit dem Übergang der

3,6-Anhydro-methylglucopyranoside in die stabileren Furanoside56).

Derivate der al-d-Glucuronsäure

Die Glucuronsäure und ihr Lacton geben am C1 und C2 alle klas¬

sischen Derivate der Aldohexosen. So lässt sie sich mit Aldehyd-

reagentien, wie aromatische Hydrazinen, Semicarbazid, Thiosemi-

carbazid, Hydroxylamin etc., in die entsprechenden Derivate über¬

führen. Da aber neben der Carbonylgruppe auch das Carboxyl der

Glucuronsäure sich unter Umständen mit diesen Reagentien um¬

setzen kann, so können statt eines einzigen, gut definierten Derivates

48) F. Weinmann, B. 62, 1637 (1929).

49) W. Goebel und F. H. Babers, J. biol. Chem. 100, 573 (1933).

50) F. Ehrlich und K. Rehorst, B. 58, 1989 (1925).

51) E. Fischer und 0. Piloty, B. 24, 524 (1891).

52) W. Goebel und F. H. Babers, J. Biol. Ch. 100, 573 (1933).

53) K. Rehorst, B. 62, 519 (1929).

54) F. Smith, Soc. 1944, 584.

55) R. E. Reeves, Am. Soo. 62, 1616 (1940).

56) W. N. Haworth, L. N. Owen und F. Smith, Soc. 1941, 88.

19

deren mehrere gleichzeitig entstehen. Damit ist die analytischeBrauchbarkeit derartiger Umsetzungen stark eingeschränkt.

Nachfolgend eine Zusammenstellung der in der Literatur be¬

sprochenen Derivate von d-Glucuronsäure und d-Glucuron.

d-Glucuronsäure d-Glucuron

Phenylosazon 57) Oxim «) »2)

Phenylhydrazid-phenylosazon67) Phenylhydrazon 82)

4-BromphenyIosazon 68) 4-Bromphenylhydrazon el) 62)

Phenylhydrazid des Phenyl- 4-Nitro-phenylhydrazon e3)

hydrazons 59) Diphenylhydrazon 6X)

Benzyl-phenylhydrazid 69) Phenylbenzylhydrazon 62)

p-Bromphenylosazon des Semiearbazon 62)

p-Bromphenylhydrazids 60) Thiosemioarbazon 61)

Glucuronide

Die gleichen Methoden, die von Glucose zu a- und /?-Glucosiden

führen, können zur Herstellung von a- und ß-Glucuroniden aus d-

Glucuron oder d-Glucuronsäure, bzw. deren Derivate, angewendetwerden.

HC-OH

-OH O

r

o

HC-Cl

-OAc O

OH

CO

I

O

HC-Ox ,OCH3C

-Ox XCH, O

-OAo

CO

II

O

RO-CH

-OAc O

r

o

-OAc

-CO

III

-OAc

CO

IV

57) O. Neuberg, B. 33, S319 (1900).

68) O. Giemsa, B. 33, 2998 (1900).

59) A. W. von Eckenstein und N. Blanksma, Rec. 24, 33 (1905).

o») C. Neuberg und W. Neimann, Z. physiol. Ch. 44, 114 (1905).

,1) P. A. Levene und La Forge, J. Biol. Chem. 15, 71.

92) M. Bergmann und W. W. Wolff, B. 56, 1060 (1923).

e3) P. A. Levene und G. M. Meyer, J. Biol. Chem. 60, 173 (1924).

20

HO-CH

-OH

HO-

O

-OH

COOH

V

HO-CH

-OH

HO-

O

-OH

COOCH3

VI

AcO-CH

-OAo

AcO-

->

HC-OAc

-OAc

O

-OAo

+ AcO-

COOCH,

VII

O

-OAc

COOCHj

Vila

HC-O, .CI

cx

AcO-

-0/ XCH,

-OAc

O

COOCH. VIII

HC-Hlg

-OAc

AcO-

R=-0CH2

IX a Hlg = CI

IX b Hlg = Br

N02

O

-OAc

COOCH,

HC-Ox /OCH,xcy

AcO-

~Oy XCH,

-OAc

RO-CH

-OAc

O

AcO-

-J

COOCH3

X

1 ^CH,0-CH

-OAc

O

-OAc

AcO-

COOCH3

XI

O

-OAc

.J

COOCH3

XII

21

Goebel und Babers haben sich eingehend mit der Herstellungvon Glucuroniden der ß-Reihe nach der Methode von Königs und

Knorr befasst64). Sie stellten zunächst aus Glucuronsäure mit Di-

azomethan und Glucuron mit Methanol, oder über das Silbersalz

mit Methyljodid den nicht kristallisierten Glucuronsäure-methyl-ester VI her68). Beim Acetylieren des Methylesters konnten sie die

isomeren <x- und ^-Tetraacetate VII und Vila des Glucuronsäure-

methylesters durch Kristallisation trennen und in reiner Form

isolieren.

Mit Acetylchlorid und Salzsäure liefert der ß-Tetraacetyl-glucu-

ronsäuremethylester VII einen Chlortriacetyl-glucuronsäuremethyl-ester VIII mit der spezifischen Drehung —16°66). Letzterer gibtbei der Kondensation mit Methanol in Gegenwart von Silbercar-

bonat ein Methyl-glucuronid der Formel X, das eine Orthoacetat-

struktur aufweist und kein echtes Glucuronid darstellt. Eine Ace-

tylgruppe des Orthoacetats (X) wird durch verdünntes Alkali nicht

verseift, dagegen verliert X Methanol schon mit hochverdünnter

Säure. Goebel und Babers vertreten die Ansicht, dass schon dem

erwähnten Chlortriacetyl-glucuronsäuremethylester VIII Ortho-

acetatstruktur zukommt.

Das in ähnlicher Weise hergestellte Diacetyl-chlorglucuron II

führt mit Methanol und Silberoxyd ebenfalls zu einem Ortho-me-

thylglykosid des Diacetylglucurons III.

Sowohl aus dem Chlortriacetylglucuronsäure-methylester VIII,

wie aus Diacetyl-chlorglucuron II können mit p-Nitrobenzylalko-hol, wenn auch in schlechter Ausbeute, echte Glucuronide (z. B.

XI) hergestellt werden.

Es scheint mir erwähnenswert, dass sowohl das ortho-Derivat III

wie das echte Glucosid IV Fehling'sche Lösung reduzieren und da¬

mit an das ähnliche Verhalten des Mannozuckersäuredilactons er¬

innern.

Echte Glykoside des acetylierten Glucuronsäuremethylesters VII

konnten aus einem zweiten Triacetylchlorglucuronsäure-methylester

64) W. Koenigs und E. Knorr, B. 34, 957 (1901).

e5) W. F. Goebel und F. H. Babers, J. Biol. Ch. 100, 743 (1933); 101, 173

(1933); 106, 63 (1934); 110, 707 (1935); 111, 349 (1935).

66) W. F. Goebel und F. H. Babers, J. Bio.. Chem. 106, 63 (1934).

22

(IXa) erhalten werden, der aus VII mit Titantetrachlorid zugäng¬lich ist und der sich nach Schmelzpunkt und Drehung vom ortho-

Derivat VIII unterscheidet.

Um eine für die Herstellung echter /3-Glucuronide z.B. (XII)

geeignetere Verbindung zu erhalten, wurde jS-Tetracetyl-glucuron-

säure-methylester VII mit Eisessig-Bromwasserstoff nach der all¬

gemeinen Methode von Fischer61) zur Herstellung von Acetohalo-

genosen umgesetzt, wobei a-Acetobrom-glucuronsäuremethylesterIXb entstand. Es konnten folgende zwei Glucuronide der /3-B,eihedurch Kondensation der Halogenose IXb mit den entsprechendenAlkoholen in Gegenwart von Silbercarbonat hergestellt werden:

a) Triacetyl-p-nitrobenzylglucuronid-methylester XI68),

b) Triacetyl-^-methylglucuronid-methylester XII68) vom Smp.149—150° und [œ]D = —29° in Chloroform. Das Präparat verbraucht

vier Äquivalente Natronlauge bei der Verseifung; ß-Methyl-d-glu-curonid konnte nicht in reiner bzw. kristalliner Form isoliert

werden.

Hydrolyse, von Uroniden

Die zur Hydrolyse von Glucuroniden meistgebrauchten Säuren

sind Schwefelsäure, Salzsäure, Oxalsäure und Ameisensäure.

Die Furanoside der Glucuronsäure werden in Glykosiden leicht

gespalten; so genügt die eigene Acidität der Pflanzengummen, um

die Furanosidbindungen nach längerem Kochen in wässriger Lö¬

sung zu zerstören69). Die gleiche Wirkung wird durch 1-proz. Mine¬

ralsäure bei 80° in wenigen Stunden erreicht70).

Pyranoside der Glucuronsäure widerstehen dagegen dieser Be¬

handlung71). Ist die Pyranoseform einer Uronsäure durch ihre Al¬

dehydgruppe glykosidisch gebunden, so verlangt der vollständigeAbbau bei einer Säurekonzentration von 4% bei 120° bis zu 24

67) E. Fischer, B. 49, 584 (1916).

68) W. F. Ooebel und H. Babers, J. Biol. Chem. 111, 349 (1935).

69) E. L. Hirst und N. Jones, Soc. 1938, 1174; N. Jones, Soc. 1939, 558.

70) E. Anderson und L. Otis, Am. Soc. 52, 4461 (1930); E. Anderson und

W. Seigle, J. Biol. Chem. 113, 683 (1936); C. L. Butler und L. H. Cretcher,

Am. Soc. 53, 4160 (1931).

71) Vgl. Fussnote 36).

23

Stunden, wobei ein grosser Teil der abgespaltenen Uronsäure zer¬

stört wird72). Die Verbesserung der Hydrolyse-Verfahren lässt sich'

am Beispiel der Alginsäure, eines aus Mannuronsäureresten aufge¬bauten Polyuronids, schön verfolgen:

Alginsäure wurde früher mit kalter 80-proz. Schwefelsäure hy-drolysiert73). Die Hydrolyse mit 2,5-proz. Schwefelsäure bei 100°

gab eine höhere Ausbeute an Mannuronsäure, die in Form ihrer

Alkaloidsalze74) oder in schlechter Ausbeute auch als Lacton iso¬

liert wurde. In der neuerdings mit siedender 90-proz. Ameisensäure

durchgeführten Hydrolyse kann unter günstigen experimentellen

Bedingungen bis zu 40% der in der Alginsäure enthaltenen Mann¬

uronsäure als kristallisiertes Mannuronsäure-y-lacton gewonnen

werden75).

Pyranose- und Furanose-Derivate des d-Glucurons

d-Glucuron (I) reagiert mit kalter methanolischer Salzsäure unter

Bildung eines ß-Methyl-d-glucurons, dem die Struktur II des ß-

Methyl-d-glucurofuranosid-3,6-lactons zukommt76). Die Behand¬

lung von II mit warmer methanolischer Salzsäure bewirkt den Über¬

gang von der Furanose- in die Pyranoseform III.

HC-OH

-OH O

r

o

_y

OH

CO

I

CH,0-CH

-OH O

r

o

-OH

HO-

OH

CO

II

O

-OH

COOCH3

III

CHoO-CH

CH.O-

-OCH,

-OCH,

O

CONH2

IV

72) G.Nelson und E. Percival, Soc. 1942, 58; S. Morell, L. Baur und

K. P. Link, J. Biol. Chem. 105, 15 (1934).

«) C. L. Butler und L. H. Cretcher, Am. Soc. 51, 1914 (1929).

74) E. Schoeffel und K. P. Link, J. Biol. Chem. 95, 213 (1932) ; K. P. Link

und B. Nedden, J. Biol. Chem. 94, 307 (1931).

75) H. A. Spoehr, Arch, of Biochem. 14, 153 (1947).

7e) L. N. Owen, S. Peat und W. Jones, Soc. 1941, 339.

24

Die Struktur des entstandenen /9-Methyl-d-glucuropyranosid-me-

thylesters III wird durch Methylierung und Überführung in das

Amid IV bewiesen77).

Amide der Olucuronsäure

HC-NEL

V HO-

-OH

HC-OH

-OH

O

-OH

HO-

CONH„

O

-OH

VI

CONH,

d-Glucuron (I) gibt beim Behandeln mit Ammoniak in trocke¬

nem Methanol amorphes 1-Desoxy-l-amino-d-glucuronsäureamid

(V)78). Letzteres liefert bei der selektiven Hydrolyse mit Kunst¬

harzionenaustauschern d-Glucuronsäureamid VI, das als a-Pyranosidkristallisiert. Die gleichen Amide, sowie deren N-Acetyl-Derivatewurden auch von Mannuron- und Galacturonsäure hergestellt78).

Identifizierung und Nachweis der d-Glucuronsäure

in Naturprodukten

Der Nachweis von d-Glucuronsäure in Naturstoffen ist schwie¬

rig, da beim Abbau dieser Verbindungen durch die saure Hydro¬

lyse79) ein grosser Teil der Glucuronsäure unter Kohlendioxydab-

spaltung zerstört wird. Die in den Hydrolysenprodukten noch vor¬

handene freie Säure wird dann durch die Zersetzungsprodukte und

die nicht hydrolysierten Anteile in so starkem Masse verunreinigt,dass ihre Isolierung meist illusorisch wird. Ferner fehlen bis jetzt

") L. N. Owen, S. Peat und W. Jones, Soo. 1941, 339.

78) H. L. Frush und H. S. Isbell, J. of Res. Natl. Bur. St. 41, 609 (1948)

R. P. 1943; 41, 11 (1948) R. P. 1898.

,9) Neuere Methoden zur schonenden Hydrolyse von Naturstoffen, die

Uronsäuren enthalten, vgl. S. 23.

25

von der d-Glucuronsäure schwerlösliche, leicht herstellbare, analy¬tisch geeignete Derivate. Dies erklärt, warum die d-Glucuronsäure

in vielen Verbindungen noch nicht identifiziert wurde, obwohl die

Anwesenheit von Uronsäuren durch Farbreaktionen und Abspal¬

tung von Kohlendioxyd beim Erwärmen mit Mineralsäure nachge¬wiesen werden kann.

d-Glucuronsäure gibt mit Naphtoresorcin und Salzsäure eine

grüne Färbung. Diese Tollens'sche Naphtoresorcinreaktion80) ist

sehr empfindlich, aber unspezifisch, da sie auch von anderen Uron¬

säuren und den Pentosen herrühren kann. Ähnlich verhält sich die

JSiarsche Orcinprobe81).Die quantitative Bestimmung der d-Glucuronsäure geschieht

nach der Methode von Lefèvre und Tollens92) durch volumetrische

Messung des beim Kochen mit Salzsäure gespaltenen Kohlendioxyds.Der Nachweis der d-Glucuronsäure wird am sichersten durch

ihre Isolierung in kristallisierter Form oder als Lacton geführt, wie

z.B. aus den Hydrolysenprodukten des Zuckerrübensaponins83) und

des Gummi Arabicum84). Die Überführung in die Alkali- oder Al-

kaloidsalze gestattet nicht, die Glucuronsäure von anderen Säuren

zu trennen. Vollständigkeitshalber seien hier einige Salze aufgeführt.

Na-Salz85) + laq [a]D =— 0,6°^ + 22,5° (Endwert)

K-Salz85) + l,5aq = + 4,5°-^ + 20° (W)

Ba-Salz85)am. =17,5° (W)

Cinchoninsalz86) F. 202° = + 190° (W)

Brucinsalz85) + laq; F. 156° =— 15° (W)

Die Umsetzung der Glucuronsäure mit aromatischen Hydrazinenund anderen Aldehydreagentien ist wegen der Uneinheitlichkeit der

Reaktion nicht zu empfehlen87).

80) B. Tollens, B. 41, 1788 (1908).

81) G. Scheff, Bio. Z. 183, 341 (1927).

82) K. U. Lefèvre und B. Tollens, B. 40, 4517 (1907).

83) K. Rehorst, B. 62, 519 (1929).

84) F. Weinmann, B. 62, 1637 (1929).

85) F. Ehrlich und K. Rehorst, B. 62, 628 (1929).

86) C. Neuberg, B. 33, 3322 (1900).

87) Vgl. S. 19.

26

Die Identifizierung der d-Glucuronsäure durch Oxydation mit

Salpetersäure zur d-Zuckersäure, die meist in Form ihres charakte¬

ristischen sauren Kaliumsalzes isoliert wird, ist zweideutig, da auch

1-Guluronsäure — obwohl diese bisher in der Natur noch nicht

nachgewiesen wurde — bei der Oxydation mit Salpetersäure zu d-

Zuckersäure führt88).Eine weitere, aber ebenfalls mehrdeutige Methode besteht in der

Oxydation der d-Glucuronsäure mit Sauerstoff in Gegenwart von

Alkali nach dem Verfahren, das die Überführung der Aldohexosen

in Pentonsäuren erlaubt89). Während aus d-Glucose durch Oxyda¬tion mit Sauerstoff in alkalischem Medium d-Arabonsäure in 80-

proz. Ausbeute erhalten wird, liefert d-Glucuronsäure ebenfalls in

guter Ausbeute unter gleichen Bedingungen die um 1 Kohlenstoff¬

atom ärmere Dicarbonsäure, die d-Arabotrioxyglutarsäure. Dabei

ist zu berücksichtigen, dass auch d-Galacturon-, d-Mannuron- und

d-Taluronsäure in gleicher Weise zu d-Arabo-trioxyglutarsäure ab¬

gebaut werden.

Von derMöglichkeit der Identfizierung der d-Glucuronsäure nach

Hydrierung der reduzierenden Gruppe als 1-Gulonsäure wurde bis¬

her noch kein Gebrauch gemacht.

Herstellung und Synthesen der d-Glucuronsäure

Bis heute hat man noch keine billige und leicht zugängliche Quellefür d-Glucuronsäure bzw. d-Glucuronsäurelacton gefunden. Die Ge¬

winnung der beiden Verbindungen auf biochemischem Wege oder

aus Naturprodukten ist mit grossen Schwierigkeiten verbunden. Der

Preis für Glucuronsäure beträgt heute ca. Fr. 2.50 pro Gramm90).Eine brauchbare Synthese aus billigen Rohstoffen wäre deshalb

willkommen, umsomehr, als Glucuron zu einem begehrten Heil¬

mittel gegen Arthritis geworden ist91).

88) M. Heidelberger und W. F. Goebel, J. Biol. Ch. 74, 613 (1927).

89) W.Nef, Ann. 403, 204 (1914); O.Spengler und A. Pfannenstiel, Z.

Ver. deut. Zucker-Ind. 85, 546 (1933); H. S. Isbell, J. of Res. Natl. Bur. of

Stand. 29, R. P. 1497 (Sept. 1924).

90) Zu beziehen bei A. S.Aloe Co., 1831 Olive Street, St. Louis, 3, Mo. USA.

91) Neuerdings scheint von G. L. Mehltretter vom North. Reg. Lab. bzw.

27

A. Gewinnung auf biochemischem Wege

In früherer Zeit wurden die für chemische Untersuchungen ge¬

brauchten kleinen Mengen Glucuronsäure ausschliesslich auf bio¬

chemischem Wege gewonnen. So wurde die d-Glucuronsäure aus

dem Harn mit Kampfer gefütterter Tiere erstmals in freier kristal¬

lisierter Form beschrieben92). Die biochemische Methode wird auch

heute noch häufig zur Darstellung von d-Glucuronsäure angewendet,wobei nach neueren Vorschriften93) etwa folgendermassen vorge¬

gangen wird. Man verabreicht durch eine Schlundsonde auf Diät

gehaltenen Hunden oder Kaninchen täglich 5 bis 10 g Monoterpen-alkohole wie Kampfer, Borneol oder Menthol. Der Harn der Tiere

wird im Laufe von zwei Tagen gesammelt, mit Ammoniak leicht

alkalisch gemacht und vom Phosphatniederschlag abfiltriert. Das

Filtrat wird mit festem Ammoniumsulfat versetzt, gekocht und fil¬

triert. Nach Aufbewahren im Eiskasten über Nacht kristallisiert

das Ammonium-Terpenglucuronid. Das Salz wird durch einstün¬

diges Kochen mit 10-proz. Schwefelsäure hydrolysiert und als in

Alkohol unlösliches Bariumglucuronid ausgefällt94). Die Freilegungder Glucuronsäure aus dem Bariumsalz erfolgt mit verdünnter

Schwefelsäure.

Bis auf einige Varianten folgen alle neueren Vorschriften dem

beschriebenen Weg95). Die Gewinnung der Glucuronsäure aus Eu-

xanthinsäure ist heute wegen der schwierigen Beschaffbarkeit des

Ausgangsmaterials nicht mehr üblich96).

der Corn. Prod. Ref. Co. in der katalytischen Oxydation von Monoaceton-

glucose mit Luft-Sauerstoff in Gegenwart von Pt-Kohle eine ergiebigeMethode zur Herstellung von Glucuronid gefunden worden zu sein; vgl.Ind. Eng. Chem., October 1950, p. 17 A.

92) 0. Schmiedeberg und H. Meyer, Z. physiol. Ch. 3, 422 (1879).

93) R. T. Williams, Biochem. J. 32, 1852 (1938).

"*) F. Ehrlich und K. Rehorst, B. 58, 1989 (1925); B. 62, 628 (1929).

95) O. Neuberg und S. Lachmann, Biochem. Z. 24, 416 (1910) ; G. Neuberg,B. 33, 3319 (1900); H.Kioliani, B. 59, 1469 (1926); A. J. Quick, J. Biol.

Ch. 74, 331 (1927); W. F. Ooebel, J. Biol. Ch. 100, 573 (1933) ; R. T. Williams,

Nature, 143, 641 (1939).

96) Vgl. Fussnote 4).

28

B. Gewinnung aus Pflanzenstoffen

Bei sorgfältiger Hydrolyse von Gummi Arabicum in Ansätzen

von etwa 1 kg soll nach Weinmann97) bis 5% des Ausgangsmate¬rials in Form von kristallisierter d-Glucuronsäure zu erhalten sein.

Diese Ausbeute scheint optimal und von der Qualität des Gummi

Arabicums und den experimentellen Bedingungen stark abhängig.Die bezüglich Ausbeute etwas unsichere Methode hat sich bis heute

nicht durchgesetzt.Aus Saponinen wie Zuckerrübensaponin98) lässt sich ebenfalls

kristallisierte d-Glucuronsäure gewinnen, jedoch kommt dieser

Quelle wegen der zeitraubenden Reinigung des Ausgangsproduk¬tes kaum Bedeutung zu.

C. Synthesen der Glucuronsäure

Es gibt zwei allgemeine Methoden für die Synthese der d-Glu¬

curonsäure:

a) Die Reduktion des kristallisierten 1,4-Monolactons") bzw.

des 1,4-Monolactonhydrats100) der Zuckersäure mit Natriumamal¬

gam in saurer Lösung. Die Ausbeute an kristallisierter d-Glucuron¬

säure beträgt einige Prozente bei Fischer"), bzw. ungefähr 40%bei Reichstein100). Die Autoren geben über die nicht kristallisie¬

renden Reaktionsprodukte keine Auskunft.

b) Die Oxydation von Derivaten der d-Glucose in 6-Stellung101).

Einwirkung von verdünnten Säuren auf 1,2—5,6-Diisopropyliden-

glucose I führt unter Abspaltung von 1 Mol Aceton102) zur 1,2-

Monoisopropylidenglucose, die mit Benzaldehyd 1,2-Isopropyliden-

3,5-benzylidengIucose liefert103). Sowohl 1,2—3,5-Diisopropyliden-

glucose wie l,2-Isopropyliden-3,5-benzylidenglucose III enthalten

97) B. 62, 1637 (1929).

98) K. Rehorst, B. 62, 519 (1929).

•») E. Fischer und 0. Piloty, B. 24, 522 (1891).

10°) T. Reichstem, Helv. 21, 1215 (1938).B. 57, 403 (1924).

101) H. Ohle und Mitarbeiter, Bio. Z. 131, 611 (1922) ; 136,428 (1923).

102) E. Fischer, B. 28, 2496 (1925).

103) L. Zervas und P. Sessler, B. 66, 1326 (1933).

29

am C6 eine freie primäre Oxygruppe. Oxydation der beiden Ver¬

bindungen mit alkalischem Permanganat und nachträgliche Abspal¬

tung der Substituenten durch vorsichtig geleitete saure Hydrolyseführt zu kristallisierter d-Glucuronsäure.

HC-CX

;ipd-oy o

HO-

-O,

CJH20/;ipd

II

HC-OxIpd

-0/ O

Or

Bzd

-O'

CH2OH

III

Nach einer weiteren, von 8tacey10i) ausgearbeiteten Methode

wird d-Glucose in den l,2,3,4-Tetraacetyl-6-trityläther (IV) über¬

geführt, der bei der DetrityHerung nach Helferich und Klein105) in

l,2,3,4-Tetraacetyl-j8-d-glucose (V) und nachfolgender Oxydationmit Permanganat in die 1,2,3,4-Tetraacetyl-d-glucuronsäure (VI)

umgewandelt wird. Durch Verseifung mit wässrigem Bariumhydro¬xyd gelingt die Abspaltung der vier Acetylgruppen aus dem Tetra-

acetat VI, worauf kristallisiertes Glucuron in einer Ausbeute von

20% der eingesetzten Glucose erhältlich sein soll.

AcO-CH

-OAc

AcO-

O

-OAc

AcO-CH

-OAc

AcO-

CH20-C(C6H5)3

IV

O

OAc

CH2OH

V

104) M. Stacey, Soc. 1939, 1529.

10ä) B. Helferich und J. Klein, Ann. 450, 219 (1926).

AcO-OH

-OAc

AcO-

O

-OAc

COOH

VI

30

D. Oxydation von Glucosiden zu Glucuroniden nach

verschiedenen Methoden

Der Gedanke, Glucose direkt zu Glucuronsäure zu oxydieren,kann mit den gebräuchlichsten Oxydationsmitteln nicht ausgeführtwerden. Man kennt kein selektives Oxydationsmittel, das d-Glu-

cose zu d-Glucuronsäure oxydieren könnte. Von Stickstoffdioxydoder Salpetersäure wird Glucose an beiden Endgruppen und damit

zur d-Zuckersäure oxydiert. In den Glucosiden der <x- und j3-Reiheist jedoch die Aldehydgruppe der Glucose durch Hemiacetalbildungblockiert. Schon früh wurden deshalb Versuche unternommen, die

leicht zugänglichen Methyl-glucoside zu Glucuroniden zu oxydieren.Als erster versuchte Smolenski106) die Oxydation des a-Methyl-

glucosids mit Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Eisen-III-hy-

droxyd, wobei nach seinen Angaben 20% a-Methyl-glucuronid in

Form des Brucinsalzes isoliert werden konnte. Durch Oxydationvon a-Menthol-d-glucosid mit Natrium-hypobromit in Pyridin ge¬

lang es Bergmann107), a-Menthol-glucuronid in schlechter Ausbeute

zu isolieren. Die Ausführung derselben Reaktion mit a-Methyl-gluco-sid ergab nur Glyoxylsäure.

Die elektrolytische Oxydation von a-Methylglucosid an Queck¬

silber-Kathode bei 11 at Sauerstoffdruck soll zu 20% a-Methylglu-curonid, als Cinchoninsalz isoliert, führen108).

E. Oxydation von Glucosiden zu Glucuroniden mit

Stickstoffdioxyd

Bekanntlich werden von Salpetersäure in Zuckern die reduzie¬

renden und die primären Oxygruppen bevorzugt oxydiert109). Die

Einwirkung von Salpetersäure auf Glucoside führt unter Hydrolyseebenfalls zur Oxydation beider Endgruppen. Durch Verwendungvon Distickstofftetroxyd versuchten Maurer und Drefahl Glucoside

unter Vermeidung der Hydrolyse zu Glucuroniden zu oxydieren110).

106) K. Smolenski, C. 24, II, 317. Originalabhandlung nicht zugänglich.

107) M. Bergmann, B. 56, 1060 (1923).

108) B. A. Leutgoeb und H. Heinrich, Am. Soc. 61, 870 (1939).

109) w_ Pigman, L. Browning und H. McPherson, Am. Soc. 71, 2200 (1949).

no) K.Maurer und G. Drefahl, B. 75, 1489 (1942); 80, 94 (1947).

31

In ihren Untersuchungen beschreiben sie die Oxydation des <x-

Methyl-d-galactosids zur a-Methyl-d-galacturonsäure, die in kri¬

stallisiertem Zustand in 35-proz. Ausbeute isoliert werden konnte.

Aus a-Methyl-glucosid konnte auf gleichem Wege kein kristallisier¬

tes a-Methyl-glucuronid dargestellt werden.

Nach Maurer und Beiff111) lässt sich auch in Cellulose die pri¬märe Oxygruppe mit Stickstoffdioxyd selektiv oxydieren. Die Re¬

aktion wurde mit gasförmigem Stickstoffdioxyd bei Zimmertempe¬ratur durchgeführt. Um eine vollständige Oxydation zu Polyglucu-ronsäure zu bewirken, wurde nach Vorversuchen das Verhältnis

Faser zu Stickstoffdioxyd wie 1 zu 4 gewählt. Bereits nach 12 Stun¬

den waren anstelle der primären Oxygruppen 60%, nach 60 Stunden

sogar 94% Carboxyl vorhanden. Die Menge der gebildeten Carboxyl-

gruppen wurde an Hand von Kohlendioxydbestimmungen nach

Tollens-Lefèvre ermittelt112). Die erhaltene Oxycellulose ist ausser-

lich unverändert, sie löst sich klar in 0,1-n. Natronlauge oder in

3-proz. Ammoniak.

Gleichgerichtete Untersuchungen von amerikanischen Autoren

führten im wesentlichen zu denselben Ergebnissen113). Die mit

Stickstoffdioxyd oxydierte Cellulose kann als Celluronsäure bezeich¬

net werden. Über den Abbau der Celluronsäure zu Glucuronsäure

liegen bis heute noch keine Publikationen vor. Als leicht resorbier¬

bares Verbandmaterial hat Celluronsäure in der Medizin eine aus¬

gedehnte Anwendung gefunden.Über die Oxydation der Stärke mit Distickstofftetroxyd berich¬

teten Mench und Degering11*). Sie scheint in gleicher Weise wie bei

Cellulose zu verlaufen. Die oxydierten Produkte sind ebenfalls in

verdünntem Alkali unter Salzbildung löslich.

m) K. Maurer und G. Beiff, J. makromol. Ch. 1, 27 (1944); vgl. dazu

O. Peiffer und D. Krüger, Beiträge zur Oxydation von Cellulose mit Stick¬

stoffdioxyd, Beiheft Nr. 55 zu „Angewandte Chemie" und „Chemie-Inge¬nieur-Technik", Verlag Chemie, 1949.

112) F. Ehrlich, B. 62, 2024 (1929).

m) E. C. Yackel und W. O. Kenyon, Am. Soc. 64, 121 (1942); C. Unruh

und O. Kenyon, Am. Soc. 64, -127 (1942) ; W. Taylor und O. Kenyon, Am. Soc.

69, 342 (1947); P. A. McGee und O. Kenyon, Am. Soc. 69, 347 (1947).114) W. Mench und F. Degering, Proc. Indiana Acad. Sei. 55, 69 (1945).

32

Eigene Versuche

Meine Untersuchungen über Derivate der d-Glucuronsäure wur¬

den in der Absicht unternommen, die Isolierung und Identifizierungdieser Säure zu erleichtern. Obwohl zahlreiche Naturstoffe Uron¬

säuren in glykosidischer Bindung enthalten, erfolgte die Identifizie¬

rung dieser Säure bisher nur an wenigen Beispielen in eindeutigerWeise an Hand kristallisierter Derivate. Die Schwierigkeiten bei der

Isolierung von Uronsäuren sind in ihrer EmpfindUchkeit gegenüberMineralsäuren und Alkali, sowie in der geringen Zahl analytisch ge¬

eigneter Derivate zu suchen115).Die Versuche zur Darstellung von Derivaten der <x- und ß-Me-

thyl-d-glucuropyranoside wurden im Zusammenhang mit der Er¬

forschung des Zuckerteils der Glyzyrrhizinsäure durchgeführt. Die

neu synthetisierten Derivate des a- bzw. /9-Methyl-d-glucuro-py-ranosids sollten mit Derivaten des aus Glyzyrrhizinsäure gewonne¬

nen Hexuronsäure-methylester-methylglucosids116) verglichen wer¬

den und bei Identität der beiden Verbindungen der Beweis für das

Vorkommen der d-Glucuronsäure in der Glyzyrrhizinsäure erbracht

werden.

Den ersten Teil dieser Arbeit bildete die Herstellung von Deri¬

vaten des x- und ß-Methyl-d-glucuropyranosids aus Verbindungen,welche den Pyranosering schon in stabiler Anordnung besitzen. Zu

diesem Zwecke wurden a- bzw. ß-Methylglucosid mit Stickstoff-

tetroxyd nach Maurer und Drefahl behandelt117).

Derivate des <x-Methyl-d-glucuro-pyranosids

Zur Herstellung des a-Methyl-d-glucuro-pyranosids wurde reines

a-Methyl-glucosid in mehreren Ansätzen mit Stickstofftetroxyd oxy¬diert. Die erhaltenen sauren Oxydationsprodukte sind keineswegsein einheitliches Produkt, sondern stellen vielmehr ein Gemisch ver¬

schiedener Säuren dar, unter denen die a-Methyl-glucuronsäure

überwiegt. Zur Reinigung wurden sie als Barium- bzw. Calcium-

115) Vgl. S. 25.

116) Vgl. S. 14.

117) K. Maurer und G. Drefahl, B. 80, 94 (1947).

33

salze aus Alkohol umgefällt und zur Entfärbung in wässriger Lösungbei 130° und 150 at mit Raney-Nickel und Wasserstoff behandelt.

Die Ausbeute an Bariumsalz beträgt etwa 60% als Ba-a-Methyl-d-

glucuronat berechnet, in Übereinstimmung mit der von Maurer

und Z>re/aAÜ117) erzielten Ausbeute. Diese Autoren haben jedoch ihre

Oxydationsprodukte als einheitlich aus a-Methyl-d-glucuronid be¬

stehend betrachtet, was trotz stimmenden Analysenwerten nicht

zutreffen dürfte. Alle Anstrengungen, aus den Bariumsalzen a-Me¬

thyl-d-glucuronid in reiner Form durch Kristallisation zu isolieren,

verHefen ergebnislos.Die aus den Calcium- bzw. Bariumsalzen mit Wofatit KS herge¬

stellten Säuren wurden mit kochender 90-proz. Ameisensäure nach

Spoehr118) hydrolysiert. Aus den Produkten der Hydrolyse konnte

in etwa 10% Ausbeute kristallisiertes d-Glucuron (III), das nach

Acetylieren und chromatographischer Aufarbeitung auch als ß-Tri-

acetyl-d-glucuron (IV) gefasst wurde, isoliert werden.

Zur präparativen Herstellung von d-Glucuron (III) aus a-Me-

thyl-glucosid ist das Verfahren in der angegebenen Ausführungs¬form noch nicht geeignet.

Da auf Grund von Vorversuchen eine weitere Reinigung der

offensichtlich uneinheitlichen Erdalkalisalzen und der daraus berei¬

teten Säuren mit physikalischen Methoden wenig aussichtsreich er¬

schien, wurden die Säuren mit Diazomethan, bzw. ihre Bariumsalze

mit methanolischer Salzsäure in die Methylester umgewandelt und

diese mit Pyridin-Acetanhydrid acetyliert. Sowohl die Methyl¬

ester119), als auch die Acetylierungsprodukte waren dunkle Öle,aus denen sich keine kristallisierten Verbindungen isolieren Hessen.

Durch Destillation im Hochvakuum und Chromatographie an Alu-

miniumoxyd gelang es leicht, aus dem dunklen Gemisch der acety-Herten Ester in etwa 10% Ausbeute reines a-Methyl-d-glucuro-py-

ranosid-methylester-triacetat (V) als farblosen Honig abzutrennen.

Das bisher nicht kristallisierende Präparat V zeigte in Chloroform

eine spezifische Drehung von +178° und verbrauchte erwartungs-

gemäss 4 Äquivalente 0,In.Natronlauge bei der Verseifung.

118) H. A. Spoehr, Arch, of Bioohem. 14, 153 (1947).

119) Reiner a-Methylglucuro-pyranosid-methylester wurde von L. N.

Owen, 8. Peat und O. Jones, Soe. 1941, 339, als Öl beschrieben.

34

HC-OCH3

-OH

HO-

HC-OCH3

-OH

O

-OH

HO-

HC-OH

-OH O

O

-OH

O

HC-OCH3

-OAc

AcO-

COOR

II R =H

IIaR = CH,

I

HC-OCH3

-OR

AcO-CH

-OAc O

O

-OH

O

-OAc

RO-

COOCH3

V

-CO

III

HC-OCH,

-OAc

CO

IV

o

OR

HO-

CONH2

VI R =H

VIaR =Ac

-OH

-OH

HC-OCH,

O

RO-

-OR

-OR

O

CONHNHCH, CONHNHR

VII VIII R =H

Villa R = Ac

Mit Ammoniak in Methanol wird das Methylester-triacetat V

unter Abspaltung der Acetylgruppen quantitativ in das sehr schön

kristallisierende a-Methyl-d-glucuro-pyranosid-amid (VI) umgewan¬delt. Das im Hochvakuum leicht sublimierbare Amid VI lieferte

mit Acetanhydrid-Pyridin ein ebenfalls kristallisiertes Tri-O-acetyl-Derivat Via, das mit verdünntem Alkali wieder leicht zu VI ver¬

seift wurde. Das Amid VI gibt entsprechend seiner Formulierungals Pyranosid im Weerman-Test kein Hydrazodicarbonamid.

Beim Erwärmen des Amids VI mit Phenylhydrazin gelangte ich

in guter Ausbeute zu dem bei 211° schmelzenden PhenylhydrazidVII. In analoger Weise gestaltete sich die Umsetzung des Amids VI

mit Hydrazinhydrat zum Hydrazid VIII, welche wegen ihres quan¬

titativen Verlaufs hervorgehoben sei. Wie VI ist auch das HydrazidVIII, allerdings erst bei 220°, im Hochvakuum ohne Zersetzungsubh'mierbar. Mit Acetanhydrid-Pyridin wurde VIII in das Tetra-

acetyl-Derivat Villa übergeführt. Für analytische Zwecke scheint

35

das Amid VI, das Triacetyl-amid Via und das Hydrazid VIII be¬

sonders gut geeignet.

Derivate des ß-Methyl-d-Glucuronids

In analoger Weise wie in der a-Reihe wurde die Oxydation des

j3-Methyl-d-glucopyranosids120) durchgeführt, um zum j3-Methyl-d-

glucuro-pyranosid (VII) und den der a-Reihe entsprechenden, mit

Ausnahme von II noch unbekannten Derivaten zu gelangen. Die

Einwirkung von Distickstofftetroxyd aufß-Methylglucosid (I) führte

erwartungsgemäss und in Ausbeuten von durchschnittlich 70% zu

sauren Oxydationsprodukten, deren Bariumsalze auf Grund ihrer

Unlöslichkeit in Alkohol isoliert und auf diese Weise von Neutral¬

körpern abgetrennt werden konnten.

Zur weiteren Aufarbeitung wurden die amorphen, sehr hygrosko¬

pischen Bariumsalze entweder mit methanolischer Salzsäure in die

Methylester umgewandelt oder zunächst mit dem Kationen-Aus¬

tauscher Wofatit KS zerlegt, worauf die freien Säuren in methanoli¬

scher Lösung mit Diazomethan verestert wurden121). Aus der dunk¬

len Lösung der freien Säuren konnte auch nach wiederholtem Ent¬

färben kein kristallisiertes ß-Methyl-d-Glucuronid isoliert werden.

Wie in der a-Reihe122) konnten nur uneinheitliche Brucinsalze er¬

halten werden.

Die rohen, mit Acetanhydrid-Pyridin acetylierten Methylester

lagen als stark dunkle, sehr viskose Masse vor, die nur zu etwa 2/3in Benzol löslich war. Filtration der benzolischen Lösung durch

Aluminiumoxyd der Aktivität II—III führte nacheinander zu zwei

farblosen, kristallisierten Eluaten im Gewicht von 15% der einge¬brachten Substanz, während die übrigen 65% der eingefahrenenSubstanz sich erst mit Methanol als dunkles Produkt vom Alumi¬

niurnoxyd ablösten.

lao) In ca. 70-proz. Ausbeute aus /3-Pentaacetylglucose über Acetobrom-

glucose herstellbar; für grössere Ansätze ist die Methylierung von Glucose

mit Dimethylsulfat und Alkali nach M. L. Maquenne, Bl. 3 33, 469 (1905)einfacher und billiger durchzuführen, trotzdem auf diese Weise nur etwa

20% Ausbeute an |3-Methylglucosid erzielt werden.

m) Siehe vorher. Seite.

122) Dort nicht erwähnt.

36

CH30-CH

HO-

-OH

CHsO-CH

O

-OH

AcO-

CH2OH

I

-OAc

O

-OAc

AcO-

COOCH3

II

COOCH3

OAc

OAc

-OAc

COOCH3

III

CONEL

HO-

-OH

-OH

-OH

CONH2

IV

CHaO-CH

-OH

HO-

-OH

CH,0-CH

O

-OH

HO-

CONH2

V

CH.O-CH

O

-OH

HO-

CONHNH2

VI

-OH

O

-OH

COOR

VII R =H

VIIaR=^

Die zuerst und in grösserer Menge eluierte, bei 105° schmelzende

Verbindung III der Bruttozusammensetzung C16H22012 wurde als

d-Zuckersäure-dimethylester-tetra-acetat123) erkannt, da sie sich

mit methanolischem Ammoniak in das bekannte Zuckersäure-di-

amid (IV) vom Smp. 168° (unter Zersetzung) [<x]D = + 16,7° (in Was¬

ser) m) überführen lies». Das stete Vorkommen von d-Zuckersäure

in den Oxydationsprodukten des jS-Methylglucosids (I) ist bemer¬

kenswert, weil in der mehrmals und analog durchgeführten Oxyda¬tion des a-Methylglucosids keine oder höchstens Spuren vonZucker¬

säure auftraten.

Das in den späteren Fraktionen eluierte, kristallisierte Präpa-

12S) In der Literatur noch nicht beschrieben.

124) O. S. Hudson und 8. Komatsu, Am. Soc. 41, 1141 (1919) fanden für

ein Präparat von Smp. 172—173 [a]D= +13,3° in Wasser. M.Bergmann,B. 54, 2651 (1921) bestimmte den Smp. zu 170° (u. Zers.) R. E. Reeves, Am.

Soc. 61, 664 (1939) zu 176—178°.

37

rat II der Formel C14H20O10 schien nach Schmelzpunkt (154°) und

optischer Drehung [a]D =—29° (in Chloroform) identisch mit dem

von Goebel und Babers125) hergestellten, als Pyranosid formulierten

/}-Methyl-glucuronid-methylester-triacetat.InÜbereinstimmung mitdieser Annahme Hess sich das in Äther sehr schwerlösliche Methyl-ester-triacetat II mit Ammoniak in Methanol in /3-Methyl-d-glu-curonid-amid (V)126) umwandeln, unter Eliminierung der drei Ace-

tylgruppen als Acetamid. Für die Pyranosid-Struktur von II sprichtder negative Ausfall des Weerman-Tests127) mit dem Amid V. Zur

Charakterisierung des Amids V stellten wir durch Kochen mit Hy-

drazinhydrat in quantitativer Ausbeute das schwerlösliche Hydra-zid VI dar.

Die alkalische Verseifung des Methylester-triacetats II führte,nach Entfernen der Natrium-ionen mit Wofatit KS, zum ß-Methyl-

glucuronid VII. Die nur schwierig kristallisierende Säure VII wurde

als unscharf bei 78—82° schmelzendes Präparat, sowie als amor¬

phes Bariumsalz zur Analyse gebracht. Durch aufeinanderfolgende

Einwirkung von Diazomethan und Acetanhydrid-Pyridin konnte die

Säure VII wieder in das Methylester-triacetat II zurückverwandelt

werden. Wie zu erwarten war, verbrauchte die Säure VII als Pyra-nose-Derivat 2 Mol Perjodsäure. Von der durch die Oxydation ent¬

standenen Ameisensäure konnten 52% der 1 Mol entsprechenden

Menge als Benzyl-thiuroniumsalz gefasst und identifiziert werden.

Untersuchungen am Diuronid C15H2i013 der Glyzyrrhizinsäure

Meine Untersuchungen hatten unter anderem den Zweck, die

Konstitution des aus dem Zuckerteil der Glyzyrrhizinsäure isolier¬

ten Diuronids C15H24013 (I) aufzuklären und durch Abbaureak-

125) J. Biol. Chem. 111, 347 (1935).

126) L. N. Owen, S. Peat und O. Jones, Soc. 1941, 339, haben ein nicht

kristallisiertes ^-Methyl-glucuro-furanosid-amid dargestellt.

127) Weerman-Test. Vgl. dazu z.B. R.A. Weerman, A. 401, 1 (1913) Rec.

37, 1, 16 (1918); W. N. Haworth, S. Peat und J. Whetstone, Soc. 1938, 1975;R. O. Ault, W. N. Haworth und E. L. Hirst, Soc. 1934, 1722; G. G. Barker,

E. L. Hirst und J. K. N. Jones, Soc. 1946, 783 ; F. Mischeel und K. Kraft, B. 67,

841 (1934). Die Ergebnisse der Untersuchungen von F. Micheel und K. Kraftwurden von W. N. Haworth und Mitarbeiter (1938) teilweise widerlegt.

38

tionen sicherzustellen. Während nach Voss12a) Mannuronsäure als

Baustein des Diuronids vorliegen soll, glaubte Eingel129) an die An¬

wesenheit einer 2-Keto-hexonsäure. Jedoch konnte von ihnen der

Beweis für das Vorhegen der vermutlichen Säuren nicht durch Iso¬

lierung von Derivaten dieser Säuren erbracht werden.

In neuerer Zeit ist es gelungen, aus den nicht kristallisierenden

Bestandteilen des Zuckerteiles der Glyzyrrhizinsäure ein Derivat

des d-Glucuro-pyranosids in ca. 2-proz. Ausbeute zu isolieren und

mit Sicherheit zu identifizieren130). Dies war ein entscheidender

Hinweis, dass wenigstens eine der zwei Säuren des Diuronids d-

Glucuronsäure ist.

d-Glucuronsäure kann aber auch einziger Baustein des Diuronids I

sein. Aus der Überlegung, dass die wichtigsten und in der Natur

am häufigsten vorkommenden Glucoside, Di- und Polysaccharidedie 1,4-a- oder ß-d-Glucopyranosidverknüpfung aufweisen, wie z.B.

Maltose oder Cellobiose, wurde als Arbeitshypothese auch für das

Diuronid aus der Glyzyrrhizinsäure diese Konstitution angenom¬

men. Dem Diuronid könnte somit die dem Methyl-maltosid oder

Methyl-cellobiosid analog gebaute Strukturformel I zukommen, wo¬

bei über Konfiguration der die Methoxylgruppe tragenden Kohlen¬

stoffatome keine weiteren Aussagen gemacht werden sollen.

CH30-CH m)

-OH

HO

CH131)

O

O

HO-

-OH

CH30-CH131)

O

-OH

HO-

COOCH3 COOCH,

I C15H24013

-OH O

O

HO¬

CH 131)

-OH

-OH

O

CH2OH

In dieser Arbeit wurde versucht, das Diuronid I durch Reduk¬

tion der beiden Estergruppen in das Disaccharid-methylglucosid II

128) M. Voss und J. Pfirschke, B. 70. 132 (1937).

129) Diss. J. Ringel, Breslau 1939.

130) Aus einer unveröffentlichten Arbeit von Dr. E. Hardegger.

lsl) Konfiguration willkürlich formuliert.

39

überzuführen. Als geeignete Methode erwies sich die Reduktion

mit Lithiumaluminiumhydrid132), die bisher nur selten auf Zucker¬

derivate angewandt wurde133). Die übliche Ausführungsform der

Reduktion in Äther konnte wegen der Unlöslichkeit des Diuronids

in Äther nicht durchgeführt werden. Um die allgemeine Anwend¬

barkeit der Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid bei Methyl¬estern von Säuren der Zuckerreihe zu prüfen, wurde zunächst

Pentaacetylgluconsäure-methylester (III) zu Sorbit reduziert, der

leicht als Hexaacetat IV isolierbar ist.

AcO-

COOCH3 CH2OAc

-OAc -OAc

LiAlH,-»-

AcO-

-OAc -OAc

-OAc -OAc

CH2OAc CH2OAc

III IV

Nach einigen Vorversuchen erwies sich schlussendlich, dass das

Diuronid C15H24013 (I) aus Glyzyrrhizinsäure mit Lithiumalumi¬

niumhydrid am besten in siedendem Dioxan reduziert wird. Aus demi

Reaktionsgemisch konnte nach Acetylieren mit Pyridin-Acetanhy-drid ein kristallisiertes Disaccharid-methylglycosid-heptaacetatC27H3g018 in 40% Ausbeute isoliert werden. Das gereinigte Präparatschmolz bei 128—133° und wies eine spezifische Drehung +51—53°

(in Chloroform) auf. Die gefundenen Daten wiesen auf /?-Methyl-maltosid-heptaacetat hin, dem dieselbe BruttozusammensetzungC27H38018 zukommt, das ebenfalls bei 128—129° schmilzt und

[<x]D=+53,5° (in Chloroform) zeigt134). Zur Identitätsprüfung beider

Substanzen wurde nun /?-Methylmaltosid-heptaacetat vom Smp.130° und der spezifischen Drehung +52° (in Chloroform) aus Mal¬

tose hergestellt. Bei übereinstimmenden Analysen- und Drehungs-

132) R.F.Nystrom und W. Q. Brown, Am. Soe. 69, 1197, 2548 (1947);70, 3738 (1948).

133) H. Hauenstein und T. Reichstein, Helv. 32, 22 (1949).134) C. S. Hudson und R. Sayre, Am. Soc. 38, 1870 (1916).

40

werten gab das acetylierte Reduktionsprodukt des Diuronids mit

/J-Methylmaltosid-heptaacetat in der Mischprobe eine Schmelz-

punktserniedrigung von ca. 10°.

Durch Verseifung wurde das acetylierte ReduktionsproduktC27H38018 mit 0,1-n. Natronlauge unter Verbrauch von 7 Äquiva¬lenten Natronlauge in ein Disaccharid-methylglucosid C^H^Oxx(II) vom Smp. 250° und [<x]D= +69° (in Wasser) übergeführt.

Reines ß-Methylmaitosid schmilzt bei 112° und dreht +78°.

Das Reduktionsprodukt des Diuronids ist somit kein Derivat der

Maltose. /3-Mefchyl-maltosid, die Methylglucoside der Cellobiose und

deren Acetate unterscheiden sich in Schmelzpunkt und Drehungso stark, dass sich ein Vergleich mit den authentischen Verbindun¬

gen erübrigte. Mit Sicherheit kann deshalb ausgesagt werden, dass

das reduzierte Diuronid weder ein Derivat der Maltose noch der

Cellobiose darstellt.

Bei der Oxydation mit Perjodsäure verbraucht das Diuronid

C15H24013 (I) 3 Atome Sauerstoff pro Mol, was auf drei a-Glykol-gruppierungen hindeutet. Die Oxydation mit Perjodsäure erwies

sich als stark von Belichtung und vom pH abhängig. Erst nach

mehreren Ansätzen gelang es, die günstigsten experimentellen Be¬

dingungen auszuwählen. Als Testsubstanz diente /S-Methyl-maltosid,das unter gleichen Bedingungen erwartungsgemäss ebenfalls 3

Atome Sauerstoff pro Mol verbrauchte.

Aufschlussreicher für die Konstitution des Diuronids verliefen

Hydrolyseversuche mit Ameisensäure nach Spoehr135). Nach dieser

allgemein anwendbaren Vorschrift zur Hydrolyse von Uroniden

konnten aus dem Diuronid bis zu 25% kristallisiertes d-Glucuron,•das mit Präparaten anderer Herkunft in Schmelzpunkt und Dre¬

hung identisch war, isoliert werden. Das Ergebnis der Hydrolysesteht im Einklang mit den früher erwähnten Befunden, die darauf

hinwiesen, dass mindestens eine der beiden Säuren des Diuronids

d-Glucuronsäure ist136). Weitere Hydrolyseversuche mit kalter

Ameisensäure, oder mit siedender Essigsäure, verliefen ergebnislosund führten nicht zu dem als Spaltprodukt der partiellen Hydro¬lyse erwarteten Methyluronid bzw. reduzierenden Diuronid.

135) H. A. Spoehr, Arch, of Biochemistry, 14, 153 (1947).

is«) Vgl. Fussnote 13°).

41

Bei der Annahme, dass das Molekül des Diuronids I aus zwei

verschiedenen Säuren besteht, war es naheüegend, die zweite noch

unbekannte Uronsäure in den nicht kristallisierenden Mutterlaugender Hydrolyse zu suchen.

Die Reduktion der Mutterlaugen mit Wasserstoff in Gegenwartvon Raney-Nickel und Umwandlung der Reduktionsprodukte über

die acetylierten Methylester in Säureamide führten zu farblosen

Ölen, aus denen keine kristallisierten Verbindungen abgetrennt wer¬

den konnten. Da es wenig aussichtsreich erschien, auf synthetischem

Wege aus der Reihe der optisch aktiven Hexonsäureamide jenes

Präparat herauszufinden, das eine Identifizierung des ohnehin nicht

kristallisierten Säureamids erlaubt hätte, wurde versucht, durch

Oxydation der Mutterlaugen in die Reihe der Zucker- bzw. Schleim¬

säuren zu gelangen.Durch Oxydation der nicht kristallisierenden Mutterlaugen mit

Salpetersäure, Verestern mit Methanol, Acetylieren der Methylesterund Überführung des durch Destillation gereinigten Acetylmethyl-esters in das Diamid konnte aber lediglich wenig kristallisiertes d-

Zuckersäurediamid isoliert werden137). Die geringe Menge des d-

Zuckersäurediamids erlaubte keine Schlüsse über die Natur der

zweiten Uronsäure des Diuronids.

Die Oxydation der Hydrolysenprodukte des Diuronids C16H24013mit Sauerstoff und Alkali zu einer der vier möglichen Trioxyglutar-säuren schien deshalb der geeignetste Weg, um die zweite Uron¬

säure wenigstens in Form eines kristallisierten Abbau-Produktes

fassen zu können. Da bis heute geeignete Derivate der Trioxyglu-tarsäuren fehlen, mussten in dieser Arbeit vorerst die Diamide der

Trioxyglutarsäuren hergestellt und auf ihre analytische Brauchbar¬

keit geprüft werden.

Derivate der Trioxyglutarsäuren

Durch Oxydation von d-Xylose (I) mit Salpetersäure gelang es,

das Bariumsalz der Xylo-trioxyglutarsäure in 80-proz. Ausbeute zu

erhalten. Durch Veresterung und Acetylieren konnte das Triace-

tyl-Derivat des Xylo-trioxyglutarsäure-dimethylesters (II) gewon-

137 ) Vgl. S. 37.

42

nen und durch Chromatographie an Aluminiumoxyd gereinigt wer¬

den. Aus dem Dimethylesteracetat II wurde mit Ammoniak in Me¬

thanol das Diamid III der Xylo-trioxyglutarsäure als eine inWasser

in der Wärme lösliche, in organischen Lösungsmitteln schwerlös¬

liche kristallisierte Verbindung vom Schmelzpunkt 180° (unter

Zersetzung) hergestellt.In gleicher Weise wurde d-Arabonsäure (IV) mit Salpetersäure

oxydiert, aus den Oxydationsprodukten d-Arabotrioxyglutarsäure-

dimethylestertriacetat (V) isoliert und in das kristallisierte Diamid

VI vom Schmelzpunkt 190° (Zersetzung) übergeführt.

CHO

-OH

HO- AcO-

-OH

COOH

COOCH3

-OAc

OAc

COOCH3

COOCH,

HO-

HO- AcO-

-OH

-OH

CH2OH IV

CO^

HO-

-OH

-OH

O

VII

-OAo

-OAo

COOCH3 V

COOCH3

-OAc

-OAo

-OAc

COOCH,

CONH2

-OH

-OH

II CONH2 III

CONHa

-OH

-OH

CONH2 VI

CONH2

-OH

-OH

-OH

IX R =H

VIII CONR IXaR = NH,

Endlich wurde aus der Oxydation des d-Eibonsäure-y-lactonsmit Salpetersäure in ähnlicher Weise das optisch inaktive, kristal¬

lisierte Ribo-trioxyglutarsäure-dimethylester-triacetat VIII vom

Smp.72° hergestellt, das in das ebenfalls schwer lösliche, bei 150°

schmelzende Diamid IX umgewandelt wurde. Aus dem Methyl-estertriacetat VIII konnte durch Kochen mit Hydrazinhydrat als

weiteres Derivat das Dihydrazid IX a bereitet werden.

43

Experimenteller Teil1)

Derivate des a-Methyl-d-glucuro-pyranosids

x-Methyl-d-glucuronid (II aus I)2)

20 g trockenes a-Methyl-d-glucosid (I) vom Smp. 166° wurden

mit 30 cm3 Distickstoff-tetroxyd Übergossen und unter zeitweisem

Umschütteln und Ausschluss von Feuchtigkeit 48 Stunden bei 20°

gehalten. Die homogene grünliche Lösung wurde dann im Wasser¬

strahlvakuum bei höchstens 40° zur Trockne eingedampft. Der in

200 cm3 Wasser gelöste, blassgelbliche, zähflüssige Rückstand wurde

bis zur negativen Reaktion auf Jodkalium-Stärke-Papier mitHarn¬

stoff (ca. 2 g) versetzt. Die Lösung wurde nun mit überschüssigemCalciumcarbonat (ca. 10 g) bei 60° neutralisiert3) und nach dem

Aufhören der Kohlendioxyd-Entwicklung und Zusatz von Norit3)

über Celite filtriert. Das braune, klare Filtrat gab eine positive Or-

cin-Reaktion4); es wurde im Vakuum auf 50 cm3 eingeengt und vor¬

sichtig in 300 cm3 Alkohol eingegossen, wobei das rohe Calciumsalz

des a-Methyl-glucuronids (II) in flockiger Form ausfiel. Der sehr

hygroskopische Niederschlag wurde sofort abgenutscht, mit abso¬

lutem Alkohol und Äther gewaschen und sofort im Exsiccator über

Calciumchlorid evakuiert. Das getrocknete rohe Calciumsalz, ein

leicht graues bis gelbliches, amorphes Pulver, wog 13 g. Das Prä¬

parat enthielt 10,5% Ca (als Oxalat bestimmt).

*) Alle Schmelzpunkte sind korrigiert.

2) Die zugehörigen Formeln sind S. 35 aufgeführt.

3) Während der Neutralisation färbt sich die Lösung braun; von Norit

wird sie nur wenig entfärbt.

4) Vgl. Tollens-Elsner, Kurzes Handbuch der Kohlenhydrate, 4. Auflage,S. 112.

44

In analoger Weise wurden mit Bariumcarbonat an Stelle von

Calciumcarbonat amorphe, ebenfalls sehr hygroskopische Barium¬

salze hergestellt; aus 100 g a-Methyl-glucosid wurden beispielsweise86 g trockene Bariumsalze erhalten.

Die Freilegung der Säure II aus den Calcium- bzw. Bariumsalzen

erfolgte durch Filtration der etwa 5-proz. wässerigen Salzlösungenüber Wofatit KS (Kationen-Austauscher). Pro Milli-ÄquivalentErd¬alkali wurden 1,5 cm3 Austauscher verwendet; die Filtrationsge¬schwindigkeit betrug etwa 5 cm3 Lösung pro cm3 Austauscher in

der Stunde.

In grösseren Ansätzen wurden zur Einsparung von Wofatit zu¬

nächst 90—95% der Erdalkalis mit verd. Schwefelsäure als Sulfat

ausgefällt und nach Filtration die in der Lösung verbliebenen Salze

mit dem Austauscher zerlegt.Die vom Austauscher abtropfenden gelblichen Lösungen, die

stets frei von Ca- bzw. Ba-ionen waren, wurden im Vakuum bei

30—40° zur Trockne eingedampft. Aus 30 g Ca-Salz erhielten wir

etwa 20 g freie Säuren in Form eines braunen Honigs. Die Präpa¬rate konnten auch nach wiederholter Behandlung mit Norit nicht

kristallisiert werden. Sie sind in Wasser und Alkohol gut, in Äther

wenig löslich; bei erhöhter Temperatur (80°) tritt im Vakuum unter

Dunkelfärbung offenbar Zersetzung ein.

d-Glucuron (III aus II)

5 g aus den Calcium- oder Barium-Salzen freigelegten Säuren

wurden in 50 cm3 90-proz. Ameisensäure 12 Stunden am Rückfluss

gekocht5). Die Ameisensäure wurde im Vakuum entfernt, der Rück¬

stand dreimal mit je 20 cm3 Alkohol im Vakuum zur Trockne ein¬

gedampft, in 75 cm3 Wasser gelöst und mit Norit behandelt. Die

bräunüche Lösung wurde im Vakuum zum Sirup eingeengt und mit

ölucuron angeimpft. Die im Verlaufe einiger Tage ausgeschiedenenKristalle schmolzen nach dem Umkristallisieren aus Wasser-Alkohol

bei 180° und wogen 0,6 g. In der Mischprobe mit d-Glucuron wurde

5) Reines Glucuron bleibt unter den angegebenen Bedingungen praktischunverändert, vgl. dazu auch die Herstellung von Mannuronsäure-lacton aus

Alginsäure, H. A. Spoehr, Arch, of Biochem. 14, 153 (1947).

45

keine Schmelzpunktserniedrigung beobachtet. Zur Analyse wurde

das Präparat 2 Tage bei 70° im Hpchvakuum getrocknet.

3,760 mg Subst. gaben 5,602 mg C02 und 1,560 mg HaO

C6H806 Ber. C 40,91 H 4,58%Gef. C 40,66 H 4,64%

Wd = +19° (c=l in Wasser).

ß-Triacetyl-d-glucuron (IV)e)

4 g Mutterlaugen, die bei der Herstellung des d-Glucurons an¬

fielen, wurden mit 10 cm3 Pyridin und 6 cm3 Acetanhydrid acety-•

liert, und die stark dunkel gefärbten, in Chloroform gelösten Acety-

Herungsprodukte durch 150 g Aluminiumoxyd der Aktivität II—III

filtriert. Die eingedampften Filtrate (0,7 g) wurden nochmals an

20 g Aluminiumoxyd (Aktivität I—II) adsorbiert. Die mit Benzol-

Äther eluierte Fraktion schmolz nach dem Umkristallisieren aus

Chloroform-Äther bei 193°. Das Analysenpräparat (0,1 g) wurde

bei 170° im Hochvakuum sublimiert.

3,618 mg Subst. gaben 6,306 mg COa und 1,505 mg HaO

C12H140„ Ber. C 47,69 H 4,67%Gef. C 47,57 H 4,63%

oL-Methyl-d-glucuronid-methylester (IIa aus II)

a) 25 g trockene Bariumsalze aus der Oxydation von a-Methyl-

glucosid wurden mit 400 cm3 2-proz. methanolischer Salzsäure 8

Stunden am Rückfluss gekocht. Nach dem Erkalten der Mischungwurde vom unlöslichen Bariumchlorid abfiltriert, das Filtrat zum

Neutralisieren der freien Salzsäure mit überschüssigem Bariumcar-

bonat geschüttelt, filtriert und das neue Filtrat im Vakuum zur

Trockene eingedampft. Der dunkelgefärbte viscose Rückstand wog

b) 6 g rohe, aus den Erdalkalisalzen freigelegte Säuren (II) wur¬den in 100 cm3 Methanol gelöst und bei 0° mit 70 cm3 2-proz. äthe-

8) Vgl. W. F. Ooebel und F. H. Babers, J. Biol. Chem. 100, 743 (1933).

46

rischer Diazomethan-Lösung versetzt. Nach dem Eindampfen im

Vakuum bleiben 6,4 g Ester als brauner, nicht kristallisierender

Honig zurück.

x-Methyl-d-glucuronid-methylester-2,3,4:,-triacetat (V aus IIa)

6,4 g roher Ester IIa wurden mit 15 cm3 Pyridin und 10 cm3

Acetanhydrid in 24 Stunden bei 5° acetyliert. Die Mischung wurde

im Vakuum eingedampft und nach Zugabe von etwas Toluol erneut

zur Trockene gesaugt. Der in Chloroform aufgenommene Rückstand

wurde mit Wasser gewaschen und portionenweise im Kugelrohr bei

140° im Hochvakuum destilliert. Das Destillat (2,8 g) wurde an

100 g Aluminiumoxyd I—II chromatographiert. Die fast farblosen

Benzol-Eluate (0,75 g) wurden im Kugelrohr im Hochvakuum bei

120° destilliert und dabei ein geringer kristalliner Vorlauf7) abge¬trennt. Die farblose Hauptfraktion (ca. 0,6 g) wurde analysiert. Das

Präparat konnte bisher nicht in kristallisierter Form erhalten

werden.

3,914 mg Subst. gaben 6,926 mg C02 und 1,998 mg H20

Ci4H20O10 Ber. C 48,27 H 5,79%Gef. C 48,29 H 5,72%

[<x]D = + 174° (c = 0,8 in Chloroform)

55,4 mg Subst. wurden in 10 cm3 0,1-n. NaOH 10 Minuten auf

90° erwärmt und nach dem Erkalten mit 0,1-n. HCl auf Phenol¬

phthalein zurücktitriert. Der Verbrauch wurde zu 6,33 cm3 0,1-n.

NaOH gefunden (ber. 6,36 cm3).

oc-Methyl-glucuronid-amid ( VI aus V)

2 g a-Methyl-d-glucuronid-methylester-triacetat (V) wurden in

50 cm3 Methanol gelöst, bei 0° mit Ammoniak gesättigt und über

Nacht bei 0° gehalten. Das Präparat kristallisierte nach dem Ab¬

saugen der flüchtigen Anteile aus einer Mischung von 2 cm3 Metha¬

nol und 10 cm3 Chloroform in sehr schönen, büschelförmig ange¬

ordneten Nadeln. Das aus Methanol-Chloroform oder Methanol-

7) Vermutlich Zuekersäure-dimethylester-triacetat.

47

Äther umkristallisierte Amid schmolz bei 168°. Das in Wasser und

Alkohol leicht, in Äther und Chloroform schwer lösliche Präparatwurde zur Analyse bei 150° im Hochvakuum sublimiert. Die Um¬

setzung von V zu VI verlief quantitativ.

3,770 mg Subst. gaben 5,611 mg C02 und 2,143 mg H20

3,615 mg Subst. gaben 0,218 cm3 N2 (19°, 738 mm)

C7H1306N Ber. C 40,58 H 6,32 N 6,76%Gef. C 40,62 H 6,36 N 6,84%

[a]D = +135° (c = 1 in Methanol)

a-Methyl-d-glucuronid-amid-triacetat (Via aus VI)

200 mg a-Methyl-d-glucuronid-amid (VI) wurden in 1 cm3 Pyri¬din mit 0,5 cm3 Acethanhydrid 16 Stunden bei 20° gehalten. Das

wie üblich aufgearbeitete Präparat war ein farbloser Sirup, der

nach Zugabe von einigen Tropfen Alkohol kristallisierte. Das im

Hochvakuum bei 125° subhmierte Analysenpräparat schmolz bei

133°.

3,744 mg Subst. gaben 6,436 mg C02 und 1,940 mg H20

5,201 mg Subst. gaben 0,197 cm3 N2 (20°, 734 mm)

C13H190„N Ber. C 46,85 H 5,75 N 4,20%

Gef. C 46,91 H 5,80 N 4,26%

[a]D = +149° (c = 0,8 in Chloroform)

Verseifung des Triacetats Via zu VI

30 mg Amid-triacetat Via wurden in 5 cm3 Methanol gelöst, bei

0° mit Ammoniak gesättigt und 16 Stunden bei 0° gehalten. Der

nach dem Eindampfen aus Methanol-Chloroform kristallisierte Rück-

stans schmolz bei 168°; er erwies sich nach Mischprobe und opti¬scher Drehung identisch mit a-Methyl-d-glucuronid-amid VI.

x-Methyl-d-glucuronid-phenylhydrazid ( VII aus VI)

200 mg a-Methyl-d-glucuronid-amid (VI) wurden mit 300 mg

Phenylhydrazin 16 Stunden, d,h. bis zum Aufhören der Ammoniak¬

entwicklung, bei 120° gehalten. Das überschüssige Phenylhydrazin

48

wurde dann im Hochvakuum bei 80° entfernt. Der aus Alkohol-

Äther umkristallisierte Rückstand schmolz bei 211°. Das Analysen¬

präparat wurde 2 Tage bei 80° im Hochvakuum getrocknet.

3,570 mg Subst. gaben 6,827 mg C02 und 2,002 mg HaO

3,458 mg Subst. gaben 0,292 cm3 N2 (18°, 727 mm)

C13H1806N Ber. C 52,34 H 6,08 N 9,39%Gef. C 52,19 H 6,28% N 9,48%

[a]D = + 105° (e = 0,6 in Methanol)

x-Methyl-d-glucuronid-hydrazid ( VIII aus VI)

0,7 g a-Methyl-d-glucuronid-amid (VI) und 1 g Hydrazinhydratwurden bis zum Aufhören der Gasentwicklung, d.h. ca. x/2 Stunde,unter Rückfluss gekocht. Nach Zugabe von 10 cm3 Alkohol schieden

sich alsbald Kristalle aus, die nach dem UmkristalUsieren aus

Wasser-Alkohol bei 234° schmolzen. Das Analysenpräparat (0,6 g)wurde bei 220° im Hochvakuum sublimiert.

4,049 mg Subst. gaben 5,617 mg C02 und 2,297 mg H20

3,964 mg Subst. gaben 0,443 cm3 N2 (17°, 722 mm)

C7H1406N2 Ber. C 37,84 H 6,35 N 12,61%Gef. C 37,86 H 6,35 N 12,53%

[a]D = + 151° (e = 1 in Wasser)

oc-Methyl-d-glucuronid-tetraacetyl-hydrazid (Villa aus VIII)

200 mg a-Methyl-d-glucuronid-hydrazid (VIII) wurden in 0,5cm3

Pyridin und 0,5 cm3 Acetanhydrid über Nacht bei 20° gehalten.Das wie üblich aufgearbeitete Acetyl-Derivat schmolz nach dem

Umkristallisieren aus Benzol bei 167°. Das Analysenpräparat wurde

bei 150° im Hochvakuum sublimiert.

3,684 mg Subst. gaben 6,264 mg C02 und 1,810 mg H20

3,722 mg Subst. gaben 0,237 cm3 N2 (17°, 727 mm)

C16H22O10N2 Ber. C 46,15 H 5,68 N 7,18%Gef. C 46,40 H 5,50 N 7,17%

[a]D = +81° (c = 1 in Chloroform)

49

Derivate des /ff-Methyl-d-glucuro-pyranosids

Oxydation von ß-Methyl-glucosid (I)8)

20 g ß-Methyl-glucosid (I) vom Smp. 105° wurden, wie für das

a-Methyl-glucosid beschrieben9), mit Distickstoff-tetroxyd10) oxy¬

diert. Die aus den Oxydationsprodukten isoHerten trockenen, sehr

hygroskopischen, gelblichen Bariumsalze wogen 21 g. Aus je 10 g

Bariumsalz wurden, ebenfalls nach der früher gegebenen Vorschrift,

sowohl mit methanolischer Salzsäure wie über die freien Carbon¬

säuren mit Diazomethan je 6,5 — 7 g11) rohe, dunkel gefärbte Me¬

thylester erhalten12).

Isolierung von Zuckersäure-dimethylester-tetraacetat (III)und ß-Methyl-glucuronid-methylester-triacetat (II)

16 g acetylierte rohe Methylester wurden bei 0° mit 100 cm3 Py¬ridin und 25 cm3 Acetanhydrid im Verlauf von 24 Stunden acety-liert. Das im Vakuum zur Trockene eingedampfte Acetylierungs-

gemisch wurde bis zum Verschwinden des Geruchs nach Pyridinbzw. Acetanhydrid mehrere Male mit Toluol im Vakuum zur

Trockene gesaugt. Der Rückstand (21 g) wurde mit Benzol dige¬

riert, wobei 14 g Substanz in Lösung gingen. Die dunkle Lösung

(ca. 100 cm3) wurde an Aluminiumoxyd II—III chromatographiert.

8) Die zugehörigen Formeln sind 8. 37 aufgeführt.

9) Vgl. S. 44.

10) Die Oxydationen wurden teils mit technischem, teils mit frisch im

Sauerstoffstrom destilliertem und über Phosphorpentoxyd getrocknetem

Distickstoff-tetroxyd vorgenommen ; Einflüsse auf die Ausbeuten an II und

III wurden nicht festgestellt.

n) Gegen ca. 3,2—3,5 g in der «-Reihe (vgl. Fussnote 2).

12) Wie nachträglich angestellte Versuche zeigten, kann das Auftreten

gefärbter Verunreinigungen, welche schon bei der Neutralisation mit Barium-

carbonat auftraten, vermieden werden, wenn die Oxydationsprodukte des

a- bzw. jS-Methyl-glucosids, nach Entfernen der überschüssigen Stickoxydeim Vakuum, in wässeriger Lösung mit Raney-Nickel z.B. 6 Stunden bei

150° und 150 at hydriert werden. Neutralisation des hydrierten Ansatzes mit

BaC03 und Ausfällen mit Alkohol führt dann zu rein weissen Bariumsalzen,bzw. in den späteren Stufen zu rohen, aber beinahe farblosen Acetyl-methyl-

estern.

50

Mit 300 cm3 Benzol wurden 1,5 g Zuckersäure-dimethylester-tetraacetat (III) eluiert. Das aus Chloroform-Äther umkristalli¬

sierte Präparat (1,4 g) schmolz bei 105°. Zur Analyse wurde eine

Probe bei 100° im Hochvakuum sublimiert.

3,830 mg Subst. gaben 6,644 mg C02 und 1,900 mg H20

C16H22012 Ber. C 47,29 H 5,46%Gef. C 47,34 H 5,55%

[<x]D = - 14° (c = 1 in Cloroform)

Die folgenden Benzol-Eluate (300 cm3) enthielten 550 mg j8-Me-

thyl-glucuronid-methylester-triacetat (II) vom Smp. 148°. Durch

mehrmaliges Umkristallisieren aus Chloroform-Äther konnte der

Schmelzpunkt von II bis auf 154° gebracht werden. Das Analysen¬präparat wurde bei 140° im Hochvakuum sublimiert.

3,800 mg Subst. gaben 6,710 mg C02 und 1,956 mg H20

CiAoOio Ber. C 48,27 H 5,79%Gef. C 48,19 H 5,76%

[a]D = - 29° (c = 0,9 in Chloroform)

Mit 300 cm3 Benzol-Chloroform (1:1) wurden aus dem Alumi¬

niumoxyd 0,35 g einer nicht kristallisierten gelben Substanz, mit

300 cm3 Methanol 9 g dunkles, nicht kristallisierendes Harz eluiert,

das nicht weiter untersucht wurde.

Zuckersäure-diamid (IV aus III)

200 mg Zuckersäure-dimethylester-tetraacetat (III) wurden in

20 cm3 Methanol gelöst und bei 0° mit Ammoniak gesättigt. Nach

12 Stunden wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene einge¬

dampft. Der Rückstand wurde aus Wasser-Methanol umkristalli¬

siert, wobei 70 mg des bei 168° (u. Zers.) schmelzenden Zucker-

säure-diamids (IV) anfielen. Das in Wasser gut, in Alkohol und Me¬

thanol schwer lösliche Präparat wurde zur Analyse 2 Tage bei 70°

im Hochvakuum getrocknet.

3,688 mg Subst. gaben 4,656 mg C02 und 1,942 mg H20

3,280 mg Subst. gaben 0,392 cm3 N2 (19°, 722 mm)

C6H1206N2 Ber. C 34,61 H 5,77 N 13,45%Gef. C 34,45 H 5,89 N 13,28%

[a]D = +16,7° (e = 0,8 in Wasser)

51

ß-Methyl-glucuronid-amid (V aus II)

200 mg j3-Methyl-glucuronid-methylester-triacetat (II) wurden

in 20 cm3 Methanol gelöst und bei 0° mit Ammoniak gesättigt. Nach

dem Absaugen der flüchtigen Anteile im Vakuum kristallisierte der

Rückstand aus Methanol. Das bei 198° schmelzende Präparat wog

70 mg. Zur Analyse wurde die Verbindung V bei 180° im Hoch¬

vakuum sublimiert.

3,686 mg Subst. gaben 5,476 mg C02 und 2,063 mg HaO

CjH^OeN Ber. C 40,58 H 6,32%Gef. C 40,54 H 6,26%

[a]D = - 72° (c = 0,4 in Methanol)

Weerman-Test: 52 mg (1/4Millimol) jS-Methyl-glucuronid-amid(V) wurden in 1 cm3 Wasser gelöst, bei 0° mit 0,5 cm3 kalter NaOCl-

Lösung versetzt und 2 Tage bei 0° stehen gelassen. Mit einigen

Tropfen 0,1-n. Natriumthiosulfat wurde das überschüssige Hypo¬chlorit zerstört und 0,1 cm3konz. Semicarbazid-acetat-Lösung (her¬

gestellt durch Verreiben von 2 g Semicarbazid-hydrochlorid mit 3 g

kristallisiertem Natriumacetat und Abfiltrieren des flüssigen An¬

teils vom ungelösten Natriumchlorid) zugegeben. Nach 2 Tagen bei

20° erschien die Mischung nur leicht getrübt.Ein in gleicher Weise mit 50 mg Gluconsäure-amid angesetzter

Test zeigte unmittelbar nach Zugabe der Semicarbazid-acetat-Lö¬

sung eine Trübung und nach 3 Stunden einen reichlichen Nieder¬

schlag von Hydrazodicarbonamid, welches durch Schmelzpunkt

(248°) und Mischprobe identifiziert wurde.

ß-Methyl-glucuronid-hydrazid ( VI aus V)

100 mg ß-Methyl-glucuronid-amid (V) wurden mit 0,5 g Hydra-

zinhydrat eine halbe Stunde am Rückfluss gekocht und nach dem

Abkühlen mit 2 cm3 Alkohol versetzt, wobei das Hydrazid VI sofort

auskristallisierte. Das Präparat wurde bis zum Smp. 238° aus Was¬

ser-Alkohol umkristallisiert und zur Analyse bei 230° im Hoch¬

vakuum sublimiert.

52

3,738 mg Subst. gaben 5,209 mg C02 und 2,176 mg H20

C,H140,N2 Ber. C 37,84 H 6,35%Gef. C 38,03 H 6,51%

[a]D = - 50° (c = 0,5 in Wasser)

ß-Methyl-glucuronid ( VII aus II)

348 (350) mg ß-Methyl-glucuronid-methylester-triacetat (II) vom

Smp. 154° wurden in 4 cm3 Methanol gelöst, mit 41 (39,9) cm3 wäs¬

seriger 0,1-n. Natronlauge 3 Minuten zum Kochen erhitzt und nach

dem Abkühlen auf Naphtholphthalein titriert, wozu 2 (2) cm3 0,1-n.

Essigsäure verbraucht wurden. Die Lösung wurde durch 15 cm3

Wofatit KS filtriert, der Wofatit zweimal mit je 40 cm3 Wasser ge¬

waschen und die vereinigten Fütrate im Vakuum über eine gekühlteVorlage zur Trockene eingedampft. Der ölige Rückstand (VII) wog

228 (228) mg (Ber. 228 mg). Das in der Vorlage gesammelte Destillat

verbrauchte 30,5 (29,8) cm3. (Ber. 32cm3) 0,1-n.Natronlauge.Das ß-Methyl-glucuronid (VII) kristallisierte aus Aceton-Chloro-

form in Gegenwart von 2 Tropfen Wasser. Ohne Zusatz von Wasser

wurde kein kristallisiertes Präparat erhalten. Die Kristalle enthiel¬

ten 1 Mol Kristallwasser; sie schmolzen unscharf von 78—82° und

röteten blaues Lackmuspapier.Das Analysenpräparat wurde 24 Stunden im Hochvakuum bei

70°13), dann 2 Tage über Phosphorpentoxyd getrocknet, im

Schweinchen eingewogen und vor dem Verbrennen bei 100° ge¬

schmolzen.

4,198 mg Subst. gaben 6,195 mg C02 und 2,216 mg H20

C7H10O6.lH2O Ber. 0 40,39 H 5,81%Gef. C 40,27 H 5,91%

Bariumsalz Vila14): Die aus dem Methylester-triacetat II mit

0,1-n. Natronlauge und Wofatit KS frisch hergestellte wässerige

13) Bei 215° trat ein Gewichtsverlust von 22% (ber. für y-Lacton 17,3%

Gewichtsverlust) ein unter gleichzeitiger teilweiser Sublimation.

") Pb-, Bi-, Ni-, Co-Salze waren ölig, Cd- und Zn-Salze waren fest aber

amorph, ein Hg(II)-SaIz (?) wurde einmal krystallin erhalten; das Salz

konnte nicht umkristallisiert werden und die Herstellung war nicht repro¬

duzierbar.

53

Lösung der Säure VII wurde mit überschüssigem Bariumcarbonat

aufgekocht, filtriert und das Filtrat in das doppelte Volumen Al¬

kohol eingetropft. Das amorphe Bariumsalz wurde zur Analyse 48

Stunden bei 70° im Hochvakuum getrocknet.

3,737 mg Subst. gaben 4,101 mg C02, 1,593 mg HaO u. 1,182 mg Rückstand

(C7Hu07)äBa.lH20 Ber. C 29,51 H 4,24 Ba 24,11%Gef. C 29,95 H 4,77 Ba 24,58%

Umwandlung des ß-Methyl-glucuronids ( VII) in das

Methylester-triacetat II

Eine frisch hergestellte Lösung von 20 mg /S-Methyl-glucmonid

(VII) in 1 cm3 Wasser wurde mit 10 cm3 Methanol und 10 cm3 ver¬

dünnter ätherischer Diazomethanlösung kurz durchgeschüttelt und

im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit

einigen Tropfen Pyridin und Acetanhydrid kurz aufgekocht, im

Vakuum zur Trockene verdampft und im Hochvakuum sublimiert.

Das kristallisierte Sublimat zeigte die für das Methylester-triacetatII charakteristische SchwerlösUchkeit in Äther. Das Präparatschmolz nach einmaligem Umkristallisieren aus Chloroform-Äther

bei 148° und gab in der Mischprobe mit Methylester-triacetat II

vom Smp. 153° keine Schmelzpunktserniedrigung.

Oxydation des ß-Methyl-glucuronids ( VIII) mit Perjodsäure

Eine wässerige Lösung, deren Gehalt an VII durch Eindampfenim Vakuum und Trocknen des Rückstandes bis zur Gewichtskon¬

stanz im Hochvakuum bei 20° über Phosphorpentoxyd bestimmt

wurde, enthielt in 4,61 g Lösung 290 mg ( = 1,05 Millimol) ß-Methyl-

glucuronid-monohydrat15). Zu dieser Lösung wurden bei 16—17°

5,60 cm3 Perjodsäure-Lösung gegeben, die 2,88 Müliatome aktiven

Sauerstoff enthielt, also ca. 1-molar war. Der Verlauf der Oxydationwurde in Proben von 0,50 cm3 titrimetrisch verfolgt16). Die Glycol-

15 ) Gehaltsbestimmungen durch Titration mit 0,01-n. Natronlauge führ¬

ten zu ca. 6% höheren Werten; die durch Wägung gefundenen Werte

scheinen uns zuverlässiger.

16) Die Proben wurden mit 10 cm3 Dikaliumhydrogenphosphat und

0,5 cm3 1-n. Kaliumjodid, das ausgeschiedene Jod mit 0,1-n. Arsenit titriert.

54

Spaltung war nach 3 Stunden beendet. Die Probe verbrauchte dann

0,87 cm3 0,1-n. Arsenit, woraus sich eine Verminderung des Gehalts

an aktivem Sauerstoff von 2 Milliatomen ( + 1%) berechnet. Nach

4 Stunden war gemäss dem Arsenit-Verbrauch von 0,85—0,86 cm3

die Oxydation nicht weiter fortgeschritten, obwohl die Lösung sich

inzwischen gelblich gefärbt hatte17). Die Oxydation wurde nun

durch Zugabe von 25 cm3 1-n. Kaliumjodid-Lösung abgebrochen.Zur Aufarbeitung wurde die Mischung mit 7 g Kaliumcarbonat

15 Stunden geschüttelt, wobei sich die Gelbfärbung stark auf¬

hellte. Dann wurde der Ansatz mit 100 cm3 Wasser und 120 cm3

Wofatit KS unter zeitweisem Schütteln 5 Minuten stehen gelassen,durch wenig frischen Wofatit KS filtriert und mit Wasser nachge¬waschen. Die Filtrate wurden mit 14 g Silbercarbonat geschüttelt,filtriert, mit Schwefelwasserstoff behandelt und eingedampft18). Dasmit Bariumhydroxyd auf Phenolphthalein neutralisierte Destillat

wurde im Vakuum auf ca. 5 cm3 eingeengt, mit einer konz. Lösungvon 250 mg Benzylthiuroniumsulfat versetzt, von ausgeschiedenemBariumsulfat abfiltriert und im Vakuum zur Trockene verdampft.Der Rückstand wog nach dem Umkristallisieren aus Wasser 110 mg.Das bei 145° schmelzende Präparat gab mit Benzylthiuroniumfor-miat (Smp. 148°) keine und mit Benzylthiuronium-acetat (Smp.140—141°) eine starke Schmelzpunktserniedrigung.

Untersuchungen am Diuronid C15H24013 der Glyzyrrhizinsäure

Beduhtion des Pentaacetylgluconsäure-methylesters III mit

LitMum-aluminiumhydrid19)

Darstellung des Methylesters: 4 g Pentaacetylgluconsäurevom Smp. 108° wurden in 40 cm3 Äther suspendiert und mit 28cm3

2-proz. ätherischer Diazomethanlösung verestert. Nach dreimaligem

") Erst längeres Stehen bei 17° führte unter Ausscheidung von Jod zu

weitergehender Oxydation.18 ) Aus dem Rückstand konnten mit Strontiumhydroxyd nur wenig

Kristalle isoliert werden, deren Menge für eine weitere Untersuchung nicht

ausreichte.

19) Die zugehörigen Formeln sind S. 40 aufgeführt.

55

Umkristallisieren aus Methanol-Äther konnten 3,2 g reiner Methyl¬ester vom. Smp. 118° erhalten werden.

Zur Reduktion wurde 1 g Ester in 50 cm3 reinem Dioxan gelöstund nach Zugabe von 1 g feingepulvertem Lithium-aluminium-

hydrid 12 Stunden am Rückfluss gekocht. Nach dem Erkalten wur¬

den die ausgefallenen Aluminiumsalze abgenutscht und gründlichmit Dioxan gewaschen. Die Dioxanlösung enthielt neben dem Re¬

aktionsprodukt noch Aluminiumsalze kolloidal gelöst, und viel Sub¬

stanz blieb im Rückstand adsorbiert. Zur weiteren Aufarbeitungwurden deshalb sowohl die ausgefallenen Aluminiumsalze als auch

der Rückstand der eingedampften Dioxanlösung je mit 20 cm3Aeet-

anhydrid und 20 cm3 Pyridin 12 Stunden bei 20° acetyliert. Das

Acetylierungsgemisch wurde am Vakuum zur Trockne eingedampftund mehrmals mit Toluol abgesaugt. Erst jetzt konnte das acety-

lierte Reduktionsprodukt mit viel Chloroform aus den Aluminium¬

salzen eluiert werden. Das durch Eindampfen der Chloroformlösungerhaltene Öl gab beim Destillieren im Hochvakuum neben einem

Rückstand von anorganischen Salzen ein kristallisiertes Destillat

(0,3 g).Nach zweimaligem Sublimieren bei 95° schmolz das Analysen-

präparat bei 99° und gab mit reinem Hexaacetylsorbit in derMisch-

probe keine Depression.

3,822 mg Subst. gaben 6,956 mg CC-2 und 2,075 mg H20

C18H26012 Ber. C 49,77 H 6,03%Gef. C 49,67 H 6,08%

[«Id = + 18° (o = 1 in Chloroform)

Reduktion des Diuronids C15H2i013 (I) aus Olyzyrrhizinsäuremit Liihiumaluminiumhydrid; Isolierung eines kristallisierten

Disaccharid-methylglykosid-heptaacetats II C27H38018

Da das zu reduzierende Diuronid in Äther kaum, in Dioxanund

Tetrahydrofuran schwer löslich ist, wurde die Substanz in einer

Filterpapierhülse, die am untern Ende des Rückflusskühlers dem

rückfliessenden Lösungsmittel ausgesetzt ist, eingebracht. Die Sub¬

stanz kommt somit als verdünnte Lösung mit einem grossen Über-

schuss an Reduktionsmittel zur Reaktion.

56

2,5 g Lithiumaluminiumhydrid wurden in 100 cm3 reinem Dioxan

suspendiert und am Rückfluss im Sieden gehalten. Aus der Filter¬

papierhülse wurden im Laufe von 8 Stunden 2,5 g Diuronid heraus¬

gelöst und dem Reduktionsgemisch zugeführt. Der Überschuss des

Lithiumaluminiumhydrids ist etwa 3-molar.

Der Ansatz wurde noch weitere 4 Stunden gekocht und die nach

dem Erkalten ausgefallenen Aluminiumsalze abgenutscht. Nach

dem Absaugen des Lösungsmittels am Vakuum wurden alle Rück¬

stände mit überschüssigem Pyridin-Acetanhydrid im Verlaufe von

12 Stunden bei 20° acetyliert. Zur weiteren Aufarbeitung wurden

die Acetylierungsmittel im Vakuum entfernt und die Rückstände

mehrmals mit Toluol abgesaugt. Erst jetzt konnte das acetylierte

Reduktionsprodukt des Diuronids mit viel Chloroform aus den

anorganischen Salzen eluiert werden. Die erhaltenen Öle wurden

aus der Kugelröhre im Hochvakuum destilliert und ergaben neben

einem geringen Vorlauf bei 160° eine Hauptfraktion 1,6 g bei 230°

Luftbadtemperatur.Zur Analyse wurde das farblose glasartige Destillat 3 Mal bei

0,01 mm und 230° destilliert.

3,758 mg Subst. gaben 6,647 mg C02 und 2,006 mg H20

C27H38018 Ber. C 49,84 H 5,89%Gef. C 48,27 H 5,97%

Das nicht ganz einheitliche Destillat (1,5 g) stimmt also annä¬

hernd auf ein Disaccharid-methylglycosid-heptaacetat IIC27H38018.Aus Äther konnte es in langen Nadeln (1,3 g) erhalten werden, die

nach dreimaligem Umkristallisieren bei 133° schmolzen. Zur Ana¬

lyse wurde das Präparat 24 Stunden bei 0,01 mm und 60° getrocknet.

3,811 mg Subst. gaben 6,959 mg C02 und 2,032 mg-H20

C27H38018 Ber. C 49,84 H 5,89%Gef. C 49,83 H 5,97%

[a]D = +51° (e = 1,5 in Chloroform)

Die Substanz liess sich bei 140° im Hochvakuum sublimieren.

Da das Sublimat den etwas tieferen Schmelzpunkt von 128° hatte,

wurde auch dieses Präparat analysiert.

57

3,677 mg Subst. gaben 6,682 mg C02 und 1,983 mg H20

C27H38018 Ber. C 49,84 H 5,89%Gef. C 49,59 H 6,03%

[a]D = +53° (c = 1,5 in Chloroform)

Mischprobe mit /3-Methylmaltosid-heptaacetat: Das als Ver¬

gleichssubstanz benötigte j8-Methylmaltosid-heptaacetat wurde aus

Acetobrommaltose und Methanol in Gegenwart von Silbercarbonat

in 75-proz. Ausbeute nach20) hergestellt.Das Analysenpräparat vom Smp. 130° wurde 24 Stunden bei

60° im Hochvakuum getrocknet.

3,770 mg Subst. gaben 6,884 mg C02 und 2,021 mg H20

C27H38018 Ber. C 49,84 H 5,89%

Gef. C 49,83 H 6,00%

[«]D = +52° (c = 1,5 in Chloroform)

Acetyliertes Red. Prod, aus dem

Diuronid der Glyzyrrhizinsäure

^27^38^18

j3-Methylmaltosid-

heptaacetat

^27H38G18

Misch¬

probe

Smp. 128° bzw. 135° 130°n. Lit.

129°119°

«D + 51-53° + 52° + 53,5°

Verseifung des acetylierten Beduktionsproduktes C272738018zum Disaccharid-methylglycosid GlzH2iOxl (II)

1,3 g des Disaccharid-methylglycosid-heptaacetats (2 m Mol)vom Smp. 133° wurden in 25 cm3 Methanol gelöst und mit 0,1-n.

Natronlauge auf Naphthophthalein heiss titriert. Der Verbrauch an

0,1-n. Natronlauge betrug 140 cm3 (ber. 140 cm3). Die Na-Ionen

wurden aus der methanolischen Lösung mit 30 cm3 Wofatit KS

entfernt. Nach dem Eindampfen kristallisierte der Rückstand in

Nadeln aus Methanol. Das Disaccharid-methylglycosid (0,65 g)schmolz bei 250°.

20) C. S. Hudson and R. Sayre, Am. Soc. 38, 1870.

58

Zur Analyse wurde das Präparat dreimal aus Methanol um¬

kristallisiert und 48 Stunden bei 110° im Hochvakuum ge¬trocknet.

3,650 mg Subst. gaben 5,838 mg C02 und 2,215 mg H20

C13H24Ou Ber. C 43,82 H 6,79%Gef. C 43,65 H 6,79%

[a]D = + 69° (o = 0,5 in Wasser)

Durch analoge Verseifung konnten aus 2 g ß-Methylheptaacetyl-maltosid 1,1 g ß-Methyl-maltosid vom Smp. 108—110° und der

Drehung [a]D= +78° (W) erhalten werden.

Oxydation des Diuronids C15H2i013 mit Perjodsäure

Bei der Ausführung der Oxydation des Diuronids mit nur einem

kleinen Überschuss an Perjodsäure stieg der Verbrauch weit über

die theoretische Menge hinaus. Die Oxydation des ß-Methylmal-tosids verlief auch unter Mehrverbrauch bei analogen experimen¬tellen Bedingungen. Bei allen diesen Versuchen war eine Braunfär¬

bung der Reaktionslösung unter Jodausscheidung bemerkbar21).Um den möglichen Lichteffekt auszuschalten, wurden die fol¬

genden Versuche im Dunkeln ausgeführt. Die günstigsten experi¬mentellen Bedingungen wurden ausgewählt und nachfolgend an¬

gegeben:206 mg Diuronid (0,5 Millimol) vom Smp. 225° wurden in einem

10 cm3-Messkolben in 1 cm3 Wasser gelöst, bei Zimmertemperatur7 cm3 0,475-n. Perjodsäurelösung zugegeben und mit Wasser auf

10 cm3 aufgefüllt (Zeit 0). Zur Ermittlung des Verbrauches an

Oxydationsmitteln wurden davon je 1 cm3 in regelmässigen Zeit-

abständen mit 0,1-n. Natriumarsenitlösung titriert. Die Titration

wurde mit Phosphatpuffer folgenderweise ausgeführt: 1 cm3 des

Oxydationsgemisches wurde mit 20 cm3 Wasser verdünnt, 2 cm3

1-n. Natriumphosphatlösung und 1 cm3 1-n. KaliumJodid zugefügtund das ausgeschiedene Jod mit 0,1-n. Na-Arsenitlösung titriert.

Nimmt der Gehalt an Oxydationsmittel zwischen 2 oder 3 Bestim¬

mungen nicht mehr ab, so ist der Endwert der Oxydation erreicht.

21) S. H. Head, Nature 165, 237 (1950).

59

Lösungen:

Perjodsäure 0,475-m. enth. 0,475 milli 0 im cm3.

Natriumarsenit 0,1-n. enth. 0,05 milli 0 im cm3.

1 cm3 Perjodsäure verbrauchte 9,5 cm3 Arsenit.

Oxydation:

cm3 Ars.

k

Zeit min Verbrauch Arsenit 0,1-n.

0 6,65

5 5,7

60 5,1

120 4,5

180 3,8

240 3,51_, ,

_,

300 3,5} Endwert

S SA.

Berechnung des Verbrauches:

Anfangstiter bei der Zeit t = 0; 0,7 x 9,5 = 6,65 cm3 Ars.

Endtiter =3,50 cm3 Ars.

Verbrauch 3,15 cm3 Ars.

Umrechnung in milli 0 (1 cm3 Ars. = 0,05 milli 0) auf den ganzenAnsatz (10 cm3):

3,15x0,05x10=1,575 milli 0 pro 206 mg Diuronid oder 3,15

milli 0 auf 1 Millimol Diuronid.

60

Das aus Glyzyrrhizinsäure gewonnene Diuronid verbraucht somit

6 Äquivalente Perjodsäure, bzw. 3 Atome Sauerstoff pro Mol.

Bei Wiederholung der Oxydation unter gleichen Bedingungenwurde derselbe Wert erhalten.

Desgleichen verbrauchte reines /3-Methylmaltosid bei analoger

experimenteller Ausführung der Perjodsäureoxydation 2,9 Atome

Sauerstoff pro Mol.

Hydrolyse des Diuronids CuH2i0ls mit Ameisensäure

5 g Diuronid (Smp. 225°) wurden in 50 cm3 90-proz. Ameisen¬

säure gelöst und 12 Stunden am Rückfluss gekocht. Gegen Ende

des Kochens färbte sich die Lösung braun; sie wurde am Vakuum

zur Trockne eingedampft, der Rückstand zur Entfernung der Amei¬

sensäure in Äthanol aufgenommen und die flüchtigen Anteile mehr¬

mals abgesaugt. Nach Auflösen des Rückstandes in Wasser wurde

die braune Lösung mit Norit entfärbt und die Hydrolysenproduktea,us absolutem Alkohol kristallisiert. Nach dreimaligem Umkristal¬

lisieren aus Wasser-Alkohol schmolz die Substanz (1 g) bei 178°.

Aus der Mutterlauge konnten noch weitere 0,3 g Substanz gewon¬

nen werden. Die Ausbeute aus dem Diuronid beträgt 25% bezogenauf Glucuron. Durch nachträgliche 24-stündige Hydrolyse der Mut¬

terlaugen (3,5 g) mit 90-proz. Ameisensäure konnten keine kristal¬

lisierten Anteile mehr gewonnen werden.

Die bei 178° schmelzende Substanz gab mit reinem d-Glucuron

vom Smp. 180° in der Mischprobe keine Depression.Das Analysenpräparat wurde 48 Stunden bei 70° im Hochva¬

kuum getrocknet.

3,788 mg Subst. gaben 5,669 mg C02 und 1,548 mg H20

C6Hs06 Ber. C 40,91 H 4,58%Gef. C 40,84 H 4,57%

Hd = + 19'5° (c = °>9 in Wasser)

In Versuchen, das Diuronid mit 90-proz. Ameisensäure bei Zim¬

mertemperatur zu hydrolysieren, konnte nur das Ausgangsprodukt

zurückgewonnen werden.

61

Versuche zur Hydrolyse des Diuronids 01&H2i013 mit Eisessig

1 g Diuronid wurde in 10 cm3 Eisessig 12 Stunden am Rückfluss

gekocht. Die klare Lösung wurde am Vakuum eingeengt und mit

Benzol abgesaugt. Der Rückstand liess sich aus absolutem Äthanol

auskristallisieren. Die Kristalle vom Smp. 188° gaben mit dem rei¬

nen Pentaacetat des Diuronids (Smp. 188°) in der Mischprobe keine

Depression.

Oxydation der Hydrolysenprodukte des Diuronids C15H2i013zur Dicarbonsäure

1,5 g nicht kristallisierender Mutterlaugen aus der Hydrolyse des

Diuronids I mit 90-proz. Ameisensäure wurden mit 2 cm3 Salpeter¬säure der Dichte 1,4 12 Stunden bei Zimmertemperatur oxydiert.Die Reaktion trat sofort ein und musste durch Kühlen gebremstwerden. Die Salpetersäure wurde aus dem Oxydationsgemisch am

Vakuum entfernt und der Rückstand mehrmals in heissem Methanol

aufgenommen und abgesaugt.Aus der so erhaltenen, nicht kristallisierenden Säure (1,5 g) wurde

mit 18 cm3 2-proz. Diazomethanlösung der Methylester hergestellt(1,5 g). Nach dem Acetylieren mit 5 cm3 Pyridin und 5 cm3 Acet-

anhydrid konnte das braune Acetylierungsgemisch nach dreimali¬

gem Destillieren im Hochvakuum bei 170° in ein hellgelbes Öl über¬

geführt werden (0,8 g). Da dieses nicht kristallisierte, wurde daraus

in bekannter Weise das Diamid in Methanol mit Ammoniak herge¬stellt. Nach dreimaligem Umkristallisieren aus Wasser-Methanol

schmolz dieses bei 171° unter Zersetzung und gab mit reinem d-

Zuckersäure-diamid keine Depression in der Mischprobe. Das kristal¬

lisierte Diamid beträgt ca. 20% des Gesamtdiuronids; der Rest ist

nicht kristallisiert.

Alkalische Oxydation der Hydrolysenprodukte des Diuronids

015H2i013 mit Sauerstoff

3,5 g getrocknete Mutterlaugen aus der Hydrolyse des Diuronids

wurden in 25 cm3 Wasser gelöst und die Lösung von 3,5 g Kalium¬

hydroxyd in 10 cm3 Wasser im Laufe von 1 Stunde unter Sauerstoff-

62

blasen bei 0° hinzugetropft. Die Oxydation wurde in einem Hydrier¬kolben unter Sauerstoffdruck bei 20° 24 Stunden bis zur negativen

Fehlingprobe fortgesetzt.Nach beendeter Oxydation wurde die dunkle Lösung durch

100 cm3 Wofatit KS zum Entfernen der K-Ionen filtriert. Nach dem

Entfärben mit Norit wurde die gelbe Lösung am Vakuum einge¬

dampft. Zur Identifizierung wurde die Säure mit Methanol und

Salzsäure in den Methylester überführt und letzterer acetyliert.Zum Vergleich mussten zuerst die entsprechenden Derivate der

4 möglichen Trioxyglutarsäuren hergestellt werden.

Derivate der Trioxyglutarsäuren

1. Xylo-trioxyglutarsaure-dimethylester-triacetat II22)

9 g d-Xylose wurden in der doppelten molaren Menge Salpeter¬säure (20 cm3) der Dichte 1,2 gelöst. Die klare Lösung wurde wäh¬

rend zwei Stunden auf 60—70° erhitzt; die Oxydation setzte beim

Erwärmen schon nach kurzer Zeit unter Gasentwicklung ein. Nun

wurde die klare Lösung mit einem Überschuss an Bariumcarbonat

(15 g) neutralisiert, wobei sie sich ziemlich stark dunkel färbte. Die

abfiltrierte Lösung des Bariumsalzes wurde etwas eingeengt (35cm3)und in 200 cm3 Alkohol eingetropft. Das ausgefallene Bariumsalz

wurde abfiltriert und im Vakuumexsikkator getrocknet (9,2 g).Zur Veresterung wurde das trockene Bariumsalz (9 g) mit 200

cm3 3-proz. methanolischer Salzsäure 12 Stunden am Rückfluss ge¬

kocht. Nach Abfiltrieren des unlöslichen Bariumchlorides wog der

rohe Dimethylester 3,5 g. Dieser wurde mit 10 cm3 Acetanhydridin 10 cm3 Pyridin bei 20° über Nacht acetyliert. Das Acetylierungs-

produkt wurde mit Toluol trockengesaugt, in 50 cm3 Chloroform

gelöst, von Verunreinigungen filtriert und aus dem Kugelrohr im

Hochvakuum destilliert. 3,6 g braunes Rohprodukt gaben nach drei¬

maligem Destillieren 1,5 g eines hellgelben Öles.

Das Analysenpräparat wurde drei Mal bei 0,01 mm und 140°

Luftbadtemperatur destilliert.

22) Die zugehörigen Formeln sind S. 43 aufgeführt.

63

3,467 mg Subst. gaben 5,953 mg CC-2 und 1,689 mg H20

Ci3H18O10 Ber. C 46,70 H 5,43%Gef. C 46,86 H 5,45%

[a]D = -4° 23) (c = 1,5 in Chloroform)

Xylo-trioxyglutarsäure-diamid (III aus II)

1,2 g reines Xylo-trioxyglutarsäure-dimethylester-triacetat (II)wurden in 20 cm3 Methanol gelöst und bei 0° mit Ammoniakgasgesättigt. Das Diamid III kristallisierte über Nacht aus der Lösung(300 mg). Nach dem Entfärben mit Norit und dreimaligem Um¬kristallisieren aus heissem Wasser schmolz das Präparat bei 180°,wobei einige Grade höher Zersetzung unter Gasentwicklung ein¬

trat.

Zur Analyse wurde die in organischen Lösungsmitteln kaum lös¬

liche Substanz 24 Stunden bei 60° im Hochvakuum getrocknet.

3,723 mg Subst. gaben 4,582 mg C02 und 1,882 mg H20

C6H10O5N2 Ber. C 33,71 H 5,66%Gef. C 33,68 H 5,67%

[«Id = 0° (optisch inaktiv)

d-Arabo-trioxyglutarsäure

Die zur Oxydation benötigte d-Arabonsäure (IV) wurde aus d-

Glucose durch Oxydation in alkalischer Lösung mit Sauerstoff her¬

gestellt und in Form ihres gut kristallisierten Kaliumsalzes er¬

halten24).Zur Freilegung der Säure wurden 20 g Kalium-d-arabonat in

200 cm3 Wasser gelöst und durch 100 cm3 Wofatit KS fliessen ge¬

lassen. Die vom Austauscher abtropfende Lösung war frei von K-

Ionen und wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der klare

Sirup wog 14 g und konnte aus den gebräuchlichsten Lösungsmit¬teln nicht kristallisiert werden.

23) Theoretischer Wert = 0°.

24) Vgl. Fussnote 89).

64

Zur Oxydation wurden 14 g amorphe d-Arabonsäure (IV) in

17 cm3 Salpetersäure der Dichte 1,2 zwei Stunden bei 60° erwärmt

und die Säure am Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 cm3

Wasser gelöst und mit überschüssigem Bariumcarbonat bei 60°

neutralisiert. Die braune Lösung des Bariumsalzes wurde in Al¬

kohol eingetropft, wodurch ein amorphes Bariumsalz erhalten

wurde, das nach dem Trocknen im Exsikkator 17 g wog. Zur Ver¬

esterung wurde das Ba-salz in 300 cm3 3-proz. methanolischer Salz¬

säure 2 Stunden am Rückfluss gekocht. Nach dem Filtrieren der

unlöslichen Bariumsalze und dem Trocknen am Vakuum wurden

10 g Dimethylester erhalten. Das Produkt wurde in 20 cm3 Pyridingelöst und mit 20 cm3 Acetanhydrid über Nacht acetyliert, von an¬

organischen Salzen abfiltriert und die flüchtigen Anteile am Vakuum

abgesaugt. Der Rückstand wurde mit 200 cm3 Benzol heiss extra¬

hiert, wobei 6,5 g Acetat in Lösung gingen, die an 150 g Alumi-

niumoxyd der Aktivität II chromatographiert wurden. Das Benzol-

eluat lieferte 4,2 g d-Arabo-trioxyglutarsäuredimethylester-triacetatin Form eines hellgelben Öles.

Zur Analyse wurde dieses drei Mal im Hochvakuum bei 140°

Luftbadtemperatur aus dem Kugelrohr destilliert.

3,991 mg Subst. gaben 6,868 mg C02 und 1,903 mg H20

Ci3H18O10 Ber. C 46,70 H 5,43%Gef. C 46,96 H 5,34%

[a]D = +31° (c = 2 in Chloroform)

d-Arabo-trioxyglutarsäurediamid ( VI aus V)

4 g des Triacetats V wurden in 100 cm3 Methanol gelöst und bei

0° mit Ammoniakgas gesättigt. Aus der Lösung kristallisierten 1,9 geines rohen Amids, das dreimal aus heissem Wasser bis zum Smp.190° (Zersetzung) umkristallisiert wurde.

Das Analysenpräparat wurde 24 Stunden bei 60° im Hochva¬

kuum getrocknet.

3,830 mg Subst. gaben 4,701 mg C02 und 1,906 mg H20

C5H10O5N2 Ber. C 33,71 H 5,66%Gef. C 33,50 H 5,57%

Wd = - 40° (e = 1 in Wasser)

65

2. Ribo-trioxyglutarsäure

10 g d-Ribonsäurelacton (VII) vom Smp. 80° wurden mit 15 cm3

Salpetersäure (d=l,2) 2 Stunden bei 60—70° oxydiert. Der Über-

schuss an Salpetersäure wurde am Vakuum entfernt und die Lösungdes klaren Sirups in 100 cm3 Wasser mit überschüssigem Barium-

carbonat (15 g) bei 60° neutralisiert und die Lösung filtriert. Das

amorphe Bariumsalz wurde wie bei der Arabo-trioxyglutarsäure mit

Alkohol ausgefällt. Nach dem Trocknen im Exsikkator wog das Ba¬

riumsalz 12 g.

Das Präparat (12 g) wurde mit 200 cm3 3-proz. methanolischer

Salzsäure 12 Stunden am Rückfluss gekocht. Nach dem Abfiltrieren

der Bariumsalze wog der rohe dunkle Dimethylester 5 g. Er wurde

mit 15 cm3 Pyridin und 15 cm3 Acetanhydrid acetyliert, mit Toluol

trocken gesaugt und der Rückstand (8,5 g) mit 150 cm3 Benzol er¬

schöpfend extrahiert (Unlösliches = 3 g). Die Benzollösung wurde

an 100 g Aluminiumoxyd der Aktivität II chromatographiert. Das

Benzoleluat lieferte 3 g eines hellgelben Öles, das aus Äther kri¬

stallisiert werden konnte.

Das Analysenpräparat vom Smp. 72° wurde bei 70° im Hochva¬

kuum drei Mal sublimiert.

3,780 mg Subst. gaben 6,490 mg C02 und 1,836 mg H20

C13H18O10 Ber. C 46,70 H 5,43%Gef. C 46,86 H 5,44%

[a]D = 0° 25) (c = 1 in Chlorofrom)

Ribo-trioxyglutarsäurediamid IX aus VIII

2,5 g Dimethylester-triacetat VIII wurden in 30 cm3 Methanol

gelöst und bei 0° mit Ammoniakgas gesättigt. Nach einigen Tagenkristallisierte das Diamid IX in runden Warzen aus, die nach drei¬

maligem Umkristallisieren bei 150° schmolzen (155° Zersetzung).Zur Analyse wurde das Präparat 12 Stunden bei 60° im Hoch¬

vakuum getrocknet.

25) Theoretischer Wert = 0°.

66

3,670 mg Subst. gaben 4,546 mg C02 und 1,837 mg H20

C5H10O5N2 Ber. C 33,71 H 5,66%

Gef. C 33,80 H 5,60%

Hd = 0° (optisch inaktiv)

Ribo-trioxyglutarsäure-dihydrazid IXa aus VIII

50 mg Dimethylester-triacetat VIII wurden mit 0,5 g Hydrazin-

hydrat 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Nach Zusatz von 5 cm3

Äthanol kristallisierte das Dihydrazid in Nadeln, die aus Wasser-

Alkohol drei Mal umkristallisiert wurden.

Das Analysenpräparat vom Smp. 197° wurde im Hochvakuum

48 Stunden bei 80° getrocknet.

3,849 mg Subst. gaben 4,012 mg C02 und 1,996 mg H20

C5H1205N4 Ber. C 28,85 H 5,81%

Gef. C 28,45 H 5,80%

Md = 0°

67

Zusammenfassung

d-Glucuronsäure scheint in animalischen und vegetabilen Orga¬nismen in Form von Glykosiden und Polysacchariden weit verbrei¬

tet, doch ist ihr Nachweis mangels analytisch geeigneter Derivate

in eindeutiger Weise bisher nur in wenigen Verbindungen geglückt.Im Verlaufe der letzten Jahre wurde in zunehmendem Masse die

ausserordentliche biologische Bedeutung der Glucuronsäure und dtsr

Glucuronide erkannt. Es schien deshalb gerechtfertigt, in der vor¬

liegenden Arbeit eine umfassende Zusammenstellung der gesamtenLiteratur über d-Glucuronsäure zu geben.

Die eigenen Untersuchungen über Derivate der d-Glucuronsäure

verfolgten den Zweck, die Isolierung und Identifizierung dieser

Säure zu erleichtern; sie wurden im Zusammenhang mit der Erfor¬

schung des Zuckerteils der Glyzyrrhizinsäure durchgeführt.Die Herstellung des a- und /?-Methyl-d-glucuro-pyranosids er¬

folgte durch Oxydation des a- und /3-Methylglucosids, die den Py-

ranosering schon in stabiler Anordnung enthalten, mit Distickstoff-

tetroxyd. Die Oxydation und die Umwandlung der beiden Methyl-

glucuronide in kristallisierte Derivate ist in zwei Publikationen

(Helv. 32, 2165 (1949); 33, 337 (1950)) beschrieben. Zur präpara-tiven Ausführung der Herstellung von d-Glucuron ist das Verfahren

noch nicht geeignet.Nach diesen Vorarbeiten wurden Versuche zur Ermittlung der

Konstitution des Zuckerteils der Glyzyrrhizinsäure unternommen.

Das aus Glyzyrrhizinsäure isolierte Diuronid C15H24013 lieferte bei

der Hydrolyse mit Ameisensäure 25% d-Glucuron, womit bewiesen

ist, dass wenigstens eine der zwei Säuren des Diuronids als d-Glu¬

curonsäure vorliegt. Der Abbau der nicht kristallisierenden Hydro-

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lysenprodukte, in denen die zweite Uronsäure enthalten sein sollte,mit molekularem Sauerstoff und Alkali führte zu einer der vier

stereoisomeren Trioxyglutarsäuren, von denen zu Vergleichs¬zwecken nach Angaben der Literatur drei hergestellt und in Form

von Derivaten charakterisiert wurden.

Die Reduktion des Diuronids mit Lithiumaluminiumhydridführte zu einem Disaccharid-methylglucosid unbekannter Konsti¬

tution, das sich mit den Methylglucosiden der Maltose und Cello-

biose nicht identisch erwies. Aus der Oxydation des Diuronids mit

drei Mol Perjodsäure ergibt sich lediglich, dass die beiden Dehydro-hexonsäuren des Zuckerteils der Glyzyrrhizinsäure untereinander

nur in 2- oder 4-Stellung verbunden sein können. Diese Schluss¬

folgerung gilt auch für das oben erwähnte Disaccharid-methyl¬

glucosid*).

*) Vgl. Anmerkung S. 14.

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Lebenslauf

Ich, Daniel Spitz, wurde am 1. Februar 1925 in Strassburg ge¬boren und absolvierte dort die Primär- und Sekundärschule. Im

Jahre 1940 kam ich nach Basel, wo ich mich auf die eidgenössischeMaturitätsprüfung vorbereitete, welche ich 1943 in St. Gallen be¬

stand. Von da an studierte ich Chemie an der EidgenössischenTechnischen Hochschule in Zürich und erhielt im Frühjahr 1948

das Diplom als Ingenieur-Chemiker. Seit dieser Zeit war ich mit der

Ausführung der vorliegenden Promotionsarbeit im Laboratorium

von Prof. Dr. L. Ruzicka beschäftigt.