Riproduzione

ASESSUATA o AGAMICA: Si ottiene una progenie geneticamente identica

(CLONE) a meno di fenomeni di mutazione o cambiamenti occasionali del

materiale genetico

tipica dei procarioti ed eucarioti unicellulari

SESSUATA o GAMICA: richiede la partecipazione di due individui in quanto è

affidata all’incontro di due cellule speciali i gameti prodotti nelle gonadi da un

individuo di sesso maschile e da uno di sesso femminile

tipica di piante e animali (eucarioti pluricellulari) ma anche di alcuni eucarioti

unicellulari

La diversità genetica associata ai meccanismi di

riproduzione sessuata offre un’enorme opportunità a

livello evolutivo

SETTO

SCISSIONE BINARIA

~ 20/30 min in condizioni

ambientali favorevoli

(temperatura, mezzo

nutritivo, assenza di specie

in competizione…)

l’informazione genetica è

stata equamente ripartita

fra le due cellule figlie

Ambiente svolge un’importante funzione di regolazione della crescita delle

popolazioni batteriche

→ CLONE = discendenza di cellule tutte uguali

Divisione cellulare nei procarioti

Riproduzione delle cellule eucariotiche

CELLULE SOMATICHE si riproducono AGAMICAMENTE

DIVISIONE CELLULARE o MITOSI, previa duplicazione del DNA,

ripartisce l’informazione genetica in due cellule che sono identiche fra di loro e uguali

a quella che le ha generate (2n)

CELLULE GERMINALI si dividono per MEIOSI

Un evento duplicativo del DNA seguito da due divisioni

→ 4 cellule con corredo cromosomico APLOIDE (n) GAMETI

cellule tipiche di individui con RIPRODUZIONE SESSUATA

CICLO CELLULARE in cellule eucariotiche

INTERFASE periodo fra 2 mitosi consecutive

FASE G1 (gap 1) non c’è duplicazione del DNA, trascrizione e traduzione attive

12-24 ore

FASE S sintesi di DNA 6-7 ore

FASE G2 trascrizione e traduzione attive, in preparazione alla mitosi

FASE M MITOSI o DIVISIONE CELLULARE

centrosoma si duplica → aster → fuso primario

G0 è una G1 prolungata tipica delle

cellule che non si dividono

G1 e G2 non sono distinguibili

morfologicamente

Rappresentazione del ciclo cellulare negli eucarioti

Cellule cancerose ad

es. perdono l’inibizione

da contatto e

continuano a crescere in

multistrato, in vitro

Natura dei meccanismi di controllo del ciclo cellulare:

• Fattori fisici (disponibilità di un ancoraggio, affollamento della coltura)

• Fattori chimici (presenza-assenza di fattori di crescita, la densità

cellulare)

a meno che non intervenga la trasformazione → cellule tumorali

Checkpoints del ciclo cellulare

es. danno al DNA, non corretto assemblaggio delle fibre del fuso

PUNTO DI RESTRIZIONE

Il fuso mitotico è una struttura del citoscheletro degli eucarioti coinvolto nella mitosi e nella meiosi. La sua

funzione è di separare i cromosomi e tutto il materiale della cellula madre durante la divisione cellulare (sia

mitosi che meiosi) per dar origine alle cellule figlie. Consiste in un fascio di microtubuli uniti alla fine ma separati

a metà, di forma vagamente ellittica.

Il centriolo è un organello a struttura cilindrica cava (lunga circa 0,5 micron e larga 0,2) la cui parete è

formata da nove triplette di microtubuli ed è dotato di appendici all'estremità distale.

I centrioli si trovano in coppia e solitamente sono disposti tra di loro a formare un angolo retto. Assieme ad un

materiale elettrondenso che li circonda, chiamato "materiale pericentriolare" (centrosoma), il più importante

"centro organizzatore dei microtubuli" (MTOC) della cellula. Svolgono una funzione essenziale durante la

mitosi, in quanto sono coinvolti nell'assemblaggio del fuso mitotico.

Le coppie di centrioli si differenziano in un centriolo più anziano (madre), vecchio di almeno due cicli cellulari, e

un figlio, che risale almeno al ciclo cellulare precedente. Durante la fase S i centrioli si duplicano, ma restano

uniti in un unico centrosoma. All'inizio della profase le due coppie si separano migrando ai poli opposti della

cellula e dando origine a due centrosomi distinti.

Aster L’aster è composto da microtubuli che si irradiano dal centrosoma. Questa struttura compare nella profase e

scompare nella telofase, ingrandendosi soprattutto nella metafase.

Fibre del fuso Le fibre del fuso compaiono, come l’aster, nella profase e scompaiono nella telofase. Queste fibre si

propagano dai due poli della cellula e possono essere distinte in base alla loro posizione e al loro rapporto

con cromosomi e poli cellulari. Le fibre dette continue si irradiano da un polo ad un altro, mentre le fibre

interzonali presenti solo in anafase tra i due gruppi di cromosomi. Le fibre del fuso sono composte da

microtubuli ed hanno per questo polarità e capacità di polimerizzare e depolimerizzare, per permettere

l’allungamento della cellula e la divisione dei cromatidi fratelli. Più nello specifico, l’accorciamento delle fibre

cromosomiche permette la divisione dei cromatidi, mentre l’allungamento di quelle continue l’allungamento

della cellula.

Formazione del fuso mitotico

a) Duplicazione della coppia di centrioli

b) L’aster si divide in due, tra di essi si allungano i microtubuli

c) La separazione continua e i microtubuli che si estendono fra gli aster formano il fuso

centrosoma

centrioli

fibre dell’Aster

piastra metafasica

microtubuli del cinetocore

(fibre del fuso acrosomiche)

centrioli

microtubuli

dell’aster

materiale

pericentriolare

microtubuli

polari

Fibre del fuso mitotico in metafase

immagine al microscopio a fluorescenza

Mitosi:

•PROFASE

•METAFASE

•ANAFASE

•TELOFASE

Cromatidi fratelli e centromero

fotografia al SEM

Cellule animali.

Solco di divisione:

microfilamenti di

actina

Cellule vegetali. Piastra cellulare:

deposizione di vescicole contenenti

polisaccaridi della parete vegetale

Meiosi permette mantenimento del numero costante dei cromosomi

in organismi a riproduzione sessuata

Negli organismi superiori viene operata esclusivamente dalle cellule

germinali per dimezzare il contenuto di DNA; 2n→n

2 divisioni precedute da 1 duplicazione del DNA:

MEIOSI I RIDUZIONALE

MEIOSI II EQUAZIONALE

• Avvengono due successive divisioni, a partire da una cellula diploide si

ottengono 4 cellule aploidi

• Le 4 cellule aploidi contengono un solo cromosoma di ogni coppia di

omologhi

• Durante la meiosi si verifica la ricombinazione dell’informazione

genetica dei cromosomi parentali, tanto che ogni cellula aploide

prodotta ha una combinazione di geni potenzialmente unica

Si suddivide in 5 stadi:

leptotene, in cui il materiale genetico si condensa a formare strutture bastoncellari in forma di filamenti sottili,

allungati, non scissi longitudinalmente;

zigotene, durante il quale avviene la sinapsi dei cromosomi omologhi a formare una struttura denominata

tetrade. L'appaiamento dei cromosomi omologhi avviene grazie ad una struttura submicroscopica proteica, il

complesso sinaptinemale;

pachitene: precoce, in cui si completa l'appaiamento degli omologhi, avanzato, in cui i cromosomi si

accorciano, si inspessiscono e avviene il crossing-over, che però ancora non si nota;

diplotene: in questo stadio i cromosomi omologhi di ciascun bivalente cominciano a separarsi (desinapsi),

soprattutto a livello del centromero, per la progressiva scomparsa del complesso sinaptinemale. Tuttavia i due

cromatidi di ciascuna coppia di omologhi restano in contatto grazie a connessioni chiamate chiasmi, segni visibili

dell'avvenuto crossing-over;

diacinesi, nel corso del quale i cromosomi completano la loro condensazione e sono chiaramente visibili. Ormai

è ben formata la tetrade o bivalente e avviene la dissoluzione della membrana nucleare e del nucleolo.

Durante la profase I, inoltre, si sviluppa il fuso, costituito da due coppie di centrioli, situate ai poli opposti della

cellula, da cui fuoriescono fibre di microtubuli. Tali fibre agganciano i cromosomi mediante il cinetocore, una

piastra proteica situata a livello del centromero. La profase I può durare per giorni o anche più a lungo e occupa il

90% del tempo richiesto per quasi tutta la divisione meiotica.

PROFASE I

PROFASE I

sinapsi: appaiamento dei cromosomi omologhi

crossing over: scambio di materiale genetico

chiasmi: siti dove è avvenuto il crossing over

dove i cromosomi omologhi rimangono uniti

Comparsa dei chiasmi nella profase 1 è la conseguenza visibile dell’avvenuto

crossing over

cromatidi ricombinanti sono geneticamente diversi da quelli di origine

cromatidi

ricombinanti

Schema relativo al crossing-over

Nella profase I si forma il complesso sinaptinemale o SINAPSI coinvolge 2

cromosomi omologhi che si appaiano

TETRADE (4 cromatidi appaiati)

Tramite crossing over si ottiene scambio di materiale genetico fra cromatidi

omologhi non fratelli → aumento variabilità genetica

CHIASMI sono i punti di attacco dei cromosomi dove si è già verificato il

crossing over

Nella Metafase I un solo cinetocore per cromosoma prende contatto con le

fibre del fuso

Nell’Anafase I si separano i cromosomi omologhi

Telofase I: si formano due cellule con corredo già aploide (n)

Assortimento indipendente dei

cromosomi omologhi

Nell’anafase I è soltanto il caso ad

attribuire un omologo della coppia ad

una cellula piuttosto che ad un’altra

Più elevato è il numero cromosomico

del corredo genetico, minore è la

probabilità che si ristabiliscano le

combinazioni parentali originali

2n = Possibili combinazioni gametiche

derivanti dall’assortimento casuale dei

cromosomi paterni e materni alla

meiosi

n = numero aploide del corredo

223 possibili combinazioni

cromosomiche diverse fra cromosomi

materni e paterni nell’uomo!

Confronto fra mitosi e meiosi

•il DNA viene duplicato

prima di ogni divisione

mitotica, ciò non accade

nell’intervallo che precede la

Meiosi II

•Nella Mitosi i due cromatidi

nel cromosoma sono

identici, nella Meiosi II sono

diversi a causa del crossing

over

•Nell’Anafase I si separano i

cromosomi omologhi non i

cromatidi come nella Mitosi

•Il numero di cromosomi che

si allinea in metafase II è

dimezzato rispetto a quello

della metafase mitotica

costanza del materiale genetico

MITOSI MEIOSI

CARIOTIPO assetto cromosomico di un individuo

cromosomi metafasici ben separati

classificazione cromosomi in base alla

posizione del centromero

Informazioni relative al numero, forma, dimensioni dei cromosomi di una cellula:

♂

Cellule umane diploidi hanno un cariotipo costituito da 23 coppie di cromosomi → 46

Non-disgiunzione alla Meiosi porta ad ANEUPLOIDIA:

condizione anomala in cui uno o più cromosomi mancano o sono in eccesso

TRISOMIA DEL 21 o Sindrome di Down

Non disgiunzione dei

cromosomi sessuali

alla Meiosi

La sindrome di Klinefelter è causata dalla presenza di una o più copie extra del

cromosoma X nelle cellule di un maschio. Extra materiale genetico dal cromosoma

X maschile interferisce con lo sviluppo sessuale, impedendo i testicoli di funzionare

normalmente e riducendo i livelli di testosterone.

I maschi con la sindrome di Klinefelter hanno tipicamente una copia extra del

cromosoma X in ogni cellula, per un totale di due cromosomi X e un cromosoma Y

(47, XXY).

Triple X sindrome (chiamata anche 47, XXX o trisomia X):

Questa sindrome risultati di una copia extra del cromosoma X in ciascuna delle

cellule di una femmina. Femmine con trisomia X hanno tre cromosomi X, per un

totale di 47 cromosomi per cellula. Il QI medio delle donne con questa sindrome è

di 90, mentre il QI medio dei loro fratelli normale è di 100 loro statura in media è più

alto per le femmine normali. Sono fertili ei loro figli non ereditano la condizione.

Sindrome di Turner:

Ciò si traduce in cui ognuno di cellule della femmina ha un cromosoma X normale

ed il cromosoma sesso è mancante o alterata. Il materiale mancante genetico

influenzi lo sviluppo e provoca i tratti caratteristici della condizione, tra cui bassa

statura e sterilità.

Circa la metà degli individui con sindrome di Turner hanno monosomia X (45, X).

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di

• ISOLARE

• AMPLIFICARE frammenti di DNA

• SEQUENZIARE

Perché manipolare i geni?

1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;

2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovra-espressione;

3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine;

4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici

CLONAGGIO-PROCEDURA

• ISOLAMENTO del gene

• INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO

• INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo

Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso….

…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI

Batterio

Cromosoma

batterico

Plasmide

2

Cellula contenente il

gene prescelto

DNAGene prescelto

DNA

ricombinante

(plasmide)

Batterio

ricombinante

Copie

di proteineCopie

di geni

Clone della

cellulaIl gene per la

resistenza

alle malattie

è inserito

nelle piante

Il gene modifica i batteri e li rende in

grado di eliminare i rifiuti tossici

La proteina viene usata per sciogliere

i coaguli nella terapia contro gli infarti

La proteina consente

alla neve

di formarsi anche a

temperature maggiori

Si isola un plasmide1

Si isola

il DNA2

Si inserisce

un gene nel

plasmide

3

Si introduce il plasmide nella

cellula prescelta

4

Si clona la cellula che possiede il

gene prescelto5

CLONAZIONE GENICA

Cosa serve per un clonaggio

Tappe caratteristiche:

VETTORI DI CLONAGGIO

Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi, ma tutti presentano alcune caratteristiche comuni:

• sono generalmente di piccole dimensioni,

• sono facilmente estraibili dalle cellule e quindi purificabili,

• possiedono un cosiddetto marcatore selettivo, ossia una proprietà che può essere utilizzata per selezionare i batteri che hanno incorporato il vettore di clonaggio (es. gene resistenza antibiotici),

• sono capaci di replicarsi autonomamente, ossia in modo indipendente dalla replicazione del cromosoma della cellula ospite,

• posseggono una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno (questa zona è detta polylinker).

VETTORI DI CLONAGGIO

I vettori di clonaggio più comunemente utilizzati per clonare geni sono i:

• Plasmidi

• Batteriofagi (virus che infettano cellule batteriche)

• Cosmidi (cosmidi sono degli elementi genetici che, pur comportandosi

come dei plasmidi, contengono sequenze di DNA specifiche di un

batteriofago che sono utili per alcuni esperimenti di clonaggio)

• Cromosomi artificiali (vettori più specializzati e complessi, chiamati che si

comportano come dei veri e propri cromosomi (anche se sono stati

“costruiti” in laboratorio) o in cellule di E. coli (BAC = Bacterial Artificial

Chromosome) o in cellule di lievito (YAC = Yeast Artificial Chromosome).

• Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati per ottenere prodotti genici su larga scala

• Le applicazioni della clonazione genica includono la produzione di prodotti genici su larga scala per usi medici e altri usi.

• I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico.

• Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.

• La tecnologia del DNA sta cambiando l’industriafarmaceutica e la ricerca biomedica

• La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impattosull’industria farmaceutica e sulla medicina umana.

• Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per produrrefarmaci e per la diagnosi delle malattie.

Terapie ormonali

• L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della tecnologia del DNA ricombinante.

• Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.

Diagnosi e cura delle malattie

• In campo medico la tecnologia del DNA sarà, probabilmente, sempre più usata per diagnosticare le malattie.

• Oltre alla sua evidente importanza nell’identificazione degli alleli associati alle malattie genetiche, si rivela infatti utile nel localizzare le

infezioni.

Vaccini

• Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado si sintetizzare anche nuovi vaccini.

• Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire

una malattia infettiva.

• Per ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA siutilizza comunemente la tecnica PCR

1 2 4 8

Molecola

iniziale

di DNA

Numero di molecole di DNA

Quando il campione di DNA è

scarso o impuro, la reazione a

catena della polimerasi

(Polymerase Chain Reaction, o

PCR) è un metodo più

appropriato per ottenere un

grande quantitativo

di un particolare gene.

PCR