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Submitted on 3 Dec 2021
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Rôle du facteur de transcription circadien Krüppel-LikeFactor 10 (KLF 10) dans le développement des
complications hépatiques de l’obésitéPierre Leclère
To cite this version:Pierre Leclère. Rôle du facteur de transcription circadien Krüppel-Like Factor 10 (KLF 10) dans ledéveloppement des complications hépatiques de l’obésité. Biologie moléculaire. COMUE UniversitéCôte d’Azur (2015 - 2019), 2019. Français. �NNT : 2019AZUR6030�. �tel-03464117�
Rôle du facteur de transcription
circadien Krüppel-Like Factor-10 (KLF-10)
dans le développement des complications
hépatiques de l’obésité Pierre LECLERE
Institut de Biologie Valrose, Nice
Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire, Nice
Présentée en vue de l’obtention du grade de docteur en Sciences de la Vie et de la Santé Interactions Moléculaires et Cellulaires d’Université Côte d’Azur Dirigée par : Michèle Teboul et Philippe Gual Soutenue le : 2 Décembre 2019
Devant le jury, composé de :
Frédéric Bost, PhD, C3M Francis Lévi, Pr, PhD, WMS Michel Samson, PhD, IRSET Fabienne Guillaumond, PhD, CRCM Michèle Teboul, Pr, PhD, iBV Philippe Gual, PhD, C3M
Président Rapporteur Rapporteur Examinatrice Co-directrice de thèse Co-directeur de thèse
THÈSE DE DOCTORAT
ANR-11-LABX-0028-01
2
Rôle du facteur de transcription circadien Krüppel-
Like Factor-10 (KLF-10) dans le développement des
complications hépatiques de l’obésité
Jury :
Président du jury : Frédéric Bost, PhD, Centre méditerranéen de médecine moléculaire (C3M) Rapporteurs : Francis Lévi, Pr, PhD, Warwick Medecine School Michel Samson, PhD, Institut de recherche en santé, environnement et travail
Examinatrice :
Fabienne Guillaumond, PhD, Centre de recherche en cancérologie de Marseille
Directeurs de thèse :
Michèle Teboul, Pr, PhD, Institut de biologie valrose Philippe Gual, PhD, Centre méditerranéen de médecine moléculaire
3
Rôle du facteur de transcription circadien Krüppel-Like Factor 10
dans le développement des stéatopathies d’origine non alcoolique (NAFLDs)
Les maladies chroniques du foie associées à l’obésité (NAFLD, Non-Alcoholic Fatty Liver Disease) sont
un problème de santé publique mondial. Ces complications sont l’évolution d’un foie sain vers la stéatose
hépatique (accumulation de lipides dans les hépatocytes) puis vers la stéatohépatite (NASH) caractérisée par une
importante inflammation et une souffrance hépatocytaire. Ce stade peut ensuite évoluer vers des complications
plus sévères telles que la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Mieux comprendre les mécanismes
physiopathologiques qui sous-tendent la transition stéatose/NASH constitue un enjeu majeur pour l’identification
de nouvelles cibles thérapeutiques.
L’horloge circadienne coordonne la plupart des fonctions physiologiques, dont les fonctions hépatiques
au cours du cycle jour/nuit. Elle est composée d’une horloge centrale située dans les noyaux supra-chiasmatiques
de l’hypothalamus et d’horloges périphériques dans toutes les autres cellules de l’organisme. Les altérations de
l’horloge circadienne associées à des changements du mode de vie (travail en heure décalées, jet lags chroniques,
prises alimentaires irrégulières, composition des régimes alimentaires, etc.), constituent des facteurs de risque
pour le développement de nombreuses pathologies dont le syndrome métabolique. De nombreux et récents
éléments laissent présumer que l’altération de l’horloge circadienne jouerait un rôle important dans la pathogenèse
des NAFLD. Le facteur de transcription Krüppel like Factor 10 (Klf10) est directement régulé par l’horloge
circadienne dans le foie où il régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans homéostasie glucido-
lipidique. KLF10 joue également un rôle dans la régulation de réponses inflammatoires chroniques ainsi que de
la mort et de la prolifération cellulaire. Ces données nous ont donc conduits à étudier l’implication du cycle
circadien et de KLF10 sur le développement des complications hépatiques.
Nos travaux ont permis de mettre en évidence que la stéatose et l’inflammation hépatiques suivent un
rythme circadien à la différence de la souffrance hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite (régime
déficient en méthionine et choline (MCD)). Cela est associé à des altérations de l’oscillation des gènes horloges
dans le foie mais aussi le rein, pouvant suggérer une modification généralisée du système circadien dans ce
modèle. De plus, l’expression hépatique de Klf10 perd sa rythmicité avec le développement des complications
hépatiques. L’absence de Klf10 chez la souris est associée à une forte augmentation de la souffrance hépatique
sans impacter le développement de la stéatose et l’inflammation sous régime MCD. Nous avons montré que
l’expression hépatique de Fsp27 gagne de la rythmicité sous régime MCD, augmente avec la sévérité des
NAFLDs, favorise la souffrance hépatocytaire, et que ce gène est surexprimé chez les souris déficientes pour
Klf10 sous régime MCD. Le rôle protecteur de KLF10 semble spécifique des hépatocytes car les souris
déficientes pour Klf10 dans les hépatocytes présentent aussi une cytolyse hépatocellulaire (ALAT) accrue. De
plus, la diminution de l’expression de Klf10 dans les hépatocytes primaires de souris diminue la viabilité cellulaire
et augmente l’activation de la caspase 3 et de l’apoptose en réponse au TNFα. Enfin, l’expression hépatique de
KLF10 corrèle avec les marqueurs circulants de la souffrance hépatique (ALAT) et de la mort hépatocytaire
(kératine 18) chez les patients obèses.
Nos données chez la souris, in vitro, et chez l’Homme indiquent que le développement des complications
hépatiques pourrait suivre un rythme circadien et que KLF10 a des propriétés hépato-protectrices qui pourraient
atténuer le développement des NAFLD.
Mots clés : KLF10, Foie, Rythmes circadiens, NAFLD, stéatohépatite (NASH), Mort cellulaire
Role of the circadian transcription factor Krüppel-Like Fator 10 in the
development of Nonalcoholic Fatty Liver Diseases (NAFLD)
Non-alcoholic steatohepatitis (NASH), the progressive form of nonalcoholic fatty liver diseases
(NAFLDs), is a global public health problem without approved pharmacological therapy. NAFLD extend from
non-pathogenic lipid accumulation, known as hepatic steatosis to hepatocellular carcinoma (HCC) through a wide
spectrum of stages including NASH and fibrosis. NASH is featured by hepatic inflammation and hepatocyte cell
death. Better understand NASH pathogenic cellular and molecular mechanisms is an important clinical
requirement.
Circadian timing system (CTS) is the main synchronizer of organismal physiology to environmental
light/dark cycles. This CTS is comprised of a central pacemaker in the supra-chiasmatic nucleus of the
hypothalamus and peripheral clocks localized in each single cell throughout the brain and body. Western society
life style, including junk food consumption and erratic feeding, chronic jet lag, light exposure at night and shift-
work, can disrupt the CTS. CTS disruption has been assessed as a risk factor for the development of chronic
diseases including metabolic syndrome and cancer. The liver is the most rhythmic organ and evidence for an
intricate link between CTS disruption and NAFLD development is most illustrated by (i) the genetic and
environmental disruption of the CTS leads to dyslipidemia, hepatic steatosis as well as spontaneous NASH and
HCC development (ii) the circadian hepatic transcriptome is rearranged in mice fed high fat diet and displaying
hepatic steatosis, showing that metabolic disruption also impacts diurnal oscillation of transcripts. Krüppel-like
factor 10 is a circadian transcription factor directly regulated by the circadian clock in the liver and help shaping
the hepatic diurnal transcriptome and the control carbohydrate and lipid metabolism homeostasis. Beside from
metabolism, this transcription factor has also been shown to regulate two NASH related processes, in very
different contexts, namely inflammation and cell death. We thus aimed to evaluate the implication of circadian
rhythms and the role of KLF10 during steatohepatitis
Here, we show that hepatic steatosis and inflammation display diurnal rhythmicity in mice developing
steatohepatitis upon feeding with a methionine and choline deficient diet (MCDD). Core clock gene oscillations
remained mostly unaffected but rhythmic Klf10 expression was abolished in this model. Klf10 deficient mice
(Klf10-/-) display enhanced liver injury despite the same level of hepatic steatosis and inflammation that control
mice upon MCDD challenge. Specific genetic ablation of Klf10 only in hepatocytes phenocopied the phenotype
of Klf10-/- mice upon MCDD. Silencing Klf10 in isolated primary hepatocytes also sensitized these cells to
apoptosis along with increased caspase 3 activation in response to TNFα. We also show that the hepatic KLF10
expression correlates with liver injury (ALT activity) and the circulating keratin 18 hepatocyte death marker in a
cohort of obese patients. Collectively our findings suggest that specific NASH features including steatosis and
inflammation display diurnal oscillations and the associated altered circadian expression of Klf10 may aggravate
liver injury through hepatocyte sensitization to cell death.
Collectively, our results gathered from cellular and animal experiments as well as correlative study in
Human indicate that hepatic steatosis and inflammation could be rhythmic during NASH and that KLF10 could
be a hepatoprotective factor that could limit NAFLD progression.
Keyword: KLF10, Liver, Circadian rhythms, Cell death, NAFLD, NASH
2
« Mundi Placet et spiritus minima »
Roi Loth
3
J’aimerais en tout premier lieu remercier Fabienne Guillaumond, Francis Lévi, Michel
Samson, et Frédéric Bost pour avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse. Je souhaite ensuite
remercier mes deux directeurs de thèse Michèle et Philippe, pour la confiance que vous m’avez
accordée, pour votre soutien et vos enseignements.
Merci à mes deux équipes d’accueil – de l’iBV- Franck, Michèle, Aline (pour le temps que
tu m’as accordé pour les clonages et nos discussions), Sophie (pour ton aide précieuse pour les
souris !!), Déborah, Emilie et les anciens : Jonathan, John, Céline et Anthony. Travailler, interagir
avec vous ainsi qu’apprendre de vous au quotidien a été un plaisir. – C3M- Petite Débo (pour avoir
partagé le stress et les différentes étapes de la thèse) , Elo(ch) (t’es la prochaine(ch)), Marina et
Marion (bon courage pour la suite !), Manon (en route pour une thèse de FFAAACCCSS), mais
aussi Grande Débo ( pou ton aide et ton soutien pour les manips, ta gentillesse et ton volontariat
naturel et surout pour ta spontanéité légendaire et ta philosophie : une journée sans rigoler est une
journée de perdue), Stéphie (pour la formation, ton aide technique mais aussi ton soutiens et les
rigolades au quotidien), Stéphanie P (pour l’aide précieuse en anapath), Béa, Rodolphe (pour ton
intérêt pour les projets scientifiques et ton expertise médical mais aussi ton accessibilité), Philippe
(pour ta simplicité et ton accessibilité, pour tout ce que tu m’as appris et pour ta confiance en moi),
Albert, Carmelo (pour les manips de FAAACCSSS et pour tout le reste, ta simplicité, pour les
rigolades et tout ce que tu as pu m’apprendre) et Cynthia.
Grâce à vous tous, venir travailler a toujours été un réel plaisir !
Le doctorat marque à la fois la fin de mes études et le début de nouvelles expériences
professionnelles et je souhaite donc remercier les personnes qui ont participé de près ou de loin, à
l’élaboration de mon parcours académique et professionnel.
Je remercie par conséquent mes enseignants : M. Blondeau, M. Félix, Sylvain, Barbara,
François Barère, François Beile, Karine. Mais aussi mes enseignants de l’IUT de Brest : Germaine
Dorange, pour la transmission d’une passion pour la biologie, Mickael Droguet, Agnès Revol,
Helène Talarmin, Gaétan Le Floch. Cette formation a été une révélation pour moi et c’est grâce à
vous tous ! J’aimerais ensuite remercier mes professeurs de l’université de Rennes 1 qui ont joué
un rôle déterminant dans mon choix de parcours académique : Christian Saligaud, Thierry
4
Guillaudeux, Claire-Piquet-Pellorce, Stéphane Deschamps, Cathrine Le Goff-Gaillard. Enfin, je
remercie Nicolas Glaishenaus de l’université de Nice pour les cours d’immunologie passionnants.
J’aimerais également remercier les personnes qui ont forgé mon parcours professionnel :
Laurent et Jean Luc Gourdon. Germaine Dorange, Mickael, Julie, Marie-Agnès, Raphaël pour mon
initiation à la recherche lors de mon stage de DUT. Pr.Thierry Lamy de la Chappelle et Stéphane
Nature pour la découverte des métiers de la recherche clinique. Franck et Céline pour m’avoir
transmis la passion des rythmes circadiens lors de mon stage de M1. G.T.J van der Horst, Aïda
Farshadi et Inês Chavez pour leur accueil chaleureux et cette expérience de recherche clef à
Rotterdam.
Merci à ma famille : Papa, Maman, Thibaud, Ségo pour tous ces moments de bonheur, de
franche rigolade, pour votre soutien et amour dans les bons et mauvais moments. Mes oncles,
tantes et les cousins.
Merci à tous les potos qui m’ont accompagné tout au long de ce parcours académique et
professionel : Mathieu, Sophie, Clément R, Clément D, Lolo, Pierre, Sylvain, Sullivan , Nico et
Amé (et le petit Raphaël), tonton Kibid et Manu (et la Xbox !!), Charlotte, Fab, Max, Choline
Jonathan, Leslie G, Adrien et Tudual, Carole, Apolline, Cess et Cholé , BenJ, Arthur et Kévin M,
Kévin F, Margot, Margaux, Céline, Morgane, Julia, Périne, Raphaël et Pauline (et le petit Jojo la
Patate). Merci également aux zicos : Serge, Marie et Laurent, le big band de JAZZ de l’université
en particulier Yann F et le mini-BIG : François, Yann B, Wil’ et Manu.
Merci à mes collègues des différents instituts : Olivier, Fancky la Chignole, Hélène,
Camille et Benoit, Guillaume, Pablito, Steph, Laurent G, Magali, Simon, Baptiste, Samah, Agnès,
Marjolein, Rayan, Darren, Patricia, Noémie. Ceux du C3M : El Gigi, Stephan, Stoyan, Rodolphe,
Joanna, Marion S, Manon, Jérôme, Jennifer, Karine, Mireille.
I finally want to thanks the Signalife program for fundings and my colleagues from the
signalife program from 3rd and 4th waves as well as the Quislings: Martin, Torsten, Anthony and
Aiden.
5
Table des matières
TABLE DES MATIERES ............................................................................................................ 2
TABLE DES FIGURES ............................................................................................................... 7
TABLE DES TABLEAUX ........................................................................................................... 8
ABRÉVIATIONS .......................................................................................................................... 8
INTRODUCTION....................................................................................................................... 15
1. Stéatopathie non alcoolique du foie (NAFLD) ................................................................. 15 1.1. Le foie ....................................................................................................................... 15
a. Anatomie ................................................................................................................... 15
b. Métabolisme des sucres et des lipides ........................................................................ 19
c. Zonation hépatique .................................................................................................... 30
1.2. Physiopathologie des NAFLD ................................................................................... 33
a. Diagnostic ................................................................................................................. 34
b. Facteurs de risque ...................................................................................................... 35
c. Stéatose hépatique ..................................................................................................... 41
d. Stéatohépatite non alcoolique ..................................................................................... 44
e. Traitement de la NASH. ............................................................................................ 72
1.3. Modèles expérimentaux de NAFLD ........................................................................... 74
a. Modèles nutritionnels ................................................................................................ 74
b. Modèles génétiques ................................................................................................... 76
c. Combinaisons de modèles .......................................................................................... 76
2. Biologie des rythmes circadiens ......................................................................................... 77 2.1. Evolution et pertinence de l’horloge circadienne ........................................................ 77
2.2. Système circadien mammifère ................................................................................... 79
a. Horloge moléculaire .................................................................................................. 80
b. Horloge centrale ........................................................................................................ 86
c. Horloges périphériques .............................................................................................. 87
d. Horloge hépatique ...................................................................................................... 90
2.3. Rythmes circadiens et NAFLD .................................................................................. 94
a. Contrôle de la prise alimentaire .................................................................................. 95
b. Rythmicité du métabolisme ........................................................................................ 96
c. Rythmicité de l’inflammation .................................................................................... 97
d. Rythmicité du microbiote intestinal ........................................................................... 98
2.4. Perturbation du système circadien et chronothérapies ............................................... 100
a. Perturbation du système circadien ............................................................................ 100
b. Chronothérapies ....................................................................................................... 102
6
3. Krüppel Like Factors ....................................................................................................... 106 3.1. Rythmicité des KLF ................................................................................................. 108
3.2. KLF et complications hépatiques ............................................................................. 108
3.3. Krüppel like factor 10 .............................................................................................. 109
a. Structure / fonction .................................................................................................. 109
b. Implication dans la mort cellulaire ........................................................................... 111
c. Implication dans l’inflammation .............................................................................. 111
OBJECTIFS .............................................................................................................................. 113
RESULTATS ............................................................................................................................. 114
Résumé ....................................................................................................................................... 114
Résultats supplémentaires ........................................................................................................ 141
DISCUSSION ET PERSPECTIVES ...................................................................................... 143 La stéatose hépatique induite par le régime MCDD est rythmique ....................................... 143
La présence de foci inflammatoire hépatique induit par le régime MCDD est rythmique ..... 145
Les bio-marqueurs de la souffrance hépatique sont rythmiques ............................................ 146
La stéatohépatite modifie faiblement l’horloge mais altère l’expression de Klf10 ................ 147
L’invalidation systémique ou hépatocytaire de Klf10 aggrave les atteintes hépatiques ......... 148
L’expression hépatique de KLF10 corrèle avec les marqueurs de souffrance hépatique chez les
patients obèses. ................................................................................................................... 150
RÉFÉRENCES .......................................................................................................................... 155
ANNEXE .................................................................................................................................... 188
Article annexe ............................................................................................................................ 188 Résumé ............................................................................................................................... 188
7
Table des figures Figure 1. Représentation schématique de l’anatomie hépatique ........................................................................... 17
Figure 2. Anatomie du lobule hépatique .................................................................................................................. 20
Figure 3. Schématisation simplifiée de la régulation de la glycémie ..................................................................... 21
Figure 4. Schéma simplifié des voies métaboliques du glucose et des lipides dans l’hépatocyte ......................... 23
Figure 5. Régulations transcriptionnelles du métabolisme du glucose et es lipides ............................................. 25
Figure 6. Schéma de la synthèse et de la maturation des VLDL ........................................................................... 28
Figure 7. Schéma de la synthèse et de la maturation des gouttelettes lipidiques ................................................. 29
Figure 8. Représentation schématique de la zonation centro-portale ................................................................... 32
Figure 9. Spectre et évolution des stéatopathies non alcooliques ........................................................................... 33
Figure 10. Mécanismes moléculaires de l’insulino-résistance ................................................................................ 38
Figure 11. Schématisation des différentes voies de mort cellulaire ....................................................................... 48
Figure 12. Schématisation simplifiée de l’apoptose induite par la voie des récepteurs de mort ........................ 51
Figure 13. Classification des protéines contenant des domaines BCL2 homology (BH) ..................................... 52
Figure 14. Apoptose induite par le stress du réticulum endoplasmique ............................................................... 56
Figure 15. Schématisation de différentes issues des signaux de mort via leurs complexes de signalisation ...... 59
Figure 16. Activation canonique et non canonique de la pyroptose ...................................................................... 61
Figure 17. Mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation hépatique ................................................ 68
Figure 18. Schéma récapitulatif des mécanismes physiopathologiques intra- et extra-hépatiques qui
participent au développement de la NASH .................................................................................................... 71
Figure 19. Fonctionnement d’une horloge biologique ............................................................................................ 79
Figure 20. Organisation du système circadien mammifère. ................................................................................... 81
Figure 21. Régulations transcriptionnelles de l’horloge moléculaire .................................................................... 83
Figure 22. Liens potentiels et avérés entre l’horloge circadienne et les complications hépatiques. .................... 99
Figure 23. Structure et classification des Krüppel Like Factors. ........................................................................ 107
Figure 24. Régulations de KLF10 et implication dans des processus physiopathologiques .............................. 112
Figure 25. Carractérisation de la stéatohépatite chez les souris Klf10Δhep nourries par un régime MCDD. .... 141
Figure 26. Expression de Klf10 dans le foie de souris nourries par un régime HFD. ........................................ 142
8
Figure 27. Schéma récapitulatif de l’étude. ........................................................................................................... 151
Table des tableaux Table 1. Critère d’évaluation du NAFLD Activity Score (NAS) ........................................................................... 35
Table 2. Classification de l’obésité et du surpoids selon l’indice de masse corporelle. ........................................ 36
Table 3. Définitions et diagnostics du syndrome métabolique ............................................................................... 40
Table 4. Polymorphismes associés à la progression ou la protection des NAFLD ............................................... 42
Table 5. Protéines de la gouttelette lipidique ........................................................................................................... 45
Table 6 . Molécules en essai clinique pour le traitement de la NASH ................................................................... 73
Table 7 Caractéristiques physiopathologiques des principaux modèles murins pour l’étude des NAFLD ....... 77
Table 8 Phénotype métabolique des différentes souris mutante de l’horloge circadienne .................................. 93
Table 9 Pharmacologie de l’horloge moléculaire .................................................................................................. 105
Abréviations
A
AACE · American Association of Clinical Endocrinologists
ACC · Acetyl-CoA carboxylase
ACLY · ATP citrate synthase
ACTH · Adreno Cortico Trophic Hormone
ADN · Acide desoxyribo nucléique
AG · Acides Gras
AIF · Apoptosis inducing factor
AKT/PKB · Protein kinase B
ALAT · Alanine Aminotransferase
AMPc · Adenosine Monophosphate cyclique
AMPK · AMP-activated protein kinase
ANSES · Agence national de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et de la santé
APAF1 · Apoptosic Peptidase Activating Factor
APC · Adenomatous Polyposis Coli
APO · Apo lipoprotein
ASAT · Asparate aminotransferase
ASC · Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD
ASK1 · Apoptosis signal-regulating kinase 1
9
ATF6 · Activating Transcription Factor 6
ATP · Adénosine-tri-phosphate
AVC · Accident vasculaire cérébral
B
BAX · BCL2 Associated Protein X
BCL2 · B-cell lymphoma 2
BCR · B cell receptor
BH · Bcl2 homology domain
bHLH · basic Helix-Loop-Helix
BID · BH3 Interacting Domain Death Agonist
BIP · Binding immunoglobulin protein
BMAL1 · Bone and muscle Arntl-like
β-TRCP · beta-transducin repeat containing
C
CAD · Caspase activated DNAse
CASP · Caspase
CBP · CREB binding protein
CCG · Clock controlled Genes
CCL2 · Chemokine ligand 2
CCL4 · Tetra chlorure de carbone
CCR2 · C-C chemokine receptor type 2
CDAA · Choline deficient L-amino acid defined
CDK2 · Cyclin dependant kinase 2
CE · Cholesterol Ester
CHC · carcinome hépatocellulaire
CHOP · C/EBP homologous protein
ChoRE · Carbohydrate-responsive element
ChREBP · Carbohydrate Response Element Binding Protein
cIAP · Cellular inhibitor of apoptosis
CIDE · Cell Death Inducing DFFA like Effector C
CK · Casein Kinase
CLOCK · Circadian Locomotor Output Cycles Kaput
CMH · Complexe majeur d'histocompatibilité
COPI / COPII ·coatomer proteins
CPA · Cellule présentatrice d'antigène
CREB · c-AMP Response Element-Binding protein
CREBH · cAMP responsive element-biinding protein H
CRH · corticotropin releasing hormone
CRTC2 · c-AMP Response Element-Binding protein co-activator 2
CRY · Cryptochromes
CtBP · C-terminal-binding protein 1
CYP7A1 · Cytochrome P450 familly subfamilly A member 1
10
CytC · Cytochrome C
D
DAG · Diacyl glycerol
DAMP · Danger Associated Molecular Pattern
DBP · D-Box-binding Protein
DC · Dendritic cells
DED · Death Effector Domain
DEN · Diethylnitrosamine
DGAT· Diacylglycerol O-Acyltransferase
DHAP · dihydroxyacetone-1-P
DISC · Death-inducing signaling complex
DR 4/5 · Death receptor 4/5 (TRAIL receptors)
DSS · dextran sulfate sodium
DT2 · diabète de type 2
E
eIF2 α · Eukaryotic initiation Factor 2 alpha
ENDOG · Endonuclease G
ERAD · Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation
E-selectin · Endothelial selectin (CD62)
F
FABP · Fatty acid binding protein
FADD · Fas Associated protein with Death Domain
Fas · Fas cell surface death receptor (CD95)
FAS · Fatty Acid Synthase
Fas-L · Fas Ligand (CD95-L)
FASPD · familly advanced sleep phase disorder
FBXL3 · F-Box and leucine rich repeat protein 3
FDA · Food and Drug Administration
FLIP · cellular FLICE-like inhibitory protein
FNP · Fraction Non Parenchymateuse
FOXO1 · Forkhead box O1
FOXP3 · Forkhead box P3
G
G · Glucose
G3P · glycéraldéhyde-3-phosphate
G6P · Glucose 6 phosphate
G6P · Glucose-6-phosphatase
G6Pase · Glucose 6 phosphatase
GL · gouttelette lipidique
GlcNAc · O-Linked N-Acetylglucosamine
11
GM-CSF · Granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GPAT4 · Glycerol-3 Phosphate Acyltransferase 4
GR · Glucocorticoid Receptor
GSDMD · Gasdermin
GSDMD-N · N-terminal peptide of Gasdermin
GSH · Gluthathione
GSK3 · Glycogen synthase kinase 3
γGT · Gamma Glutamyl Transferase
H
HAT · Histone acetyl-transferase
HLF · Hepatic leukaemia factor
HMGB1 · High mobility group box 1
HNF · Hepatocyte Nuclear Factor
HSC · Hepatic Stellate Cell
HSF · Heat shock factor
HSP · Heat shock protein
I
IARC · International agency for research on cancer
I-CAM · Intercellular Adhesion Molecule
IFN · Interféron
IKB · nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor
IKK · Inhibitor of NFkB regulatory subunit
IL · Interleukine
ILC · Innate Lymhoid cell
IMC · Indice de masse corporelle
iNKT · Invariant TCR Natural Killer
INSIG2 · Insulin induced protein 2
IP3 · Inositol 3 phosphate
IR · Insulino résistance
IRE-1α · Inositol-requiring enzyme 1 α
IRS · Insulin Receptor Substrate
ITCH · Itchy E3 ubiquitin ligase
J
JAMA · Junctional adhesion molecule A
JARID1B · Jumanji AT rich interactive domain 1B
JNK · c-Jun N-Terminal Kinase 1
K
KC · Kupffer cell
KLF · Krüppel Like Factors
12
L
LB · Lymphocyte B
LDL · Low Density Lipoproteins
LDN · Lipogénèse De Novo
LPC · Lysophatidylcholine
LPS · Lipopolysacharide
LRE · LXR response element
LSEC · Liver sinusoïdal endothelial cells
LUBAC · Linear ubiquitin chain assembly complex
LXR · Liver X Receptor
M
MAIT · Mucosal Associated Invariant T cells
MCDD · Methionine and choline deficient diet
MDSC · Myeloid derived supressive cells
MLKL · Mixed lineage kinase domain like pseudokinase
MLL · Mixed-lineage leukemia 1
MOMP · Mitochondrial outter membrane permeabilization
MPTP · Mitochondrial Permeability Transition Pore
mTORC1 · Mammalian target of rapamycin 1
MTP · Mitochondrial transition pore
MTTP · Microsomal Triglyceride Transfer Protein
N
NA · Noradrénaline
NAFLD · Nonalcoholic fatty liver disease
NAMPT · Nicotinamide phosphoribosyltransferase
NAS · NAFLD Activity Score
NASH · Non alcoholic Steatohepatitis (Stéatohépatite non alcoolique)
NEMO · NF-kappa-B essential modulator
NFIL3 · nuclear factor interleukin 3 regulated
NFkB · Nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells
NK · Natural Killer
NLR · NOD like receptor
NLRC ·NOD-like receptor C
NLRP3 . Gène encodant pour NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 (NALP3)
NMDA · N-methyl-D-aspartique acid
NRF2 · NF-E2-Related Factor 2
O
OA · oxaloacétate
OGT · O-Linked N-Acetylglucosamine (GlcNAc) Transferase
OMS · Organisation mondiale de la santé
13
P
P/CAF · P300/CBP-associated factor
PA · Potentiel d’action
PACAP · Pituiary adenylate cyclase activating peptide
PAMP · Pathogens Assossiated Molecular Pattern
PAR-bZIP · Proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper
PAS · PER-ARNT-SIM
PC · Phosphatidylcholine
PCase · Pyruvate Carboxylase
PDE · Phosphodiesterase
PD-L1 · Programmed death-ligand 1
PEP · Phospho-Enol-Pyruvate
PEPCK · Phosphoenol Pyruvate Carboxy Kinase
PER · Period
PERK · Protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase
PGC1a · Proliferator activated receptor g-co-activator 1a
PKA · Protéine Kinase AMPc dépendante
PLIN · Perilipin
PNPLA · Patatin Like Phospholipase Domain Containing 1
PP2A· Protéine phosphatases 2A
PPAR · Peroxisome proliferator-activated receptor
PRR · Pattern regognition receptor
PUMA · p53 upregulated modulator of apoptosis
R
RCPG · Récepteur couplé aux protéines G
RE · Réticulum endoplasmique
RHT · Retinohypothalamic tract
RIPK · Receptor Interacting Protein Kinase
ROCK · Rho Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase
ROR · Retinoic acid-Related Orphan Receptor
RORE · ROR binding Elements
ROS · Reactive oxygen species
S
SAM ·S-adenosyl-L-methionine
SCD1·Stearoyl-CoA desaturase-1
SCF · Skp, Cullin, F-box containing complex
SCFA · Short chain fatty acid
SIAH1 · Siah E3 Ubiquitin Protein Ligase 1
SIN3A · SIN3 Transcription Regulator Family Member A
SIRT · Sirtuine
SMA · Smooth Muscle Actin
SMAC · Second mitochondrial derived activator of caspases, également appelé DIABLO
14
SNP · Single nucleotide Polymorphism
SOCS · Supressor of cytokine signaling
SOD · Superoxyde dismutase
SREBP1c · Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c
T
TA · Tissu adipeux blanc
TAK1 · TGF-Beta activated Kinase 1, TGF-Beta associated Kinase
TCR · T cells receptor
TEF · Tyrotrophin embryonic factor
TG · Triglycérides
TGF-β · Transforming growth factor β
Th · T helper
TLR · Toll like receptor
TNFα · Tumor Necrosis Factor alpha
TNFαR1 · TNFα receptor 1
TRADD · TNFR1-associated death domain protein
TRAF · TNFR associated factor
TRAIL · TNF-related apoptosis-inducing ligand
Treg · Lymphocytes T régulateur
TRF · Time restricted feeding
TRP · Transient receptor potential
β-TRCP · Beta-transducin repeats-containing proteins
TAB1/2 · TGF-Beta Activated Kinase 1 binding protein 1/2
U
UPR · Unfolded Protein Response
USF1 · Upstream Stimulatory Factor1
V
VCAM · Vascular Adhesion Molecule
VDAC · Voltage dependent anion channel
VIP · Vasoactive intestinal peptide
VLDL · Very Low Density Lipoproteins
VOCC· Voltages operated calcium channels
X
XBP1 · X-box binding protein 1
XIAP · X-linked inhibitor of apoptosis protein
Xu-5P · Xylose 5-phosphate
Z
ZT · Zeitgeber time
15
Introduction
1. Stéatopathie non alcoolique du foie (NAFLD)
1.1. Le foie
Le foie est un organe vital qui possède des rôles multiples à la fois exocrine et endocrine. Ses
fonctions exocrines sont principalement la production et sécrétion de la bile hépatique qui
contribue à la digestion des lipides ainsi qu’à l’élimination des xénobiotiques et des déchets
métaboliques. Ses fonctions endocrines regroupent la synthèse de la majeure partie des protéines
plasmatiques dont l’albumine, les facteurs de coagulation et les protéines du complément (Clark,
2011; Hubscher, 2006) mais également la sécrétion des vésicules lipido-protéiques de transport,
des métabolites et des hépatokines (Stefan and Haring, 2013). Le foie joue également un rôle clé
dans le métabolisme glucido-lipidique. Sa situation anatomique particulière lui confère les rôles
de carrefour métabolique et de filtre entre les organes de la cavité abdominale et la circulation
générale (Abdel-Misih and Bloomston, 2010).
a. Anatomie
Le foie est déjà visible environ 28 jours post-fécondation, sous l’ébauche cardiaque. Les
hépatoblastes, issus de l’endoderme et de l’intestin antérieur, forment le foie embryonnaire. Ils se
différencieront ensuite en hépatocytes et en cholangiocytes, qui constituent le parenchyme
hépatique et l’épithélium biliaire respectivement (Bhatia and Bordoni, 2019; Rohrig and Schulze,
2016; Zorn, 2008). Le foie est le plus gros organe interne du corps. Il est composé de deux lobes
(droite et gauche) chez l’Homme et de quatre lobes chez les rongeurs (droite, gauche, médian et
caudal). Situé dans le cadran supérieur droit de la cavité péritonéale sous l’hémi-diaphragme, sa
16
position est maintenue grâce aux attachements ligamenteux qui l’enveloppent et le relient au
péritoine (Abdel-Misih and Bloomston, 2010).
C’est un organe très vascularisé recevant plus de 25% de l’efflux cardiaque au repos. Il
possède un système d’irrigation singulier, alimenté par l’artère hépatique d’une part et la veine
porte d’autre part. La première, représente 25 à 30% de l’afflux sanguin hépatique tandis que la
seconde participe de 70 à 75% à cet afflux (Abdel-Misih and Bloomston, 2010). La veine porte
fait partie de la circulation splanchnique qui relie les organes de la cavité péritonéale au foie. Elle
draine le sang des veines mésentériques supérieure et inférieure ainsi que les veines gastriques et
la veine splénique. Ces veines proviennent respectivement du tractus intestinal proximal et distal,
de l’estomac, de la rate et du pancréas. La veine porte draine également le sang en provenance du
tissu adipeux viscéral qui se développe autour des organes péritonéaux et leur vasculature. Le tronc
portal entre dans le foie au niveau du hile hépatique (point d’entrée dans l’organe des vaisseaux
sanguins et du canal biliaire) et se divise ensuite en les veines portes droite et gauche chez
l’Homme, droite, gauche, médiane et caudale chez le rongeur, qui irriguent les lobes
correspondants. Le sang circule ensuite dans les sinusoïdes hépatiques, et quitte le foie par les
veines centro-lobulaires qui effluent dans les veines sus-hépatiques qui elles-mêmes se connectent
à la veine cave inférieure en direction du cœur (Figure 1) (Abdel-Misih and Bloomston, 2010;
Bouhnik, 2011; Parikh et al., 2010).
Comme tous les tissus, le foie est composé de nombreux types cellulaires. Ils incluent les
hépatocytes qui constituent la fraction parenchymateuse et représentent 60 à 70% des cellules du
foie et la fraction non parenchymateuse (FNP) qui représente les 30-40% restants. La FNP est
constituée par: les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSEC), les cellules stellaires
hépatiques (HSC), les cellules de Kupffer, une population de macrophage résidente du foie et bien
17
Figure 1. Représentation schématique de l’anatomie hépatique
(A) Vue d’ensemble de l’anatomie du foie, sa vascularisation et son innervation. Les organes sont numérotés en
gris. Le système vasculaire veineux et artériel est numéroté en bleu et rouge, respectivement. Les systèmes
nerveux sympathiques et parasympathiques sont numérotés en violet et jaune, respectivement. (B)
Représentation ventrale du système portal veineux et artériel hépatique. (C) Représentation ventrale des plexus
nerveux hépatiques et biliaires. Adapté de Abdel-Misih and Bloomston (2010)
18
d’autres cellules immunitaires de l’immunité innée et adaptatrice (Figure 1) (Ben-Moshe and
Itzkovitz, 2019). Histologiquement, le foie est constitué d’une répétition d’unité anatomique
appelée lobule. Un lobule est une « colonne hexagonale » mesurant environ 0,5mm chez la souris
et 1 mm chez l’Homme. Il est composé de plusieurs travées d’hépatocytes organisés de façon
concentrique autour d’une veine centrale, à la manière des rayons d’une roue de vélo. Aux six
extrémités du lobule, appelé zone péri-portale, se trouvent une veine et une artère portale ainsi
qu’un canal biliaire (Figure 2). La travée d’hépatocytes, généralement d’une largeur de deux à
trois hépatocytes, est séparée par un canalicule biliaire qui se déverse dans le canal biliaire (JC,
2017). Le sang circule de la zone péri-portale, situé à l’extrémité du lobule, à la zone centro-
lobulaire, au centre (Figure 2). Les sinusoïdes hépatiques sont composés d’un endothélium
fenestré et n’ont pas de membrane basale, ce qui facilite les échanges entre le compartiment
sanguin et parenchymateux. La lymphe, issue de la filtration du sang dans les sinusoïdes
hépatiques s’écoule dans l’espace de Disse, espace entre les LSEC et les hépatocytes. Elle circule
dans deux directions : péri-portale et péri-centrale (Figure 2). La circulation de la lymphe est
assurée par le système vasculaire lymphatique hépatique. Les capillaires lymphatiques sont situés
au niveau des nœuds péri-portaux mais également le long de la veine centrale (Figure 2). La
lymphe qui emprunte les capillaires péri-portaux, rejoint des vaisseaux collecteurs qui mènent aux
ganglions lymphatiques au niveau du hile hépatique. En revanche, la lymphe qui emprunte les
vaisseaux péricentraux, converge vers les ganglions médiastinaux postérieurs via de gros
vaisseaux lymphatiques qui longent la veine cave inférieure au travers du diaphragme (Tanaka and
Iwakiri, 2016). Enfin, comme tout organe, le foie est innervé par le système nerveux autonome.
Ces nerfs longent la veine porte, l’artère hépatique, les canaux biliaires et le hile hépatique pour
s’infiltrer dans l’organe (Figure 2). Chez l’Homme contrairement au rat, les fibres sympathiques
19
s’infiltrent dans les sinusoïdes hépatiques. En revanche chez ces deux espèces, l’innervation
parasympathique se limite à la zone péri-portale (Jensen et al., 2013).
b. Métabolisme des sucres et des lipides
Le foie joue un rôle majeur dans l’homéostasie glucido-lipidique qui vise à augmenter ou à
diminuer la glycémie non seulement en fonction du statut nutritionnel mais aussi de l’activité
physique et du stress. Les mécanismes qui sont hyperglycémiants se mettent en place à l’état de
jeûne tandis que ceux qui sont hypoglycémiants s’activent à l’état nourri. Dans le métabolisme des
glucides, la « molécule » élémentaire est le glucose, son lieu de synthèse est principalement le foie
et il est stocké sous forme de glycogène dans le foie et les muscles. Dans le métabolisme des
lipides, les « molécules » élémentaires sont les acide gras (AG). Leur synthèse s’effectue dans de
nombreux organes en particulier dans le foie et le tissu adipeux blanc (TA) et ils sont stockés sous
forme de triglycérides (TG) dans le TA (Figure 3) (Roder et al., 2016).
Métabolisme des carbohydrates
A l’état nourri, la glycémie élevée stimule directement la sécrétion d’insuline par les cellules β-
pancréatiques. L’insuline est la seule hormone hypoglycémiante et a des effets pléiotropes. En
effet, elle favorise l’augmentation de la captation du glucose et son stockage sous forme de
glycogène au niveau hépatique et musculaire. Parallèlement, l’insuline stimule la lipogenèse de
novo (LDN) dans l’hépatocyte et l’adipocyte, pour produire des AG et du glycérol à partir de
précurseurs métaboliques non lipidiques comme le dihydroxyacetone-1-P (DHAP ) ou l’acétyl-
CoA, issue de la glycolyse. De cette façon, la LDN utilise le glucose, et participe à la diminution
de la glycémie. A l’inverse, dans un état de jeûne, la faible glycémie provoque la sécrétion
d’hormones et de neuromédiateurs hyperglycémiants. Ces derniers sont de de diverses natures et
sont produits par différents organes : le glucagon par le pancréas, le cortisol par les glandes
20
Figure 2. Anatomie du lobule hépatique
(A) Schématisation du plan de coupe des schémas B et C. (B) Organisation schématique hexagonale du
lobule hépatique composé d’une veine centro-lobulaire et des veines portes, artères portes et des canaux
biliaires péri-portaux. (C) Organisation et composition cellulaire des sinus hépatiques. En bleu : les
circulations veineuses et sinusales, en rouge : les artères, en vert : les voies biliaires, en violet : l’innervation
sympathique et en jaune : l’innervation para-sympathique. En gris : Le foie, le lobule et les vaisseaux
lymphatiques. Adapté de Ben-Moshe and Itzkovitz (2019) et Tanaka and Iwakiri (2016)
21
surrénales, la noradrénaline par système nerveux sympathique. Ces médiateurs conduisent à
l’hydrolyse du glycogène en glucose par le foie et le muscle, ainsi qu’à la stimulation de la
Figure 3. Schématisation simplifiée de la régulation de la glycémie
La glycémie est maintenue par des régulations humorales et nerveuses quel que soit l’état nutritionnel. (A) A
l’état nourri, la glycémie augmente suite à la digestion et provoque une sécrétion d’insuline par les cellules β-
pancréatiques. L’insuline agit sur le foie et le muscle (non représenté) stimulant la glycogénogenèse. L’insuline
stimule également la LDN, la synthèse des VLDL et l’export des TG au niveau du foie. Ces TG sont stockés
dans le TA où l’insuline stimule aussi la synthèse des AG. (B) A jêun, la glycémie diminue ce qui favorise la
sécrétion de glucagon par les cellules α-pancréatiques et l’activation du système sympathique (non représenté)
qui activent la néoglucogenèse hépatique, la lipolyse des TG du TA et inhibent la LDN hépatique et adipeuse.
VLDL : Very low density lipoprotein, AG: Acide Gras, LDN: Lipogenèse de novo, TG: triglycérides. Adapté de
Roder et al. (2016)
22
néoglucogénèse et l’utilisation du glycérol et l’acétyl-CoA, issus du catabolisme des TG adipeux
et des acides gras respectivement (Figure 3). Le foie participe à environ 90% de la production de
glucose (néoglucogenèse) par l’organisme et est vital pour l’homéostasie glucidique (Ekberg et
al., 1999). Les précurseurs de la néoglucogenèse incluent les intermédiaires de la glycolyse, le
lactate, le glycérol ainsi que tous les produits intermédiaires du cycle de Krebs. Par conséquent,
ils incluent également, toutes les molécules pouvant l’alimenter dont un grand nombre d’acides
aminés et les AG. Le glycérol est transformé en DHAP, puis soit en glycéraldéhyde-3-P ou en
fructose 1,6 biphosphate, deux métabolites indirectement transformables en glucose. Les AG sont
dégradés par la β-oxydation mitochondriale en acétyl-coA. L’augmentation de la concentration en
acétyl-coA dans la mitochondrie, active la pyruvate carboxylase (PCase) par allostérie et conduit
à la production d’oxaloacétate (OA ). Celui-ci peut enfin être transformé en phospho-énol-pyruvate
(PEP) par la Phosphoénol Pyruvate Carboxy Kinase (PEPCK) (Figure 4). La régulation hormonale
ou nerveuse du métabolisme glucidique dans l’hépatocyte consiste tout d’abord en une régulation
rapide du stock de glycogène. Cela s’opère par la phosphorylation inhibitrice de la glycogène
synthase par la protéine kinase AMPc dépendante (PKA). L’insuline en se liant à son récepteur,
inhibe la PKA alors que le glucagon et la noradrénaline (NA) l’activent, via la modulation de la
production d’AMPc via la phosphodiestérase (PDE) et les petites protéines Gαs couplées au
récepteur (RCPG) respectivement via des régulations transcriptionnelles plus lentes ainsi que des
régulations indirectes s’exercent également. Ces régulations transcriptionnelles consistent
essentiellement en la régulation de l’expression de deux enzymes clés de la néoglucogenèse :
PEPCK qui transforme l’OA en PEP et la glucose-6-phosphatase (G6Pase) qui déphosphoryle le
glucose 6-P et permet ainsi sa sortie de la cellule. La transcription de ces gènes est activée par le
glucagon et la NA, qui activent la PKA, laquelle phosphoryle le récepteur canal de l’inositol 3
23
Figure 4. Schéma simplifié des voies métaboliques du glucose et des lipides dans l’hépatocyte
Les voies de biosynthèse et de dégradation des sucres et des acides gras communiquent. Le catabolisme
glucidique alimente la production d’acides gras et inversement. La glycolyse correspond à l’ensemble des
voies de biotransformation du glucose en pyruvate. La première étape est le transport du glucose dans la
cellule par le transporteur GLUT2 et la phosphorylation du glucose en G6P par l’ HK. La gluconéogenèse
est l’ensemble des voies qui conduisent à la synthèse de glucose à partir de précurseurs non glucidiques. Les
voies principales de la néoglucogenèse sont représentées en jaune. La β-oxydation est la voie de
biotransformation des AG en Acetyl-coA dont la première étape est l’entrée d’AG dans les cellules par un
FAT. La LDN consiste en la synthèse de triglycérides à partir de précurseurs non lipidiques. L’ensemble des
voies de la LDN est représentée en orange. LDN : Lipogenèse de novoG : Glucose, G6P : Glucose 6
phosphate, HK : Hexokinase, G6PC : Glucose 6 phosphatase, F1,6BP : fructose 1,6 bi-phosphate, G3P :
glyceraldéhyde 3-phosphate, PEP : phospho-enol-pyruvate, OA : oxaloacétate, TG : triglycéride, FABP :
fatty acid binding protein GLUT2 : Glucose transporter 2, AQP9 : Aquaporin 9, FAT : Fatty Acid
Transporter. Adapté de Petersen et al. (2017) et Rohrig and Schulze (2016)
24
phosphate (IP3) du réticulum endoplasmique et entraîne la libération de Ca2+ dans le cytosol. Le
Ca2+ active le c-AMP Response Element-Binding protein co-activator 2 (CRTC2) qui, associé au
c-AMP Response Element-Binding protein (CREB), active la transcription du Proliferator
activated receptor γ-co-activator 1α (PGC1α). En absence d’insuline, Forkhead box O1 (FOXO1),
associé à PGC1α active la transcription de PEPCK et G6PC (Figure 5). De plus, PGC1α coopère
avec d’autres facteurs de transcription impliqués dans l’activation de la néoglucogénèse : le
récepteur aux glucocorticoïdes (GR) ou encore l’Hepatocyte Nuclear Factor-4 (HNF-4).
L’inhibition de FOXO1 par AKT ne semble pourtant pas être le mécanisme unique de régulation
de l’insuline dans la répression de la néoglucogenèse. En effet, les souris triplement invalidées
pour Akt1, Akt2 et Foxo1 spécifiquement dans les hépatocytes, présentent encore une production
de glucose hépatique diminuée, associée à une répression des gènes de la néoglucogenèse en
réponse à l’insuline, comparées aux souris contrôles (Lu et al., 2012; Titchenell et al., 2016). Le
contrôle de la production de glucose hépatique par l’insuline, reposerait donc essentiellement sur
son action inhibitrice de la lipolyse dans le TA (Petersen et al., 2017).
Métabolisme Lipidique
Le foie est un carrefour central du métabolisme des lipides puisque les hépatocytes assurent les
fonctions de captation, d’estérification, d’oxydation et de sécrétion des AG. Chez les patients
obèses, il a été déterminé que les AG hépatiques sont issus de 15 à 30% de l’alimentation, jusqu’à
30% de la LDN pendant la période d’alimentation et 60% de la lipolyse du tissu adipeux pendant
le jeûne (Donnelly et al., 2005). Les TG alimentaires, sont dégradés par les sels biliaires en AG et
absorbés par les entérocytes. Ces AG sont ensuite empaquetés puis sécrétés dans la circulation
veineuse splanchnique sous forme de TG ou de cholestérol esters (CE) dans les chylomicrons. Les
chylomicrons résiduels, sont captés par les hépatocytes via les récepteurs aux LDL et les LDL
related protein. Les chylomicrons transportent également le rétinol estérifié, qui provient de
25
Figure 5. Régulations transcriptionnelles du métabolisme du glucose et es lipides
(A) Régulation transcriptionnelle de la LDN. La LDN est régulée au niveau transcriptionnel par de nombreux
facteurs de transcription incluant ChREBP, USF1, LXR et SREBP1c. Ces facteurs de transcriptions sont activés
par la voie de signalisation de l’insuline ou directement par le glucose. (B) Les facteurs de transcription qui régulent
la néoglucogenèse sont régulés par les hormones hyperglycémiantes comme le glucagon, les cathécolamines ou le
cortisol. PDE : Phospho diesterase, GLUT2 : Glucose transporter 2, PKA : protein kinase A, PI3K :
phosphoinositide 3-kinase, Akt : Protein Kinase B, Ins : Insulin, InsR : Insulin receptor, ChREBP : Carbohydrate-
responsive element binding protein, OGT : O-Linked N-Acetylglucosamine transferase, SREBP-1 : Sterol
Regulatory element-binding protein 1, USF1 : Up-stream Factor 1, LXR : Liver X Receptor, RXR : Retinoid X
receptor, CREB : cAMP response Element-binding Protein, GR : Glucocorticoid receptor, FOXO1 : Forkhead box
protein O, Cort : Corticoïde, Gαa : petite protéine G α activatrice de l’AMP cyclase. PGC1α: Peroxisome
proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α, CRCT2: CREB coactivator 2, P : Phosphorylation, Ac :
Acetylation, O : oxysterol. D’après Petersen et al. (2017) et Wang et al. (2015)
26
l’alimentation. Le rétinol, quant à lui, est hydrolysé et stocké dans les HSC. A l’état nourri, le foie
joue un rôle crucial dans le stockage transitoire et l’export des lipides essentiellement via la LDN.
Elle est contrôlée par les facteurs de transcription Upstream stimulatory factor1 (USF1), Sterol
Regulatory Element Binding Protein 1c (SREBP1c), Liver X Receptor (LXR) et Carbohydrate
Response Element Binding Protein (ChREBP) (Figure 5). USF1 lie l’élément de réponse E-box
et s’associe à la DNA/PK et à P/CAF qui le phosphoryle et l’acétyle respectivement. Ces
régulations s’opèrent uniquement à l’état nourri lorsqu’USF1 régule la transcription de la Fatty
Acid Synthase (FAS) et SREBP1c. SREBP1c fonctionne de pair avec USF1, il est régulé par
l’insuline via AKT et mTORC1 et est acétylé par P300. Des deux isoformes du récepteur nucléaire
LXR (α et β), LXRα est majoritairement exprimé dans le foie. Il a pour ligands naturels les
oxystérols et le desmostérol, un intermédiaire de la biosynthèse du cholestérol. Il lie l’élément de
réponse LRE et active la transcription des gènes de la synthèse du cholestérol comme les
transporteurs ABC (A1, G1, G5, G8) ou l’apolipoprotéine E ainsi que des gènes de la LDN comme
SREBP1c et ChREBP. ChREBP se lie sur les éléments de réponse ChoRE et régule les enzymes
lipogéniques comme ACLY, FAS, ACC et SCD1. Sa translocation nucléaire dépend de sa
déphosphorylation par la PP2A activée par le Xu-5P dont la concentration dépend directement de
la concentration de glucose cellulaire. ChREBP pourrait également lier des métabolites de la
glycolyse comme le G6P et le F2,6-P2 et induire un changement de conformation important pour
son interaction avec des partenaires nucléaires. De plus, l’activité de ChREBP dépend de son
acétylation par P300 qui régule sa capacité de liaison à son élément de réponse, ainsi que de sa O-
GlcNacylation par OGT qui est directement régulée par le niveau de glucose cellulaire (Filhoulaud
et al., 2013; Wang et al., 2015 ). Le foie a également un rôle important dans la distribution des
lipides aux autres organes notamment via la synthèse et l’export des very low density lipoproteins
27
(VLDL). Les VLDL contrairement aux gouttelettes lipidiques, ne sont pas issues directement du
système de sécrétion. La production des VLDL débute par la synthèse de la protéine ApoB100
dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) rugueux. Lors de celle-ci, cette protéine subit
des modifications post traductionnelles de lipidation et l’incorporation de TG microsomaux
catalysés par la Microsomal Triglyceride Transfer Protein (MTTP). Au fur et à mesure de ce
transfert, la lipoprotéine se charge en lipides neutres et prend une forme sphérique pour devenir,
un pré-VLDL localisé dans la lumière du RE. La maturation du pré-VLDL en VLDL et son export
sont encore méconnus. Cependant, les pré-VLDL empruntent le système vésiculaire antérograde
en direction de l’appareil de Golgi puisque ApoB100 est retrouvée dans les vésicules COPII
(Figure 6). La synthèse des VLDL est activée d’une part par le flux d’acides gras libres. Le
stockage des lipides neutres dans la cellule, comme les TG et les CE, s’effectue sous forme de
gouttelettes lipidiques (GL). Ces GL sont des organelles extrêmement dynamiques qui grandissent
au cours de leur maturation, soit par synthèse locale de TG, soit par fusion avec d’autre GL. Ainsi,
selon les types cellulaires, différentes tailles de GL sont retrouvées. On note les GL initiales (iGL
d=300-800nm), qui sont converties en GL plus grosses lors de leur expansion (eGL d > 1µm). Il
existe un troisième type de gouttelette de taille supérieure : les GL géantes (gGL >10 µm), celles-
ci ne sont cependant retrouvées que dans les adipocytes et les hépatocytes. Les GLs sont
composées d’un cœur lipidique hydrophobe et d’une monocouche de phospholipides émanant du
feuillet externe du RE (Figure 7). Ce feuillet amphiphile, joue le rôle d’interface entre le cytosol
polaire et le cœur de la gouttelette apolaire et réduit également la tension de surface (Olzmann and
Carvalho, 2019), stabilisant ainsi les particules hydrophobes dispersées. La GL est également
composée de protéines provenant à la fois du RE et du cytosol. Parmi ces protéines, des enzymes
28
de la synthèse des TG comme GPAT4 et DGAT2, mais également les protéines Cell death
Inducing DFFA Like Effector
Figure 6. Schéma de la synthèse et de la maturation des VLDL
Une fois synthétisée, la protéine ApoB100 interagit avec la protéine MTTP qui permet le chargement de
lipides neutres et de phospholipide dans la poche hydrophobe d’Apo100. A mesure que cette protéine se
charge en lipides, elle prend une forme sphérique pour former le pré-VLDL. La maturation du pré-VLDL
consiste en l’accumulation de lipides neutres qui augmente la taille du VLDL. Une fois mature, le VLDL
est sécrété vers le golgi, dans des vésicules COPII. VLDL : very low density protein, TG : triglycéride,
CE : cholestérol ester, MTTP: microsomal triglyceride transfer protein, RE: reticulum endoplasmique,
COPII : Coat protein type II.Adapté de Fukuhara et al. (2015)
29
Figure 7. Schéma de la synthèse et de la maturation des gouttelettes lipidiques
(A) Les gouttelettes (GL), consistent en un noyau compose de lipides neutres enrobés d’une monocouche de
phospholipide amphiphiles. Les protéines se localisent à la gouttelette, soit depuis le RE, soit depuis le
cytosol.(B) la formation des GL débute avec la synthèse de lipides neutres qui s’accumulent entre les feuillets
de la membrane du RE pour créer une simple déformation. (C) Cette déformation peut éventuellement
générer le bourgeonnement d’un feuillet, et permettre la naissance d’une GLi (gouttelette lipidique initiale).
(D) Les molécules COPI peuvent scinder par bourgeonnement la GLi entrainant, une diminution de la tension
de surface et la re-fusion avec le feuillet externe du RE. De cette façon, de nombreuses protéines et enzymes
peuvent s’insérer à la surface de la gouttelette. GL : gouttelette lipidique, RE : Réticulum endoplasmique,
COPI : Coat protein type I. Extrait de Gluchowski et al. (2017)
30
(CIDEA, B et C) , impliquées dans la croissance des gouttelettes (Figure 7). Les GL géantes
retrouvées dans les hépatocytes, sont formées soit par fusion physique de deux gouttelettes si la
tension de surface est forte, ce qui est causé par un manque de phosphatidyl-choline (PC), soit par
diffusion facilitée des lipides neutres des petites GL vers les GL géantes. Les CIDEA, B et C (aussi
appelé Fsp27 chez la souris) jouent un rôle unique dans ce dernier mécanisme. En effet alors que
CIDE B est localisé aux contacts entre les gouttelettes petites et grandes où il favorise la fusion
des gouttelettes et le transfert de lipides, CIDEA et CIDEC sont spécifiquement localisés aux
points de contacts entre les grandes gouttelettes où ils favorisent également la fusion et le transfert
de lipides (Xu et al., 2016). Enfin, ces GL peuvent être utilisées à des fins métaboliques mais
également pour alimenter la synthèse des VLDL par l’hydrolyse de leur contenu via les lipases
(PNPLA2, PNPLA3) ou, d’une façon minime en condition physiologique, par lipophagie.
c. Zonation hépatique
Comme nous l’avons vu dans les sections précédentes, le foie possède une circulation
sanguine particulière et un rôle métabolique unique. Une conséquence directe de cette organisation
est une hétérogénéité transcriptomique et fonctionnelle le long de l’axe porto-central appelé
zonation. La zonation est un processus extrêmement complexe, qui fait intervenir de très
nombreuses signalisations impliquées dans le développement et le métabolisme. Par conséquent
nous n’allons aborder que le concept de zonation en l’illustrant par les exemples de la zonation
métabolique et de la voie Wnt/β-Caténine (Figure 8). La zonation peut s’expliquer par le fait que
les cellules localisées dans la zone périportale ne sont pas exposées au même environnement
signalétique que les cellules localisées dans la zone péri-centrale. Il existe en effet des gradients
dont un gradient métabolique entre ces zones. En conséquence, on distingue différents profils
d’expression génique impliqués dans le métabolisme du glucose et des acides aminés, dans la
31
détoxification des xénobiotiques et dans la sécrétion de la bile le long de cet axe centro-portal
(Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019). Cela est également orchestré au niveau moléculaire par une
zonation de l’activité de la voie de signalisation Wnt-β-catenin /Adenomatous Polyposis Coli
(APC), entre bien d’autres voies de signalisation, le long de l’axe centro-portal. Wnt est le ligand
qui se lie à son récepteur Frizzled et est sécrété majoritairement par les cellules endothéliales.
L’activation de la voie Wnt active le facteur de transcription β-caténine qui passe d’une
localisation para-cellulaire au niveau des jonctions serrées à la membrane plasmique, à une
localisation nucléaire. La voie est en revanche inhibée par la protéine APC qui est importante pour
la dégradation de la β-caténine et empêche son activation (Perugorria et al., 2019). Ainsi, dans la
zone péri-portale où le sang est riche en hormones et en O2, la signalisation Wnt est peu active et
les hépatocytes expriment la β-caténine à la membrane plasmique. Les fonctions métaboliques
sont la gluconéogenèse, la β-oxydation, la synthèse du cholestérol, la synthèse et la sécrétion des
protéines. Dans la zone péri-centrale au contraire, la voie Wnt est fortement activée et les
hépatocytes n’expriment pas APC. Cette zone est associée aux fonctions de glycolyse, de LDN,
de production des acides biliaires, de la synthèse de la glutamine, du métabolisme des
xénobiotiques (Figure 8) (Ben-Moshe and Itzkovitz, 2019; Perugorria et al., 2019 ).
32
Figure 8. Représentation schématique de la zonation centro-portale
Il existe des gradients métaboliques et de signalisation entre la zone centrale et portale du lobule.
Les vaisseaux péri-portaux sont riches en O2 et en nutriments. Par conséquents les hépatocytes
localisés dans cette zone ont des fonctions spécifiques et différentes, des hépatocytes
péricentraux. A l’inverse, il existe un gradient de la signalisation WNT/β-caténine, qui est plus
importante dans la zone centrale et plus faible dans la zone péri-portale. Adapté de Ben-Moshe
and Itzkovitz (2019).
33
1.2. Physiopathologie des NAFLD
Figure 9. Spectre et évolution des stéatopathies non alcooliques
La majorité des patients présentant des facteurs de risque pour les NALFD ont une stéatose
hépatique qui est réversible. Une proportion plus faible de ces individus développent des
complications plus sévères et de moins en moins réversibles. D’après Tacke and Weiskirchen
(2018) et Hubscher (2006).
34
Les stéatopathies hépatiques non alcooliques (Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)) sont
des complications hépatiques, en l’absence d’autres étiologies telles que : une infection par les
virus de l’hépatite A,B,C,D,E, l’utilisation de médicaments qui induisent une stéatose (e.g.
amiodarone, tamoxifène), une hépatite auto-immune, une hémochromatose, la maladie de Wilson
ou une consommation importante d’alcool de façon chronique (supérieure à 40g d’alcool
pur/jours ; environ 21 verres/semaine chez les hommes et 14 verres chez la femme) (Seitz et al.,
2018; Younossi et al., 2019). Les NAFLD regroupent un ensemble de complications hépatiques
qui incluent : la stéatose hépatique qui progresse vers la stéatohépatite non alcoolique (Non
Alcoholic SteatoHepatitis (NASH)), la fibrose et la cirrhose hépatique qui peut éventuellement
conduire au développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). La majorité des patients
présentant des facteurs de risque pour les NALFD vont présenter une stéatose hépatique qui est
réversible. Une proportion plus faible de ces individus va développer des complications plus
sévères et de moins en moins réversibles comme le CHC ou une insuffisance hépatique chronique
également appelée maladie hépatique terminale ou décompensation qui peut conduire au décès du
patient (Figure 9) (Hubscher, 2006 ; Liverfoundation.org, 2019).
a. Diagnostic
Différentes approches non-invasives sont utilisées pour le diagnostic de la stéatose et de la
fibrose. Des critères biologiques et la recherche de biomarqueurs circulant, des critères d’imagerie
pour l’évaluation de la stéatose (Castera et al., 2019; Moreno et al., 2019), et des critères physiques
pour évaluer la fibrose via la mesure de la rigidité du foie par l’utilisation d’ultrasons ou la
résonance magnétique. Le diagnostic des NAFLD se réalise sur ponction biopsie hépatique , un
acte medical invasif donc à risque ce qui rend son diagnostic difficile chez des patients sans
prédisposition aggravante.
35
Le bilan sanguin notamment celui des fonctions hépatiques indique en premier lieu si la
biopsie est requise. Celui-ci inclut entre autres, le dosage des transaminases circulantes qui
reflètent l’intégrité du foie. Le diagnostic des NAFLD et plus particulièrement de la NASH
s’effectue cependant au niveau histologique par un anatomo-pathologiste qui établit le NAFLD
Activity Score (NAS). Ce score comprend une évaluation du pourcentage de stéatose, le nombre
de foci inflammatoires reflétant l’inflammation lobulaire et la présence d’hépatocytes ballonisés
indiquant une souffrance hépatocytaire (Table 1) (Kleiner et al., 2005).
b. Facteurs de risque
Obésité
Le surpoids et l’obésité se définissent comme une accumulation excessive de masse grasse.
L’indice de masse corporelle (IMC) est une mesure simple du poids par rapport à la taille. Il est
couramment utilisé pour estimer le surpoids et l’obésité chez l’adulte indifféremment du genre. Il
correspond au poids (en kg) divisé par la taille au carré (en m²). L’organisation mondiale de la
Paramètre
Critère de
définition du
score
Score
Grade de
stéatose
<5%
5-33%
33-66%
>66%
0
1
2
3
Inflammation
Lobulaire
Absence
<2 foci
2-4 foci
>4 foci
0
1
2
3
Ballonisation
hépatocellulaire
Absence
Peu
Beaucoup
0
1
2
Table 1. Critère d’évaluation du NAFLD Activity Score (NAS)
Le NAFLD activity score (NAS) est le score qui évalue la sévérité de la NAFLD. C’est
la somme du grade de la stéatose, des foyers inflammatoires et d’hépatocytes ballonisés
Kleiner et al. (2005).
36
santé (OMS) définit le surpoids comme un IMC supérieur ou égal à 25 kg/m² et l’obésité comme
un IMC supérieur ou égal à 30kg/m² (Table 2). Chez l’enfant et l’adolescent en croissance, il est
plus difficile d’utiliser un simple index pour mesurer le surpoids et l’obésité, du fait de leur
métamorphose corporelle (Who.int, 2016). Selon l’OMS, l’obésité dans le monde a triplé depuis
1975 et est considérée comme épidémique depuis 1998. En 2016, 1.9 millions d’adultes, 340
millions d’enfants et adolescents (5-19 ans) sont en surpoids et l’obésité représente 13% de la
population mondiale.(Who.int, 2016). L’obésité implique une gestion énergétique importante qui
interfère et défie les régulations physiologiques. De nombreuses complications sont associées à
l’obésité dont le diabète de type 2 (DT2) et les maladies cardio-vasculaires, qui sont la première
cause de décès associés à l’obésité et aux complications hépatiques. De plus, la composition, la
fréquence et la quantité de la prise alimentaire chez les individus obèses, entraînent une
modification de la flore intestinale associée à une altération de la perméabilité intestinale qui joue
un rôle crucial dans la pathogenèse de l’insulino résistance (IR), du syndrome métabolique et des
complications hépatiques.
Résistance à l’insuline et diabète de type 2
L’IR, englobe un ensemble de mécanismes qui entraînent une diminution de la réponse des tissus
à la signalisation de l’insuline. La conséquence de cette résistance à l’insuline est une dérégulation
du métabolisme glucido-lipidique, une insulinémie élevée pour compenser cette résistance qui, à
Indice Masse Corporelle (Kg/m²)
(IMC) Statut nutritionnel selon l’OMS
< 18,5 Poids insuffisant
18,5-24,9 Poids normal
25-29,9 Surpoids
30-34,9
35-39,9
≥ 40
Obésité modérée (Classe 1)
Obésité sévère (Classe 2)
Obésité morbide (Classe 3)
Table 2. Classification de l’obésité et du surpoids selon l’indice de masse corporelle.
Extrait de (Who.int, 2016)
37
long terme, conduit au développement d’un DT2. L’origine de l’IR est essentiellement
l’inflammation de bas grade, associée à l’obésité qui en est la cause la plus fréquente. Le contexte
de l’obésité est crucial pour comprendre l’IR et l’initiation de la stéatose hépatique. Le stress
métabolique au niveau du TA qui gère des quantités massives de TG chez des individus obèses,
conduit à une activation du système immunitaire. Dans le TA, l’environnement immunitaire est
majoritairement anti-inflammatoire (de type 2). Cela est assuré par les cellules innées d’une part :
les polynucléaires éosinophiles, les cellules innées lymphoïdes (ILC) de type 2 et les invariant
TCR natural killer (iNKT) de type 2 et régulateurs maintiennent la polarisation anti-
inflammatoire M2 des macrophages (Brestoff et al., 2015; Crosby and Kronenberg, 2018) et par
les cellules de l’immunité adaptatrice d’autre part : via la polarisation des cellules T
majoritairement Th2 et Treg. Lors de l’obésité, l’adipocyte lui-même sécrète des AG, des
cytokines, des adipokines et des chimio-attractant comme CCL2, qui favorisent le recrutement et
l’activation de cellules immunitaires dont des monocytes, macrophages et des lymphocytes
(Figure 10). L’environnement anti-inflammatoire devient alors pro-inflammatoire de type 1.
L’activation de ces cellules immunitaires est renforcée par les produits bactériens provenant de
l’intestin dont la perméabilité est augmentée lors de l’obésité. Les cytokines pro-inflammatoires
interfèrent avec la signalisation de l’insuline non seulement au niveau du tissu adipeux mais
également de façon systémique. En effet, la neutralisation du Tumor necrosis factor α (TNFα), une
cytokine pro-inflammatoire, améliore la sensibilité à l’insuline (Hotamisligil et al., 1993). Cette
interférence se fait au niveau intracellulaire. En effet, la signalisation des cytokines, médiateurs
inflammatoires, adipokines comme la leptine, métabolites comme les AG saturés, les céramides,
le DAG conduisent à l’activation de sérines thréonines kinases comme les JNK, IKK et les aPKC
ainsi qu’à l’augmentation de l’expression de SOCS, lesquels phosphorylent ou interagissent avec
38
Figure 10. Mécanismes moléculaires de l’insulino-résistance
Chez l’individu obèse, la quantité et la composition de la prise alimentaire, associées à une dysbiose et une
augmentation de la perméabilité intestinale conduisent à une inflammation du tissu adipeux. La signalisation des
cytokines pro-inflammatoires ainsi que l’abondance d’acides gras libres, interfèrent avec la signalisation de
l’insuline. Le DAG issu de l’estérification de deux AG à un glycérol, active la PKCε qui phosphoryle sur des résidus
sérines et thréonines du récepteur de l’insuline et empêche ainsi la liaison de ses protéines adaptatrices IRS1/2 qui
sont indispensables à l’amplification du signal. Les récepteurs aux cytokines et le stress oxydatif activent les kinases
JNK et IKKβ, qui elles aussi phosphorylent le récepteur de l’insuline et les IRS1/2, et empêchent sa signalisation.
Enfin, la protéine SOCS est induite en réponse aux cytokines pro-inflammatoires et entre en compétition avec
IRS1/2 pour le récepteur de l’insuline, inhibant ainsi la signalisation de l’insuline. GLUT : Glucose transporter,
IRS : Insulin Receptor substrate, PKC : Protein Kinase C, DAG : Diacylglycerol, JNK : c-Jun N terminal kinase,
SREBP1c : sterol regulatory element binding protein, ChrEBP : Carbohydrate responsive element-binding protein,
AG : acides gras, SOCS : Supressor of cytokine signaling, IL : Interleukin, CCL : Chemokine ligand, Inf :
inflammatoire, NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, G : Glucose, TNF : Tumor Necrosis
Factor. Adapté de Stefan et al. (2019)
39
le récepteur de l’insuline ou les Insulin Receptor Substrates (IRS1/IRS2) (Figure10) (Boucher et
al., 2014; Lackey and Olefsky, 2016; Stefan et al., 2019 ), des protéines adaptatrices du récepteur
de l’insuline, indispensable à la médiation de sa signalisation. Ces phosphorylations ou ces
interactions inhibent la signalisation de l’insuline. Ainsi, l’inflammation de bas grade participe à
la mise en place de la résistance à l’insuline dans tous les organes insulino-sensibles qui de la
même façon développent une inflammation tissulaire. Cela s’étend au système nerveux central qui
participe également aux régulations métaboliques (Guilherme et al., 2019).
Syndrome métabolique
Le syndrome métabolique est un ensemble de troubles du métabolisme systémique, qui
sont très fréquemment retrouvés chez les individus obèses et qui constituent un enjeu de santé
publique majeur. Sa définition précise n’est pas clairement établie et diffère selon les organismes
tels que l’OMS, le European group for the study of insulin, le National Cholesterol Education
program-Third Adult Treatment Panel, l’Association pour l’endocrinologie clinique ou encore la
Fédération Internationale du Diabète. Cependant, il est généralement admis que le syndrome
métabolique comprend un large nombre de facteurs de risque qui incluent l’IR, un tour de taille
élevée, un fort taux de triglycérides plasmatiques, une dyslipidémie et de l’hypertension artérielle
(Table 3) (O'Neill et al., 2016). Le syndrome métabolique et la résistance à l’insuline sont des
complications de l’obésité et tous deux sont des facteurs de risques pour l’apparition de
complications hépatiques. En effet, la méta-analyse de Younossi et al. (2016), confirmée en 2019
par le même auteur, évalue la prévalence des NAFLD dans le monde à 25% (Younossi et al., 2019).
Parmi les 25% de patients ayant une NAFLD et ayant eu une biopsie hépatique, 59% ont une
NASH. Cette étude confirme que l’obésité, l’IR et le syndrome métabolique sont des facteurs de
risque associés aux NAFLD. En effet, 82% des patients atteints de NASH sont obèses. De plus,
23% des patients qui présentent une stéatose hépatique et 44% des patients qui présentent une
40
Définition OMS EGIR NCEP:ATP-III AACE IDF
Fondamentale Insulinémie
élevée
Résistance à
l’insuline
Tolérance au
glucose
altérée
CA (spécifique de
l’ethnicité et au sexe)
Nombre de
Composants
Au moins 2 des
composants
suivants :
Au moins 2 des
composants
suivants :
Un des 3
composants suivants
- -
Obésité
abdominale
CA > 93 cm
IMC >30 kg/m²
CA≥94cm (H)
≥80 cm (F)
CA>101 cm (H)
CA>89 cm (F) - -
Triglycérides
>150 mg/dL
>2 mmol/L
≥150 mg/dL
≥150 mg/dL
≥150 mg/dL
HDL
(mg/dL)
<35 (H)
<39 (F) <1
<40 (H)
<50 (F)
<40 (H)
<50 (F)
<40 (H)
<50 (F)
Pression
Artérielle
(mmHg)
≥140/90
≥140/90
>130/85
ou
Médication de
l’hypertension
>130/85 >130 /85
Micro-
albuminurie > 30 mg/g - - - -
Glycémie à
jeûn - ≥6.1 mmol/L >110 mg/dL
≥5.6 mmol/L
ou diabète de type 2
Table 3. Définitions et diagnostics du syndrome métabolique
Le syndrome métabolique regroupe un ensemble de désordres métaboliques. Les critères pour le
diagnostic ne sont cependant pas clairement établis et varient selon les institutions. CA, circonférence
abdominale, IMC, Indice de Masse Corporelle, H, homme, F, femme, HDL, High Density Lipoprotein.
Extrait de O'Neill et al. (2016).
41
NASH sont également diabétiques. Enfin, 69% des patients qui ont une stéatose et 72% des
patients atteints de NASH présentent aussi une dyslipidémie. Bien que la NAFLD soit une
complication fréquente, elle n’est pas exclusive de l’obésité et du surpoids, puisqu’elle peut être
retrouvée chez des individus présentant un IMC normal (Loomba and Sanyal, 2013).
Facteur de risque génétique
De nombreuses études alliant l’utilisation d’outils génétiques et épidémiologiques, ont pu
démontrer l’association de certains SNP (single nucleotide polymorphysm) à la stéatose hépatique
qui présente, dans ce cas, un caractère héréditaire de façon indépendante de l’adiposité et des
facteurs socio-économiques (Dongiovanni et al., 2013 ; Guerrero et al., 2009; Loomba et al., 2010 ;
Loomba et al., 2015 ; Makkonen et al., 2009; Schwimmer et al., 2009 ). Il y a au moins quatre
gènes pour lesquels il existe des variants génétiques associés au développement des NAFLD. Ces
gènes codent pour des protéines qui sont impliquées dans le métabolisme lipidique hépatique et la
signalisation de l’insuline, (Dongiovanni et al., 2015), le stress oxydatif, l’immunité innée et
l’activation des cellules stellaires (Eslam et al., 2018). L’ensemble de ces variants génétiques sont
récapitulés dans la Table 4.
c. Stéatose hépatique
Définition et diagnostic
La stéatose hépatique est définie par l’accumulation de lipides dans les hépatocytes. Elle
est cliniquement définie par la présence de vacuoles lipidiques, généralement macrovésiculaires,
au sein des hépatocytes. Elle est significative lorsque au moins 5 % des hépatocytes contiennent
des gouttelettes lipidiques, et débute typiquement en région péri-centro-lobulaire. La stéatose
microvésiculaire, caractérisée par des hépatocytes avec des noyaux en position centrale et un
42
Variant Gène Fonction Gain ou perte de
fonction (G/P)
Phénotype
(Aggravant / Protecteur)
rs738409 C > G PNPLA3 Remodelage GL P NAFLD / NASH/ FIBROSE / CHC
rs58542926 C > T TM6F2 Sécrétion VLDL P NAFLD / NASH/FIBROSE rs12137855 C > T LYPLAL1 Hydrolyse TG ? NAFLD rs780094 A > G
rs1260326 C > T GCKR Régulation LDN
?
P NAFLD / NASH/ FIBROSE
Multiple APOB Export VLDL P NAFLD / NASH/ FIBROSE / CHC Multiple MTTP Sécrétion VLDL P NAFLD
rs13412852 C > T LPIN1 Métabolisme
Lipidique ? NASH / FIBROSE
rs4880 C > T SOD2 Anti-oxydant P FIBROSE
rs695366 G > A UCP2 Phosphorylation
oxydative G NASH
rs1044498 A > C ENPP1
Inhibiteur de la
signalisation de
l’insuline
G FIBROSE
rs1801278 A > C IRS1 Signalisation de
l’insuline P FIBROSE
s12979860 C > T IL28B Immunité innée P FIBROSE
rs3750861 G > A KLF6 Régulation LDN,
Fibrose P FIBROSE
rs4374383 G > A MERTK Immunité innée /
Activation HSC P FIBROSE
rs3480 A > G FNDC5 Activation HSC ? FIBROSE
Table 4. Polymorphismes associés à la progression ou la protection des NAFLD
LDN : Lipogenèse de novo, HSC : cellule stellaire hépatique, TG : Triglycérides,
VLDL : Very Low density lipoprotein. Adapté de Eslam et al. (2018)
43
cytoplasme rempli d’une multitude de GL, dont la taille est inférieure à celle des noyaux, n’est pas
une caractéristique reconnue des NAFLD (Tandra et al., 2011). Son score s’étend de S0 à S3
(Table 1). La stéatose est également présente chez les patients présentant une NASH, une NASH
fibrosante et tend à diminuer avec la sévérité de la fibrose (Caldwell et al., 1999; Nagaya et al.,
2008).
Physiopathologie
L’accumulation de TG intra hépatiques est due à un déséquilibre entre l’import et la LDN
d’une part et la β-oxydation et l’export d’autre part. Dans un contexte d’obésité et d’IR, le flux
d’AG en provenance soit de la lipolyse du TA soit de l’alimentation est augmenté.
Chez les patients présentant une NAFLD, le traçage d’AG radio marqués, a permis de
mettre en évidence que 59% des TG hépatiques provenaient des AG libres du tissu adipeux, 26%
de la LDN et 15% de l’alimentation (Donnelly et al., 2005). Cet afflux d’AG dans le foie, participe
à l’augmentation de la quantité de substrat disponible pour la formation ou la synthèse de TG au
niveau des GL. De plus, la stéatose hépatique est associée à l’augmentation des transcrits de gènes
qui codent pour des protéines impliquées dans l’import des acides gras comme CD36, FABP4 ou
FABP5 (Miquilena-Colina et al., 2011). De façon surprenante, la contribution de la LDN au pool
d’acide gras hépatique reste importante, malgré l’IR. En effet, l’insuline chez ces patients stimule
toujours l’activité et l’expression de SREBP1c (Greco et al., 2008).
Les TG en excès, sont stockés sous forme de GL. Ces GL sont composées d’une
monocouche de phospholipides et de protéines à la surface ou à proximité de la gouttelette. Ces
protéines sont de diverses natures et incluent des protéines de transport, des enzymes lipogéniques
ou des lipases. Ces protéines jouent un rôle clé dans le stockage et le devenir des lipides hépatiques.
Un aperçu de ces protéines est récapitulé dans la Table 5. Les protéines CIDE, CIDEA, B et C
44
sont retrouvées à la surface des gouttelettes lipidiques. L’expression de CIDEA est contrôlée par
SREBP1-c et est retrouvé dans l’hépatocyte gras. CIDEC (chez l’Homme) ou Fsp27 (chez la
souris), est régulé par PPARα, PPARγ et CREBH. CIDEC, interagit avec PLIN1, qui n’est exprimé
dans l’hépatocyte qu’en condition pathologique, pour effectuer le transfert de lipides d’une GL à
une autre. Alors que l’expression de CIDEC est augmentée avec la sévérité des complications
hépatiques, CIDEA diminue et CIDEB n’est pas affecté (Sans et al., 2019), ce qui reflète la
complexité du rôle des protéines de la gouttelette. De plus, CIDEC joue un rôle dans la mort
hépatocytaire. En effet, son expression est très fortement augmentée dans le foie de patients
présentant une NASH et corrèle avec les marqueurs de souffrance et de mort hépatocellulaire. La
phosphatidyl choline (PC), qui joue un rôle essentiel dans la fusion physique des GL et l’export
des VLDL, prévient la fusion des GL en diminuant la tension de surface de celles-ci. Chez la
souris, le développement de la stéatose hépatique est associé à une diminution de la production de
PC, ce qui favoriserait également la fusion des GL (Niebergall et al., 2011). De plus, la stéatose
hépatique est associée à un défaut de l’export des VLDLs et à une déficience en choline qui
augmente davantage le stockage de lipides intra-hépatiques (Corbin and Zeisel, 2012).
d. Stéatohépatite non alcoolique
La NASH est définie par l’association d’une stéatose, d’une inflammation et d’une
souffrance hépatocytaire ou ballonisation, associée à la mort hépatocellulaire. Elle peut être
associée à des lésions de fibrose de sévérité variable. Dans le contexte de la stéatose hépatique, les
différents types cellulaires du foie, et en particulier les hépatocytes, sont exposés à (i) des facteurs
intra- hépatiques : une forte activité métabolique avec une glycémie élevée, l’accumulation de
lipides intracellulaires et une réponse partielle à l’insuline (ii) à des facteurs extra-hépatiques : des
résidus et métabolites bactériens, directement issus du système porte, provenant de l’intestin
45
Protéine GL Site d’expression Fonctions observées Interaction avec
d’autres facteurs
PLIN1
(PERLIPIN A)
TA, muscle cardiaque, TA
brun, Foie stéatosé
Stabilité de la GL, contrôle de
la lipolyse hormono-dépendante
PNPLA2, SREBP1c,
CIDEC,
PLIN2 (Adipophilin) Ubiquitaire
Stabilité de la GL,
différenciation adipocytaire,
lipidation des VLDL
PPARα, γ,δ
PLIN3 Ubiquitaire
Stabilité de la GL, production
PGE2, trafficking intra
cellulaire
Récepteur du mannose
6-phosphate
PLIN4 TA, muscle squelettique
Stabilité GL, différenciation
adipocytaire
PLIN5
PLIN5
Muscle squelettique, TA
brun, cœur, foie, cellules
β-pancréatiques
Stabilité GL, oxydation
lipidique, recrutement
mitochondrie
PPARα, δ, PNPLA2,
PLIN4
PNPLA3 TA, foie, muscle
squelettique, pancréas
Activité estérase pour les TG et
le retinyl-palmitate
SREBP1-c
PNPLA2 TA, foie
Lipolyse SIRT1, PLIN5, PLIN1
CIDEA TA, foie Lipogenèse
SREBP1-c
CIDEB TA, foie
Lipogenèse, VLDL lipidation,
assemblage du VHC
Protéine du VHC NS58
CIDEC TA, foie
Stabilité de la GL, fusion des
GL, transfert de lipides de GL à
GL, activité pro-apoptotique
PPARα, γ
CREBH
SEIPIN TA, foie, cerveau, testicule Maturation des GL, Lipolyse
Table 5. Protéines de la gouttelette lipidique
TA : Tissu adipeux, GL : Gouttelette lipidique PGE : Prostaglandine E, VLDL : very low density lipoprotein, VHC :
virus de l’hépatite C. Extrait de Minehira and Gual (2018).
46
dont la flore microbienne et la perméabilité sont modifiées. Parmi les facteurs extra-hépatiques
figurent aussi la production d’adipokines et de facteurs pro-inflammatoires. Ces facteurs vont
induire la mort des hépatocytes et l’activation du système immunitaire et ainsi faire progresser la
stéatose vers la NASH. Ces deux caractéristiques de la stéatohépatite, s’alimentent mutuellement,
la souffrance et la mort hépatocytaire activant le système immunitaire et le système immunitaire,
favorisant la mort des hépatocytes gras.
Souffrance hépatocellulaire
L’atteinte hépatique est classiquement évaluée par les transaminases circulantes ALAT, ASAT et
γGT. Les ALAT, sont le premier biomarqueur couramment utilisé pour l’évaluation des atteintes
hépatiques aigües et chroniques. Les ALAT contrairement aux ASAT et aux γGT ont une
expression presque exclusivement hépatocytaire. Les ASAT et γGT sont un reflet d’un état de
souffrance global et sont utilisées pour mieux définir l’étiologie de l’atteinte hépatique (Luedde
et al., 2014). Bien que le niveau circulant des ALAT soit généralement corrélé à la progression
de la NASH, la fibrose et de la cirrhose (Anty et al., 2010; Loomba, 2014), d’autres biomarqueurs
de la souffrance hépatique ont été décrits et peuvent être complémentaire des ALAT. En effet, la
kératine 18, et ses fragments générés par les caspases pro-apoptotiques, peuvent prédire la
sévérité de la stéatohépatite et de la fibrose chez des patients obèses et alcoliques (Anty et al.,
2010 ; Diab et al., 2008 ; Feldstein et al., 2013; Lavallard et al., 2011). On distingue plusieurs
types de mort cellulaire : l’apoptose, la nécrose, la nécroptose et la pyroptose. Si l’existence de
ces quatre types de mort cellulaire est indéniable, leur rôle dans la NASH est parfois discuté. Ce
qui distingue de façon claire ces types de mort est leur immunogénicité. En effet, dans les concepts
actuels, l’apoptose est une mort stérile ou non-immunogénique, qui ne conduit pas à l’activation
du système immunitaire. La nécrose, la nécroptose et la pyroptose sont, au contraire,
immunogéniques car elles entraînent la libération de molécules intracellulaires appelés Danger
47
Associated Molecular Patterns (DAMP), qui peuvent être reconnues par les cellules immunitaires
et ainsi les activer (Figure 11). Cependant, cette vision est très simplifiée et le rôle des différents
types de mort cellulaire ainsi que leur inter-connexion ont certainement des conséquences bien
plus complexes sur l’activation des mécanismes inflammatoires et fibrosant et par conséquent
dans la progression de la NASH.
L’apoptose est caractérisée par la conservation de l’intégrité membranaire associée à
l’inversion de ses feuillets externes et internes ou « Flip-flop ». Ce phénomène permet
l’opsonisation, la reconnaissance et l’élimination des corps apoptotiques par les macrophages. De
plus, elle est caractérisée par la formation de corps apoptotiques bourgeonnants, une condensation
de la chromatine, des noyaux pycnotiques, associés à la digestion de l’ADN en fragments
nucléosomiques (Kolb et al., 2017). C’est un processus ATP dépendant, déclenché par de très
nombreux stimuli. Les acteurs centraux de cette signalisation sont les caspases (CASP). Elles sont
synthétisées à l’état de zymogène ou pro-caspase, c’est-à-dire non actives. Elles sont ensuite
activées par clivage par d’autres protéases, le plus souvent des caspases mais également les
calpaïnes et le granzyme B (Holcik, 2001). On distingue classiquement les voies apoptotiques
extrinsèques et intrinsèques. Les voies extrinsèques correspondent aux voies qui dépendent des
récepteurs de mort. Ils incluent les couples de ligands / récepteurs de la famille du TNF, incluant
le TNFα/TNFαR1, FAS-L/FAS, TRAIL/DR5 ou DR4. Le système perforines/granzyme, utilisé
par les cellules immunitaires cytotoxiques pour induire la mort de la cellule cible, fait également
partie des voies extrinsèques mais n’engage pas de récepteur. L’hépatocyte exprime tous ces
récepteurs de mort. La fixation du ligand à son récepteur induit la formation d’une plateforme de
signalisation par changement de conformation et la reconnaissance de domaines d’interaction
comme le domaine Death Effector Domain (DED). Suite à la trimérisation du récepteur de mort,
48
Figure 11. Schématisation des différentes voies de mort cellulaire
La mort par apoptose est dépendante des caspases effectrices. Elle n’est pas immunogénique
et conduit à l’élimination des corps apoptotiques par les cellules immunitaires (efferocytose).
L’état sub-léthal des hépatocytes ainsi que la nécroptose, la nécrose et la pyroptose entrainent
la lyse de la cellule et le relargage de DAMPS qui sont immunogéniques. Casp : Caspases,
ROS : Reactive Oxygen Species, MOMP: Mitocondrial Outter Membrane Permeabilization
Pore. Adapté de Schwabe and Luedde (2018)
49
les interactions DED-DED entre la CASP 8 ou 10 et Fas Associated protein with Death Domain
(FADD) permettent l’auto-clivage de la CASP 8/10 et son activation (Schwabe and Luedde, 2018).
Cette activation peut être inhibée par compétition par la protéine cFLIP qui possède également un
domaine DED (Tsuchiya et al., 2015). Cette première plateforme de signalisation sous le récepteur
de mort s’appelle DISC. La CASP 8/10 clivée (cCASP 8/10), active directement les CASP 3, 6 et
7 qui sont les caspases effectrices qui vont activer un grand nombre de protéases permettant la
dégradation de l’ADN comme CAD, par le clivage de son inhibiteur I-CAD, ou des structures du
cytosquelette et du noyau par la dégradation de ROCK1 et de lamine respectivement. Dans certains
types cellulaires, dits de type 1, cette signalisation est directe et suffisante pour le clivage des
caspases effectrices et l’induction de l’apoptose. En revanche dans les types cellulaires, dits de
types 2 dont l’hépatocyte, le TNFαR1 stimule la voie de survie NFkB par l’intermédiaire du
complexe 1. L’induction de l’apoptose dans ces cellules requiert une signalisation supplémentaire
via la mitochondrie. Cela s’effectue majoritairement via le clivage de BID en tBID par les
cCASP8/10. tBID se localise alors à la mitochondrie et va entraîner la perméabilisation de cette
dernière (MOMP). Le potentiel mitochondrial est très finement régulé dans la mitochondrie par la
famille des protéines BCL2 (Figures 12 et 13) (Desagher and Martinou, 2000). Ces protéines ont
des degrés d’homologie variables et possèdent 4 domaines conservés : les Bcl2 homology (BH)
domain 1, 2, 3 et 4 avec ou sans domaine transmembranaire qui leur permet de s’ancrer dans les
membranes des différentes organelles. Ils sont classés selon le nombre de domaine qu’ils possèdent
ainsi que par leur fonction anti- ou pro-apoptotique. La présence du domaine BH4 confère la
propriété anti-apoptotique. En effet, les protéines de la sous famille des BAX oligomérisent pour
former un pore dans la membrane externe de la mitochondrie. L’oligomérisation est inhibée par la
séquestration des protéines BAX par les protéines de la famille des BCL2 (Gross and Katz, 2017).
50
La composition des différentes sous familles : des protéines anti et pro apoptotiques est récapitulée
dans la Figure 13. L’équilibre, qui existe entre les facteurs pro et anti-apoptotiques
mitochondriaux est finement régulé. Lors du clivage de BID, tBID déplace cet équilibre, entraîne
le MOMP et le relargage de facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux dans le cytosol comme le
cytochrome C (CytC), SMAC ainsi qu’AIF et ENDO-G. Le CytC favorise la formation de
l’apoptosome, une multimère composée d’APAF1 et de la pro-CASP9. Cet assemblage favorise
l’auto clivage de la CASP9, qui à son tour, clive les caspases effectrices 3 et 7. SMAC/DIABLO
est un inhibiteur de XIAP, eux même des inhibiteurs protéiques des caspases effectrices. AIF et
ENDOG sont des endonucléases qui transloquent directement dans le noyau pour y dégrader
l’ADN. De cette façon, la voie mitochondriale permet l’amplification du signal de mort dans les
cellules dites de type 2 et est requis pour induire l’apoptose dans ces cellules (Schwabe and
Luedde, 2018) (Figure 12). Les voies apoptotiques intrinsèques sont l’ensemble des voies qui
déclenchent l’apoptose par des mécanismes intracellulaires et incluent le stress du réticulum
endoplasmique, le stress oxydatif et le stress génotoxique. Dans le contexte de la NASH ces stress
résultent essentiellement d’une forte activité métabolique et sont déclenchés principalement par la
lipotoxicité et la glucotoxicité. Les lipides et dérivés lipidiques qui participent à la lipotoxicité
sont : les AG libres, la lysophosphatidylcholine (LPC), les céramides, le cholestérol libre (CL) et
certains acides biliaires. Les glucides impliqués dans la glucotoxicité sont majoritairement le
glucose et surtout le fructose. Ce dernier provient majoritairement du sirop de maïs, très utilisé
dans l’industrie agro-alimentaire. Le stress oxydatif est généré par les espèces réactives de
l’oxygène (Reactive oxygen specices (ROS)) qui sont de petites molécules de courte demi-vie,
formées à partir de la réduction partielle du dioxygène. Ce sont des molécules qui contiennent des
dérivés de l’oxygène comprenant des radicaux libres oxygénés très instables comme le superoxide
51
Figure 12. Schématisation simplifiée de l’apoptose induite par la voie des récepteurs de mort
La liaison d’un ligand à son récepteur de mort entraine la formation d’une plateforme de signalisation qui aboutit
au clivage de la pro-CASP8 en CASP-8 active. Cette protéase clive à son tour les CASP 3 et 7. Celles-ci activent
par clivage, des protéases, DNases et lipases qui permettent la dégradation d’éléments structurels indispensables
à la cellule. Ce signal de mort peut être amplifié par la voie apoptotique mitochondriale. cCASP8 clive BID
pour générer tBID qui déplace la balance anti-apoptotique / pro-apoptotique et favorise ainsi le Membrane
Outter Membrane Permeability. La perméabilisation de la membrane mitochondriale permet le relargage du
cytochrome C, lequel permet l’assemblage de l’apoptosome composé du CytC, d’APAF1 et de la pro-CASP9.
Cet assemblage permet l’auto-activation de la CASP9, qui à son tour active les CASP3/7. Le MOMP permet
également le relargage de SMAC, un inhibiteur des XIAP, des inhibiteurs endogènes des CASP3/7. Cette boucle
d’amplification permet de contrebalancer la signalisation de survie médiée par le TNFR1 qui requiert le
complexe RIPK1, TRADD et TAK1, qui phosphoryle IkBa favorisant ainsi sa dégradation et la translocation
du facteur de transcription NFkB qui active l’expression de gène anti-apoptotique comme c-FLIP ou les XIAP.
Adapté de Czabotar et al. (2014) et Schwabe and Luedde (2018)
52
Figure 13. Classification des protéines contenant des domaines BCL2 homology (BH)
Les protéines de la famille des BCL-2 sont regroupées selon leur capacité à activer ou inhiber
l’apoptose. L’ensemble de ces protéines est composé de domaines appelés BCL2 homology (BH)
et parfois d’un domaine transmembranaire. Adapté de Gross and Katz (2017)
53
(O2●-) ou le radical hydroxyl (OH●), qui peuvent être rapidement convertis en radicaux libres plus
stables comme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou l’acide hypochlorique (HClO). Ces ROS
présentent une toxicité cellulaire importante puisqu’ils provoquent une oxydation de l’ADN, des
protéines, des sucres et des lipides. Leur contrôle est assuré par un grand nombre de molécules et
d’enzymes anti-oxydantes à fort potentiel de réduction comme la glutathione (GSH), les
superoxide dismutases (SOD) ou encore la Catalase. Ces processus sont régulés par des voies de
signalisations transcriptionnelles orchestrées essentiellement par les facteurs de transcriptions
NRF2, NFkB et p53. Les ROS sont majoritairement produits par la mitochondrie dans les
différents complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale. Chez les sujets obèses présentant
une stéatose hépatique, la chaîne mitochondriale est fortement sollicitée par le catabolisme des
sucres et des AG. Chez ces patients, la respiration mitochondriale est en effet augmentée, sans
augmentation du stress oxydatif. En revanche, les patients atteints de NASH présentent une
altération de la capacité respiratoire avec une fuite de proton plus élevée. Cela, associé à une
diminution, des capacités antioxydantes conduit à l’augmentation du stress oxydatif (Koliaki et al.,
2015). Les AG eux-mêmes, peuvent également entraîner l’ouverture d’un canal mitochondrial de
la membrane externe, le VDAC, ce qui entraîne le MOMP et le relargage du CytC et de ROS. Le
CytC déclenche l’apoptose par l’assemblage de l’apoptosome et les ROS induisent indirectement
l’apoptose par la génération de dommages à l’ADN et l’activation d’un stress génotoxique. Ces
dommages sont reconnus par une machinerie spécialisée qui conduit à l’apoptose si la réparation
de l’ADN est impossible. Cela s’opère par l’activation de P53, qui active la transcription d’un très
grand nombre de gènes dont les gènes pro-apoptotiques PUMA et BAX. Le stress oxydatif joue
un rôle important dans la progression des complications hépatiques et est induit par de nombreux
facteurs dans le foie. En effet la beta oxydation des AG, l’altération du découplage mitochondrial,
54
la réponse immunitaire innée génèrent des ROS qui participent à la souffrance hépatique. Si les
approches thérapeutiques anti-oxydantes sont souvent prometteuses chez la souris, davantage
d’études sont requises pour démontrer leur bienfait chez l’Homme (Garcia-Ruiz and Fernandez-
Checa, 2018).
Le stress du réticulum endoplasmique est généré par une modification de l’homéostasie
calcique, protéique, par le stress oxydatif ou une modification de la composition lipidique et de la
fluidité des membranes. A court terme, le RE met en place une réponse adaptatrice qui vise à
rétablir l’homéostasie cellulaire nommée : Unfolded Protein Response (UPR). Les trois principaux
axes activés par l’UPR sont IRE-1α-XBP1, PERK-eIF2α et ATF6. En condition physiologique,
les protéines transmembranaires du RE, IRE1α, PERK et ATF6 sont liées à une protéine chaperone
intraluminal BIP. En condition de stress, qu’il soit protéique, calcique ou lipidique, BIP se dissocie
des protéines transmembranaires qui sont ainsi activées. Le rôle premier de ces voies est de
restaurer l’homéostasie du RE, via la transcription de gène codant pour des protéines impliquées
dans l’UPR, comme les protéines chaperones et les protéines de l’ERAD (le système de
dégradation des protéines du RE). Une activation soutenue de ces voies activent la transcription
de gènes pro-apoptotiques. En effet IRE-1α peut interagir avec TRAF2, ASK1 qui activent les
JNK. Ces kinases, ont une action pro-apoptotiques via l’activation du facteur de transcription c-
Jun/AP-1 qui contrôle notamment la transcription de PUMA, d’une part, et la phosphorylation
inhibitrice de BCL2 d’autre part. PERK, via la voie eiF2α et la traduction d’ATF4, active la
transcription de CHOP, un facteur de transcription pro-apoptotique, qui induit l’expression
notamment de BAX et inhibe celle de BCL2. ATF6, après clivage, active directement l’expression
de XBP1 et de CHOP (Figure 14). Enfin, le stress du réticulum endoplasmique entraîne un
relargage de Ca2+, ce dernier active directement les calpaïnes qui activent la CASP12 par clivage,
55
qui à son tour, active les caspases effectrices dont la CASP3. Le stress du réticulum endoplasmique
dans le foie apparaît avec l’obésité (Ozcan et al., 2004).
L’activation des caspases en particulier la caspase 3 est augmentée chez les patients
présentant une NASH et se traduit par l’augmentation du clivage de la K18 (Schneck et al., 2016).
L’absence de la caspase3, limite la progression des complications hépatiques dans le modèle
MCDD (Thapaliya et al., 2014). Des inhibiteurs des pan-caspases ont été développés comme
approche thérapeutique. Chez la souris, l’utilisation d’inhibiteurs pan-caspases comme l’IDN-
6556 et le VX-166 limitent la souffrance hépatique, l’inflammation et la fibrose dans les modèles
HFD et MCDD (Anstee et al., 2010; Barreyro et al., 2015). Chez l’Homme, ces molécules sont en
cours d’évaluation (phase II) et montrent déjà quelques résultats prometteurs (Shiffman et al.,
2019).
La nécrose, est morphologiquement définie par un gonflement de la cellule, une rupture de la
membrane plasmique, et la libération du matériel intracellulaire. Elle est par conséquent
immunogénique. Elle est considérée comme non régulée, est indépendante des caspases et associée
à des dysfonctions mitochondriales et une déplétion en ATP. Cependant, la nécrose est également
régulée au niveau mitochondrial, par les protéines effectrices. La dysfonction mitochondriale lors
de la nécrose, est typiquement induite par une ouverture prolongée du Mitochondrial Permeability
Transition Pore (MPTP), un canal cationique non sélectif de la membrane interne de la
mitochondrie. Son ouverture entraîne une dépolarisation de cette membrane et donc une perte du
gradient protonique qui permet la synthèse d’ATP et la production d’espèces réactives de
l’oxygène (ROS). La nécrose, dépendante de ce mécanisme peut cependant être inhibée par des
inhibiteurs de la Cyclophilin D qui régule l’ouverture du MPTP, par des inhibiteurs des JNK ou
56
Figure 14. Apoptose induite par le stress du réticulum endoplasmique
Lors d’un stress du RE soutenu, l’activation des trois senseurs du RE : IRE1α, PERK et ATF6 conduit à
l’activation de facteurs de transcription via l’épissage de XBP-1, la traduction d’ATF4 et le clivage d’ATF6
respectivement. Ces facteurs de transcriptions conduisent tous à l’activation de la transcription de CHOP, qui,
lui-même permet la transcription de gènes pro-apoptotiques comme DR5 ou PUMA. Parallèlement, IRE-1α
interagit avec TRAF2 lequel permet une signalisation dépendante de JNK qui aboutit à la dérégulation de la
balance des protéines anti- et pro-apoptotiques à la mitochondrie. Lors d’un stress soutenu, l’homéostasie
calcique est dérégulée, conduisant à un relargage de Ca2+ notamment via l’IP3R. Ce relargage de calcium
entraine la perturbation de l’homéostasie calcique mitochondriale et entraine le MOMP. Par ailleurs le Ca2+
active directement les calpaïnes qui vont cliver la pro-CASP12. Le MOMP, la cCASP12 ainsi que
l’augmentation de l’expression de protéines pro-apoptotiques par CHOP conduisent à l’apoptose médiée par
l’activation des CASP effectrices. Adapté de Lebeaupin et al. (2018)
57
encore par l’antioxydant N-acétylcystéine. Cela démontre donc que la nécrose est un processus
bien plus régulé qu’une simple mort accidentelle induite par des stimuli physico-chimiques.
La nécroptose est une voie de mort cellulaire qui partage les caractéristiques de l’apoptose
et de la nécrose. Elle est spécifique de la signalisation du TNFα qui est complexe et dont l’issue
est variable en fonction des plateformes de signalisation formées en aval du TNFαR1. On distingue
trois complexes de signalisation. La liaison du TNFα à son récepteur, entraîne le recrutement de
la protéine Receptor Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1), de TRADD via leur DED. TRADD
recrute TRAF2 ainsi que l’ubiquitine ligase cIAP1. cIAP ubiquitine RIPK1, ce qui conduit au
recrutement de LUBAC, de TAK1, TAB1/2 et IKKs (IKK1,2 et NEMO). IKK, une fois activée
par TAK1, phosphoryle IKBα, ce qui entraîne sa dégradation et la libération de NFκB. Ce dernier
transloque dans le noyau et active la transcription de gènes de l’inflammation comme des cytokines
ou des récepteurs inflammatoires, mais également des gènes anti-apoptotiques tels que cFLIP.
L’absence de formation ou d’activation de ce complexe se traduit par la formation du complexe
II, qui lui induit la mort par apoptose ou par nécroptose. RIPK1 joue un rôle crucial dans les
complexes I et II en tant que protéine adaptatrice et que kinase. Ces deux rôles sont en effet
dissociés puisque, alors que les souris RIPK1-/- meurent dans les trois jours après leur naissance,
les souris knock-in RIPK1 kinase-dead sont viables. Dans le foie, l’absence de RIPK1 dans les
cellules de la fraction parenchymateuse aggrave l’atteinte hépatique en réponse à la concanavaline
A. Cependant, ces atteintes sont dimunuées dans les souris RIPK1 kinase dead (Filliol et al., 2016).
On distingue 3 types de complexe II. Le complexe IIa correspond à la formation du DISC, décrit
précédemment, et ne contient pas RIPK1. Le complexe IIb ou riptosome, inclut RIPK1, FADD, la
CASP8 et c-FLIP. Ce complexe conduit à l’apoptose par activation de la caspase 8 et dépend de
l’activité kinase de RIPK1. Enfin, le complexe IIc ou nécrosome, se forme à partir du complexe
58
IIb, en l’absence ou par inhibition de la CASP8 et l’activation parallèle de RIPK1 (Figure 15)
(Schwabe and Luedde, 2018). Ce dernier interagit alors avec RIPK3 qui s’oligomérise et s’auto-
phosphoryle. Il active alors la MLKL par phosphorylation, laquelle oligomérise à son tour, et
transloque à la membrane plasmique ou les oligomères forment un pore, qui entraîne la lyse de la
cellule. Cette voie de mort est encore peu caractérisée. En effet, MLKL est la seule protéine
effectrice connue de cette voie à l’heure actuelle. De la même façon, les conditions d’activation de
cette voie, c’est-à-dire les conditions physio-pathologiques dans lesquelles la CASP8 est inhibée,
sont encore indéterminées. De façon intéressante, la nécroptose pourrait être déclenchée par
RIPK3 directement, de façon indépendante de RIPK1 (Roychowdhury et al., 2013), mais les
conditions physiologiques de cette activation sont encore peu connues. De plus, l’expression de
RIPK3 est augmentée dans le foie de patients NASH ainsi que dans les différents modèles murin
de NASH. Cependant, le phénotype des souris Ripk3-/- diffère selon le modèle utilisé ce qui suggère
que cette kinase possède de nombreux rôles dans différents types cellulaires et l’utilisation de
modèles d’invalidation spécifiques à un type cellulaire, apporterait davantage d’information non
seulement dans sa contribution à la nécroptose ou éventuellement à d’autres processus comme la
stéatose et l’insulino-résistance (Dara, 2018). Enfin, les marqueurs spécifiques de la nécroptose ne
sont pas bien définis et peu d’outils sont disponibles, ce qui rend son évaluation en particulier chez
l’Homme, difficile.
La pyroptose est une voie de mort « inflammatoire ». En premier lieu, elle permet la
sécrétion de cytokines pro-inflammatoire comme l’IL1-β et l’IL-18 aussi bien par les cellules de
l’immunité innée que par les cellules épithéliales (e.g. intestinales et hépatiques). Elle cause
également la mort de la cellule par lyse cellulaire, et permet de cette façon d’amplifier
l’inflammation. D’abord décrite dans les cellules immunitaires lors d’une réponse anti-
59
Figure 15. Schématisation de différentes issues des signaux de mort via leurs complexes de signalisation
Suite à la liaison du TNFα à son récepteur, plusieurs types de complexes de signalisation peuvent se former.
Chaque complexe conduit à des signalisations différentes. La signalisation médiée par le complexe I est une
signalisation de survie, relayée par le facteur de transcription NFkB, Lorsque cette signalisation est défectueuse,
le complexe II se forme et conduit à la mort de la cellule par apoptose. Le complexe IIa, aboutit au clivage de
la caspase 8 via les protéines du DISC composé de TRADD et FADD. Le complexe IIb, conduit également à
l’apoptose et l’activation de la caspase 8 via le riptosome composé de RIPK1 et de RIPK3. La caspase 8 une
fois active inhibe la formation du complexe III et la nécroptose. Cependant lorsque la caspase 8 est inhibée, par
FLIP par exemple, le complexe III ou nécrosome, composé par FADD, RIPK1 et des oligomères de RIPK3, se
forme. RIPK3, peut alors phosphoryler MLKL qui s’oligomérise, se localise à la membranne et entraine la
perméabilisation de la membranne plasmique ainsi que la mort de la cellule par nécroptose. TRADD : Tumor
necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein, FADD : Fas-associated protein with death
domain, RIPK: Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, MLKL: Mixed Lineage domain-Like
protein, DISC: Death inducing signaling Complex Extrait de Schwabe and Luedde (2018)
60
bactérienne, la pyroptose, contrairement à l’apoptose, fait intervenir les CASP 1 et 11 chez
la souris, et les CASP 1, 4 et 5 chez l’Homme. Elle est activée par des récepteurs Pattern
Recognition Receptors (PRR) qui regroupent un ensemble de récepteurs dont les TLR et les NLR
qui reconnaissent des signaux extra- et intra-cellulaires représentant une menace infectieuse (les
Pathogens Associated Molecular Pattern (PAMP)) ou des signaux, dits stériles, issus des cellules
hôtes lésées (les Danger Associated Molecular Pattern (DAMP)). L’inflammasome est un
complexe multiprotéique qui comprend un senseur, spécifique d’un ou plusieurs ligands, d’un
adaptateur ASC ou NLRC4 et une pro-CASP inflammatoire 1 et 11 chez la souris ou 1 et 4/5 chez
l’Homme (Szabo and Petrasek, 2015). La liaison des PAMP ou DAMP aux senseurs de
l’inflammasome, entraîne l’assemblage de l’inflammasome et de son oligomérisation. Cela permet
l’activation des pro-caspases inflammatoires en caspases inflammatoires par auto-clivage. Les
caspases actives, entraînent la maturation et la sécrétion des interleukines pro-inflammatoires IL-
1β et IL-18. Cependant, les pro-caspases 11 chez la souris et 4/5 chez l’Homme peuvent
s’oligomériser et s’activer par reconnaissance directe du LPS, en l’absence de PRR et de molécule
adaptatrice (voie non canonique) (Figure 16). Enfin, ces caspases ont également pour substrat la
Gasdermin (GSDMD). Une fois clivé, le domaine N-terminal de la GSDMD (GSDMD-N), se lie
aux phosphoinositides de la membrane plasmique et s'oligomérise pour former un pore (Shi et al.,
2017). La formation de ce pore permet d’une part la sortie des formes matures de l’IL-1β, de l’IL-
18 et d’autre part entraîne la lyse de la cellule. Dans la NASH, la pyroptose et la détection du
fragment GSDMD-N sont augmentés chez l’Homme et corrèlent avec le score NAS, cependant la
spécificité de l’anticorps utilisé reste débattue. Les souris Gsdmd-/- présentent une plus faible
atteinte hépatique ainsi qu’une inflammation et une stéatose hépatique diminuées après un régime
MCD. A l’inverse, sa surexpression dans les hépatocytes aggrave la pathologie (Xu et al., 2018).
61
Figure 16. Activation canonique et non canonique de la pyroptose
Les senseurs canoniques de l’inflammasome détectent divers signaux microbiens et activent la caspase
1 via ASC ou NLRC4. La caspase 1 clive les pro-IL1β et pro-IL-18. La voie non canonique d’activation
de l’inflammasome passe par une activation directe de la caspase 11 (souris) et caspases 4/5 (Homme).
Ces deux voies aboutissent au clivage de la Gasdermine D, et ses fragments N-terminaux s’
oligomérisent, se localisent à la membrane plasmique pour former un pore. Ce pore permet la libération
des formes matures des IL1β et IL-18 et entraine également des mouvements d’eau qui entrainent la lyse
de la cellule. Extrait de Shi et al. (2017)
62
Cependant, le mécanisme exact et le rôle de la pyroptose dans les différents types cellulaires dans
le cadre de la NASH sont encore flous.
Le système immunitaire dans le foie
Le foie est un organe immunitaire à part entière. En effet, en plus de son rôle de sécrétion
des protéines de la phase aiguë de l’inflammation et des protéines du complément, il joue un rôle
crucial d’immuno-surveillance en filtrant le sang veineux et artériel, évitant ainsi la dissémination
bactérienne. On retrouve au niveau hépatique les cellules de l’immunité innée qui regroupent les
monocytes/macrophages qui comprennent les cellules de Kupffer, les granulocytes
(majoritairement les neutrophiles et les éosinophiles) qui sont issues de la lignée myéloïde
(Krenkel and Tacke, 2017). Les Innate Lymphoïd Cells (ILC) sont des lymphocytes qui ne
possèdent pas de T cell Receptor (TCR), et regroupent les cellules Natural Killer, les ILC1, ILC2
et les ILC3 (Klose and Artis, 2016). Enfin, les cellules dendritiques (DC), spécialisées dans la
présentation des antigènes, font également partie de l’immunité innée et dérivent de progéniteurs
à la fois lymphoïdes et myéloïdes (Heymann and Tacke, 2016). L’immunité adaptatrice regroupe
les lymphocytes B et T qui possèdent un récepteur spécifique d’un antigène (BCR et TCR,
respectivement). Les lymphocytes T contiennent les αβTCR CD4+, les αβTCR CD8+ cytotoxiques.
Enfin, des cellules qui possèdent à la fois des propriétés de l’immunité innée et adaptatrice sont
également retrouvées dans le foie : les Mucosal Associated Invariant T cells (MAIT), les
lymphocytes γδTCR et les invariant NK αβTCR (iNKT)(Hammerich and Tacke, 2014). Les
cellules non-immunes comme les cellules endothéliales hépatiques (LSEC), les cellules stellaires
hépatiques (HSC) et les hépatocytes, jouent également un rôle crucial dans l’immunologie du foie
et le développement de l’inflammation dans la NASH (Shetty et al., 2018). Le foie contient la plus
large population de macrophages (majoritairement les cellules de Kupffer), de cellules NK, NKT
et le plus grand réseau réticulo-endothélial de l’organisme (Jenne and Kubes, 2013). Dans ce
63
réseau, le flux sanguin est très faible, ce qui, non seulement facilite les échanges métaboliques,
mais également la captation d’antigènes et de microbes dans le sang. C’est un organe fréquemment
exposé aux antigènes bactériens et alimentaires intestinaux à faible dose. Par conséquent,
l’environnement immunitaire hépatique est tolérogène, ce qui permet la tolérance orale et la
tolérance aux endotoxines. Les endotoxines, qui font parties des Pathogen Associated Molecular
Pattern (PAMP) et sont des composés bactériens ou toxines bactériennes qui peuvent être
reconnues par des récepteurs de l’immunité innée. Ces récepteurs, appelés Pattern Recognition
Receptors (PRR), sont exprimés à la fois par les cellules immunitaires innées, les cellules
épitheliales. Parmis les PRR figurent les Toll Like Récepteur (TLR). La tolérance antigénique est
induite par de nombreux mécanismes qui incluent par exemple la faible expression des molécules
de CMH de classe II ainsi que des molécules co-stimulatrices par les cellules présentatrice
d’antigène (CPA), l’expression forte de molécules modulatrices comme PD-L1 à la surface des
LSEC et des hépatocytes, ou encore la production de cytokines régulatrices comme l’IL-10 et le
TGF-β par les CPA (KC, LSEC, DC et LB). En conséquence, les populations de cellules
immunitaires hépatiques présentent des polarisations dites anti-inflammatoires (M2, Th2 et Treg)
(Kubes and Jenne, 2018).
Inflammation hépatique dans la NASH
La NASH est associée à une modification de la réponse immunitaire hépatique qui, de
façon extrêmement dynamique et plastique, passe d’une réponse majoritairement tolérogène à une
réponse inflammatoire, délétère pour les hépatocytes gras (Gao and Tsukamoto, 2016).
Dans la NASH, des facteurs intra hépatiques comme les stress métaboliques et la mort
cellulaire, ainsi que des facteurs extra-hépatiques comme les produits bactériens intestinaux,
participent à la mise en place de l’inflammation dite stérile. Cette inflammation reflète une
64
activation du système immunitaire en l’absence d’infection ou de développement tumorale. Parmi
les facteurs extra-hépatiques, la dysbiose intestinale correspond à un déséquilibre de la
composition en microorganismes dans le tractus digestif. Le microbiote intestinal est un
écosystème composé de bactéries, d’archées, de protistes, de champignons et de virus qui
colonisent le tractus digestif et interagissent de façon dynamique avec l’hôte. Ce microbiote est
complexe et variable puisqu’il dépend de très nombreux paramètres inhérents à l’hôte comme son
système immunitaire, son alimentation, son activité physique, la prise médicamenteuse et l’horloge
circadienne (Belkaid and Harrison, 2017; Honda and Littman, 2016; Thaiss et al., 2016). Bien que
les Eukarya, Archea et les virus soient bien présents dans le microbiote intestinal, leur rôle dans la
physiologie et la pathologie humaine n’ont été que très peu étudiés. Par conséquent, les
nombreuses études sur la manipulation du microbiote intestinal ne tiennent pas toujours compte
des effets éventuels du changement de l’écosystème (diversité des virus, phage et champignons)
dans les niches intestinales (différents segments du tractus intestinal). Le microbiote bactérien
participe activement à la digestion des aliments, facilite leur absorption et produit des cofacteurs
essentiels comme la vitamine K1 (Schroeder and Backhed, 2016). Il interagit également
activement avec le système immunitaire intestinal et participe à l’élaboration d’un répertoire
antigénique, via la reconnaissance des antigènes, la sélection, la prolifération, et l’acquisition de
propriétés effectrices des cellules immunitaires (Abt and Artis, 2009 ; Honda and Littman, 2016 ;
Ivanov et al., 2008 ; Rosshart et al., 2019; Rosshart et al., 2017). Ces bactéries ont aussi un impact
à distance du tractus digestif notamment via la production de métabolites (e.g. alcools, AG à courte
chaine) retrouvés dans la circulation sanguine (Canfora et al., 2015).
Les modifications du microbiote bactérien intestinal ont été associées au développement
de l’obésité et de l’IR. En effet, les souris rendues axéniques par traitement antibiotique
65
dépourvues de tout microbiote, ont une adiposité réduite et sont protégées contre l’obésité et l’IR
induite par un régime riche en graisse (Backhed et al., 2007; Cani et al., 2008 ; Membrez et al.,
2008). Le phénotype est restauré deux semaines après recolonisation des souris GF, ce qui prouve
l’implication du microbiote dans le développement des désordres métaboliques (Turnbaugh et al.,
2006). De plus, le transfert du microbiote d’une souris obèse à une souris mince, augmente
l’obésité induite par un régime HFD chez la souris receveuse (Turnbaugh et al., 2006). Malgré la
variabilité inter individuelle du microbiote intestinal, certains phyla sont associées à l’obésité et
aux NAFLD comme les Proteobactericeae, les Enterobacteriaceae, les Bacteroides qui sont plus
abondantes dans les féces des patients obèses atteints de NALFD et de NASH comparés à des
patients minces, sans complication hépatique (Boursier et al., 2016; Zhu et al., 2013 ). Ce
déséquilibre de la flore intestinale a de nombreuses conséquences qui incluent : une inflammation
(Canfora et al., 2015) intestinale, une altération de la perméabilité intestinale et l’élévation de la
quantité d’antigènes bactériens dans la circulation portale ainsi qu’un déséquilibre de la production
des métabolites bactériens. En effet, chez l’Homme, la NASH est associée à une perméabilité
intestinale accrue, et une diminution de l’expression des molécules d’adhésion de l’épithélium
intestinal (Luther et al., 2015; Miele et al., 2009). L’augmentation de la perméabilité intestinale
aggrave considérablement les complications hépatiques. Expérimentalement, dans un modèle
murin de NASH induit par un régime riche en graisse et en sucre, l’altération de la perméabilité
intestinale chez les souris Jama-a-/-, dont les jonctions épithéliales intestinales sont fragilisées, ou
par l’administration de Dextran Sodium Sulfate (DSS) augmente la quantité de LPS portale et
aggrave la stéatohépatite (Gabele et al., 2011; Rahman et al., 2016). La diminution de la proportion
de certains phyla importants pour la production de métabolites comme les acides gras à courtes
chaînes (SCFA) ou le métabolisme des acides biliaires, a également un impact direct sur le
66
métabolisme de l’hôte. La sous-représentation de ces bactéries participe au développement de
l’obésité et des NAFLD. En effet, des molécules comme les SCFA ont des rôles physiologiques
locaux ou distants en se liant à des RCPG. Ils permettent une diminution du stockage des graisses
et favorisent l’utilisation de l’énergie dans le foie et le muscle (Schroeder and Backhed, 2016). Le
bénéfice des probiotiques et des prébiotiques qui visent à modifier la composition du microbiote
intestinal sont prometteurs. Cependant il faut noté que ces intervention ont des effets transitoires
et requierts par conséquent des traitements ou des interventions chroniques (Kootte et al., 2017).
De même, l’injection de dérivés bactériens comme les AG à courte chaîne pourraient améliorer
légèrement l’IR (Canfora et al., 2015; Ding et al., 2019; Schroeder and Backhed, 2016).
En plus de l’élévation de la concentration des endotoxines dans le sang veineux portal, les
cellules immunitaires du foie sont exposées à un grand nombre de signaux de danger intra-
hépatiques que sont les DAMP également appelés alarmines. Ce sont des structures cellulaires ou
cytokines détectées par des récepteurs spécifiques. Le relargage de DAMP dans le milieu extra-
cellulaire est très dépendant de la souffrance hépatique (e.g. la nécrose, la nécroptose ou la
pyroptose abordées précédemment). Ces DAMP peuvent également être excrétés par des cellules
en souffrance, par l’augmentation de leur synthèse et de leur sécrétion. Les DAMP signalent donc
une atteinte de l’intégrité de la structure parenchymateuse ou des stress cellulaires sublétaux. Ces
molécules incluent des molécules comme l’ATP, HMGB1, des composants de la matrice extra-
cellulaire comme le hyaluronan de bas poids moléculaire (LMW-HA), le fibrinogène ou la
tenascine C ou encore l’IL-33 (Arshad et al., 2012; Gong et al., 2019). La reconnaissance de ces
molécules par leurs récepteurs active la production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires
dans les cellules immunitaires, les hépatocytes et les HSC, favorise la mise en place de
l’inflammation. Dans le cas de la NASH, cette inflammation consiste en (i) l’activation des cellules
67
innées et adaptatrices, la production de cytokines pro-inflammatoires, la reconnaissance et
l’élimination des cellules en souffrance ou mortes (ii) le recrutement au site de l’inflammation de
cellules périphériques de l’immunité innée et adaptatrice. Cela s’opère par la sécrétion de
cytokines, chimiokines et l’expression de molécules d’adhésion au site de l’inflammation. Enfin
(iii) l’activation du système de cicatrisation qui consiste en une phase de fibrogenèse et la synthèse
importante de collagène, suivie d’une phase de résolution et d’élimination des cellules pro
inflammatoires. Dans la NASH, les stress cellulaires répétés favorisent la fibrogenèse au détriment
de la phase de résolution et par conséquent, la progression de la pathologie vers une NASH
fibrosante (Elpek, 2014).
Les cellules de l’immunité innée sont activées par leur récepteurs PRR et cytokiniques. Les
cellules de Kupffer sécrètent entre autres les chimiokines CCL2 et Granulocyte Macrophage
Stimulating Factor (GM-CSF) qui permet la production, le recrutement et la différenciation de
cellules innées comme les neutrophiles et les monocytes qui expriment CCR2 (Baeck et al., 2012;
Nam et al., 2017) (Figure 17). La polarisation de ces cellules passe du statut M2, anti-
inflammatoire à celui de M1, pro-inflammatoire. Elles produisent alors, par exemple, de l’IL-1 β
et du TNFα. Les ILC qui sont des cellules résidentes du foie, sont activées par le milieu cytokinique
environnant et les PRR. Ce sont des cellules très plastiques, capables de trans-différenciation, qui
partagent des similarités transcriptionnelles avec les cellules T (Vivier et al., 2018). Les ILC
prédominantes dans le foie sont les ILC1 et les NK et expriment des récepteurs activateurs et
inhibiteurs qui contrôlent, en partie, leur activité et leur réponse. Elles produisent de l’IFNγ, du
TNFα, de l’IL2, du GM-CSF et des granules lytiques contenant les perforines et les granzymes qui
tuent les cellules en souffrance (Figure 17) (Luci et al., 2019). Le rôle exact des cellules
dendritiques dans la NASH est peu compris. De nombreuses cellules du foie sont des CPA (KC,
68
Figure 17. Mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation hépatique
L’ensemble des cellules immunitaires intra-hépatiques sont en premier lieu activées par des signaux de danger
sub-léthaux (exovésicules, DAMPS, cytokines), des métabolites (AG, choestérol), des PAMPS issus de l’intestin.
La mort des hépatocytes gras entraine le relargage de DAMPS qui vont activer les cellules immunitaires innées.
La sécrétion de chimiokines par les cellules résidentes du foie, permet le recrutement d’un ensemble de cellules
immunitaires (neutrophiles, monocytes, lymphocytes, NK). L’ensemble de ces cellules vont exprimer et/ou
sécréter des molécules pro-inflammatoires, profibrosantes favorisant ainsi, la mort des hépatocytes gras et la
progression vers la fibrose. IL : Interleukin, TNF : Tumor necrosis Factor, CCL : C-C Motif Chemokine Ligand
2, GM-CSF: Granulocyte-monocyte stimulating factor, CMH: Complexe majeure d’histocompatibilité, ROS :
Reactive Oxygen species, MMP : Matrix Metallo-Protease, PAMPS : Pathogen Associated Molecular Pattern,
DAMPS : Danger Associated Molecular Pattern, Th : T helper, MAIT: Mucosal associated invariant T Cells,
NKT: TCR expressing Natural Killer, NK: Natural Killer, ILC: Innate Lymphoïd cells, KC: Kupffer cells, DC:
Dendritic cells, LSEC: Liver Sinusoid Endothelial cells. Adapté de Cai et al. (2019)
69
DC, LSEC, HSC) et participent donc à l’orientation de la réponse immunitaire (Bernsmeier
and Albano, 2017; Crispe, 2011; Kubes and Jenne, 2018). Ces cellules, participent à la polarisation
des cellules T CD4, qui reconnaissent des antigènes présentés à des molécules de CMH-II, et
présentent majoritairement une polarisation Th1 et Th17 pro-inflammatoire dans la NASH. Ces
cellules produisent de l’IL2, de l’IFNγ et de l’IL-18 (Th1), de l’IL-17A et F ainsi que de l’IL-23.
Les lymphocytes T CD8 cytotoxiques reconnaissent des antigènes associés à des molécules de
CMH-I, et tuent les hépatocytes fragilisés. Elles produisent principalement des granules lytiques
et de l’IFNγ (Van Herck et al., 2019) (Figure 17). Le rôle des cellules à récepteur T non
conventionnelles, les iNKT et les lymphocytes T γδ est peu compris dans la NASH. Il a été
récemment montré que les Mucosal Associated Ivariant T-cells (MAIT) jouent un rôle délétère
principalement par la production d’IL17A et de cytokines pro-inflammatoires (Kurioka et al.,
2016; Toubal et al., 2019). Ces cellules peuvent reconnaître plusieurs types d’antigènes dont des
glycolipides présentés par la molécule CD1d. Les iNKT et les MAIT sécrètent de l’IL17, de l’IFNγ
et de l’IL2. Enfin les LSEC, jouent un rôle clé dans l’activation et le recrutement des cellules
immunitaires. Elles sont activées par les PRR, sécrètent du TNFα, de l’IL-1β et expriment des
molécules d’adhésion comme V-CAM1, I-CAM1 et la E-selectin (Figure 17) (Shetty et al., 2018).
L’hépatocyte lui-même joue aussi un rôle central dans la mise en place de l’inflammation
hépatique. En effet, il est activé par des signaux inflammatoires et métaboliques qui conduisent à
des stress et à la mort cellulaire. En plus des DAMP, les hépatocytes stréssés sécrètent de l’IL-1β,
de l’IL-18, de l’IL-6, et du TNFα (Zhou et al., 2016). L’inflammation hépatique, la souffrance et
la mort hépatocytaire activent simultanément les cellules stellaires, lesquelles se dédifférencient
en myofibroblastes (αSMA+) et participent au remodelage de la matrice extra-cellulaire. Parmi les
signaux activateurs, on retrouve les PAMP et les DAMP, des adipokines comme la leptine, mais
70
également des cytokines comme l’IL-17 et le TGF-β qui est indispensable à leur activation (Seki
et al., 2007; Tsuchida and Friedman, 2017). Ainsi, au cours de l’obésité, les facteurs extra- et intra-
hépatiques participent au changement du niveau d’activation du système immunitaire. Le foie
passe progressivement d’un état tolérogénique à un état pro-inflammatoire ce qui entraîne
l’aggravation des complications hépatiques. Un cercle vicieux se met alors en place, la mort des
hépatocytes active l’inflammation et l’inflammation favorise la mort des hépatocytes gras.
Synthèse des mécanismes physiopathologiques
Pour récapituler, l’IR induit une lipolyse du TA et un relargage d’AG libres dans la circulation
portale qui favorise leur stockage ectopique (foie, muscle). Ces acides gras, en majorité, sont captés
par les hépatocytes, estérifiés en TG et stockés sous forme de gouttelettes lipidiques (Figure 18).
L’IR hépatique favorise également l’augmentation de la néoglucogenèse et de la lipogenèse qui
augmente le contenu hépatocytaire en AG et en glucose. A long terme s’installent une glucotoxicité
et une lipotoxicité qui entraînent une chronicité des stress oxydatif et du réticulum endoplasmique,
qui conduisent à la mort des hépatocytes (Figure 18). La souffrance et la mort des hépatocytes par
nécrose, pyroptose et apoptose, activent le système immunitaire hépatique (corps apoptotique,
DAMP). Outre ces facteurs intra-hépatiques, l’obésité est aussi associée à une modification du
microbiote intestinal, à une altération de l’inflammation intestinale et à l’augmentation de sa
perméabilité. En conséquence, de nombreux produits bactériens (PAMP) affluent vers le foie et
activent le système immunitaire hépatique déjà pré-activé dans le contexte de l’obésité. Parmi les
facteurs extra-hépatiques figure aussi la sécrétion d’adipokines (comme la leptine), qui ont des
actions directes sur les cellules immunitaires innées et les HSC (Figure 18) (Kaplan, 1998). Ces
facteurs intra- et extra- hépatiques incluent des changements de polarisation des macrophages et
des lymphocytes dans les profils M1, Th17 et Th1 pro-inflammatoires et la production de cytokines
pro-inflammatoires (Figure 18). Le système immunitaire ainsi activé par divers mécanismes
71
incluant la sécrétion de médiateurs ou l’engagement de récepteurs, entraîne l’élimination des
hépatocytes en souffrance. Ces mécanismes participent à long terme à l’activation des cellules
stellaires, leur trans- différenciation et le remodelage de la matrice extracellulaire qui constituent
des étapes précoces de la fibrose hépatique (Figure 18).
Figure 18. Schéma récapitulatif des mécanismes physiopathologiques intra- et extra-hépatiques qui
participent au développement de la NASH
72
e. Traitement de la NASH.
Aucun traitement pharmacologique n’est actuellement disponible pour le traitement de la
NASH (Konerman et al., 2018). Les stratégies thérapeutiques de la NASH visent à agir sur
différents aspects clés dans la physiopathologie qui sont : le métabolisme et la lipotoxicité, la mort
cellulaire, l’inflammation, la fibrose hépatique (développés précédemment). La NASH est une
pathologie complexe, dont la prévalence explose dans les pays industrialisés et en voie de
développement. La NASH représente la seconde indication de transplantation hépatique (aux
USA) (Younossi et al., 2016) et favorise le développement des maladies cardio-vasculaire
(Francque et al., 2016). Cela fait de cette pathologie un problème de santé publique et un grand
centre d’intérêt pour la recherche bio-médicale. De nombreuses découvertes sur ces pathologies
ont permis d’identifier certains mécanismes majeurs et des cibles thérapeutiques potentielles qui
visent les grands axes des pathologies (métabolisme, axe intestin-foie, mort cellulaire,
inflammation). L’ensemble de ces traitements sont récapitulé dans la Table 6 et ne seront pas
développés davantage pour des raisons synthétiques Cependant, très peu d’essais cliniques
s’avèrent parfaitement efficaces. Les modèles précliniques pour l’étude de la NASH sont-ils de
bons modèles ? Au vu de la complexité de cette pathologie, des combinaisons de thérapies qui
viseront différents axes seront sans aucun doute développées dans un futur proche. Enfin, la grande
majorité de cibles visées étant des cibles qui sont très dynamiques et souvent rythmiques, des
approches de chronothérapies pourraient par conséquent être envisagées.
73
Table 6 . Molécules en essai clinique pour le traitement de la NASH
Extrait de (Tacke and Weiskirchen, 2018)
Therapeutic
target Mechanism Compound Company Clinical trial phase
Metabolism
FXR agonism Obeticholic acid Intercept III
FXR agonism Tropifexor
GS-9674/
Novartis
Gilead II
FXR agonism
FXR/TGR5 AKN-083/ INT-767 Allergan / Intercept I/II
Bile acid / fatty acid
conjugate Aramchol Galmed II
PPARα/δ agonism Elafibranor Genfit III
PPARα/γ agonism Saroglitazar Zydus II
PPARα/γ/δ agonism Lanifibranor Inventiva II
Recombinant FGF-21 BMS-986036 BMS II
GLP-1 agonism Liraglutide,
semaglutide Novo Nordisk II
THR-β agonism MGL-3196 Madrigal II
THR-β agonism VK-2809 Viking Therapeutics II
ACC inhibition GS-0976 Gilead II
ACC inhibition PF-05221304 Pfizer I/II
Gut-liver axis engineered FGF19
analogue NGM282 NGMBio II
Inflammation
CCR2/CCR5
inhibition Cenicriviroc Allergan III
AOC3 inhibition BI 1467335 Boehringer II
Galectin 3 inhibition GR-MD-02 Galectin Therapeutics I
74
1.3. Modèles expérimentaux de NAFLD
Un grand nombre de modèles expérimentaux animaux existent pour l’étude des NAFLD et
chacun présente des avantages et des inconvénients. Il n’existe pas de modèle qui récapitule
complètement, à lui seul, les caractéristiques humaines de la NASH. La difficulté du modèle
animal est de pouvoir reproduire à la fois les complications métaboliques et l’ensemble du spectre
des complications hépatiques allant de la stéatose hépatique à la fibrose et l’hépatocarcinome Les
espèces animales les plus utilisées sont les rongeurs, souvent de fond génétique C57BL/6 pour les
souris et Wistar et Sprague Dawley, pour les rats. Ces fonds génétiques présentent une
prédisposition au développement de l’obésité, du diabète de type 2 et des NAFLD (Kohli and
Feldstein, 2011 ; Takahashi et al., 2012). Ci-dessous, seuls les modèles nutritionnels et génétiques
les plus fréquents dont certains sont évoqués dans les parties suivantes seront développés.
L’ensemble des modèles d’étude est listé dans la Table 7.
a. Modèles nutritionnels
Régimes riches en graisse (High fat diet (HFD))
Les régimes riches en graisse englobent un grand nombre de régimes qui contiennent une
forte quantité, souvent majoritaire, de graisses allant de 45 à 75% (Jacobs et al., 2016). Dans ces
modèles, l’obésité se développe chez la souris après environ 10 semaines de régime. Ces souris
présentent une résistance à l’insuline et une dyslipidémie. Une fibrose minime peut être observée
après 36 à 50 semaines de régime. Le régime HFD a pour inconvénient d’être de durée longue et
variable selon l’espèce, la souche de souris et l’environnement sanitaire de l’animalerie.
De nombreuses variantes de ce régime sont également utilisées et consistent en
l’enrichissement en sucrose (HFHSD ou Western Diet (WD)) ou fructose (HFHFD), retrouvé en
forte concentration dans l’alimentation des individus obèses. Le régime HFHFD comparé au
75
régime HFD induit une prise de poids plus rapide à 8 semaines de régime et une augmentation de
l’inflammation hépatique à 16 semaines mais n’induit pas de transaminases circulantes plus
importantes (Sellmann et al., 2015). Pour le régime HFHSD, à la différence des transaminases plus
élevées après 15 semaines, les mêmes résultats sont observés (Ishimoto et al., 2013). Une autre
variante du régime HFD est l’association de ce régime à une déficience en choline (CD-HFD) qui
permet le développement de tout le spectre des NAFLD avec le développement d’une obésité et
des complications métaboliques observées avec l’obésité (Ikawa-Yoshida et al., 2017).
Régime déficient en méthionine et choline (MCDD)
Le régime MCDD est un des régimes les mieux décrits en tant que modèle d’étude des
NAFLD. Ce régime contient une composition en sucrose (40%) et en graisses (10%) plus élevée
qu’un régime standard (7% et 3%, respectivement). L’absence de choline conduit à une
modification des fluidités membranaires et des gouttelettes lipidiques et la diminution de l’export
des VLDL (Rinella et al., 2008). La déficience en méthionine entraîne une perturbation des voies
de synthèse des homocystéines, de la gluthathione et de la phosphatidylcholine. Ces perturbations
conduisent à une stéatose hépatique, à l’augmentation du stress oxydatif, à la mort hépatocytaire,
à l’élévation des transaminases circulantes, au développement d’une inflammation hépatique
importante (présence de foci inflammatoires intra-hépatiques) et le développement de la fibrose.
Ce modèle reproduit l’ensemble des caractéristiques histopathologiques de la NASH retrouvées
chez l’Homme. Cependant, il ne reproduit pas le contexte métabolique observé au cours
del’obésité. Un des grands avantages de ce modèle est le développement rapide et progressif des
différents stades des complications hépatiques : après 2 semaines, apparition de la stéatose
hépatique ; après 7 semaines développement de la fibrose hépatique (Stephenson et al., 2018)..
76
Régime déficient en Choline et défini en L-Acides Aminés CDAA
Ce régime est similaire au régime MCDD puisqu’il est également déficient en choline.
Cependant, les protéines du régime CDAA, sont remplacées par une mixture de L-acides aminés
incluant la méthionine. Ce régime reproduit les mêmes atteintes que le régime MCDD dans une
période de temps plus longue (6 semaines à 22 semaines), mais induit une prise de poids et une
faible résistance à l’insuline (Zhong et al., 2019).
b. Modèles génétiques
Les modèles génétiques d’obésité et de stéatose hépatique les plus utilisés sont les souris
Ob/Ob et Db/Db, qui possèdent une mutation naturelle pour le gène de la leptine et un de ses
récepteurs respectivement. La leptine agit au niveau central dans les centres de l'appétit de
l’hypothalamus et a une action anorexigène. Elle est couramment nommée hormone de la satiété.
Les souris dépourvues de cette hormone ou de son récepteur sont par conséquent hyperphages et
développent une obésité et une perturbation des paramètres métaboliques dès l'âge de 3-4
semaines. Ces souris développent une stéatose hépatique mais pas de NASH sous régime contrôle
(Febbraio et al., 2019). Le challenge de ces souris par des régimes comme le HFD, MCD, CDAA
ou encore l’injection de LPS ou de CCL4 (qui provoque une forte hépato-toxicité) est requis pour
induire une NASH.
c. Combinaisons de modèles
Enfin, de nombreux modèles, qui ne sont pas des modèles de NASH, permettent cependant
de comprendre et de disséquer les mécanismes inflammatoires ou de mort cellulaire. Ces modèles
incluent les injections aiguë ou chronique d’agent bioactifs comme le LPS, le TNFα, le D-
Galactosamine, la concanavaline A, sFas-L, le CCl4 ou encore le DEN (Febbraio et al., 2019).
77
2. Biologie des rythmes circadiens
2.1. Evolution et pertinence de l’horloge circadienne
Depuis 4.54 milliards d’années, la terre tourne sur elle-même générant ainsi une alternance
entre le jour et la nuit. Les espèces se situant à la surface de la Terre sont donc exposées à des
variations cycliques de luminosité et de température au cours d’une journée de 24h (Buhr and
Takahashi, 2013). Cela représente une pression de sélection forte. En effet, pour anticiper ces
variations environnementales rythmiques, la plupart des êtres vivants, des cyanobactéries à
l’Homme, possèdent une horloge interne (Takahashi, 2017). Au cours de l’évolution, l’horloge
s’adapte à la complexité des organismes pluricellulaires (métazoaires) et à la nécessité d’une
Table 7 Caractéristiques physiopathologiques des principaux modèles murins pour l’étude des NAFLD
D’après Febbraio et al. (2019)
78
synchronisation entre toutes les cellules qui constituent l’organisme. En effet, si l’horloge des
cyanobactéries est composée de seulement trois kinases (KaiA,KaiB, KaiC,) (Johnson et al., 2008),
l’horloge moléculaire mammifère est composée de nombreux gènes horloge (Bmal1, 2, Clock,
Npas2, Cry1,2, Per1,2,3, Ror α,β,γ, Rev-erbα,β) auxquels peuvent s’ajouter des kinases, des
phosphatases, des acétylases, des machineries de dégradation, de translocation toutes aussi
importantes pour la régulation fine de cette horloge moléculaire. De plus, elle est dotée d’un
système de synchronisation complexe entre toutes les cellules d’un même organisme. Un point
commun rassemble cependant les horloges de toutes ces espèces : c’est la génération d’oscillations
biologiques robustes et dotées d’une grande plasticité pour permettre l’adaptation de l’individu à
son environnement. La génération de rythmes physiologiques présente plusieurs avantages. Tout
d’abord, elle permet l’anticipation de phénomènes rythmiques et le fonctionnement optimal d’un
système. Par exemple, l’ensemble des mécanismes qui assure les fonctions digestives, motrices
etc., sont maximales pendant la phase d’activité. Ces oscillations sont également une façon
supplémentaire de confiner et séparer, dans le temps, certains processus cellulaires incompatibles,
et viennent ainsi renforcer le confinement spatial. Par exemple, la division cellulaire est restreinte
à la phase nocturne et limite ainsi les risques d’endommagement de l’ADN par l’exposition aux
UV qui sont présents le jour (Feillet et al., 2015).
79
2.2. Système circadien mammifère
La découverte du support moléculaire de l’horloge et la découverte du gène PERIOD en
1980 chez la Drosophile a conduit au décernement du prix Nobel de Physiologie et Médecine 2017
aux Drs Michael Young, Micheal Rosbash et Jeffrey Hall (Callaway, 2017). Les horloges, quelle
que soit leur complexité, sont composées de trois éléments : une entrée ou input (des
synchroniseurs externes), un oscillateur autonome et auto-entretenu qui fonctionne en l’absence
d’input (l’horloge biologique) et une sortie qui émane de l’oscillateur lui-même (les fonctions
physiologiques rythmiques). Bien que facultatif, l’input qui est imposé par l’environnement agit
comme un synchroniseur ou Zeitgeber , littéralement « donneur de temps » (Figure 19).
L’horloge circadienne mammifère est complexe. C’est un oscillateur moléculaire, encodé
génétiquement, qui opère dans toutes les cellules de l’organisme (Bunger et al., 2000; Panda,
2016). On distingue l’horloge centrale des horloges périphériques, uniquement par leurs propriétés
de synchronisation. L’horloge centrale est localisée dans les noyaux supra chiasmatiques (SCN)
de l’hypothalamus et les horloges périphériques dans toutes les autres cellules extra-SCN.
L’ensemble de ces horloges est connecté, et maintenu en phase par des signaux de synchronisation.
Figure 19. Fonctionnement d’une horloge biologique
80
L’horloge centrale est synchronisée par la lumière, via la rétine. Les horloges périphériques sont
synchronisées par des synchroniseurs internes comme le cortisol ou la température corporelle qui
sont contrôlés par les SCN (Figure 20) via des voies nerveux ou neuro-endocrines. Bien qu’ayant
des propriétés de synchronisation différentes, l’horloge centrale et périphérique reposent sur une
machinerie moléculaire commune (Hastings et al., 2019; Takahashi, 2017).
a. Horloge moléculaire
Chez les mammifères, l’horloge moléculaire est un oscillateur très complexe qui fait
intervenir des régulations transcriptionnelles et post-traductionnelles importantes. Au niveau
transcriptionnel, cette horloge est composée d’un activateur central : le facteur de transcription
(FT) hétéromérique qui associe Bone and muscle Arntl-like 1 (BMAL1) et Circadian Locomotor
Output Cycles Kaput (CLOCK). Ces partenaires sont des facteurs de transcription de la famille des
basic helix-loop-helix (bHLH) et contiennent des domaines PER-ARNT-SIM (PAS) (Gekakis et
al., 1998; King et al., 1997). Ce complexe lie des éléments de réponse génomique appelés Enhancer
Boxes (5’-CACGTTG-3’), et E’-boxes (5′-CACGTT-3′), et active la transcription des gènes cibles
(Buhr and Takahashi, 2013). Ces séquences sont retrouvées dans un ensemble de gènes horloges
rythmiques qui incluent les gènes Period (PER) (PER1,2 et 3) et les gènes Cryptochromes (CRY1
et 2) (Kume et al., 1999; Shearman et al., 2000; van der Horst et al., 1999). Les protéines PER et
CRY interagissent l’une avec l’autre dans un complexe protéique avec la Caseine Kinase 1 (CK1)
δ et CK1ε (Gallego and Virshup, 2007; Lee et al., 2001). Ce complexe transloque dans le noyau
où il interagit avec le complexe BMAL1/CLOCK et inhibe son activité, inactivant ainsi
l’expression des gènes PER et CRY eux-mêmes. La chute de leur expression protéique conduit
enfin à la levée de cette répression et un nouveau cycle recommence (Figure 21). Cette boucle de
81
rétrocontrôle négatif dure environ 24h. En plus de cette boucle, BMAL1/CLOCK active également
la
Figure 20. Organisation du système circadien mammifère.
Le système circadien est composé d’entrée de synchronisation (synchroniseurs externes). L’horloge centrale
(violet) est synchronisée par la lumière et se situe dans les SCN de l’hypothalamus. Les horloges périphériques
(bleues) sont localisées dans toutes les autres cellules extra-SCN de l’organisme y compris dans le système
nerveux central. Les horloges périphériques sont entrainées par des synchroniseurs internes, eux-mêmes
contrôlés directement ou indirectement par les SCN. Elles sont également directement entrainées par des
synchroniseurs externes comme les nutriments et le microbiote intestinal. L’horloge centrale et les horloges
périphériques en phase, permettent la rythmicité des fonctions comportementales et physiologiques. Adapté de
(Hastings et al., 2019).
82
transcription d’autres gènes horloges comme les récepteurs nucléaires orphelins REV-ERBα, β
également appelés NR1D1 et NR1D2 ainsi que les Retinoic acid-Related Orphan Receptors
(RORA, RORB et RORC). Ces facteurs de transcription ont également une expression rythmique,
puisqu’ils dépendent de l’activité de BMAL1/CLOCK. Les ROR et REV-ERB reconnaissent les
mêmes éléments de réponse : RevDR2 et ROR binding Elements (RORE) et contrôlent,
positivement et négativement respectivement, l’expression de Bmal1 et de Clock (Figure 21)
(Guillaumond et al., 2005; Preitner et al., 2002 ) générant ainsi l’oscillation des transcrits de Bmal1
et Clock qui sont antiphasiques à celui des Per. Enfin, une troisième boucle de régulation
impliquant BMAL1/CLOCK fait intervenir les facteurs Proline and acidic amino acid-rich basic
leucine zipper (PAR-bZIP) qui incluent D-Box-binding Protein (Dbp), Thyrotrophine Embryonic
Factor et Hepatic Leukaemia factor. Ces protéines lient l’élément de réponse D-box et interagissent
avec le facteur de transcription Nuclear Factor Interleukin 3 regulated (NFIL3) encore appelé
E4BP4 qui est régulé par les REV-ERB et les RORs (Figure 21) (Gachon et al., 2004; Mitsui et
al., 2001). Ces trois boucles de rétroaction transcriptionnelle contrôlent également l’expression de
nombreux gènes qui ne sont pas impliqués dans le fonctionnement de l’horloge : les Clock
controlled Genes (CCGs). Parmi les CCGs, figurent de nombreux facteurs impliqués dans la
régulation de l’expression génique comme des facteurs de transcription, des micro-RNA, des
facteurs de traduction et de dégradation des protéines. Ainsi, à la fois l’horloge circadienne, elle-
même, mais aussi les CCGs, participent à l’élaboration d’un transcriptome et d’un protéome qui
varient au cours de la journée. Au niveau transcriptionnel, des travaux de séquençage d’ARN à
haut débit dans de nombreux organes chez la souris ont démontré que, tout organe confondu, 10 à
15% des transcrits sont exprimés de façon circadienne (Panda et al., 2002a), et environ 43% des
transcrits qui codent pour des protéines sont circadiens (Zhang et al., 2014). Plus récemment, ces
83
Figure 21. Régulations transcriptionnelles de l’horloge moléculaire
(A) L’horloge moléculaire repose sur une boucle de rétrocontrôle négatif retardée post-traductionnellement, ce qui
permet l’oscillation de l’expression génique et protéique des gènes horloges. Le couple BMAL1/CLOCK active la
transcription des gènes Per et Cry en se fixant sur les E-box de leurs promoteurs. Les protéines PER et CRY sont
phosphorylées par les kinases CK1ε/δ et AMPK respectivement qui régulent leur stabilité via les systèmes
ubiquitine/protéasome β-TRCP et SCF respectivement. Une fois accumulés, PER et CRY forment un complexe avec
la CK1ε/δ qui transloque dans le noyau. Ce complexe interagit directement avec BMAL1/CLOCK et inhibe son
activité. L’expression des gènes Rev-erbs et Rors est également activée de façon rythmique par BMAL1/CLOCK.
En retour, REV-ERBα,β et RORs inhibent et activent respectivement la transcription des gènes Bmal1 et Clock,
générant ainsi l’oscillation de leur expression. La dernière boucle est régulée par DBP et NFIL3 dont l’expression
génique est régulée par BMAL1/CLOCK et REV-ERBs, RORs respectivement. Ces facteurs participent également
à la régulation des gènes horloges (Per, Cry, Rev-erb et Rors).
84
expériences de séquençage d’ARN, chez le primate non humain, ont mis en évidence que plus de
80% des transcrits codant pour des protéines ont une expression circadienne (Mure et al., 2018).
Il faut noter, que cette différence de pourcentage ne peut pas être attribuée uniquement aux
différences entre deux espèces, car la sensibilité des technologies est différente.
L’horloge moléculaire est également régulée au niveau post-traductionnel. Son rôle est
souvent complexe et peu compris. La période de l’horloge est finement régulée par ces
modifications post-traductionnelles. La période est directement dépendante de la stabilité des
protéines PER et CRY. Les protéines PER sont stabilisées ou dégradées par des phosphorylations
sur plusieurs sites qui conduisent, soit à leur stabilisation, leur association avec CRY et leur
translocation nucléaire, soit à leur ubiquitination par β-TRCP et leur élimination par le protéasome
26S (Figure 21). Les CK1δ et CK1ε jouent un rôle clé dans ce processus. Une mutation activatrice
de la CK1ε appelée « tau » raccourcit la période de l’horloge et est d’ailleurs à l’origine du
syndrome d’avance de phase du sommeil chez l’Homme (Familial Advanced Sleep Phase disorder
(FASPD) (Jones et al., 1999; Xu et al., 2005). La stabilité des protéines CRY est régulée par
l’AMPK qui les phosphoryles et FBXL3, une sous unité du Skp, Cullin, F-box containing complex
(SCF) qui porte l’activité E3 ubiquitine ligase, qui permet leur dégradation (Busino et al., 2007;
Yoo et al., 2013). La modification des histones permet l’ouverture ou la condensation de la
chromatine. Elle régule de cette façon l’accessibilité des facteurs de transcriptions et des enhancers
à leurs séquences cible sur l’ADN. L’acétylation des lysines (K) des histones facilite leur
Figure 21. Régulations transcriptionnelles de l’horloge moléculaire (suite)
(B) De nombreux gènes contiennent des éléments de réponses E-box, RRE et D-Box et ont par
conséquent une expression rythmique. Parmis ces gènes figurent des facteurs de transcription, qui, à leur
tour, contrôllent l’expression de nombreux gènes et participent donc à l’élaboration d’un transcriptome
rythmique, circadien. D’après Takahashi (2017)
85
ouverture, et donc l’ouverture de la chromatine, tandis que leur déacétylation permet la
condensation de la chromatine et empêche la transcription. La méthylation des histones permet à
la fois d’ouvrir ou de fermer les histones.
Les différents complexes protéiques de l’horloge interagissent avec de nombreuses
protéines de modification des histones. CLOCK et BMAL1 interagissent avec les histones acétyl-
transférases (HAT) p300 et CREB-binding protein (CBP) respectivement (Curtis et al., 2004;
Etchegaray et al., 2003 ). CLOCK possède également une activité HAT intrinsèque qui permet
l’acétylation des histones H3 et de BMAL1 (Hirayama et al., 2007). Ces acétylations sont
réversibles par l’action des déacetylases NAD+ dépendantes : les sirtuines (SIRT). SIRT1 apparaît
comme un composant important de l’horloge. En effet, SIRT1 régule les horloges centrales et
périphériques, par différents mécanismes encore peu compris aujourd’hui (Chang and Guarente,
2013; Foteinou et al., 2018). Il a été démontré que SIRT1 régule la stabilité de PER2 (Asher et al.,
2008), déacetyle BMAL1 ainsi que les histones H3 et, de cette façon, régule l’expression génique
circadienne (Nakahata et al., 2008). La protéine SIRT1 est exprimée constitutivement et seule son
activité est rythmique. En effet, son activité dépend du NAD+ qui est produit par l’enzyme
circadienne NAMPT (Nakahata et al., 2009; Ramsey et al., 2009). En plus de la SIRT1, la SIRT6
joue également un rôle dans le recrutement de BMAL1 sur le promoteur des CCGs et la
déacetylation des H3 (Masri et al., 2014). CLOCK et BMAL1 interagissent également avec la
méthyltransférase MLL1, qui permet la tri-méthylation de l’histone H3 (H3K4me3), marqueur
d’une activation de la transcription. MLL1 serait également nécessaire au recrutement de CLOCK
sur les promoteurs des CCGs (Katada and Sassone-Corsi, 2010). De plus, MLL1 est régulée par
SIRT1 qui la déacétyle (Aguilar-Arnal et al., 2015).
86
b. Horloge centrale
L’horloge centrale correspond à l’ensemble des horloges des neurones et des astrocytes des
SCN dans l’hypothalamus, au-dessus du chiasma optique, contre le troisième ventricule.
L’ablation, par lésion stéréotaxique des SCNs, abolit le rythme circadien d’activité / repos et de
consommation d’eau (Stephan and Zucker, 1972). De plus, la greffe de SCN néonataux dans un
animal préalablement lésé, restaure les rythmes d’activité / repos. Les SCN portent également la
signature moléculaire de la période de l’activité locomotrice. En effet, la transplantation de SCN
d’un hamster mutant « tau », de courte période, à un hamster WT et inversement, confère la
période d’activité à l’animal receveur (Ralph et al., 1990). Les SCN sont composés d’environ
10,000 neurones qui peuvent être divisés en sous régions dites centrale et périphérique, sur la base
de leurs connexions rétiniennes ou efférentes ainsi que de leur expression de neuropeptides
(Hastings et al., 2019). De façon intéressante, contrairement aux neurones isolés (Welsh et al.,
1995), la synchronisation des neurones entre eux est observée lors d’enregistrement sur des
tranches organotypiques. Ces neurones présentent une oscillation robuste et maintenue dans le
temps. La génération de ses trains de potentiel d’action est une caractéristique principale des SCN
in vivo et in vitro. De façon indépendante de l’activité de l’espèce (diurne ou nocturne), les SCN
ont un fort taux de décharge pendant la phase lumineuse. Ce taux de décharge de potentiel d’action
encode, par conséquent, le « temps solaire ». L’activité est directement couplée à ce taux de
décharge au cours de la journée chez les espèces diurnes et nocturnes (Hastings et al., 2019).
Cependant, alors que les voies qui connectent les SCN aux centres qui contrôlent le sommeil sont
activatrices chez les espèces diurnes, elles sont inhibitrices chez les espèces nocturnes.
L’entraînement ou synchronisation de l’horloge centrale est similaire chez les espèces diurnes et
nocturnes et s’opère par la lumière via le système rétino-hypothalamique (RHT) indépendamment
87
de la photoréception visuelle. En effet, des souris dépourvues des photorécepteurs cônes et
bâtonnets ont une activité locomotrice normale ce qui suggère que l’horloge centrale est
correctement synchronisée et que cette synchronisation passe par un autre système que le circuit
visuel (Foster et al., 1991; Freedman et al., 1999 ). En effet, cette signalisation fait intervenir les
cellules appelées cellules ganglionnaires de la rétine intrinsèquement photosensibles (ipRGCs) qui
expriment le photopigment Opn4m, la mélanopsine. Les souris Opn4m-/- ne sont plus
photosensibles et présentent un décalage de phase d’environ 40% comparé à des souris WT en
réponse à la lumière. Cependant, ce KO ne modifie pas la présence d’un rythme locomoteur dans
des conditions d’obscurité constante (DD) (Panda et al., 2002b). La mélanopsine permet la
conversion du signal lumineux en un signal électrique, lequel est relayé jusqu’aux SCN. L’effet
de ce signal électrique dépend de la phase circadienne. En effet, pendant le jour, ce signal lumineux
a peu d’effet sur l’horloge. Pendant la nuit, il est au contraire capable d’induire une
resynchronisation de l’horloge (Lowrey and Takahashi, 2000). De cette façon, l’activité neuronale
des SCN est couplée à l’heure solaire. Les cycles d’activité électrique, en l’absence de lumière,
sont directement contrôlés par l’horloge moléculaire. La modulation du taux de décharge par les
SCN via des outils optogénétiques ont permis de mettre en évidence la resynchronisation de
l’horloge moléculaire centrale aux signalisations électriques (Jones et al., 2015). Cette
resynchronisation s’opère notamment par l’activation de la transcription des gènes PER via le
Ca2+/cAMP response element (CRE) auquel se lie le facteur de transcription CREB (Sakamoto et
al., 2013).
c. Horloges périphériques
Pendant de nombreuses années, les SCN ont été considérés comme la structure unique
contenant l’horloge biologique, notamment pour leur importance dans la modulation du rythme
88
d’activité/ sommeil. La découverte du maintien de la rythmicité des gènes horloge dans des cellules
en culture synchronisés par un choc au sérum en l’absence de tout autre signal de synchronisation,
a permis de mettre en évidence la présence d'horloges périphériques autonomes (Balsalobre et al.,
1998). Suite à cette découverte, Micheal Rosbach avait déclaré, de façon ironique mais également
visionnaire, dans un commentaire publié dans Cell en 1998 que les cellules Rat-1 devaient
remplacer les SCN pour l’étude de l’horloge moléculaire (Rosbash, 1998). Dix-neufs années plus
tard, les cellules U2OS sont utilisées par les équipes de John Hoegenesh et Steve Kay pour générer
le criblage des gènes qui modifient la période de l’horloge, ce qui donnera naissance à la base de
données « BioGPS Circadian screen search » (Zhang et al., 2009). En 2004, le développement de
rapporteurs transcriptionnels de l’horloge comme les constructions PER2:LUC ou REV :VENUS,
ont permis la découverte d’une horloge autonome et auto entretenue à l'échelle de la cellule unique
en l'absence de tout signaux de synchronisation (Nagoshi et al., 2004; Welsh et al., 2004 ; Yoo et
al., 2004 ). In vivo, ces horloges sont maintenues en phase par des signaux de synchronisation
commandés directement ou indirectement par les SCN. Ces signaux incluent les rythmes
d’alimentation, de température, la production d’hormones et de neuromédiateurs. L’ensemble de
ces signaux sont capables d’entraîner l’horloge moléculaire et ainsi de synchroniser les horloges
périphériques. En plus de ces signaux d’entraînement, des signaux locaux, spécifiques d’un organe
ou d’un type cellulaire, sont également capables d’influencer le fonctionnement de l’horloge
moléculaire (Challet, 2019). Par conséquent, la phase de l’horloge d’un tissu donné est fonction
de l’intégration de tous ces signaux. Les SCN, pour assurer leur rôle de relais de l’information
lumineuse, sont insensibles à ces signaux de synchronisation (Rensing and Ruoff, 2002). Au
niveau moléculaire, tout comme dans les SCN, la synchronisation de l’horloge passe par la
89
régulation de l’expression des gènes PER par différents facteurs de transcription dont CREB,
HSF, GR, SRF.
La régulation et la sécrétion des glucocorticoides est complexe. Ces hormones ont un rôle
dans l’éveil, le stress, l’inflammation et le métabolisme. Leur régulation dépend d’une composante
circadienne en condition non stressée et d’une composante homéostatique en réponse à un stress
(Dumbell et al., 2016). Les glucocorticoïdes sont un signal de synchronisation fort des horloges
périphériques et sont sécrétés en anticipation de la phase d’activité. Leur production est assurée
par les glandes surrénales et est contrôlée par les SCN via l’axe HPA, d’une part, mais également
directement via le système nerveux (Ishida et al., 2005). Les glucocorticoïdes principaux sont le
cortisol chez l’Homme, et la corticostérone chez la souris. La régulation dépendant de l’axe HPA,
fait intervenir la production circadienne de CRH par l’hyphothalamus et d’ACTH par l’anté-
hypophyse. Expérimentalement, la dexaméthasone, un agoniste du récepteur aux glucocorticoïdes,
permet de synchroniser les horloges de fibroblastes in vitro, et restaure une rythmicité hépatique
dans des souris dont les SCN ont été lésés (Balsalobre et al., 2000; Reddy et al., 2007). Les
glucocorticoïdes par l’intermédiaire de leur récepteur, activent la transcription des gènes PER et
ainsi réinitialisent l’horloge. La température corporelle permet également la synchronisation des
horloges bien que la température ambiante soit un signal de synchronisation comportementale très
faible chez les espèces homéothermes (Rensing and Ruoff, 2002). La température corporelle
fluctue de façon circadienne de 1°C à 5°C selon l’espèce (Refinetti and Menaker, 1992). La
régulation de la température corporelle est réalisée par un système complexe. En effet, ce système
fait intervenir différents réseaux nerveux de régulation et un ensemble de tissus métaboliques et
de glandes sécrétrices. Les centres d’intégration et de relais incluent l’air pré-optique,
l’hypothalamus, le tronc cérébral, la moelle épinière et les ganglions sympathiques et
90
parasympathiques. Les organes effecteurs regroupent le tissu adipeux brun, les muscles
squelettiques, les vaisseaux sanguins, les glandes sudoripares et salivaires (Madden and Morrison,
2019). La lésion des SCN chez la souris abolit les cycles de température corporelle. Du point de
vue moléculaire, l’entraînement par la température fait intervenir les facteurs de transcription
HSF1 et 2 (Saini et al., 2012) (Tamaru et al., 2011) qui activent la transcription de PER2. De façon
intéressante, les SCN ne sont pas sensibles à ce mécanisme (Buhr et al., 2010). Une autre propriété
importante de l’horloge moléculaire est sa compensation de la température. En effet, pour
conserver la cohérence de phase entre l’oscillateur moléculaire et la phase lumineuse, il est
important que la période de l’horloge soit stable dans une large gamme de température. Cette
propriété est conférée, d’une part, par les kinases CK1δ/ε qui sont insensibles à la température, et
d’autre part, par le mécanisme de phospho-switch qui permet une adaptation de la stabilité de la
protéine PER2 en fonction de la température pour contrebalancer l’effet de la température sur les
autres réactions impliquées dans le fonctionnement de l’horloge (Narasimamurthy et al., 2018;
Zhou et al., 2015).
d. Horloge hépatique
Toutes les fonctions du foie sont rythmiques. En effet, le cistrome, le transcriptome, le
protéome, ainsi que le métabolome et le lipidome hépatiques sont rythmiques (Aviram et al., 2016;
Dyar et al., 2018; Mauvoisin et al., 2014; Reddy et al., 2006; Zhang et al., 2014). La coordination
de l’homéostasie énergétique dans le foie s’opère par le contrôle de nombreuses enzymes
limitantes des voies métaboliques. L’horloge hépatique est essentielle à la coordination et au
maintien de l’homéostasie glucidique. En effet, la délétion de Bmal1 dans les hépatocytes ou les
cellules β-pancréatiques, conduit au développement d’une hypoglycémie restreinte à la phase de
jeûne et à un diabète sucré respectivement. A l’inverse, la délétion globale de Bmal1 n’a pas d’effet
91
important sur l’homéostasie glucidique basale, à l’exception d’une modification de la tolérance au
glucose, ce qui illustre l’importance de la synchronisation entre les organes (Lamia et al., 2008;
Marcheva et al., 2010). Les protéines CRY régulent la néoglucogenèse via leur interaction avec
les récepteurs couplés aux protéines G, inhibant ainsi la signalisation cAMP dépendante et
l’activation de la néoglucogenèse médiée par CREB (Zhang et al., 2010). PEPCK, l’enzyme
limitante de la néoglucogenèse, est contrôlée de façon très complexe et rythmique, notamment via
les protéines rythmiques CRY et KLF10 qui répriment son expression, ainsi que KLF15 et le GR
qui l’active (Jang et al., 2016; Takeuchi et al., 2016). L’horloge hépatique joue également un rôle
dans le métabolisme des lipides. Ce contrôle se fait par la régulation de l’expression de facteurs de
transcription et d’enzymes clés à la fois de la LDN et de la β-oxidation. Les facteurs de
transcription qui régulent ces voies incluent des protéines horloge comme REV-ERB et ROR mais
également PGC1α, SREBP1c et les PPARα et γ. Ces régulations notamment par REV-ERBα, ne
dépendent pas uniquement de sa liaison à l’ADN. En effet, REV-ERBα interagit avec d’autres
facteurs de transcription spécifiques du foie comme HNF4a ou HNF6 et permet le recrutement des
histones déacétylases et des co-répresseurs qui régulent la transcription de Elovl, Acss3, Agpat et
Lpin par exemple (Reinke and Asher, 2016). La coopération de REV-ERBα et de HDAC3 est
indispensable pour éviter l’accumulation de lipides pendant la phase de prise alimentaire (Feng et
al., 2011). Enfin, l’ablation ou la mutation de gènes horloge chez la souris conduisent à des
phénotypes d’altération de l’homéostasie lipidique et glucidique dans différents paradigmes
expérimentaux récapitulés dans la Table 8. Enfin, l’horloge hépatique contrôle également le
métabolisme des acides biliaires. Le foie est le principal organe de conversion du cholestérol en
acides biliaires qui facilitent l’absorption des lipides. Ces acides biliaires sont déversés dans le
duodénum lors de la digestion, et sont recyclés par réabsorption créant ainsi une boucle hépato-
92
biliaire. La synthèse de ces acides biliaires est rythmique et est contrôlée par cette boucle d’une
part, et par l’horloge circadienne d’autre part. En effet, REV-ERBα régule l’expression de LXR et
INSIG2-SREBP qui régulent l’enzyme CYP7A1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol
(Le Martelot et al., 2009). De plus, DBP régule directement l’expression de CYP7A1 (Duez et al.,
2008). Enfin, le facteur de transcription KLF15 qui est régulé par l’horloge, réprime
rythmiquement la signalisation FXR-FGF15 qui contrôle la synthèse d’acide biliaire (Han et al.,
2015).
A l’inverse, un grand nombre de métabolites affectent l’horloge moléculaire comme le Mg2+, le
NAD/NADH, l’ATP, l’acétyl-CoA, l’α-keto glutarate, le S-adénosyl méthionine (SAM), le
monoxyde de carbone ou les polyamines (Panda, 2016). La O-GlcNac de résidus sérines, est une
réaction dépendante de la concentration de glucose. Cette modification post-traductionnelle est
médiée par la O-GlcNac transférase (OGT). Cette enzyme a pour substrat PER2, CLOCK et
BMAL1. Cette modification de CLOCK et BMAL1, interfère avec leur ubiquitination et leur
dégradation (Li et al., 2013). La O-GlcNac de PER2 agit comme un switch moléculaire
supplémentaire, interférant avec les phosphorylations de la CK1 et donc sa stabilité (Kaasik et al.,
2013; Li et al., 2019). De cette façon, cette modification est un levier supplémentaire pour ajuster
la période de l’horloge à la concentration de glucose. Une autre connexion implique les ratios
NAD+/NADH agissent via les enzymes SIRT, PARP dont l’activité régule la période de l’horloge
(Asher et al., 2010). Une autre connexion implique la production d’ATP via l’AMPK qui contrôle
la stabilité des protéines CRY (Reinke and Asher, 2019). Certains métabolites comme les
polyamines qui sont synthétisés par des enzymes régulées par l’horloge et influencent l’association
de CRY et modulée par ces ligands qui dépendent directement du métabolisme. Enfin, les rythmes
93
de concentration de Mg2+ intracellulaires, régulent indirectement la période de l’horloge des
réactions enzymatiques (Feeney et al., 2016).
Paramètres circulants Phénotype du foie référence
Rev-erbα KO
+ shRev-erbβ hépatique
(veine caudale)
Backcross C57BL/6
Hypoglycémie modérée Stéatose hépatique (Bugge et al., 2012)
Rev-erb -/-
Backcross C57BL/6
Hyperglycémie
Hyperinsulinémie
GTT et ITT normaux
↑ TG hépatiques
(SD et HFD) (Delezie et al., 2012)
Cry1/2 -/-
C57BL/6
Hyperglycémie à jêun
Hyperinsulinémie (HFD)
GTT altéré (HFD)
ITT altéré (HFD)
Stéatose hépatique
(HFD)
CHC (SD)
(Barclay et al., 2013)
(Kettner et al., 2016)
Bmal1-/-
C57BL/6 ↑ TG circulants (SD-HFD) Stéatose hépatique (Shimba et al., 2011)
Bmal1Δhep Hypoglycémie
(phase de jeûne) CHC (SD)
(Lamia et al., 2008)
(Kettner et al., 2016)
ClockΔ19
C57BL/6
Hyperglycémie (SD)
ITT Normal (SD)
↑ TG circulants (SD)
Stéatose hépatique
(SD) (Turek et al., 2005)
Table 8 Phénotype métabolique des différentes souris mutante de l’horloge circadienne
SD: Standard diet, HFD : High fat diet, GTT:Glucose tolerance test, ITT: Insulin tolerance test,
Adapté de Zarrinpar et al. (2016)
94
2.3. Rythmes circadiens et NAFLD
Comme pour de nombreuses pathologies (e.g. syndrome métabolique, cancers), il existe des
relations bidirectionnelles entre le dérèglement de l’horloge circadienne et le développement des
NAFLD (Mukherji et al., 2019; Pan et al., 2011; Roenneberg and Merrow, 2016; Sulli et al., 2019).
En effet, la perturbation de la physiologie, via différents paradigmes expérimentaux ou en
condition pathologique, conduit à l’apparition d’oscillations de novo des empreintes
chromatiniennes, des transcrits, de protéines et de métabolites de façon spécifique d’un organe.
Cette observation a tout d’abord été décrite par Eckel-Mahan et al. (2013) lors d’un régime HFD
pendant 10 semaines conduisant au développement de la stéatose hépatique. Plus tard cela sera
observé dans le foie et l’intestin de souris nourries par un régime HFD (Dyar et al., 2018; He et
al., 2016; Murakami et al., 2016), par un régime cétogène (Tognini et al., 2017), ainsi que dans le
foie de souris nourries avec un mode d’alimentation arythmique (prises alimentaires fractionnées
toutes les 3h pendant le cyle de 24h)(Greenwell et al., 2019). Cela est également observé chez des
souris axéniques (Thaiss et al., 2016) ainsi que dans d’autres contextes physiopathologiques. En
effet, chez la souris, l’infection par le P. chabaudi conduit à un rythme de novo de TNFα
plasmatique aux jours 6 et 8 post-infection. Chez la drosophile, certains gènes reliés à la réponse
au stress présentent un gain de rythmicité au cours du vieillissement (Kuintzle et al., 2017). Enfin,
chez l’Homme, un gain de rythmicité de protéines et de transcrits, des leucocytes mononucléés
circulants, est retrouvé chez des patients atteints de ployarthrite rhumatoïde (Poolman et al., 2019).
Les rythmes de novo ont été observés de façon récurrente dans de nombreux contextes
physiopathologiques et semblent être une caractéristique dynamique de la perturbation d’un
système.
95
A l’inverse, plusieurs études ont montré que des perturbations du système circadien
conduisaient au développement des NAFLD. Tout d’abord, des études épidémiologiques montrent
que le travail de nuit est un facteur de risque important pour le développement de désordres
métaboliques, comme la résistance à l’insuline, les dyslipidémies et le diabète de type 2 qui, eux
même, favorisent le développement des complications hépatiques (Pan et al., 2011; Roenneberg
and Merrow, 2016; Tucker et al., 2012). Chez la souris, la délétion systémique ou tissu-spécifique
de gènes horloges, présentent une modification de l’homéostasie glucido-lipidique souvent
associée à une stéatose hépatique dans différentes conditions expérimentales (Table 8). Cela
démontre que le maintien d’une organisation temporelle inter-organes ou au sein d’un même
organe est primordial pour le contrôle de l’homéostasie générale. Enfin, l’importance de la
dérégulation de l’horloge dans la pathogenèse des NAFLD est également illustrée par l’étude de
Kettner et al. (2016). Les auteurs ont réalisé la preuve de concept selon laquelle une perturbation
forte du système circadien par un jet lag chronique expérimental et/ou l’utilisation de souris
mutantes pour des gènes horloges (Table 8) (Bmal1Δhep, Per1/2-/-, Cry1/2-/-) conduit au
développement spontané d’une cholestase, d’une NASH puis d’un CHC. Les mécanismes avancés
dans cette étude sont, une perturbation générale du métabolisme hépatique associée à des
dérégulations géniques hépatiques médiées par le récepteur nucléaire CAR via le système nerveux
sympathique (Kettner et al., 2016).Dans les parties suivantes, nous allons détailler l’implication
des rythmes circadiens dans chacun des processus participant au développement des désordres
métaboliques (Figure 22).
a. Contrôle de la prise alimentaire
La rythmicité de la prise alimentaire détermine la rythmicité de nombreuses fonctions. La
prise alimentaire est contrôlée par une composante homéostatique et une composante circadienne
96
autonome. La première est une balance entre des facteurs oréxigènes et anoréxigènes. Les facteurs
oréxigènes augmentent progressivement les processus de prise alimentaire et d’éveil, qui prennent
le dessus sur les processus de jeûne et de sommeil. En réponse à une prise alimentaire, les facteurs
anoréxigènes activent les processus de satiété qui inhibent l’action des facteurs oréxigènes.
L’horloge, quant à elle, permet une organisation temporelle de la prise alimentaire qui facilite la
coordination de processus cohérents comme la prise alimentaire et la glycogénogenèse par
exemple. A l’inverse, cela permet la séparation de processus incohérents comme la prise
alimentaire et le sommeil (Challet, 2019). De plus, le contrôle circadien permet à l’organisme et
aux organes d’anticiper des évènements cycliques, comme la disponibilité alimentaire. Chez les
rongeurs, lorsque l’accès à l’alimentation est restreint à la phase de repos, les rythmes
activité/repos s’inversent et se découplent ainsi des rythmes jour/nuit. L’horloge, dite alimentaire,
localisée dans différents noyaux hypothalamiques, contrôle dans ces conditions le rythme de
l’activité locomotrice. L’alimentation est, par conséquent, le synchroniseur le plus important des
horloges périphériques (Challet, 2019).
b. Rythmicité du métabolisme
Une conséquence directe de l’activité rythmique est l’apparition de fluctuations circadiennes
des métabolites sanguins. En effet, la plupart des métabolites intermédiaires comme le glucose, les
acides aminés, les lipides, oscillent et sont plus abondants pendant la phase d’activité (Dyar et al.,
2018). Ces rythmes sont synchronisés avec l’environnement externe par des mécanismes
cellulaires d’absorptions et de relargages contrôlés par l’horloge circadienne permettant ainsi le
maintien de l’homéostasie. Cette homéostasie est coordonnée et contrôlée à différents niveaux : la
prise alimentaire, le contrôle d’hormones et de voies nerveuses métaboliques, et au niveau génique
via le contrôle de l’expression d’enzymes métaboliques (Mukherji et al., 2019). La coordination
97
et la cohérence de l’ensemble de ces mécanismes sont contrôlées par les horloges moléculaires à
la fois centrales et locales. De façon générale, l’horloge contrôle les fonctions principales des
organes métaboliques comme le débit sanguin, la synthèse et la sécrétion de l’insuline et du
glucagon par le pancréas ainsi que le métabolisme hépatique dans son intégralité (cf Horloge
hépatique) (Reinke and Asher, 2016; Sadacca et al., 2011 ; Vieira et al., 2015).
c. Rythmicité de l’inflammation
Comme la plupart des fonctions physiologiques, le système immunitaire est hautement
rythmique. Cela est conceptuellement très cohérent puisque la phase de susceptibilité d’infection
est la phase d’activité (Man et al., 2016; Scheiermann et al., 2018). La migration des cellules
immunitaires est particulièrement rythmique en conditions physiologique et pathologique. Très
récemment, il a été mis au jour la complexité des mécanismes qui régulent la circulation des
cellules immunitaires dans les organes au cours de la journée. En effet, la combinaison de
l’expression de molécules d’adhésion et de la sécrétion de chimiokines dans un organe donné
permet l’élaboration d’un « homing code » unique à chaque tissu qui intègre une dimension
temporelle. Ce homing code est régulé, d’une part, par l’horloge, et d’autre part, par des facteurs
environnants comme le système nerveux ou un environnement pro-inflammatoire (de Juan et al.,
2019; Druzd et al., 2017; He et al., 2018; Scheiermann et al., 2013; Scheiermann et al., 2012;
Winter et al., 2018).
Cette rythmicité du « trafficking », a une conséquence primordiale dans les fonctions
d’éducation, d’immuno-surveillance, de prolifération et de réponse mémoire. Elle permet la
concordance de phase entre le risque infectieux et l’activité du système immunitaire (Man et al.,
2016; Scheiermann et al., 2018). L’horloge participe également au contrôle de l’expression et de
98
la sécrétion des cytokines ou chimiokines produites par les cellules immunitaires (Curtis et al.,
2014; Sato et al., 2014). L’horloge, dans de très nombreux types cellulaires, joue un rôle crucial
dans l’homéostasie des organes et réponse immunitaire de différents types : anti-bactérienne, anti-
virale, auto-immune (Godinho-Silva et al., 2019 ; Heipertz et al., 2018; Hopwood et al., 2018;
Kiessling et al., 2017 ; Sengupta et al., 2019; Teng, 2019 ; Wang, 2019; Wang et al., 2017 ). Les
cellules immunitaires innées et les cellules épithéliales utilisent des récepteurs PRR pour détecter
des signaux de danger et ainsi jouent un rôle dans l’initiation de la réponse immunitaire innée.
L’horloge joue également un rôle dans le contrôle de l’expression d’un grand nombre de TLR et
de composants de l'inflammasome. Cela a été démontré dans les cellules épithéliales intestinales
(Mukherji et al., 2013), bronchiques (Gibbs et al., 2014) et dans des modèles d’hépatite fulminante
(Pourcet et al., 2018; Wang et al., 2018) et de sepsis (Heipertz et al., 2018).
d. Rythmicité du microbiote intestinal
Nous avons vu que la dysbiose intestinale joue un rôle important dans le développement
de la NASH. Thaiss et al. (2016) ont démontré que le microbiote bactérien intestinal est rythmique
tant en quantité qu’en diversité chez des souris nourries ad libitum et hébergées avec 12h de jour
et 12h de nuit (Thaiss et al., 2016). Cette rythmicité est dépendante de plusieurs facteurs incluant
la prise alimentaire, et la production circadienne de peptides anti-microbiens qui limite l’expansion
bactérienne. Ces deux composantes sont contrôlées par l’horloge. En effet les souris Per1/2-/-, dont
la prise alimentaire est arythmique, ne présentent pas de rythme du bactériome intestinal
lorsqu’elles sont nourries ad libitum. Cependant, ce rythme est restauré par un accès à la nourriture
restreint à la phase lumineuse, montrant que cette rythmicité est en partie influencée par les
rythmes d’alimentation. Cette même étude a montrée également que la rythmicité du microbiote
intestinal, influence le transcriptome et l’épigénome, non seulement des organes proximaux
99
comme l’épithélium du colon, mais également le foie en lui conférant une rythmicité de la fonction
de détoxification. Leone et al. (2015) avaient précédemment montré que le régime HFD modifie
la rythmicité qualitative et quantitative du microbiote intestinal. Cette modification impacte
l’horloge et le transcriptome d’organes distants comme le foie et l’hypothalamus (Leone et al.,
2015). Cette observation est en adéquation avec d’autres études qui décrivent que le microbiote
Figure 22. Liens potentiels et avérés entre l’horloge circadienne et les complications hépatiques.
En condition physiologique, le métabolisme hépatique et du tissu adipeux, l’inflammation et le microbiote
intestinal sont des composantes rythmiques. Des perturbations génétiques du système circadien conduisent au
développement d’une stéatose hépatique. Une perturbation environnementale importante du système circadien
conduit au développement spontané de la NASH et du CHC.
100
intestinal modifie le transcriptome circadien hépatique, notamment par l’intermédiaire des
récepteurs nucléaires entérique et hépatique (Montagner et al., 2016; Murakami et al., 2016),
jusqu’à lui conférer un dimorphisme sexuel (Weger et al., 2019). L’horloge permet donc le
contrôle temporel, par les rythmes d’alimentation, de la composition et de la quantité des bactéries
intestinales, ce qui permet une symbiose temporelle. Certaines questions restent cependant à
élucider : quel est l’impact de cette rythmicité sur le système immunitaire et, à l’inverse, quel rôle
joue le système immunitaire dans le contrôle de la rythmicité du microbiote intestinal ? Un rythme
de l’ensemble du microbiote intestinal, incluant les virus, les phages et les champignons, est très
probable mais n’a pour l’heure jamais été étudié. Enfin, les microbiotes respiratoire et de la peau
sont-ils également rythmiques ?
2.4. Perturbation du système circadien et chronothérapies
a. Perturbation du système circadien
Depuis la première révolution industrielle il y a environ 200 ans, le fonctionnement socio-
économique des pays industrialisés a profondément changé. En effet, l’exposition aux lumières
artificielles, des éclairages ou des écrans, l’accès facilité et la surconsommation de nourriture
industrielle souvent de faible qualité défie la physiologie qui n’a pas pu évoluer en si peu de temps.
Notre mode de vie a profondément changé et avec lui, apparaissent de nombreuses pathologies,
souvent d’ordre inflammatoire chronique dont des maladies métaboliques comme l’obésité
(Corbett et al., 2018). Notre mode de vie favorise également la perturbation du système circadien.
En effet, il est aujourd’hui estimé que 80% de la population mondiale est exposée à la lumière, la
nuit. De plus, 20% de la population européenne et 29% de la population états-unienne travaille
avec des horaires décalés ou inversés (travail de nuit) ce qui favorise la perturbation de l’horloge
(Roenneberg and Merrow, 2016). Nous avons vu jusqu’ici, que l’horloge permet la
101
synchronisation de processus compatibles et la séparation dans le temps des processus
incompatibles. La perturbation de cette organisation est un facteur de risque pour le développement
de pathologies y compris métaboliques comme la résistance à l’insuline, les dyslipidémies et le
diabète de type 2 (Pan et al., 2011; Roenneberg and Merrow, 2016; Tucker et al., 2012). Nous
avons vu que dans l’organisation du système circadien, les synchroniseurs importants sont la
lumière et l’alimentation. Ces facteurs sont, par conséquent, des perturbateurs potentiels si la prise
alimentaire ou l’exposition à la lumière sont déphasées avec l’environnement. En effet, des
expositions à la lumière la nuit, les jet-lag chroniques, une consommation alimentaire erratique et
déséquilibrée sont des perturbateurs du système circadien. De plus, des études épidémiologiques
montrent que le travail en horaire décalé est associé à une plus grande incidence de troubles
métaboliques et gastro-intestinaux (Knutsson, 2003; Schernhammer et al., 2003; Sigurdardottir et
al., 2012; Tynes et al., 1996). L’IARC a classé le travail en horaire décalé comme facteur de risque
carcinogène (Iarc, 2019; Zhang and Papantoniou, 2019). Enfin, des rapports de l’ANSES de 2016,
confirment l’association du travail de nuit et du travail en horaire décalé comme étant un facteur
de risque pour le développement du syndrome métabolique. De plus, ces perturbations sont
évaluées comme potentiellement associées à une diminution de la santé psychique et des
performances cognitives ainsi qu’à l’obésité, au diabète de type 2 ainsi qu’à une forte pression
artérielle et à un risque d’AVC (ANSES, 2016). Un autre rapport de 2019, confirme également
l’effet néfaste des LED et de l’exposition à la lumière bleue (ANSES, 2019). Chez la souris
également, les protocoles de jet-lag chronique conduisent à la carcinogenèse hépatique (Kettner et
al., 2016; Mteyrek et al., 2016). A l’inverse, l’activité de l’horloge est également altérée chez des
souris WT nourries au HFD (Eckel-Mahan et al., 2013; Kohsaka et al., 2007). En conséquence, les
102
rythmes des transcrits et des métabolites sont remodelés dans le foie et le sérum de ces souris (Dyar
et al., 2018; Eckel-Mahan et al., 2013; Murakami et al., 2016).
b. Chronothérapies
Bien que le domaine de recherche des rythmes circadiens ait longtemps été un sujet de
recherche fondamentale, de nombreuses études ont montré l’importance des rythmes et leur
synchronisation dans le développement d’un grand nombre de pathologies. La nature rythmique
de la physiologie apparaît comme cruciale pour la santé et son rôle important en clinique (Ruben
et al., 2019). Certaines stratégies thérapeutiques, toujours à l’étude, se développent et visent à
maintenir ou rétablir des rythmes chez les individus en agissant sur des synchroniseurs externes
comme les rythmes jour/nuit ou encore de prise alimentaire/jeûne. D’autres stratégies consistent à
optimiser l’heure d’administration d’un médicament. Enfin une dernière stratégie consiste à cibler
des protéines de l’horloge qui agissent indirectement sur la coordination d’un ensemble de cibles
simultanément (Cederroth et al., 2019; Sulli et al., 2018a).
Entraîner les rythmes
Parmi les stratégies qui visent à renforcer les rythmes, figurent des médications ou
compléments alimentaires, comme la mélatonine qui vise à faciliter le sommeil, ou encore des
molécules antagonistes compétitives de la mélanopsine, encore en phase d’essai pré-clinique, qui
permet de conférer une obscurité pharmacologique (Jones et al., 2013). Récemment, Satchinanda
Panda du Salk Institute a développé le concept de time-restricted-feeding (TRF). Nous l’avons vu,
la prise alimentaire est un synchroniseur puissant des horloges périphériques. En 2012, Hatori et
al. (2012) montrent que limiter la prise alimentaire, même riche en graisse, pendant la phase
d’activité, sans modification de la quantité de calories ingérées, renforce les rythmes
physiologiques et prévient la prise de poids, la résistance à l’insuline, la stéatose hépatique et
103
l’inflammation du tissu adipeux (Hatori et al., 2012). En 2014, Chaix et al. (2014) ont démontré
que le TRF a des vertus préventives contre le développement de l’obésité et de l’IR induite par
différents régimes diabétogéniques. Cette même étude montre également que le TRF réverse les
effets délétères du régime HFD, à savoir l’obésité et l’intolérence au glucose. Egalement en 2014,
Zarrinpar et al. (2014) démontrent que le TRF restaure partiellement la nature cyclique du
microbiome intestinal même lorsque les souris sont soumises à un régime HFD (Zarrinpar et al.,
2014). Enfin, Chaix et al. (2019) montrent que les bienfaits du TRF chez la souris sont
indépendants de l’horloge. En effet, le TRF, chez les souris Bmal1Δhep, Rev-erbα/βΔhep et Cry1/2-/-
, corrige l’intolérance au glucose et la résistance à l’insuline et protège des dyslipidémies et de la
stéatose hépatique induites par le HFD. Chez l’Homme, les études sont peu abondantes. Cependant
une étude récente met en avant les bienfaits du TRF. En effet, cette étude menée chez 8 patients
pré-diabétiques pendant 5 semaines montre une amélioration de la sensibilité à l’insuline, de la
réponse des cellules β-pancréatiques, de la pression artérielle, du stress oxydatif et une réduction
de l’appétit chez les patients ayant suivi un TRF (Sutton et al., 2018).
Chronopharmacologie
La chronothérapie vise à administrer une drogue ou un soin au temps le plus bénéfique
pour l’individu. L’heure optimale dépend de la rythmicité des processus de bio-distribution et de
pharmacocinétique de la molécule, ainsi que de la rythmicité de la cible thérapeutique (Dallmann
et al., 2016). L’étude de séquençage à haut débit réalisée sur de nombreux organes, chez le primate
non-humain, montre que 82% des gènes qui codent pour des protéines identifiées comme de
potentielles cibles pharmacologiques, sont rythmiques (Mure et al., 2018). Bien entendu, à cela
s’ajoutent les protéines rythmiquement exprimées dont les transcrits ne sont pas rythmiques. De
plus, des analyses protéomiques circadiennes encore très peu nombreuses ont identifié la
phosphorylation comme un mécanisme central dans le contrôle de la rythmicité de la physiologie
104
(Robles et al., 2017). De très nombreux médicaments notamment anti-cancéreux ciblent l’activité
de nombreuses protéines kinases. D’autre part, les mécanismes qui participent à la
pharmacocinétique et la biodistribution d’une molécule pharmacologique sont bien souvent, eux
aussi, rythmiques (Dallmann et al., 2014). L’ensemble de ces éléments permet de comprendre
qu’une molécule pharmacologique donnée possède une chrono-efficacité qui lui est propre. La
chronopharmacologie consiste à déterminer l’heure d’administration optimale d’un médicament,
en prenant en compte tous ces paramètres : la rythmicité de l’expression ou de l’activité de la cible,
la rythmicité de la pharmacocinétique du médicament, la rythmicité de sa toxicité. L’heure
optimale est l’heure pour laquelle la réponse maximale et la toxicité minimale sont observées
(Ruben et al., 2019).
Les exemples pionniers les plus frappants sont ceux du traitement de différents cancers. En
effet, l’administration de la doxorubicine le matin ou le soir n’a pas la même efficacité pour le
traitement du cancer de l’ovaire (Hrushesky, 1985). Les mêmes observations ont été réalisées avec
l’oxiplatine, le fluoracil et l’acide folique dans le traitement des cancers colorectaux (Levi et al.,
1997), de l’endomètre, de la vésicule biliaire et du rein (Kobayashi et al., 2002). D’autres études
ont pu montrer le bénéfice de la chronopharmacologie par la diminution de la toxicité de la
chimiothérapie dans le cancer du poumon ainsi que de la radiothérapie dans les cancers du sein,
du cervix, de la tête et du cou et de la prostate (Chan et al., 2017). Depuis, la chrono-pharmacologie
et la toxicité de nombreuses substances et de médicaments actuellement sur le marché ont été
établies. De façon intéressante, Winter et al. (2018) démontrent chez la souris que l’utilisation de
l’antagoniste de CCR2, de façon chrono-modulée permet la diminution du recrutement des
monocytes inflammatoires et l’amélioration de l’athérosclérose. Les antagonistes de CCR2 sont
également testés en phase 2 pour le traitement de la NASH et ne montrent pas de résultats
105
prometteurs. Il serait intéressant d’établir l’efficacité de la chronopharmacologie de cet inhibiteur
dans la NASH dans des modèles précliniques, puis cliniques. Déterminer l’heure optimale de
médication implique de déterminer le chronotype du patient. Celui-ci présente une variabilité
interindividuelle élevée, contrairement à celui des rongeurs de laboratoire qui ont une génétique
identique et sont élevés dans des conditions standardisées avec 12h de jour et 12h de nuit
(Cederroth et al., 2019). De plus, la pathologie elle-même peut modifier ce chronotype.
Développer des méthodes de prédiction du chronotype en fonction d’un minimum de paramètres
si possible non invasifs est un pré-requis de la chrono-pharmaco-thérapie (Akashi et al., 2010;
Ballesta et al., 2017; Komarzynski et al., 2019; Laing et al., 2017).
Composé Cible Activité
Nobieltin RORs Agoniste
SR1001 RORs Agoniste inverse
GSK2945 REV-ERBα Agoniste
GSK0999 REV-ERBα Agoniste
GSK5072 REV-ERBα Agoniste
SR8278 REV-ERBS Antagoniste
GSK2667 REV-ERBα Agoniste
SR9011 REVERBS Agoniste
SR9009 REVERBS Agoniste
GSK4112 REV-ERBα Agoniste
Enfin, un intérêt grandissant vise à cibler des protéines horloge qui influent sur la
coordination de multiples cibles. Les facteurs de transcription nucléaires de l’horloge sont les plus
drugable (Table 9). Parmi de nombreux modulateurs des ROR, peu sont caractérisés pour leur
effet sur l’horloge. Récemment, l’inhibition REV-ERBα par les composés SR9009 et SR9011 a
montré des effets bénéfiques pour le traitement du glioblastome chez la souris (Sulli et al., 2018b)
Table 9 Pharmacologie de l’horloge moléculaire
Adapté de Sulli et al. (2018a)
106
et favorise la tolérance d’ischémie ré-oxygénation du myocarde à la transition jour nuit (Montaigne
et al., 2018).
3. Krüppel Like Factors
Les Krüppel Like Factors (KLF) font partie de la famille des facteurs de transcription à
doigt de zinc et sont apparentés au facteur de trancription Specific Protein 1 (SP1) et comptent 17
membres établis (KLF1 à KLF17) (Kim et al., 2017). Ces facteurs de transcription sont conservés
au cours de l’évolution. Ils reconnaissent spécifiquement des séquences d’ADN appelées G/C rich
box, de motif 5’-CACCC-3’ (Kadonaga et al., 1987) via leur domaine à doigt de zinc en carboxy-
terminal C2H2. De plus, les KLF partagent, dans ce domaine, une séquence extrêmement conservée
entre les doigts de zinc (TGEKP-Y/F-X) (Cao et al., 2010). Contrairement à ce domaine C-terminal
très conservé, les domaines N-terminaux sont variables et permettent l’interaction spécifique avec
des partenaires de régulation de la transcription (Figure 23). Classiquement, les KLF sont répartis
en 3 groupes sur la base de leur parenté phylogénétique, leur structure et leur mécanisme d’action.
Cette dernière classification fait d’un KLF particulier un activateur ou un répresseur de la
transcription. On notera, que la régulation de la transcription est à la fois très dynamique et contexte
dépendante, il est par conséquent difficile d’attribuer le rôle de répresseur ou d’activateur de la
transcription à un facteur de transcription donné en toute circonstance.
Le premier groupe inclut KLF3, 8 et 12 qui ont été classés comme répresseurs de la
transcription par leur interaction avec la C-terminal binding protein (CtBP). Le groupe 2 est
constitué de KLF1, 2, 4, 5, 6 et 7 qui interagissent avec des histones acétylases (HAT) et ont donc
été classés comme activateurs de la transcription. Enfin, les KLF 9, 10, 11, 13, 14 et 16 constituent
le groupe 3 et ont été classés comme répresseurs de la transcription par leur capacité à lier SIN3A,
un corépresseur transcriptionnel (Figure 23). KLF15 et KLF17 ne sont classés dans aucun de ces
107
groupes. Les KLF sont impliqués dans un grand nombre de processus incluant la prolifération
cellulaire, la différentiation, le métabolisme, l’apoptose, l’inflammation, la migration,
l’embryogenèse, ainsi que l’initiation, la maintenance et la progression tumorale.
Figure 23. Structure et classification des Krüppel Like Factors.
Les KLF sont des facteurs de transcription composés d’un domaine de liaison à l’ADN
consitué de 3 domaines à doigts de zinc dans la partie C-terminale et d’une partie N-terminale
de longueur variable. Ils contiennent un ou plusieurs domaines d’interaction avec des
partenaires de co-activation comme les HAT et/ou de co-répression comme Sin3A et CtB. Le
nombre de domaines d’activation/repression est variable. Leur capacité d’interaction avec les
co-Activateurs ou represseurs a permis leur classification en 3 groupes. Adapté de McConnell
and Yang (2010)
108
3.1. Rythmicité des KLF
De nombreux KLF ont une expression circadienne et sont régulés par l’horloge. Notre
équipe a mis en évidence ces liens en montrant que KLF10 a une expression circadienne dans le
foie de souris WT élevées en condition standard. Ce rythme est aboli chez des souris Bmal1 -/- . De
plus, ce travail a pu montrer la présence d’une E-box dans le promoteur de Klf10 et la liaison de
BMAL1 à cette E-box par des approches de ChiP dans le foie de souris et de trans-activation de
promoteur in vitro (Guillaumond et al., 2010). En 2014, le ChiP seq de CLOCK dans le foie au
temps ZT8 a mis en évidence sa liaison sur des E-box dans les régions promotrices de Klf19, Klf10,
Klf13, Klf15 et Klf16 (Yoshitane et al., 2014). De façon concordante, les expressions de Klf 1, 4,
9, 10, 11, 12, 13, 15 et 16 sont rythmiques dans le foie de souris WT (Weger et al., 2019) et les
KLF2, 4, 8, 9 et 10 sont rythmiques dans le foie du primate non-humain (Mure et al., 2018). Outre
une différence d’espèce, le nombre de KLF rythmiques peut également être lié à la variabilité
interindividuelle, puisque les données obtenues sur le primate contiennent un seul animal par ZT,
contre trois dans les données murines. Parmi l’ensemble de ces KLF, Klf15 est le facteur le plus
décrit dans la régulation circadienne du métabolisme des acides aminés (Jeyaraj et al., 2012), des
acides biliaires (Han et al., 2015), de l’adipogenèse (Matoba et al., 2017) et de la rythmicité de la
physiologie cardiaque (Zhang et al., 2015).
3.2. KLF et complications hépatiques
Nombre de ces KLF sont impliqués dans la pathophysiologie hépatique. Klf9 et Klf11 ont
été décrits comme activant et inhibant respectivement l’expression de Col1a1 dans les cellules
stellaires hépatiques (Mathison et al., 2013; Ratziu et al., 1998 ). Les souris Klf11-/- présentent
d’ailleurs une aggravation de la fibrose hépatique induite par le CCl4 administré de façon
chronique (Mathison et al., 2013). L’expression hépatique de Klf11 est augmentée dans le foie de
109
souris obèses Db/Db ou nourries avec un régime riche en graisse. L’inhibition génétique de Klf11
médiée par un adenovirus shRNA ciblant spécifiquement le foie, corrige l’accumulation de lipides
dans le modèle HFD (Zhang et al., 2013a). Enfin, KLF6 est un régulateur de la β-oxydation via
PPARα. De plus, le knock-out de KLF6 protège les souris de l’obésité, de la stéatose hépatique
dans le modèle HFD (Bechmann et al., 2013). De plus, le polymorphisme de Klf6 (KLF6-IVS1-
27G>A) est associé à l’intolérance au glucose et à la résistance à l’insuline ainsi qu’à la fibrose
chez l’Homme (Bechmann et al., 2013; Miele et al., 2008). KLF10 contrôle l’expression d’un
grand nombre de gènes hépatiques impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique
(Guillaumond et al., 2010). Son expression hépatique, quant à elle, est augmentée dans des
modèles génétiques et alimentaires d’obésité et de NASH au ZT8 (Kim et al., 2014). Son
invalidation par des shRNA spécifiquement dans le foie corrige la résistance à l’insuline et la
stéatose hépatique dans le modèle Db/Db (Yang et al., 2017b). En dehors de cette étude, aucune
évidence du rôle de KLF10 dans les complications hépatiques sévères n’a été explorée.
3.3. Krüppel like factor 10
a. Structure / fonction
Klf10 ou TIEG1 (Transforming Growth Factor Inducible 1) a été identifié par Malananyan
Subramaniam et al. en 1995 comme gène induit par le TGF-β dans l’ostéoclaste foetal humain
(Subramaniam et al., 1995). C’est une protéine de 480 acides aminés`, codés par 5 exons`,
exprimée dans un grand nombre de tissus. KLF10 contient un domaine de liaison à l’ADN
comprenant trois domaines C2H2 doigts de zinc dans sa partie C-terminale. De plus`, il contient
trois sites de répression (R1à R3) (Cook et al.; Subramaniam et al., 1995). Le site R1, est important
pour l’interaction de Klf10 avec le corépresseur Sin3A (Zhang et al., 2001). Les sites de répression
permettent également de lier l’histone déméthylase JARID1B qui permet de modifier la
110
chromatine et donc de bloquer la transcription (Kim et al., 2010). KLF10 a également été décrit
comme interagissant avec d’autres régulateurs de la transcription comme P/300, PACAF et
polycomb au promoteur de FOXP3 dans les lymphocytes T (Xiong et al., 2012 ; Xiong et al.,
2014). In vivo, l’absence de KLF10 se traduit par un phénotype marqué qui inclut une ostéopénie
chez les femelles, des anomalies tendineuses, des cardiomyopathies hypertrophiques chez le mâle.
La régulation de Klf10 est dépendante du contexte et du type cellulaire. Outre son induction par le
TGF-β, de très nombreux facteurs ont été décrits comme induisant une modification de son
expression génique dans différents tissus. Ces signaux incluent la signalisation du TGF-β et des
BMP, les oestrogènes, le NO, le BDNF, GDNF, NGF, l'endothéline, les agonistes de PPARα, le
glucose et le LPS (Figure 24) (Mitsumoto et al., 2003; Rakhshandehroo et al., 2009; Tau et al.,
1998; Wahab et al., 2005; Zhang et al., 2013b). Bien que peu d’études aient été menées sur la
régulation protéique de KLF10, on sait cependant que sa stabilité est régulée par une
phosphorylation par CDK2, et une dégradation par SIAH1 (Lin et al., 2015). Récemment, Yu et
al ont mis en évidence un autre système de dégradation de KLF10 par le système d’ubiquitination
SCFFBW7 (Yu et al., 2018). KLF10 est également phosphorylé par TYK2 une protéine impliquée
dans la signalisation de l’IL-6. Cette phosphorylation entraîne la poly-ubiquitination de KLF10 et
empêche sa translocation nucléaire (Peng et al., 2011). De plus, dans les lymphocytes T, KLF10
est mono-ubiquitiné par l’ubiquitine ligase ITCH et est requis pour la fonction de KLF10 au
promoteur de FOXP3 (Venuprasad et al., 2008). Klf10 régule à son tour des gènes impliqués dans
de très nombreux processus biologiques incluant le métabolisme, la croissance et la division
cellulaire, la mort cellulaire, la différentiation cellulaire (Figure 24). Son rôle dans l’ensemble de
ces processus est contexte dépendant et est par conséquent impossible à généraliser. Il semble
cependant être un facteur pro-apoptotique, anti-tumoral et anti-métastatique dans de nombreuses
111
cellules cancéreuses et modèles tumoraux pancréatiques, hépatiques, mammaires et médullaires
(Heo et al., 2015 ; Hsu et al., 2011; Jiang et al., 2012; Mishra et al., 2017; Ribeiro et al., 1999;
Song et al., 2012; Weng et al., 2017 ; Yang et al., 2017a). Les mécanismes régulés par KLF10 ne
sont cependant pas bien identifiés et diffèrent selon les types cellulaires et les études.
b. Implication dans la mort cellulaire
Au plus proche de l’hépatocyte, dans les Hep3B, une lignée de cellule d’hépato carcinome
humain, KLF10 est induit par le TGF-β. La surexpression de KLF10 est suffisante pour induire
l’apoptose de ces cellules de façon identique à la mort induite par le TGF-β. La mort est
associée à un découplage mitochondrial et à un stress oxydatif (Ribeiro et al., 1999). Dans une
autre étude, l’invalidation de KLF10 diminue la sensibilité de ces cellules à la mort induite par
le TGF-β (Jiang et al., 2012). La signalisation du TGF-β a des effets variables selon les types
cellulaires et leur état de différenciation. Cependant, dans l’hépatocyte, la signalisation du
TGF-β a également un rôle pro-apoptotique au cours de la NASH. En effet, l’invalidation du
récepteur TGFBRII spécifiquement dans l’hépatocyte, protège de la NASH dans le modèle
CDAA (Yang et al., 2014). Dans la littérature, aucune donnée n’est disponible quant au rôle
de KLF10 dans la mort cellulaire de cellules épithéliales ou non transformées.
c. Implication dans l’inflammation
Le rôle de KLF10 dans différentes cellules immunitaires est cohérent avec celui du TGF-
β, une cytokine anti-inflammatoire, qui régule de nombreux processus immunologiques
(Figure 24). Klf10 dans différents types cellulaires et différents modèles, agit comme un
facteur anti-inflammatoire. Il favorise dans tous les cas la signalisation du TGF-β via le
contrôle transcriptionnel du Tgf-β, et de Foxp3 dans les lymphocytes T CD4 (Cao et al., 2009)
112
(Venuprasad et al., 2008), du Tgfbr2 dans les lymphocytes T CD8 et les macrophages
(Papadakis et al., 2015a; Papadakis et al., 2015b).
Figure 24. Régulations de KLF10 et implication dans des processus physiopathologiques
reliés aux NAFLD
Dans des contextes cellulaires et physiopathologiques différents, KLF10 peut être régulé
transcriptionnellement et post-traductionnellement par de nombreux stimuli. KLF10 est
impliqué dans le contrôle de nombreux processus cellulaires et physiopathologiques comme le
métabolisme, le stress oxydatif et la mort cellulaire ou encore l’inflammation qui sont des
processus reliés à la progression des complications hépatiques.
113
Objectifs
L’horloge circadienne coordonne de nombreuses fonctions cognitives, et physiologiques. Son
altération, qu’elle soit environnementale ou génétique, est un facteur de risque pour le
développement de nombreuses pathologies, dont les désordres métaboliques. Cela souligne que le
maintien de rythmes physiologiques robustes est important pour l’homéostasie générale. Les
stéatohépatites non-alcooliques (NASH), qui sont la forme évolutive des stéatopathies non-
alcooliques métaboliques (NAFLD), sont un problème de santé publique majeure pour lesquelles
il n’existe pas de thérapie pharmacologique. Une meilleure compréhension des mécanismes
physiopathologiques qui favorisent la progression de ces complications est un des enjeux majeurs
de la recherche en hépatologie. La rythmicité du transcriptome hépatique est régulée en partie par
l’horloge circadienne ainsi que par un ensemble de facteurs de transcription qui sont eux-mêmes
contrôlés par l’horloge et donc rythmiques. Les Krüppel Like Factor sont des régulateurs
circadiens émergeants du métabolisme. Notre équipe a pu mettre en évidence la régulation de Klf10
par l’horloge et son implication dans la régulation circadienne du métabolisme hépatique, en
particulier glucidique et lipidique, jouant un rôle primordial dans le contrôle de la néoglucogenèse.
De plus, dans d’autres modèles, Klf10 est impliqué dans la régulation de l’inflammation et de la
mort cellulaire.
Les objectifs de ce travail étaient de :
1) Caractériser la stéatohépatite induite par un régime MCDD de façon circadienne
2) Caractériser l’horloge hépatique et systémique dans le modèle MCDD
3) Déterminer l’implication de KLF10 dans le développement de la stéatohépatite
114
Résultats
Résumé
La stéato-hépatite entraîne une rythmicité des biomarqueurs histologiques et altère
l’expression du facteur de transcription circadien hépato-protecteur KLF10
Nous avons pu montrer au cours de cette étude, un rythme diurne des gouttelettes lipidiques
et des foci inflammatoires dans le modèle de stéatohépatite induite par le régime déficient en
méthionine et choline (MCDD). L’expression des principaux gènes horloge dans le foie et le
rein est peu altérée. Cependant, l’expression rythmique de Klf10 est abolie dans ces deux tissus.
Les souris déficientes pour Klf10 de façon systémique ou spécifiquement dans l’hépatocyte,
présentent des atteintes hépatiques plus élevées que les souris contrôles après un régime
MCDD. L’invalidation de Klf10 dans les hépatocytes primaires de souris les sensibilise à
l’apoptose induite par le TNFα. Nous montrons également que l’expression hépatique de
KLF10 corrèle avec les ALAT et la kératine 18 circulante dans une cohorte de patients obèses
présentant ou non des complications hépatiques. Nos résultats suggèrent donc que certaines
caractéristiques histologiques de la NASH, comme la stéatose ou le nombre de gouttelettes
lipidiques, sont rythmiques dans le modèle MCDD. Cela est associé à un remodelage de
l’expression génique circadienne de nombreux gènes, incluant une perte de rythmicité de
Klf10, qui pourrait participer à l’installation des atteintes hépatiques par sensibilisation des
hépatocytes à l’apoptose.
115
Steatohepatitis induces a diurnal rhythm of associated biomarkers but impairs the
expression of the hepato-protective circadian transcription factor KLF10
Pierre S. Leclère (1,2), Déborah Rousseau (2), Stéphanie Patouraux (3), Sophie Guérin (1), Stéphanie Bonnafous (3),
Aline Gréchez-Cassiau (1), Anthony Ruberto (1), Carmelo Luci (2), Rodolphe Anty (3), Antonio Iannelli (3),
Malayannan Subramaniam (4), Albert Tran (3), Franck Delaunay (1), Philippe Gual (2)*, Michèle Teboul (1)*
(1) Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, France
(2) Université Côte d’Azur, INSERM, C3M, France
(3) Université Côte d’Azur, CHU, INSERM, C3M, France
(4) Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, Rochester, USA.
*shared last author
e-mails corresponding authors :
Philippe Gual [email protected]
Michèle Teboul [email protected]
ORCID
Stéphanie Patouraux https://orcid.org/0000-0001-6004-7685
Aline Gréchez-Cassiau https://orcid.org/0000-0003-3327-0157
Anthony Ruberto https://orcid.org/0000-0002-3215-9484
Carmelo Luci http://orcid.org/0000-0001-9687-4164
Franck Delaunay https://orcid.org/0000-0003-4927-1701
Philippe Gual https://orcid.org/0000-0001-7393-8356
Michèle Teboul https://orcid.org/0000-0002-3418-4384
Fundings: This work was supported by grants from INSERM (France), charities (Association Française pour l’Etude
du Foie (AFEF) to PG). This work was also funded by the French Government (National Research Agency, ANR):
#ANR-15-CE14-0016-01, #ANR-18-CE14-0019-02 and through the "Investments for the Future" LABEX
SIGNALIFE (#ANR-11-LABX-0028-01) and the UCAJEDI Investments in the Future project (#ANR-15-IDEX-01).
Acknowledgments
We thank the engineer and technical staff from the iBV animal and histology core facilities and from the C3M flow
cytometry and imaging core facilities for their skillful assistance and suppport.
Disclosure: The authors have declared that no conflict of interest exists
116
ABSTRACT
Non-alcoholic steatohepatitis (NASH), the progressive form of nonalcoholic fatty liver diseases (NAFLDs),
is a global public health problem without approved pharmacological therapy. A large number of hepatic functions are
regulated by the circadian clock and recent evidences suggest that clock disruption could be a risk factor for liver
complications. The circadian transcription factor Krüppel like factor 10 (KLF10) has been involved in liver
metabolism as well as cellular inflammatory and death pathways. Here, we show that hepatic steatosis and
inflammation display diurnal rhythmicity in mice developing steatohepatitis upon feeding with a methionine and
choline deficient diet (MCDD). Core clock gene oscillations remained mostly unaffected but rhythmic Klf10
expression was abolished in this model. Klf10 deficient mice display enhanced liver injury upon MCDD challenge.
Silencing Klf10 also sensitized primary hepatocytes to cell death and apoptosis along with increased caspase 3
activation in response to TNFα. We also show that the hepatic KLF10 expression correlates with liver injury (ALT
activity) and the circulating keratin 18 hepatocyte death marker in a cohort of obese patients. Collectively our findings
suggest that specific NASH features including steatosis and inflammation display diurnal oscillations and the
associated altered circadian expression of Klf10 may aggravate liver injury through hepatocyte sensitization to cell
death.
Key word: KLF10, Circadian clock, NASH, Liver injury, Cell death
INTRODUCTION
Non-alcoholic fatty liver diseases (NAFLDs) are the most frequent chronic liver pathologies worldwide with
a global prevalence ranging from 22% to 28% [1]. NAFLDs cover a spectrum of hepatic abnormalities ranging from
reversible steatosis to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and steatofibrosis which may lead to cirrhosis and
ultimately hepatocellular carcinoma (HCC). NASH is characterized by i) fatty hepatocytes, ii) inflammatory foci iii)
ballooned hepatocytes and iv) increased hepatocytes apoptosis and necrosis. Liver injury associated with NASH
correlates with elevated systemic levels of transaminase activity and hepatocyte death markers such as keratin 18,
(K18) [2-5]. Sustained activation of cellular stresses in lipid-overloaded hepatocytes and increased activation of death
receptor signaling pathways including the Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) pathway, have been associated with
the hepatocellular injury during NASH [6,7]. Additional modes of cell death including necroptosis and pyroptosis
could also participate to liver injury during NASH [8-10]. Hepatocyte injury derived signals such as Danger
Associated Molecular Pattern Signals (DAMPS) as well as pro-inflammatory mediators (cytokines and chemokines)
are also strong drivers of NASH progression [11]. Although an increasing number of clinical trials are now in progress,
approved pharmacological therapy for burn-out NASH is still missing.
The mammalian circadian timing system (CTS) coordinates most of physiology and behavior with the
external light/dark cycle. The system is organized hierarchically with a central pacemaker in the suprachiasmatic
nuclei (SCN) of the hypothalamus that receives light inputs from the retina and in turn entrains cellular clocks present
in virtually all peripheral tissues and extra-hypothalamic brain regions via internal temporal coordinator [12]. Cellular
circadian clocks control a vast array of biological processes in a tissue specific manner and the liver is the organ
117
showing the most extensive circadian regulation [13]. Many features of modern society life style including chronic
and social jet lag, light at night, overfeeding, and night eating collectively contribute to the misalignment of internal
body time with the environmental cycle and this may in turn compromise health [14]. Consistently, epidemiological
studies increasingly support the notion that a poorly synchronized CTS is an important risk factor for the development
of many chronic metabolic diseases including dyslipidemia, overweight and insulin resistance, and cancer [15-19].
Reciprocally, circadian physiology can be altered by diseases [20-22]. This is exemplified by the reprogramming of
the liver and serum metabolome as well as hepatic transcriptome occurring in obese mice, [23-27]. Furthermore, global
and tissue specific knock-out or mutation of clock genes (Rev-erbα/β-/-, Cry1-/-, Bmal1-/- and ClockΔ19) promote
hepatic steatosis, and alter blood glucose and lipid homeostasis in lean and high fat diet (HFD) fed obese mice [28-
34]. Accordingly, sustained chrono-disruption in mice via experimental chronic jet lag leads to spontaneous
development of NASH and hepatocellular carcinoma [35,36]. Several transcription factors belonging to the Krüppel
Like Factor (KLF) family have emerged as important circadian regulators involved in liver functions and diseases
[37-40]. While some of these KLF family members including KLF4 and KLF6 are potential players in NAFLD
development [41-43], the significance of KLF10 in liver physiopathology remains unknown. We previously reported
that hepatic Klf10 displays a robust circadian expression as a result of a direct regulation by the BMAL1/CLOCK
heterodimer. Transcriptome profiling of Klf10-/- mouse liver further identified a differentially expressed gene set that
was significantly enriched for lipid and carbohydrate metabolism processes. In addition, KLF10 was shown to regulate
hepatic gluconeogenesis through the direct transcriptional repression of Pepck [37]. It has also been recently reported
that Klf10 hepatic expression is strongly increased in fatty liver of obese mice [44] and that insulin resistance seen in
diabetic mice was improved upon its shRNA mediated down regulation [45]. All these features suggest that KLF10
may have a role in the development of steatohepatitis that remains to be explored. In the current study, we use mice
fed a methionine and choline deficient diet (MCDD) that recapitulates the main hepatic features of human NASH to
investigate the link between circadian timing, Kl10 expression and the development of steatohepatitis.
MATERIALS AND METHODS
Animals and study design. Animal experiment procedures were carried out in accordance with the CNRS and
INSERM institutional guidelines. The local ethical committee (Comité Institutionnel d'Éthique Pour l'Animal de
Laboratoire CIEPAL-AZUR, national agreement n°28 PEA N° NCE 20 –355) specifically approved this study. All
the animals were housed under a 12h light/12h dark cycle in a temperature and humidity controlled facility. WT and
Klf10-/- mice in the C57BL/6j genetic background were generated by crossing of heterozygous animals. Genotyping
of the mice was performed by polymerase chain reaction (PCR) of genomic DNA. For experiments, 3-6 months-old
WT (Janvier-Labs), and WT / Klf10-/- [37] male mice were fed ad libitum either a methionine- and choline-deficient
diet (MCDD) or control diet (CD) for 4 weeks (diets from SSNIFF (MCDD # E15653-947 ; Ctrl D # E15654-047).
For the circadian time series, blood sampling and animal sacrifice were performed every 6 hours over a 24h period, at
ZT3, ZT9, ZT15 and ZT21, ZT0 being the time where light is switched on (7.00 am). Following sacrifice, liver and
kidney were sampled as described in the following section. For experiments comparing two genotypes, mice were
sacrificed at ZT3, ZT9 and ZT21 blood and liver were sampled.
118
Real-time quantitative PCR analysis have been performed as previously described [46,47]and described in the
Supplementary Methods.
Cellular models and treatments. Primary hepatocytes were isolated as described in Supplementary Methods. Klf10
siRNAs (#11320001 MSS238499, life technology) or control siRNA (#12935400, life technology) were transfected
in primary hepatocytes using lipofectamine RNAiMAX (#13778075, life technologies) according to the
manufacturer’s recommendations. After a 48-hour transfection, cells were treated with TNFα (#315-01A Preprotech
) (20 ng/ml) and actinomycin D (#A9415 Sigma-Aldrich-Aldrich) (0.1µg/ml) in a William medium containing 0.5%
BSA for 12h or 16h as indicated.
MTT and cell death assays. Cell survival was assessed using the MTT assay using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (#M2003-1G Sigma-Aldrich) according to the manufacturer’s recommendations. Cell
death was analyzed using a double fluorescent staining annexin-V-PE and 7-AAD according to the manufacturer’s
instructions (AnnexinV-PE apoptosis detection kit I, BD Biosciences). Single cell fluorescence was analyzed by flow
cytometry (BD Canto II) and FlowJo software® (BD).
Immunoblotting. Cells were solubilized in lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 150 mM
NaF, 2 mM sodium orthovanadate, 10 mM pyrophosphate, protease inhibitor cocktail, and 1% Triton X-100) for 45
min at 4°C. Lysates were cleared (14 000 rpm, 15 min). Proteins were quantified (BCA Protein assay kit, 23225
Thermo Fisher Scientific Inc.), separated by SDS-PAGE and immunoblotted as previously described [48]. The
proteins were probed with anti-caspase 3 (#9662, Cell Signaling) and anti-HSP90 (#4877, Cell Signaling) antibodies
at 1 µg/mL as indicated. Detection was performed using electro chemio-luminescent method (Western lightning Plus
NEL105001EA) exposure to Amersham Hyperfilm ECL (#28906837 GE life sciences).
Human samples. Human samples (blood and liver biopsy) were obtained from 31 morbidly obese patients. All the
information related to the patients are described in the Supplementary Methods, Table 1 and ethics approval sections.
All subjects gave their informed written consent to participate in this study in accordance with French legislation
regarding Ethics and Human Research (Huriet-Serusclat law). The ‘‘Comité Consultatif de Protection des Personnes
dans la Recherche Biomédicale de Nice” approved the study (07/04:2003, N° 03.017).
Statistical analysis. Circadian rhythmicity of time series parameters was assessed using the non-linear regression
analysis based cosinor method implemented in R as described previously [37,47]. Statistical significances were
determined using a boot-strap analysis to compare confidence intervals between oscillation parameters (mean level,
amplitude and phase). Significance threshold was set at p<0.05. For single time point data, statistical significances
between two groups were determined using the non-parametric Mann–Whitney test. Data from cell culture
experiments were analyzed using the Student t-test. Pearson’s correlation test was used for the correlative analysis in
the patient study. Differences were considered significant for p < 0.05.
119
RESULTS
Diurnal rhythmicity of liver steatosis and inflammation markers in MCDD fed mice. Several experimental
paradigms using nutritional challenges in mice have shown a reprogramming of the circadian transcriptome and
physiology in many organs suggesting that these pathogenic conditions have the potential to unveil disease related
rhythmic patterns [21,23,25-27]. To evaluate whether steatohepatitis features, including hepatic steatosis,
inflammation and liver injury, display a circadian rhythmicity, WT mice were fed with a control diet (CD) or a
methionine and choline deficient diet (MCDD) for 4 weeks. Blood and liver were collected every 6 hours over 24h at
ZT3, 9, 15 and 21, ZT0 and ZT12 being the time when the light is switched on and off respectively (Fig. 1a). Hepatic
steatosis evaluated by the percentage of lipid droplets displayed a robust diurnal rhythmicity with a calculated
acrophase during the rest phase at ZT8 (Fig. 1b and Table S1) upon MCDD challenge. Consistent with this
observation, hepatic expression of Fsp27 (also known as Cidec) and Pnpla2 which code for two proteins involved in
lipid droplet fusion and unpacking respectively, also showed a rhythmic profile with a peak of expression during the
rest phase (Fig. 1c and Table S1). The hepatic triglyceride (TG) content displayed rhythmicity in CD fed mice as
expected from previous work [49]. Expectedly, the TG content was increased upon MCDD, but was no longer
rhythmic (Fig.1b and Table S1). These observations suggest that although the elevated content of TG remains
constant during the 24h cycle, the dynamics of CIDE-regulated lipid droplet formation may be a rhythmic process.
Hepatic inflammation evaluated by the number of inflammatory foci also exhibited a robust diurnal rhythmicity during
steatohepatitis. Interestingly, expression of the inflammatory markers Tnfα and Ccl2, which is not rhythmic in the CD
group, displayed de novo- rhythmicity upon MCDD-induced steatohepatitis (Fig. 1d, e and Table S1). As expected,
upon MCDD, both AST and ALT activities were higher in the MCDD fed mice than in the CD fed mice (Fig. 1f and
Table S1). We observed that ALT activity was higher at ZT3 than ZT9 and ZT15 but the cosinor analysis could not
detect a statistically significant 24h rhythm. In contrast, the AST activity displayed a robust 24 h oscillation (Fig. 1f
and Table S1). Collectively these results demonstrate that multiple markers of the MCDD induced NASH mouse
model display a time of day dependent variation that may have clinical implications.
NASH induces discrete alterations of the liver molecular clock and abolishes Klf10 oscillation. To investigate
whether the observed de novo rhythmicity of Fsp27 and Pnpla2 could be linked to a modification of the hepatic
circadian clock gene network, we profiled clock and clock-controlled gene expression in the liver of mice fed with
MCDD vs CD every 6 hrs during 24 hrs. We observed robust oscillations in both normal and pathogenic livers for all
core clock genes (Bmal1, Rev-erbα and β, Per2, Cry1, Rorc) that were analyzed (Fig. 2a and Table S2). However we
noticed that the phase of Bmal1 and Cry1 was advanced by approximately 3 hours and that amplitude of Rorc was
augmented by 2-fold (Fig. 2a and Table S2). In contrast the profile of the clock-controlled transcription factor Dbp
was more severely altered as its amplitude of was dampened by 2 fold in MCDD fed mice (Fig. 2a). Along the same
line Klf10 expression became arrhythmic upon this challenge (Fig. 2b and Table S2). To address whether the observed
changes in clock and clock-controlled gene expression are restricted to the liver, we also determined the expression
of the same set of genes in the kidney. Interestingly, clock genes were also rhythmic in both groups of mice and
displayed discrete modifications of their phase and amplitude (Fig. S1, Table S3). However, among all the evaluated
120
genes, Klf10 was also the only gene losing circadian rhythmicity upon MCDD in the kidney (Fig. S1c, Table S3). We
next determined whether this loss of rhythmicity was also observed for other Klfs known to be linked to liver
physiology and NAFLD including Klf6, Klf4 and Klf11. As shown in Fig. 2b and Table S2, expression of Klf4,
previously described in the M2 polarization of Kupffer cells during NASH [42], was increased upon MCDD.
Similarly, Klf6, which was associated with NAFLD and fibrosis [41,50,51], was also up regulated and displayed a
rhythmic pattern. In contrast, expression of Klf10 paralog Klf11, which has been previously reported to be important
in hepatic lipid metabolism [43], was not affected with the development of NASH. Collectively, these gene expression
data suggests that the core circadian clock is remarkably resilient to the MCDD challenge. However, the clock output
Klf10 appears to be depending on MCDD induced pathways that overcome its physiological circadian regulation
normally occurring in healthy organs.
Lack of KLF10 does not impact on the development of MCDD induced steatosis and inflammation. Since the
hepatic circadian expression of Klf10 was strongly impacted upon the MCDD challenge, we then determined its
significance during steatohepatitis. To address this possibility, WT and Klf10-/- mice were fed with MCDD for 4 weeks
and livers were sampled at two different ZTs during the rest phase as the steatosis and inflammatory foci are more
important during this time window of the 24hrs cycle (ZT9 and ZT3). Following MCDD challenge, the number of
lipid droplets and inflammatory foci were similar in both genotypes at both ZTs (Fig. 3a-b and Fig. S2a-b). In
addition, the hepatic expression of inflammatory markers, Tnfα and Ccl2, was also similar in both genotypes (Fig. 3c
and Fig. S2d). In accordance with the quantification of the inflammatory foci, the recruitment of granulocytes
(Ly6C+/Ly6G+) and inflammatory monocytes (Ly6Chigh ) into the liver were also similar in both genotypes at ZT3
(Fig. S2c). This data indicates that at this stage of the MCDD induced NASH disease, KLF10 does not appear to play
a significant role in the development of hepatic steatosis and inflammation.
Lack of KF10 aggravates MCDD induced liver injury and TNF induced cell death. As liver injury is a hallmark
of NASH in addition to steatosis and inflammation, we compared ALT activity in WT and Klf10-/- MCDD fed mice.
Measurements were done in blood samples taken during the ZT21-ZT3 time window, as this corresponds to the highest
activity (Fig. 1f). Klf10-/- mice displayed significantly higher circulating ALT activity as compared to their WT
controls suggesting that more cell death was occurring in Klf10-/- MCDD fed mice (Fig. 4a).To determine whether
KLF10 would be a negative regulator of hepatocyte death, we challenged Klf10 silenced vs control mouse primary
hepatocytes with TNFα and actinomycin D (ActD). TNFα is a well-known factor mediating hepatocyte death in NASH
and is strongly upregulated in MCDD mice (Fig. 1e, 3c, S2d and S3d). Klf10-silenced primary hepatocytes displayed
reduced cell viability, evaluated by MTT assay in response to TNFα/ActD (Fig. 4b). Furthermore, they also exhibited
a higher percentage of dead cells and early apoptotic cells, in response to TNFα/ActD (Fig. 4c). These cells also
exhibited higher levels of activated (cleaved) caspase 3 (p17) (Fig. 4d), in response to TNFα/ActD compared to control
primary hepatocytes. These results suggest that hepatocytes lacking Klf10 are more prone to apoptosis mediated by
TNFα, which could support the aggravated liver injury observed in Klf10-/- mice upon MCDD challenge.
121
Hepatic expression of KLF10 correlates with liver injury in obese patients with NAFLD. To address the clinical
relevance of our results in mice, we correlated hepatic KLF10 expression with cell death markers in a cohort of 31
morbidly obese patients undergoing bariatric surgery (Table 1). According to the histological criteria, obese patients
were classified into two groups: patients without NAFLD (n=7) and patients with NAFLD (n=24) (Table 1). All the
clinical and biological data and liver biopsies were collected after an overnight fasting independently of the time of
sample collection. NAFLD patients displayed more liver injury (serum ALT activity) and hepatocyte death (serum
keratin 18 (K18)) as compared to the patients without NAFLD (Table 1) [52,53]. The hepatic mRNA level of KLF10
was upregulated with NAFLD (Fig. 5a) and positively correlated with NAFLD severity (NAFLD activity score, NAS),
serum ALT activity and K18 level (Fig. 5b). Hepatic expression of KLF10 thus correlated with liver injury in obese
patients.
DISCUSSION
Recent studies have shown that nutritional challenges including high fat and ketogenic diets can reprogram
extensively and in a tissue-specific manner the mouse circadian physiology [21,23-26]. In the present work we used
the MCDD experimental paradigm to study the link between circadian timing and the development of NASH in the
mouse and we found that while the hepatic molecular clock is resilient to this metabolic challenge, markers of steatosis
and lobular inflammation, as well as serum alanine transferase activity displayed a diurnal rhythmicity. The finding
that multiple metabolic challenges can consistently unveil pathology-related diurnal oscillations has several important
basic mechanistic and translational implications.
The emergence of robust circadian rhythms in a pathologic setting may seem paradoxical at first glance, but
this phenomenon is likely to reflect the fact that the CLOCK:BMAL1 heterodimer acts primarily as a pioneer factor
regulating rhythmically chromatin accessibility to other transcription factors rather than being a necessary and
sufficient driver of circadian transcription [54,55]. The extensive de novo rhythmicity induced by the high fat diet
regimen was for example explained by the circadian nuclear accumulation of the lipogenic transcription factor PPAR
[25,27]. It is therefore conceivable that transcriptional responses to acute or chronic metabolic challenges involve
genes which are normally repressed or not significantly expressed but which contain CLOCK:BMAL1 binding sites
in their enhancers so that their pathogenic activation by other transcription factors such as for example PPAR, CREBH,
NF-kB gets temporally constrained by the circadian clock[25,56,57]. In line with this model, the Fsp27/Cidec mRNA
coding for a protein promoting lipid droplet formation that serves as a marker of liver steatosis displayed a high
amplitude rhythm with a phase preceding the peak of droplets in MCDD fed mice, and this gene was previously
reported to be bound by the CLOCK:BMAL1 heterodimer despite being not expressed in healthy liver [55] .
Interestingly, the two FSP27α and β isoforms of mouse FSP27 corresponding to human CIDEC1and 2, respectively
are regulated by the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and Cyclic-AMP-responsive-
element-binding protein H (CREBH) [58,59] respectively, which both become rhythmic. It is not excluded that, in the
MCDD model, Fsp27 could become rhythmic in the pathogenic liver through a mechanism similar to that described
by Murakami et al [27]. An additional and not exclusive mechanism may also be attributed to a putative disruption of
homeostatic microbiome rhythmicity by the MCDD model since this challenge was reported to alter the gut microbiota
122
[60]. Importantly, disruption of homeostatic microbiome rhythmicity was reported to lead to genome-wide de novo
oscillations in both intestine and liver [26,27,61-63] Unexpectedly, the diurnal pattern of MCDD induced steatosis
was not paralleled by a similar rhythm of hepatic TG. In high fat diet challenged mice, metabolomics revealed that
hepatic glycerol levels are elevated and not rhythmic [23]. This suggests that the dynamics of lipid droplets rather than
TG metabolism is rhythmic in hepatic steatosis models. The mechanism underlying such rhythmicity could operate at
the level of droplet biogenesis and/or degradation or alternatively be the result of interaction with clock-controlled
cellular processes [64] such as mitochondrial metabolism [65], autophagy [66,67] or the ER stress response [68-71].
One important role of lipid droplets besides the storage of TGs, steryl esters and retinyl esters, is to safely sequester
otherwise toxic lipids such as overabundant non esterified fatty acids (NEFA). This protective function against
lipotoxicity is a probable explanation for the abundant accumulation of lipid droplets in many disease states such as
NAFLD [72,73]. This implies that the intracellular toxicity of harmful lipids such as NEFAs is likely to be rhythmic.
Immune cells trafficking displays diurnal variations under basal conditions in multiple organs, including the
liver [74-78]. Our data provides the evidence that there is a clear diurnal variation of inflammatory foci during the rest
phase in the liver of mice fed a MCDD. Interestingly, this rhythmicity is close to what was observed in the aortic
plaque during atherosclerosis [79]. This rhythm could be the result of a general inflammatory circadian homing code.
Regarding inflammatory markers, hepatic Tnfα and Ccl2 gene expression gained rhythmicity with a peak of expression
during the rest phase (ZT2 and 4, respectively). During steatohepatitis, TNFα is an important mediator of hepatic
inflammation while CCL2 plays a crucial role in leukocyte recruitment into the liver [46,80-83]. These observations
are in line with previous studies in mouse models of inflammation mediated by either Plasmodium infection or diet-
induced atherosclerosis [79,84]. In the latter, CCL2 was involved in the circadian recruitment of granulocytes and
monocytes at the site of inflammation in a clock dependent fashion [79].
We previously showed that Klf10 is a circadian clock-controlled gene that regulates metabolic genes in liver
[37]. The finding that this transcription factor loses rhythmicity upon MCDD despite small and discrete alterations of
the core clock supports the notion that Klf10 could be regulated by other cues in addition to the CLOCK:BMAL1
heterodimer as previously described [37] [85-87]. Assitionally, our data demonstrates that the loss of KLF10 is
associated with higher liver injury despite similar hepatic steatosis and inflammation than WT mice upon MCDD
challenge. This clearly indicates that KLF10 in hepatocytes is required to limit hepatocyte death and subsequently the
disease progression. We also report that the silencing of Klf10 in mouse primary hepatocytes enhances TNFα-mediated
caspase 3 activation and subsequent apoptosis. This is in contrast to many other studies showing that KLF10 acts as a
tumor suppressor through TGF signaling by playing an important role in induction of apoptosis [88-90]. However this
pro-apoptotic role has never been investigated in non-cancer cell lines and our data suggests that the role of KLF10 in
apoptosis could depend upon the type of disease and tissue. We also found that the aggravation of liver injury in Klf10-
/- MCDD mice was associated with a significant upregulation of Fsp27 (Fig. S2e). In addition to regulate the size of
lipid droplets [73], FSP27 is also a potent apoptotic inducer via the activation of the pro-apoptotic caspases [91-94].
Furthermore, we have recently reported that its overexpression also sensitizes hepatocytes to cell death mediated by
123
TNFα. Its hepatic expression level is also closely related to liver injury in mouse and human NAFLD [48]. This
findings, in addition to the findings linked to our NASH-inducing paradigm in mice suggest that upon liver injury,
Klf10 expression is dysregulated
Despite a growing body of evidence supporting the relevance of circadian timing for the prevention, diagnosis
and treatment of diseases, this remains mostly overlooked in the current general medical, occupational and clinical
practice. Our data adds a new piece of evidence to suggest that taking into account circadian timing may be critical
for both the study and the management of NAFLD. Most preclinical studies using NAFLD models are performed
without any circadian timing consideration and our results suggest that this could lead to important biases in the
interpretation of the data. Along the same line, as the diagnosis of NAFLD patients is highly constrained by logistical
and organizational considerations, its accuracy may be questioned in the light of the disease related circadian variations
seen in our mice model. If these variations translate to humans is yet to be determined. Despite the limited knowledge
at this time, the rhythmicity of ALT activity reported in cirrhotic patients [95] suggests that variations may occur at
different stages of liver disease. Finally, although no approved treatment is yet available for NAFLD, future trials
designed to tackle this current limitation may also be improved by using a timed delivery of the assessed drugs. This
is the basis for chronotherapy which already has proven to be effective for improving the tolerability and/or efficacy
of treatments targeting cancer, asthma, infectious agents or inflammation [96,97]. This innovative therapeutics
approach would be particularly relevant to NAFLD as the liver is probably the most rhythmic organ.
Contribution statement: PSL, FD, PG and MT designed the research, analyzed and interpreted the data and wrote
the paper. PSL, DR, SP, SG, SB, AGC, AR, and CL performed the experiments. SB, RA, AI, AT contributed to human
sample and data collection. All the other authors edited and approved the final submitted draft.
124
Fig. 1 Hepatic steatosis and inflammation display circadian rhythmicity during steatohepatitis. (A) WT male
mice fed on a Control diet (CD) (n=3-4 mice per ZT) or a Methionine and choline deficient diet (MCDD) (n=5-6 mice
per ZT) for 4 weeks and the blood and liver were sampled around the clock every 6 hours. (B) Quantification of
hepatic steatosis from H&E stained liver sections (%) and total liver triglyceride contents (mg/g of tissue). (C) Hepatic
gene expression of Pnpla2 and Fsp27. (D) Inflammatory foci from the H&E staining of liver tissue section samples.
(E) Gene expression of Tnfα and Ccl2. (F) Serum ALT and AST activity (U/L). All the data are expressed as means
± SEM. Gene expressions are normalized to B2m and are expressed as relative expression of the CD ZT3. Rhythmicity
of the liver complications and related gene expressions was evaluated by nonlinear regression cosine fitting analysis
(cosinor) according to the diet (supplementary Table S1)
125
Fig. 2 Steatohepatitis in mice leads to Klf10 loss of rhythmicity and punctual alterations of circadian clock genes
expression in the liver. WT male mice fed on a control diet (CD) (n=3-4 mice per ZT) or a methionine and choline
deficient diet (MCDD) (n=5-6 mice per ZT) for 4 weeks and the blood and liver were sampled around the clock every
6 hours (see Fig. 1a). (A) Gene expression of Bmal1, Rev-erbα, Per2, Cry1, Rev-erb-β, Rorc and Dbp. (B) Gene
expression of Klf10, Klf11, Klf4 and Klf6. All the data are expressed as means ± SEM. Gene expression is normalized
to B2m and expressed as relative expression of the CD ZT3. Rhythmicity of the liver complications and related gene
expressions was evaluated by nonlinear regression cosine fitting analysis (cosinor) according to the diet
(supplementary Table S2)
126
Fig. 3 Klf10 deficiency does not impact the development of hepatic steatosis and inflammation during
steatohepatitis in mice. Wild-type (WT; n =9) and Klf10-/- (n = 9) mice fed a Methionine and Choline Deficient Diet
(MCDD) for 4 weeks and sacrificed at ZT9. (A) Representative images, showing the presence of lipid droplets and
inflammatory foci (black arrows), from H&E stained liver sections of WT and Klf10-/- upon MCDD. (B) Quantification
of hepatic steatosis and inflammatory foci from H&E stained liver sections. (C) Hepatic expression of Tnfα and Ccl2.
All the data are expressed as means ± SEM. Gene expression is normalized to B2m and expressed as relative expression
of Wt mice fed on a CD (ZT9; n=3). Data were statistically analyzed using the Mann-Whitney test. ** versus CD WT
mice, p<0.01
127
Fig. 4 Klf10 deficiency aggravates liver injury during steatohepatitis in mice and hepatocyte death in vitro. (A)
Serum ALT activity of Wild-type (WT) and Klf10 -/- mice fed Methionine and Choline deficient diet (MCDD) for 4
weeks and sacrificed at ZT 9 and 21 (n=8-20 mice/group). (B-D) Mouse primary hepatocytes were transfected with
control (siCtr) or Klf10 (siKlf10) siRNA and were stimulated with TNFα (20 ng/mL) plus actinomycin D (0.1 µg/mL)
for 16h (B-C) or 12h (D). (B) Hepatocyte Klf10 gene expression (n=6). Gene expression is normalized to B2m and
expressed as relative expression of the untreated siCtr condition, 72h after transfection. Hepatocytes cell viability
assessed by MTT assay (n=6). (C) Hepatocyte cell death and apoptosis assessed by flow cytometry following 7aaD
and annexinV staining (n=5). (D) Representative Western blot of cleaved caspase 3 fragment (17kDa) (c-CASP3) and
HSP90 protein has shown out of three independent experiments. Densitometry quantification of cleaved caspase 3
was normalized to HSP90 densitometry of the corresponding condition and expressed as a fold of the untreated siCtr
condition. All the data are expressed as means ± SEM. In mice, data were statistically analyzed using the Mann-
Whitney test (A) or the Student t test (B-D) vs control group or cells *, p<0.05; **, p<0.01;**** p<0.0001
128
Without NAFLD With NAFLD
n 7 24
Age (years) 35.3 ± 5.0 39.0 ± 2.1
BMI (kg/m²) 43.0 ± 0.41 43.9 ± 1.0
Fasting insulin (mIU/L) 10.6 ± 2.7 26.0 ± 5.0
Fasting glucose (mmol/L) 4.9 ± 0.1 5.9 ± 0.3*
HOMA-IR 2.2 ± 0.5 3.9 ± 0.8*
HbA1c (%) 5.3 ± 0.2 7.3 ± 1.4*
ALT (IU/L) 14.7 ± 1.4 31.9 ± 2.8*
K18 (U/L) 223.7 ± 16.8 580.1 ± 113.0*
NAFLD Activity Score (n) 0 (7)
1(1) 2 (4) 3 (9) 5
(10) Grade of steatosis (n) 0 (7) 1(1) 2 (4) 3 (19)
Lobular inflammation (n) 0 (7) 0 (13) 1 (11)
Hepatocellular ballooning
(n) 0 (7) 0 (13) 1 (11)
Table 1. Characteristics of obese patients Without NAFLD: patients with normal liver histology; With NAFLD: patients with NAFLD. Data
are expressed as mean ± SEM and comparisons between patients with or without NAFLD were
made using the non-parametric Mann Whitney test. * indicates p<0.05.
129
Fig. 5 Hepatic KLF10 expression increases with NAFLD and correlates with liver injury in obese patients.
Morbidly obese patients cohort (n=31) was subdivided in two groups according to histological criteria: without
NAFLD (n = 7) and with NAFLD (n = 24). (A) Hepatic KLF10 gene expression. (B) Correlation between hepatic
KLF10 expression (fold) with hepatic NAFLD activity score (NAS) and serum ALT and marker of hepatocyte death
(keratin 18). Data are expressed as means ± SEM. Gene expression was normalized to RPLP0 and were expressed as
relative expression of the control group. Data were statistically analyzed using the Mann-Whitney test. *, p<0.05.
Correlations were performed using the Pearson’s correlation test
130
Fig. S1 Steatohepatitis in mice leads to Klf10 loss of rhythmicity and punctual alterations of circadian clock
genes expression in the kidney. WT male mice fed on a Control diet (CD) (n=2-4 mice per ZT) or a Methionine and
choline deficient diet (MCDD) (n=5-6 mice per ZT) for 4 weeks and kidneys were sampled around the clock every 6
hours. (B) Gene expression of Bmal1, Rev-erbα, Per2, Cry1, Rev-erb-β, Rorc and Dbp.(C) Gene expression of Klf10
and Klf11. All the data are expressed as means ± SEM. Gene expressions are normalized to B2m and are expressed as
relative expression of the CD ZT3. Rhythmicity of the liver complications and related gene expressions was evaluated
by nonlinear regression cosine fitting analysis (cosinor) according to the diet. (supplementary Table S3)
131
Items Diet Mean level Amplitude Acrophase (ZT : min)
Steatosis (%) CD ND ND ND
MCDD 12.10 (7.83 ; 16.42)* 13.19 (7.32 ; 19.25) 08:07 (06:19 ; 10:06)
Inflammatory foci
( foci / 10 fields)
CD ND ND ND
MCDD 12.49 (7.08 ; 19.10)* 12.27 (3.72 ; 21.08 ) 07:38 (04:24 ; 11:08)
Hepatic TG
(mg/g of liver)
CD 2.98 (2.47 ; 3.58) 1.59 (0.87 ; 2.35) 14.27 (12.19 ; 16.36)
MCDD 7.35 (5.59 9.49)* NSR NSR
ALT
(U/L)
CD 20.02 (16.36 ; 25.13) NSR NSR
MCDD 84.20 (74.35 ; 94.92)* NSR NSR
AST
(U/L)
CD 202 (179 ; 227) NSR NSR
MCDD 620 (553 ; 689) 307 (211 ; 400) 00:57 (00:15 ; 02:00)
Pnpla2 CD 1.08 (0.93 ; 1.24) 0.43 (0.20 ; 0.64) 08:35 (06:29 ; 10:46)
MCDD 2.02 (1.79 ; 2.30)* 0.66 (0.30 ; 1.01) 08:44 (06:22 ; 10:59)
Fsp27/Cidec CD 1.28 (0.85 ; 1.75) NSR NSR
MCDD 17.96 (14.90 ; 20.92) 7.73 (3.73 ; 11.93) 06:25 (04:04 ; 08:31)
Tnf CD 1.20 (1.00 ; 1.43) NSR NSR
MCDD 8.73 (7.01 ; 10.78)* 5.77 (3.21 ; 8.39) 4:26 (02:19 ; 06:13)
Ccl2 CD 0.88 (0.49 ; 1.48) NSR NSR
MCDD 6.73 (5.40 ; 8.29)* 4.55 (2.61 ; 6.53) 02:20 (00:32 ; 04:11)
Table S1. NAFLD features cosinor analysis. Bootstrap analysis was performed to generate the 95%
confidence intervals. * indicates statistical difference between CD and MCD fed mice (p<0.05). NSR,
not significantly rhythmic, ND, not detectable.
132
Gene Diet Mean level Amplitude Acrophase (ZT : min)
Bmal1 CD 0.83 (0.67 ; 1.00) 0.75 (0.52 ; 0.99) 22:20 (21:10 ; 23:35)
MCDD 1.10 (0.96 ; 1.28) 1.21 ( 0.96 ; 1.46) 19:12 (18:29 ; 19:54)*
Rev-erbα CD 0.43 (0.28 ; 0.61) 0.57 (0.33 ; 0.81) 04: 26 (02:44 ; 06:07)
MCDD 0.36 (0.22 ; 0.54) 0.56 (0.33 ; 0.80) 03:17 (01:38 ; 04:53)
Per2 CD 7.13 (5.58 ; 8.88) 7.63 (5.31 ; 9.97) 11:36 (10:22 ; 12:49)
MCDD 7.68 (6.91 ; 8.47) 5.85 (4.74 ; 6.95) 10:34 (09:50 ; 11:16)
Cry1 CD 2.04 (1.65 ; 2.38) 1.64 (1.18 ; 2.12) 19:23 (18:10 ; 20:39)
MCDD 2.22 (2.09 ; 2.37) 1.88 (1.69 ; 2.07) 16:26 (16:01 ; 16:50)*
Rev-erbβ CD 0.78 (0.64 ; 0.95) 0.55 ( 0.34 ; 0.78) 08:07 (06:31 ; 09:49)
MCDD 0.47 (0.41 ; 0.54)* 0.35 (0.26 ; 0.44) 08:19 (07:11 ; 09:23)
Rorc CD 2.66 (2.27 ; 3.15) 1.16 ( 0.56 ; 1.77) 15:53 (13:34 ; 18:02)
MCDD 2.87 (2.63 ; 3.13) 2.44 (2.12 ; 2.78)* 14:35 (13:58 ; 15:10)
Dbp CD 1.69 (1.22 ; 2.19) 2.32 (1.69 ; 3.00) 07:44 (07:41 ; 09:56)
MCDD 0.63 (0.47 ; 0.80)* 0.88 (0.62 ; 1.14)* 8:42 (07:33 ; 09:46)
Klf10 CD 1.99 (1.40 ; 2.67) 1.50 (0.59 ; 2.41) 9:23 (6:46 ; 12:00)
MCDD 2.50 (2.06 ; 3.00) NSR NSR
Klf11 CD 0.70 (0.49 ; 0.97) 0.51 (0.18 ; 0.87) 02:57 (23:54 ; 05:58)
MCDD 0.95 ( 0.83 ; 1.07) 0.50 (0.34 ; 0.68) 01:31 (00:09 ; 2:52)
Klf4 CD 0.98 (0.78 ; 1.24) NSR NSR
MCDD 2.64 (2.34 ; 2.94)* NSR NSR
Klf6 CD 0.88 (0.75 ; 1.03) NSR NSR
MCDD 4.19 (3.68 ; 4.71)* 1.66 (0.97 ; 2.41) 01:17 (23:30 ; 03:06)
Table S2. Liver clock genes cosinor analysis
Bootstrap analysis was performed to generate the 95% confidence intervals. * indicates statistical
difference between CD and MCD fed mice (p<0.05). NSR, not significantly rhythmic.
133
Gene Diet Mean level Amplitude Acrophase (ZT : min)
Bmal1 CD 0.88 (0.66 ; 1.11) 0.64 (0.32 ; 0.97) 21:15 (19:09 ; 23:17)
MCDD 1.06 ( 0.96 ; 1.18) 1.03 (0.87 ; 1.18) 18:19 (17:44 ; 18:53)*
Nr1d1 CD 0.68 ( 0.53 ; 0.85) 0.46 (0.24 ; 0.70) 7:03 ( 05:07 ; 08:52)
MCDD 0.63 (0.46 ; 0.90) 0.94 (0.60 ; 1.29) 03:29 (02:04 ; 04:54)*
Per2 CD 1.41 (1.15 ; 1.66) 0.93 (0.57 ; 1.29) 13:18 (11:29 ; 14:39)
MCDD 1.44 (0.97 ; 2.04) 1.24 (0.48 ; 2.02) 08:45 (06:02 ; 11:18)*
Cry1 CD 4.11 (3.24 ; 4.97) 3.77 (2.58 ; 4.93) 16:19 (14:59 ; 17:37)
MCDD 8.68 (5.67 ; 3.22)* 8.28 ( 3.65 ; 4.06) 10:38 ( 07:44 ; 13:29)*
Nr1d2 CD 0.88 (0.77 ; 1.00) 0.46 (0.29 ; 0.62) 08:59 (07:38 ; 10:16)
MCDD 1.09 (0.67 ; 1.68) 1.23 (0.51 ; 1.93) 05:52 ( 03:00 ; 08:15)
Rorc CD 2.39 (2.46 ; 3.51) 2.54 (1.85 ; 3.24) 16:30 (15:15 ; 17:36)
MCDD 3.38 (3.17 ; 4.76) 2.2 (1.11 ; 3.38) 13:07 (11:03 ; 15:28)
Dbp CD 1.77 (51.38 ; 2.15) 2.01 ( 1.44 ; 2.60) 09:41 ( 08:40 ; 10:43)
MCDD 2.22 (1.88 ; 2.57) 2.68 (2.20; 3.19) 05:49 (05:08 ; 06:29)*
Klf10 CD 2.02 (1.71 ; 2.35) 1.18 (0.77 ; 1.59) 14:41 (13: 07 ; 16:22)
MCDD 2.15 ( 1.71 ; 2.67) NSR NSR
Klf11 CD 0.68 (0.56 ; 0.83) 0.33 (0.16 ; 0.51) 03:15 (00:36 ; 05:42)
MCDD 0.85 (0.69; 1.02) 0.60 (0.37; 0.83) 03:34 (01: 55; 05:03)
Table S3. Kidney clock genes cosinor
Bootstrap analysis was performed to generate the 95% confidence intervals. * indicates statistical
difference between CD and MCD fed mice (p<0.05). NSR, not significantly rhythmic.
.
134
Fig. S2 Klf10 deficiency does not impact the development of hepatic steatosis and inflammation during
steatohepatitis in mice sampled at ZT3. Wild-type (WT) and Klf10 -/- mice fed on a Methionine and Choline
Deficient Diet (MCDD) for 4 weeks and sacrificed at ZT 3. (A) Representative images, showing the presence of lipid
droplets and inflammatory foci (black arrows), from H&E stained liver sections of WT and Klf10-/- upon MCDD. (B)
Quantification of hepatic steatosis and inflammatory foci from H&E stained liver sections (n=8-11 mice/group). (C)
Number of hepatic granulocytes and monocytes assessed by flow cytometry on hepatic non parenchymal cells stained
for CD45, Ly6C and Ly6G. Data represent the number of cells/g of tissue (5-6 mice/group). (D) Hepatic expression
of Tnfα and Ccl2 (8-12 mice/group). (E) Hepatic expression of Fsp27 (8-12 mice/group). All the data are expressed
as means ± SEM. Gene expressions are normalized to B2m and are expressed as relative expression of Wt mice fed
on a CD (ZT3, n=12). Data were statistically analyzed using the Mann-Whitney test vs control group WT CD. *,
p<0.05; **, p<0.01;**** p<0.0001
135
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141
Résultats supplémentaires
Figure 25. L’invalidation de Klf10 dans les hépatocytes n’impacte pas le dévelopement de la stéatose hépatique net
de l’inflammation mais augmente la souffrance hépatocellulaire chez la souris pendant la stéatohépatite.
Les souris invalidées pour Klf10 dans l’hépatocyte (Klf10Δhep ) et leur souris contrôles (Klf10Flox/flox) ont été nourries avec
un régime MCDD pendant 4 semaines et ont été sacrifiées au temps ZT3 (n=8-11 souris/groupe). (A) Images
représentatives de coupes de foie colorées à l’H&E. (B) Quantification de la stéatose hépatique. (C) Nombres de
granulocytes et monocytes évalués par cytométrie de flux sur les cellules non parenchymateuses marquées pour CD45,
Ly6C, Ly6G. Les résultats sont représentés en nombre de cellules / g de tissu (5-6 souris / groupe). (D) Expression génique
hépatique de Tnfα et Ccl2. Tous les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± SEM. Les expressionS géniques
sont normalisées au gène de référence B2m et représentées en expression relative de la condition CD Klf10flox/flox . Les
résultats sont analysés statistiquement par l’utilisation du test non paramétrique de Man-Whitney comparé au CD
Klf10flox/flox ou aux conditions indiquées. *, p<0.05; **, p<0.01;**** p<0.0001
142
Figure 26. Expression de Klf10 dans le foie de souris nourries par un régime HFD.
Des souris de 6 semaines ont été nourries par le régime HFD pendant 10 semaines. Données
extraites de la base de données GSE52333, RNAseq ND vs HFD (Eckel-Mahan et al., 2013).
La rythmicité est déterminée par test JTK_Cycle : Klf10 ND : p= 0.0037, Klf10 HFD : p=0.0106
ND : Normal Diet, HFD : High Fat Diet
143
Discussion et perspectives
La stéatose hépatique induite par le régime MCDD est rythmique
Pour déterminer si les caractéristiques physiopathologiques de la stéatohépatite sont
rythmiques, nous avons nourri des souris WT pendant 4 semaines avec un régime MCDD pour
induire une stéatohépatite. Après 4 semaines, le sang, le foie et les reins ont été prélevés toutes les
6 heures sur 24h, aux ZT3, ZT9, ZT15 et ZT21 ; ZT0 étant l’heure à laquelle la lumière s’allume
(7h00 du matin) (Fig1A). La stéatose hépatique évaluée histologiquement par le pourcentage de
gouttelettes lipidiques présente un pic calculé à ZT8 (Fig1B, Tableau S1). En accord avec cette
rythmicité, l’expression génique de Fsp27 et Pnpla2 dans le foie est également rythmique en
régime MCDD (Fig1C, TableS1). Les triglycérides hépatiques sont rythmiques en régime CD en
accord avec l’étude lipidomique de Aviram et al. (2016). Bien que le contenu en TG hépatiques
soit bien augmenté en régime MCDD, il ne présente pas de rythmicité. La formation et
l’élimination des gouttelettes lipidiques sont des processus très dynamiques. Sachant que le régime
MCDD inhibe l’export des VLDL, et que le contenu en TG est constant au cours de la journée, la
rythmicité des gouttelettes pourrait s’expliquer par (i) les échanges dynamiques qui existent entre
les gouttelettes lipidiques avec d’autres organelles (Olzmann and Carvalho, 2019) qui assurent des
fonctions variées qui peuvent être contrôlée par l’horloge (Chaix et al., 2016) comme le
métabolisme mitochondrial (Jacobi et al., 2015), l’autophagie et la lipophagie (Ma et al., 2012; Ma
et al., 2011), le stress du RE (Bu et al., 2018; Mauvoisin et al., 2014; Milev and Gatfield, 2018;
Welte, 2015; Zhu et al., 2017) (ii) la régulation directe de l’expression des protéines qui régulent
la dynamique de la gouttelette par l’horloge. En accord avec cette dernière hypothèse, l’expression
génique de Fsp27 et Pnpla2 sont rythmiques et ont des phases qui correspondent au pic du score
de stéatose hépatique. Il s’agit cependant uniquement d’une expression génique, la rythmicité de
144
l’expression protéique reste à déterminer. De façon intéressante, BMAL1:CLOCK est retrouvé de
façon rythmique dans les régions régulatrices de Fsp27 à l’état basal, sans effet remarquable sur
son expression (Trott and Menet, 2018). L’expression de Fsp27 en condition pathologique pourrait
donc s’expliquer par une accessibilité aux éléments de réponses restreintes à certaines phases de
la journée, via la présence de BMAL1:CLOCK déjà présent à l’état basal. L’observation d’un tel
rythme de Fsp27 a également été faite dans le modèle HFD (Eckel-Mahan et al., 2013 ; He et al.,
2016; Murakami et al., 2016 ). Dans ce modèle, cette rythmicité de novo a été imputée à
l’activation rythmique de PPARγ de façon dépendante du microbiote intestinal (Murakami et al.,
2016). Il est possible que l’oscillation de novo de Fsp27 soit également liée à une modification de
la rythmicité du microbiote intestinal dans le modèle MCDD, dont la composition est altérée
(Henao-Mejia et al., 2012; Ye et al., 2018). Il existe deux isoformes de Fsp27 : Fsp27a et β qui
sont régulées par deux facteurs de transcriptions différents, PPARγ et CREBH (Xu et al., 2015),
respectivement. Dans le modèle HFD, la phase de Fsp27 est différente de celle observée en régime
MCDD (ZT12 vs ZT6) ce qui suggère un mécanisme de régulation rythmique différent. De façon
intéressante, les deux isoformes de Fsp27 n’ont pas le même niveau d’expression hépatique pour
un ZT donné dans les modèles HFD et MCDD. En effet alors que Fsp27a et β sont tous deux
augmentés sous régime HFD, seul Fsp27β est augmenté sous régime MCDD (Sans et al., 2019).
Par conséquent, la différence de phase observée pour l’oscillation de l’expression hépatique de
Fsp27 total (Fsp27a et β cumulées) entre les régimes HFD et MCDD pourrait s’expliquer par une
différence d’expression circadienne des deux isoformes de Fsp27 dans les deux modèles. Il serait
donc intéressant d’évaluer l’expression circadienne de Fsp27a et β dans les deux modèles, dont
les régulateurs respectifs sont rythmiques (Murakami et al., 2016; Zheng et al., 2016).
145
La présence de foci inflammatoire hépatique induit par le régime MCDD
est rythmique
Nous avons également démontré la rythmicité du nombre de foci inflammatoires (Fig1D,
Table S1). L’infiltration des cellules immunitaires dans les tissus est hautement circadienne. Elle
est régulée par l’expression rythmique des molécules d’adhésion, la sécrétion de chimiokines, et
l’expression de leur récepteur, à la fois sur les cellules immunitaires mais également les cellules
endothéliales de façon tissu-spécifique (de Juan et al., 2019; Druzd et al., 2017 ; He et al., 2018;
Pick et al., 2019; Scheiermann et al., 2012). De façon intéressante, dans le foie sain, le pic
d’abondance de la majorité des cellules immunitaires apparait à la transition jour/nuit
contrairement à ce qu’ l’on observe sur coupe histologique en condition MCDD (He et al., 2018).
Dans le modèle MCDD, on ne sait cependant pas si la variation dans le nombre de foci est la
conséquence d’une rythmicité de l’infiltration rythmique, la prolifération ou encore d’une mort
des cellules immunitaires. Il est d’ailleurs fort probable qu’il s’agisse d’un équilibre qui s’établit
entre ces différents processus. De plus, on ne sait pas exactement quelles cellules immunitaires
sont rythmiques dans ces conditions et il serait intéressant d’aller plus loin dans la caractérisation
de ces cellules. Nos résultats indiquent aussi, une rythmicité de novo de l’expression génique de
CCL2 dans le foie total (Fig1E, TableS1). CCL2 est un acteur central dans le recrutement des
leucocytes dans le foie lors de la NASH (Baeck et al., 2012; Bertola et al., 2010; Gao and
Tsukamoto, 2016; Patouraux et al., 2017) et sa neutralisation améliore la pathologie chez la souris
(Marra and Tacke, 2014). Dans un modèle d’athérosclérose (souris ApoE-/-), une autre maladie
inflammatoire chronique, l’abondance la plus importante des monocytes et des granulocytes au
site de l’inflammation, dans la plaque d’athérome, survient pendant la phase de repos. Dans ce
modèle, cette rythmicité dépend de l’horloge des granulocytes et monocytes et de leur production
rythmique de CCL2 (Winter et al., 2018). Ce gain de rythmicité pourrait être directement expliqué
146
par le contrôle de l’expression de CCL2 par l’horloge. En effet, CCL2 est contrôlé par les protéines
horloge BMAL1, RORα et REV-ERBα dans les macrophages péritonéaux et dérivés de la moelle
osseuse (Curtis et al., 2014; Man et al., 2016; Nguyen et al., 2013; Sato et al., 2014). La rythmicité
de l’expression hépatique du Tnfα devient également rythmique en condition MCDD (Fig1E,
Table S1). De façon intéressante, le TNFα circulant et splénique sont également rythmiques avec
un pic d’abondance en début et fin de la phase de repos respectivement, en réponse à une infection
au Plasmodium et à l’injection de LPS respectivement (Hirako et al., 2018; Keller et al., 2009).
Déterminer quelles cellules produisent CCL2 et le TNFα, l’importance de l’horloge dans
l’observation de ce rythme, et savoir si cette observation s’étend à d’autres cytokines seraient
intéressant dans ce modèle. L’inhibition de CCR2 par des antagonistes est une stratégie
thérapeutique actuellement évaluée chez l’Homme (phase II). L’utilisation de ces antagonistes en
chronothérapie pourrait améliorer leurs effets. En effet, il a été démontré chez la souris un bénéfice
sur la réduction du recrutement des cellules immunitaires et la formation de la plaque d’athérome
de l’administration d’un antagoniste de CCR2 (RS102895) à ZT17 (Winter et al., 2018).
Les bio-marqueurs de la souffrance hépatique sont rythmiques
Dans notre étude, nous avons pu montrer une forte rythmicité des ASAT et une variabilité
des ALAT non significative par le test cosinor qui pourrait s’expliquer par la faible résolution
temporelle (Fig1F, TableS1). En effet, les transaminases circulantes ont déjà été décrites comme
étant rythmiques chez des patients cirrhotiques prélevés toutes les heures sur une journée (Cordoba
et al., 1998). Si ce rythme est le résultat d’une dynamique complexe de relargage et d’élimination,
il pourrait également refléter une souffrance hépatique rythmique, qui suit le rythme de stéatose
hépatique et l’inflammation lobulaire. Il serait intéressant de regarder dans le foie si les marqueurs
de souffrance et de mort hépatique sont rythmiques (par exemple HMGB-1, fragments de la
147
kératine 18, cCASP3, MLKL phosphorylée, N-GSDMD). Il serait également important de vérifier
chez l’Homme la rythmicité de ces marqueurs chez les patients obèses à différents stades de la
pathologie.
La stéatohépatite modifie faiblement l’horloge mais altère l’expression de
Klf10
L’observation de tels changements de rythmes entre les régimes CD et MCDD nous ont
conduits à évaluer dans quelle mesure, la fonction de l’horloge est affectée par le développement
de la pathologie. Nous avons donc dosé l’expression génique des principaux gènes horloge dans
le foie et le rein comme reflet d’une éventuelle perturbation générale du système circadien, chez
les souris nourries par un régime MCDD pendant 4 semaines. L’horloge moléculaire pouvant être
affectée par le statut red-ox d’une part (Putker et al., 2018) et les polyamines, qui dépendent
directement de la méthionine d’autre part (Panda, 2016; Zwighaft et al., 2015), il est surprenant
d’observer que l’oscillation de l’expression des gènes horloges n’est pas fortement modifiée dans
les deux organes (foie, rein) (Fig2, FigS1, Table S2). Parmi les différents gènes évalués, seuls
certains Clock controlled genes (Ccg) comme Dbp et Klf10, ont une expression atténuée et
arythmique respectivement (Fig2A, B FigS1B, Table S2). Cette observation pourrait s'expliquer
par (i) l’activation rythmique de voies transcriptionnelles en conditions pathologiques, (ii) la
présence de protéines horloges ou rythmiques dans les complexes de régulation transcriptionnelle
liés aux promoteurs ou aux enhancers des gènes cibles (Eckel-Mahan et al., 2013; Trott and Menet,
2018) ou (iii) un rythme de prise alimentaire modifié. En effet, si la restriction temporelle de la
prise alimentaire est un synchroniseur fort de l’horloge, l’arythmicité de la prise alimentaire
n’altère pas l’horloge, mais entraine un remodelage important du transcriptome circadien
hépatique (Greenwell et al., 2019). De façon intéressante, d’autres Klf ayant été associés au
148
développement des complications hépatiques comme Klf11 impliqué dans le métabolisme
lipidique et la fibrogenèse (Mathison et al., 2013; Zhang et al., 2013a), Klf4 impliqué dans
l’activité des cellules de Kupffer pendant la NASH (Han et al., 2017) et Klf6 qui favorise le
développement des NALFD (Ghiassi-Nejad et al., 2013)Ray, 2013 #1066;Miele, 2008
#1067 ;Bechmann, 2013 #548}, ont des profils tout à fait différents de celui de Klf10 (Fig2B,
TableS2). En effet, l’expression de Klf11 n’est pas affectée par le régime MCDD, celle de Klf4 est
augmentée et conserve une rythmicité, et celle de Klf6 gagne en rythmicité et est fortement
augmentée. Par contre, Klf10 perd sa rythmicité, ce qui pourrait indiquer que sa régulation par
l’horloge est abolie sous régime MCDD, ou qu’il est régulé par d’autres facteurs en plus de
l’horloge. Klf10 est aussi régulé par le TGFβ, PPARα, le LPS, le glucose et les glucocorticoïdes
dans différents contextes et types cellulaires, (Guillaumond et al., 2010; Iizuka et al., 2004;
Rakhshandehroo et al., 2009; Subramaniam et al., 2007; Zhang et al., 2013b)(Ruberto et al
unpublished). D’autre part, on estime que l’expression de Klf10 observée dans le foie total est
principalement attribuée à l’expression hépatocytaire puisqu’il s’agit de la population majoritaire.
On sait cependant que Klf10 est également exprimé dans la fraction non parenchymateuse comme
les cellules de Kupffer et les cellules stellaires (Halpern et al., 2018) et il serait intéressant
d’évaluer son expression circadienne dans les différentes fractions.
L’invalidation systémique ou hépatocytaire de Klf10 aggrave les atteintes
hépatiques
Pour déterminer le rôle de Klf10 dans le développement des complications hépatiques, nous
avons nourri les souris Klf10-/- avec un régime MCDD pendant 4 semaines. Deux expériences
indépendantes, nous ont permis de réaliser les prélèvements à 3 ZT différents (ZT3 ainsi que ZT9
et ZT21). Malgré le développement d’une stéatose et d’une inflammation hépatique qui semble
149
équivalente aux souris contrôles (Fig3), les souris Klf10-/- développent une souffrance
hépatocellulaire accrue, évaluée par l’augmentation des ALAT circulantes (Fig4A). Ces résultats
semblent indiquer que Klf10 pourrait avoir un rôle hépatoprotecteur. Pour confirmer cela, nous
avons utilisé des souris invalidées pour Klf10 spécifiquement dans les hépatocytes et les avons
soumises au régime MCDD vs CD pendant 6 semaines. Ces souris présentent le même phénotype
que les souris Klf10-/- avec des transaminases circulantes plus élevées mais avec un développement
d’une stéatose et d’une inflammation similaire aux souris contrôles (Figure 25). De plus, par les
expériences in vitro sur les hépatocytes primaires invalidés pour Klf10 sont plus sensibles à la mort
induite par le TNF-α et présentent une diminution de la viabilité associée à une augmentation de
la mort cellulaire et du clivage de la caspase 3 (Fig4B, C, D). Cependant, ce rôle de KLF10 semble
être spécifique de l’hépatocyte non cancéreux. En effet dans une lignée d’hépato-carcinome, les
cellules Hep3B, l’invalidation de KLF10 réduit l’apoptose induite par le TGF-β. Sa surexpression
dans ces cellules augmente l’apoptose de façon dépendante du stress oxydatif (Jiang et al., 2012;
Ribeiro et al., 1999). Ce rôle opposé de KLF10, dans des cellules cancéreuses et différenciées,
pourrait s’expliquer par la présence de partenaire de co-activation ou répression différents, dans
un contexte où les voies de signalisation et le métabolisme cellulaire ne sont pas les mêmes.
L’ensemble de nos résultats suggèrent donc que Klf10 joue un rôle hépato-protecteur et limite
l’atteinte hépatique au cours de la stéatohépatite induite par le régime MCDD. Nous avons
également observé une augmentation de l’expression de Fsp27 dans le foie des souris Klf10-/-
nourries par un régime MCDD comparées aux WT pour le ZT3. De façon intéressante, Fsp27-β
est également un facteur pro-apoptotique capable d’induire le clivage des caspases pro-
apoptotiques, et qui augmente également la mort hépatocytaire en réponse au TNF-α (Inohara et
al., 1998; Liu et al., 2009 ; Sans et al., 2019; Tang et al., 2011; Yonezawa et al., 2011). De plus
150
l’expression de CIDEC2 /Fsp27-β, corrèle avec les marqueurs de souffrance hépatocellulaire chez
l’homme et la souris. L’absence de KLF10 pourrait donc modifier le niveau et le rythme
d’expression de Fsp27-β et ainsi augmenter la souffrance hépatique. Il reste à déterminer les
mécanismes responsables de ce rôle hépatoprotecteur, en évaluant, les différents types de morts
cellulaires affectées par l’absence de KLF10 (Apoptose, Nécrose, Nécroptose, Pyroptose). Cela
peut être accompli en caractérisant d’une part les différents marqueurs de mort en régime MCDD,
et d’autre part en utilisant des modèles d’hépatite aigües combinés à différentes souris ayant un
KO/KI conditionnel (Ripk1, Ripk1KD Ripk3, Tnfr etc.). Cette sensibilisation pourrait également
être indirecte, on sait par exemple que l’absence de Klf10 conduit à des déséquilibres métaboliques
(Guillaumond et al., 2010; Kammoun et al., 2019), qui pourraient sensibiliser la cellule à
l’apoptose via des mécanismes mitochondriaux. L’effet protecteur de Klf10 pourrait donc être un
effet métabolique.
L’expression hépatique de KLF10 corrèle avec les marqueurs de
souffrance hépatique chez les patients obèses.
Enfin, pour connaitre la relevance humaine de nos résultats, nous avons évalué l’expression
génique de KLF10 dans le foie de 31 patients obèses morbides ayant subi une chirurgie bariatrique.
Ces patients ont été caractérisés pour la présence ou non de NAFLD par histologie après biopsie
hépatique. La cohorte a ainsi été répartie en deux groupes de patients obèses sans (N=7, 1 homme
et 6 femmes) ou avec (N=24, 8 hommes et 16 femmes) des complications hépatiques. Nous avons
pu montrer que l’expression hépatique de KLF10 est augmentée chez les patients qui présentent
une NAFLD. De façon intéressante, son expression corrèle avec les marqueurs circulants de
souffrance hépatocellulaire : les ALAT et la K18 totale ainsi que la stéatose hépatique et le score
NAS. L’ensemble de ces prélèvements ont été réalisés la journée à des horaires variables pour des
151
raisons évidentes d’organisation du soin. L’expression de KLF10 dans ces conditions, peut être
regardée comme une expression moyenne de l’ensemble des points de jour. L’augmentation de
l’expression de KLF10 pourrait être un mécanisme de protection pour limiter la souffrance
hépatocytaire. L’augmentation de l’expression hépatique de KLF10 semble cependant dépendant
du statut métabolique, l’insulino-résistance et stéatosique. En effet, dans le modèle HFD,
l’expression circadienne de Klf10 conserve sa rythmicité et est augmenté de façon constante au
cours de la journée (Figure 26) (Eckel-Mahan et al., 2013). L’ensemble des résultats, et des
conclusions de notre étude sont récapitulés schématiquement dans la Figure 27.
Figure 27. Schéma récapitulatif de l’étude.
Dans un modèle murin de NASH, les gouttelettes lipidiques, la présence de foci inflammatoires, les
transaminases circulantes ainsi que l’expression hépatique des gènes horloges sont rythmiques.
Klf10 n’est cependant plus rythmique dans ces conditions. Enfin, KLF10 joue un rôle
hépatoprotecteur, en limitant la mort hepatocytaire au cours de la NASH.
152
Notre étude démontre la présence d’une rythmicité de transcrits et de marqueurs
pathologiques lors de la NASH dans le model MCDD. Il serait intéressant d’étendre cette
caractérisation à l’ensemble du spectre des NAFLD. Cela permettrait d’établir une cartographie
complète qui inclut la dimension temporelle, par l’utilisation de technique à haut débit (seqARN,
seqARN16S, ATAQseq, CyTOF, Métabolomique). Le modèle d’étude préférable serait un régime
diabétogénique, associé à une insulino résistance périphérique et hépatique comme le HFD-CD ou
le HFHSD. Pour avoir un aperçu mécanistique du rôle de l’horloge et de KLF10 au cours du
développement et de la sévérité des NAFLD, l’utilisation de souris invalidées ou exprimant
spécifiquement BMAL1 et/ou KLF10 dans les différents types cellulaires (hépatiques,
immunitaires, intestinaux) impliqués dans la progression des NAFLD seraient informatif. En
parallèle, il serait intéressant de mesurer les rythmes d’activité locomotrice et d’alimentation, de
corticostérone et de température. Enfin, il serait important de pouvoir réaliser ce type d’étude chez
l’Homme. Il serait en effet envisageable de réaliser une caractérisation rythmique des cellules, des
marqueurs biochimiques ainsi que des métabolites circulants dans une cohorte de patients sains,
obèses, obèses avec une NAFLD. Il serait également réalisable de déterminer l’activité
locomotrice et alimentaire de ces patients via l’utilisation d’application pour smartphone (Gill and
Panda, 2015).
La présence de tels rythmes a des implications dans la découverte de nouveaux
biomarqueurs mais également dans les possibilités d’approches thérapeutiques. En effet, bien que
de nombreuses molécules soient à l’essai chez l’Homme pour le traitement de la NASH fibrosante,
il n’existe pas encore de traitement pharmacologique approuvé. La rythmicité des cibles
thérapeutiques, offre la possibilité d’action sur l’horloge, ainsi que d’utiliser une approche chrono-
153
pharmacologique qui permet l’administration d’une drogue à un temps optimal pour une réponse
maximale et une toxicité minimale.
L’entraînement de l’horloge ou plus largement des rythmes, par l’alimentation pourrait être
inclus dans les mesures hygiéno-diététiques. Ces mesures ont montré qu’une perte de 10% du
poids est suffisant pour la réversion d’une NASH fibrosante (Hohenester et al., 2018). Par ailleurs,
le Time Restricted Feeding, c’est-à-dire la restriction de la prise alimentaire dans le temps sans
restriction calorique (e.g. 8h de prise alimentaire / 16h de jeün) (Zarrinpar et al., 2016), pourrait
avoir un bénéfique pour l’amélioration des paramètres cardio-métaboliques chez des sujet pré-
diabétiques, sans réduction de la masse corporelle (Sutton et al., 2018). Son efficacité chez les
sujets qui présentent de sérieuses complications n’est pour l’instant pas attestée. La durée
nécessaire pour observer des effets sur la correction de l’IR et du score NAS serait certainement
importante, ce qui, bien qu’il n’y ait pas de restriction calorique, ferait de l’assiduité à un tel régime
une réelle difficulté chez le sujet obèse. Cela pourrait être testé chez la souris dans un premier
temps en reproduisant les expériences de Time Restricted Feeding (TRF) dans des modèles de
NASH fibrosante (régimes MCDD, CDAA ou HFHSD par exemple).
Enfin, l’utilisation d’autres approches pour resynchroniser les rythmes comme des
compétiteurs de la mélanopsine la luminothérapie ou des molécules facilitant le sommeil
pourraient également être envisagé et être intéressante pour des stades ou l’horloge circadienne
serait fortement altérée (Jones et al., 2013; Serkh and Forger, 2014). Ces approches pourraient
également être utilisées en complément des autres stratégies thérapeutiques. Cibler l’horloge par
la pharmacologie vise à consolider ou rétablir les rythmes mais surtout à agir sur un ensemble de
cibles dans différents tissus, avec une seule molécule. Cette approche serait utile pour des stades
où l’horloge est modifiée et/ou sa fonction est impliquée dans la pathogenèse de la pathologie.
154
Enfin, la chronothérapie a permis d’obtenir des résultats satisfaisants là où les protocoles standards
ont échoués conduisant à l’arrêt de l’utilisation, d’une molécule ou de son développement (e.g.
irrinotrecan) (Cederroth et al., 2019; Dallmann et al., 2014; Dallmann et al., 2016). On peut
également remarquer que l’ensemble des cibles thérapeutiques à l’étude chez l’Homme sont des
cibles rythmiques potentiellement intéressantes pour la chronothérapie.
Une meilleure caractérisation et compréhension de la dimension temporelle dans la
progression des NAFLD, de la stéatose hépatique au carcinome hépatocellulaire permettra d’offrir
de nouvelles alternatives diagnostics, thérapeutiques et de médecine personnalisée.
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Annexe
Article annexe
Résumé
Mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la transition
stéatose-NASH est un impératif clinique important. Les protéines de la famille des Cell-death
inducing DFF45 like effector (CIDE A,B et C) régulent l’homéostasie lipidique en contrôlant la
taille des gouttelettes lipidiques ou la synthèse des VLDL. Cependant, ces protéines et en
particulier FSP27, peuvent également réguler la mort cellulaire. Ce travail démontre que
l’expression hépatique de CIDEA et FSP27 (α/β) est augmentée dans des modèles de stéatose
hépatique associée à l’obésité (modèle HFD). A l’inverse, alors que l’expression de CIDEA et
Fsp27-α diminue, celle de Fsp27-β augmente fortement dans le modèle de stéatohépatite induite
par le régime MCDD. Cette différence d’expression entre Cidea et Fsp27-β s’accentue avec la
durée du régime et la sévérité de l’inflammation et de la souffrance hépatocellulaire. Chez
l’Homme, l’expression de CIDEC2 (l’homologue humain de Fsp27-β) corrèle aussi avec le
NAFLD activity score (NAS) et la souffrance hépatocellulaire. Bien que l’expression hépatique
de CIDEA ait tendance à augmenter avec l’obésité, son expression diminue avec la sévérité des
complications. Dans des lignées d’hépatocytes, l’invalidation de FSP27-β conduit au
fractionnement des gouttelettes lipidiques en réponse à l’acide oléique, et sa surexpression diminue
l’expression de BCL-2 (facteur anti-apoptotique). Les cellules qui surexpriment FSP27-β sont
également plus sensibles à la mort induite par le TNFα et les acides gras saturés. L’ensemble de
ces résultats chez l’animal, l’Homme et in vitro, indiquent que l’expression différentielle de
FSP27-β/CIDEC2 et CIDEA est associée à la progression des complications hépatiques et à la
souffrance hépatocellulaire.
1Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
www.nature.com/scientificreports
The Differential Expression of Cide Family Members is Associated with Nafld Progression from Steatosis to SteatohepatitisArnaud Sans1,2, Stéphanie Bonnafous1,2, Déborah Rousseau1, Stéphanie Patouraux1,2, Clémence M. Canivet1,2, Pierre S. Leclere1, Jeanne Tran-Van-Nhieu3, Carmelo Luci 1, Béatrice Bailly-Maitre1, Xu Xu 4, Ann-Hwee Lee5, Kaori Minehira6, Rodolphe Anty1,2, Albert Tran1,2, Antonio Iannelli1,2 & Philippe Gual1
Improved understanding of the molecular mechanisms responsible for the progression from a “non-pathogenic” steatotic state to Non-Alcoholic Steatohepatitis is an important clinical requirement. The cell death-inducing DFF45 like effector (CIDE) family members (A, B and FSP27) regulate hepatic lipid homeostasis by controlling lipid droplet growth and/or VLDL production. However, CIDE proteins, particularly FSP27, have a dual role in that they also regulate cell death. We here report that the hepatic expression of CIDEA and FSP27 (α/β) was similarly upregulated in a dietary mouse model of obesity-mediated hepatic steatosis. In contrast, CIDEA expression decreased, but FSP27-β expression strongly increased in a dietary mouse model of steatohepatitis. The inverse expression pattern of CIDEA and FSP27β was amplified with the increasing severity of the liver inflammation and injury. In obese patients, the hepatic CIDEC2 (human homologue of mouse FSP27β) expression strongly correlated with the NAFLD activity score and liver injury. The hepatic expression of CIDEA tended to increase with obesity, but decreased with NAFLD severity. In hepatic cell lines, the downregulation of FSP27β resulted in the fractionation of lipid droplets, whereas its overexpression decreased the expression of the anti-apoptotic BCL2 marker. This, in turn, sensitized cells to apoptosis in response to TNF α and saturated fatty acid. Considered together, our animal, human and in vitro studies indicate that differential expression of FSP27β/CIDEC2 and CIDEA is related to NAFLD progression and liver injury.
Non Alcoholic Fatty Liver Diseases (NAFLD) is a major public health concern with global prevalence ranging from 22% to 28%1. NAFLD is increasingly recognized as the most common chronic liver disease1. The spectrum of the hepatic diseases ranges from steatosis (fatty liver) to nonalcoholic steatohepatitis (NASH) (steatosis, inflam-mation, liver injury) and subsequently to the activation of fibrogenic pathways, which correlates with a high risk of developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Despite lifestyle changes and bariatric surgery for severe/morbid obesity, the treatment of NAFLD (NASH) is still limited because of the lack of effective pharmacological treatment as well as lack of effective and practical diagnostic tools. NAFLD is associated with obesity and met-abolic syndrome and the presence of type 2 diabetes mellitus can increase the risk of liver diseases2,3. Inversely, NAFLD is also a risk factor for many metabolic diseases, including type 2 diabetes4 and cardiovascular disease5.
The mechanisms underlying the transition from steatosis to NASH are multifactorial and not fully elucidated. The hepatocyte accumulation of triglycerides in lipid droplets is a protective mechanism that buffers free fatty acids and prevents lipotoxicity6. However, this protective mechanism can be overwhelmed. To illustrate this, it has
1Université Côte d’Azur, INSERM, U1065, C3M, Nice, France. 2Université Côte d’Azur, CHU, INSERM, U1065, C3M, Nice, France. 3HU Henri Mondor, Department of Pathology, AP-HP - Université Paris Est Créteil, Créteil, France. 4Weill Cornell Medicine, Department of Medicine, Division of Gastroenterology and Hepatology, New York, USA. 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College, New York, USA. 6University of Lausanne, Department of Physiology, Lausanne, Switzerland. Arnaud Sans, Stéphanie Bonnafous and Déborah Rousseau contributed equally. Correspondence and requests for materials should be addressed to P.G. (email: [email protected])
Received: 8 August 2018
Accepted: 3 May 2019
Published: xx xx xxxx
opeN
2Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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been reported that the inhibition of the triglyceride synthesis via the targeting of diacylglycerol acyltransferase 2 (DGAT2) improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fibrosis in obese mice with NASH7. The vulnerable fatty hepatocytes generate danger signals including the release of alarmins and damage-associated molecular patterns as well as the enrichment of apoptotic bodies. This activation of sterile inflammation is involved in the initiation of a vicious cycle, where inflammation enhances hepatocyte death and vice-versa.
The cell death-inducing DFF45 like effector (CIDE) protein family, including CIDEA, CIDEB and CIDEC/fat-specific protein 27 (FSP27), are lipid droplet-associated proteins. Since these proteins regulate lipid droplet synthesis and hepatic lipid homeostasis, they could be key players in the control of NAFLD progression8. The CIDEA is a short-lived protein that is mainly controlled by the sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c; master transcription factor regulated de novo lipogenesis) and shows increased expression in the case of hepatic steatosis9,10. Its overexpression in mouse liver resulted in augmented hepatic lipid accumulation and the formation of large lipid droplets. In contrast, the hepatic knockdown of CIDEA in obese mice resulted in significantly reduced hepatic lipid accumulation and smaller lipid droplets10. CIDEB is highly and constitutively expressed in the liver and controls both insulin sensitivity and VLDL maturation11,12. CIDEC, also known as fat-specific protein 27 (FSP27) in mouse, is also highly expressed in fatty liver and knock-down of its expression in fatty liver tissue ameliorated hepatic steatosis13–17. Its overexpression in hepatic cells enhanced the triglyceride content of lipid droplets17. The two FSP27α and β isoforms of mouse FSP27 (corresponding to human CIDEC1 and 2, respectively) are regulated by the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ)14–17 and Cyclic-AMP-responsive-element-binding protein H (CREBH)18,19. The CIDE protein family can also mediate cell death depending on their expression levels and cellular localization20–23.
The relative expression levels of the three CIDE members over the transition period from simple steatosis to NASH has not yet been investigated. Interestingly, it has recently been reported that the strong upregulation of FSP27/CIDEC, with no change to CIDEA and CIDEB expression levels, contributes to alcohol-induced liver damage19. We therefore evaluated the expression level of the three CIDE members in NASH development and liver injury in experimental mouse models and in a cohort of patients at various stages of NAFLD progression.
ResultsHepatic expression of CIDEA, FSP27α and β increased with obesity-induced hepatic steatosis. We first evaluated the hepatic expression levels of CIDEA, CIDEB and FSP27α and β in dietary mouse models of obesity and hepatic steatosis. After 33 weeks of high-fat diet (HFD), the wild-type C57BL/6 (Wt) mice devel-oped obesity (Supplementary Fig. 1A), severe hepatic steatosis (Supplementary Fig. 1B,C) and hepatic injury as assessed by ALT activity (Supplementary Fig. 1D). The hepatic expression levels of CIDEA and FSP27 α and β were robustly increased upon 33 weeks of HFD at both the mRNA (Fig. 1A) and protein (CIDEA and FSP27) (Fig. 1B) level. Hepatic expression of CIDEA, FSP27 α and β also correlated with hepatic steatosis and liver injury (Fig. 2A,B). These occurred at the same extent as evaluated by the FSP27 α /CIDEA and FSP27 β/CIDEA ratios which did not change with hepatic steatosis and did not correlate with liver injury (Figs 1C, 2C). The hepatic expression of FSP27α and β were similarly increased in obese mice (Fig. 1C: relative expression of FSP27β versus FSP27α). Even though it is robustly expressed in the liver (data not shown), hepatic expression of CIDEB did not change with obesity or hepatic steatosis (Fig. 1A). Steatosis and/or obesity were thus associated with the upregu-lation of the hepatic expression of CIDEA, FSP27α and β.
Differential expression of CIDEA and FSP27β is related to the severity of the MCDD-mediated steatohepatitis. To subsequently investigate the behavior of the CIDECs in response to the progression and the severity of the NAFLD, we monitored their hepatic expression in wild-type mice fed a diet deficient in methionine and choline (MCDD) for 2 and 7 weeks. At 2 weeks, mice developed moderate hepatic steatosis with mild hepatic inflammation and liver injury (Supplementary Fig. 2). The long-lasting MCDD challenge (7 weeks) aggravated the liver complications with severe steatosis (from 50 ± 8% at 2 w to 81 ± 3% at 7 w, p = 0.0201), inflammation (from 9 ± 3 foci/10 fields at 2 w to 77 ± 7% at 7 w, p = 0.0024) and liver injury (ALT activity from 51 ± 7 U/L at 2 w to 282 ± 42 U/L at 7 w, p = 0.0024) (Supplementary Fig. 2). Hepatic CIDEA decreased in concert with the severity of the NAFLD at both the mRNA and the protein level (Fig. 3A, D). Its hepatic expression nega-tively correlated with hepatic inflammation (number of inflammatory foci) and liver injury (ALT activity) after 7 weeks of MCDD (Fig. 4A). In contrast, the hepatic FSP27β was robustly augmented as NAFLD severity increased, from a 13-fold (±3) increase at 2 weeks to a 28-fold (±2) increase after 7 weeks of MCDD (Fig. 3B, D). Hepatic FSP27β also correlated with inflammation and liver injury after 7 weeks of MCDD (Fig. 4B). The increased FSP27 expression was mainly caused by the upregulation of FSP27β since FSP27α expression tended to decrease (Fig. 3B). This inverse regulation pattern for CIDEA and FSP27β expression was better illustrated by the FSP27β/CIDEA ratio, with a 21-fold increase at 2 weeks versus a 48-fold increase at 7 weeks, p = 0.017 (Fig. 3C). This ratio also strongly correlated with hepatic inflammation and liver injury (Fig. 4C). The severity of the steatohepatitis was thus associated with an opposite expression of CIDEA and FSP27β.
Hepatic CIDEC2 correlated with the severity of the NAFLD in obese patients. To address the human relevance of our findings, we examined the relationship between hepatic CIDEA, CIDEB, CIDEC1 and CIDEC2 expression and the NAFLD progression from normal liver to steatosis and subsequent NASH in human liver biopsies from morbidly obese patients seeking for bariatric surgery. Patients were classified into 3 groups: without NAFLD, with hepatic steatosis (Steatosis) and with NASH (NASH) (assessed on the basis of three histo-pathological features steatosis, lobular inflammation and hepatocellular ballooning; Table 1, Supplementary Fig. 3 and Supplementary Methods). Liver mRNA levels of CIDEC2 were progressively upregulated with hepatic steato-sis and subsequent NASH (Fig. 5A). This expression correlated with NAFLD features including hepatic steatosis, NASH and NAFLD activity score (NAS)(Fig. 5B). Hepatic CIDEC2 also correlated with hepatic injury as assessed
3Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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by ALT activity (Fig. 5C) and serum levels of keratin 18 (hepatocyte death marker) and caspase-generated keratin 18 fragment (hepatocyte apoptotic marker)24,25 (Fig. 5C). As reported in the mouse model of steatohepatitis, the upregulation of CIDEC is mainly related to CIDEC2 expression since CIDEC1 is not altered (data not shown). In contrast, hepatic CIDEA tended to increase in obesity (lean versus obese patients without NAFLD) and then to decrease in NAFLD (Fig. 5A). This relationship was significantly amplified when the CIDEC2/CIDEA ratio was evaluated (with NAS: rs = 0.861, p < 0.001, n = 26)(Supplementary Fig. 3). Consistent with our animal results, the CIDEB expression was not modified with obesity and NAFLD (Fig. 5A) in human studies.
Down regulation of FSP27β resulted in a decreased lipid droplet size in mouse hepatocytes. Since FSP27β is localized on the surface of lipid droplets and is known to suppress lipolysis18, we therefore investi-gated if altered FSP27β expression could affect hepatocyte lipid droplet synthesis. The down-regulation of FSP27β in AML12 hepatocytes (Fig. 6A), the main isoform expressed in hepatocyte (Fig. 6A), modified the size distribu-tion of the lipid droplets in response to oleic acid (Fig. 6B, C). The number of small lipid droplets increased, while the number of large lipid droplets decreased. FSP27β expression could thus be involved in the development of hepatic macro-steatosis.
Overexpression of FSP27β sensitized hepatocytes to cell death in response to TNFα and pal-mitic acid and led to decreased BCL2 expression. FSP27, in addition to regulating lipid droplet devel-opment, could also mediate apoptosis in an expression-dependent fashion21,22,26. Furthermore, our human and experimental data strongly suggested that the expression level of FSP27β (mouse)/CIDEC2 (human) was associ-ated with NAFLD progression and correlated with liver injury in NAFLD (Figs 2, 4 and 5). As TNFα was strongly upregulated in NASH liver, strongly correlated with ALT activity (HFD mice: rs = 0.666, p = 0.007, n = 15; 7 weeks MCDD mice: rs = 0.879, p = 0.002, n = 9) and well reported to mediate hepatocyte death27–30, we first
Ctrl D HFDA
B
HSP90
CIDEA
FSP27
Ctrl D HFD
0
5
10
15
20
25
CIDEA CIDEB
p=0.001
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
C
p= 0.0009
p= 0.0015
FSP27α FSP27β
0
50
100
150
200 **
FSP27β vs FSP27α
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
FSP27α/CIDEAratio
FSP27β/CIDEAratio
p>0.9999
P=0.8357
Figure 1. Hepatic expression of CIDEA, FSP27α and FSP27β increased with hepatic steatosis induced by HFD challenge. Wild-type mice fed a control diet (Ctrl D) (n = 7) or HFD (n = 7) for 33 weeks. (A, C) Hepatic expression of CIDEA, CIDEB, FSP27α and FSB27β was evaluated in Wt, Ctrl D and HFD mice at the mRNA level (7 mice/group). The gene expression was normalized to the mRNA levels of B2M or 36B4. Results are expressed relative to the expression level in controls (means ± SEM) and statistically analyzed using the Mann–Whitney test. (B) Hepatic expression of CIDEA, FSP27 and HSP90 was evaluated in Wt, Ctrl D and HFD mice at the protein level (2–4 mice/group). *p < 0.05.
4Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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evaluated the effect of the FSP27β overexpression on the sensitivity to cell death under basal conditions and in response to TNFα and TNFα with actinomycin D (Acti D). At baseline, the overexpression of FSP27β (Fig. 7A) caused minor increased cell death as evaluated by flow cytometry (Fig. 7B). This slight effect could be explained by the low percentage of transfected cells (20.48 ± 2.84% of GFP+ cells; n = 4). Interestingly, this cell death was associated with a decrease in anti-apoptotic BCL2 expression (Fig. 7A). Furthermore, these effects were further amplified in response to TNFα and TNFα with Acti D in HEPG2 cells overexpressing FSP27β, versus control HEPG2 hepatocytes (Fig. 7B). We then evaluated the effect of the FSP27β overexpression on HEPG2 viability in response to saturated fatty acid (palmitic acid), key player in hepatocyte lipotoxicity. Again, the cell viability was further decreased in response to palmitic acid in HEPG2 cells overexpressing FSP27β, versus control HEPG2 hepatocytes (Fig. 7C). By regulating hepatic steatosis and liver injury, FSP27β thus plays a key role in the NAFLD progression to more severe complications, i.e., NASH.
DiscussionHere we report differential hepatic expression of CIDEA and FSP27β/CIDEC2 in response to increasing NAFLD severity. Hepatic FSP27β/CIDEC2 expression was not associated with obesity, but progressively increased with hepatic steatosis and subsequent steatohepatitis in mouse and human studies, respectively. In contrast, hepatic CIDEA increased with obesity but its hepatic expression tended to decrease with the severity of the steatohep-atitis. The FSP27β/CIDEC2 to CIDEA ratios better illustrated this opposing regulatory pattern and strongly
A
B
C
CID
EA(fo
ld)
Steatosis (%) ALT (U/L)FS
P27α
/CID
EA ra
tio
Steatosis (%) ALT (U/L)
FSP2
7β/C
IDEA
ratio
Steatosis (%) ALT (U/L)
FSP2
7α(fo
ld)
FSP2
7β(fo
ld)
Steatosis (%) ALT (U/L) Steatosis (%) ALT (U/L)
rs=0.779p=0.001n=14
rs=0.743p=0.002n=14
rs=0.656P=0.011n=14
rs=0.794P=0.001n=14
rs=0.801P=0.001n=14
rs=0.670p=0.009n=14
rs=-0.06p=0.822n=14
rs=-0.20p=0.486n=14
rs=0.045p=0.879n=14
rs=0.044p=0.881n=14
Figure 2. Hepatic CIDEA, FSP27α and FSP27β correlated with hepatic steatosis and liver injury in HFD-induced obese mice. Correlation between hepatic expression of CIDEA (A), FSP27α, FSB27β (B), FSP27α/CIDEA ratio or FSP27β/CIDEA ratio (C) (fold) with hepatic steatosis (%) and ALT in Wt, Ctrl D and HFD mice (7 mice/group, 33 weeks of challenges) were analyzed using the Pearson’s correlation test.
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correlated with hepatic inflammation (number of inflammatory foci in mouse studies, and NASH and NAS in patients) and liver injury (ALT activity in mouse and human studies).
As previously demonstrated, the hepatic expression of CIDEA is increased in a mouse model of diet-induced obesity and hepatic steatosis9,10. This upregulation could be more closely associated with obesity than hepatic steatosis. Indeed, its hepatic expression tended to increase in obese patients without liver complications and metabolic syndrome, compared to lean patients. It has also been reported that the hepatic expression of CIDEA correlates with body mass index in obese patients31. CIDEA polymorphism has also been associated with obe-sity in human32,33, although this could be more closely related to its role in adipose tissue. The role of CIDEA in hepatic triglyceride accumulation and lipid droplet formation has been clearly demonstrated and its targeting (overexpression and down regulation) regulates hepatic steatosis in obese mice10. In our cohort of obese patients and in a mouse model of steatohepatitis, the hepatic expression of CIDEA decreased with the severity of liver injury and steatohepatitis. However, it is important to emphasize that this is specific for CIDEA. Indeed, other important elements in the regulation of lipid droplet synthesis, such as PLIN5 and PNPLA2, are still upregulated in the fatty liver tissue of MCDD mice (after 7 weeks of MCDD: 2.3-fold increase for PLIN5, p = 0.0142; 3.13-fold increase for PNPLA2) and strongly correlate with hepatic steatosis in obese patients (PLIN5: rs = 0.698, p < 0.001, n = 30; PNPLA2, rs = 0.767, p < 0.001, n = 30). Since CIDEA expression is mainly dependent on SREBP1c9,10 and
Ctrl D MCDDA
CIDEA
0
0.5
1.0
1.5
2.0
p=0.093 p=0.014
p=0.109
2 Wks 7 WksCIDEB
0
0.5
1.0
1.5
2.0
p=0.241 p=0.915
2 Wks 7 Wks
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
HSP90
CIDEA
FSP27
Ctrl D MCDD
7 Wks
D
B
0
10
20
30
40p=0.017
p=0.011
p=0.006
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
0
0.5
1.0
1.5
2.0 p=0.012
FSP27α2 Wks 7 Wks
FSP27β2 Wks 7 Wks
C
FSP2
7β/C
IDEA
ratio
0
10
20
30
40
50
60
7 Wks
*
*
2 Wks
p=0.017
Figure 3. Hepatic expression of FSP27β strongly increased with the severity of NAFLD whereas CIDEA expression decreased. Wild-type mice fed a control diet (Ctrl D) (n = 4) or MCDD (n = 6) for 2 and 7 weeks. (A, B, C) Hepatic expression of CIDEA, CIDEB, FSP27α and FSP27β was evaluated in Wt, Ctrl D and MCDD mice at the mRNA level (4–6 mice/group). The gene expression was normalized to the mRNA levels of B2M or 36B4. Results are expressed relative to the expression level in controls (means ± SEM) and statistically analyzed using the Mann–Whitney test. (D) Hepatic expression of CIDEA, FSP27 and HSP90 was evaluated in Wt, Ctrl D and MCDD mice at the protein level (2–5 mice/group). *, versus Ctrl D, p < 0.05
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the down-regulation of SREBP-1c has been associated with the development of burned-out NASH34, the decrease in CIDEA could reflect the severity of NAFLD (NASH with fibrosis).
Similarly, the progressive upregulation of FSP27β/CIDEC2 with the progression of NAFLD could be a marker but also an important player. This gradual increase is more closely associated with FSP27β/CIDEC2 than FSP27α/CIDEC1 in mouse and human studies. Xu et al., who first described the β isoform of FSP27 in fatty liver, also reported its upregulation in mouse models of diet-induced obesity and steatohepatitis and in human studies18. The “mild” upregulation of FSP27β could be related to hepatic steatosis as we and other groups have previously reported (Fig. 1 and13–17). Furthermore, we have observed that its down-regulation in hepatic cells promoted the fractionation of lipid droplets in response to oleic acid. In accordance with this, it has been reported that the down-regulation of FSP27β in steatotic liver tissue resulted in reduced accumulation of hepatic triglycerides and lipid droplets17.
The strong upregulation of FSP27β/CIDEC2 could be more closely related to steatohepatitis and liver injury. Hepatic expression of FSP27β/CIDEC2 shows a strong correlation with liver injury as evaluated by ALT activity (in mouse and human studies) and a serum marker of hepatocyte apoptosis (in humans). With the increasing severity of the steatohepatitis, hepatic expression of FSP27β rises to a 28-fold (±2) increase in 7 weeks MCDD mice, versus a 13-fold (±3) increase in 2 weeks MCDD and HFD mice. We also observed that overexpression of FSP27β sensitized hepatocytes to cell death mediated by cytokine (TNFα) and saturated fatty acid (palmitic acid). Several groups have reported that FSP27 is a potent apoptotic inducer via the activation of the pro-apoptotic caspases, which trigger both the release of cytochrome c from mitochondria and DNA fragmentation20–23. This apoptotic role for FSP27 was found to require the CIDE-C domain. In line with this, overexpression of CIDE-C domain containing FSP27α also sensitized hepatocytes to cell death mediated by cytokine (TNFα)
)L/U( TLAsdleif 01/icofrbN
)L/U( TLAsdleif 01/icofrbN
)L/U( TLAsdleif 01/icofrbN
A
B
C
CID
EA(fo
ld)
FSP2
7β/C
IDEA
ratio
FSP2
7β(fo
ld)
rs=-0.772p=0.009n=10
rs=-0.715p=0.020n=10
rs=0.652p=0.041n=10
rs=0.815p=0.004n=10
rs=0.652p=0.041n=10
rs=0.863p=0.001n=10
Figure 4. Hepatic CIDEA and FSP27β negatively and positively correlated with steatohepatitis and liver injury in MCDD mice, respectively. Correlation between hepatic expression of CIDEA (A), FSP27β (B) or FSP27β/CIDEA ratio (C) (fold) with hepatic steatosis (%) and ALT activity (U/L) in Wt, Ctrl D and MCDD mice (4–6 mice/group, 7-week challenge) were analyzed using the Pearson’s correlation test.
7Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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(Supplementary Fig. 4), while FSP27α expression tended to decrease with the severity of the steatohepatitis. Interestingly, the same domain of FSP27 also mediated its localization to lipid droplets and its interaction with CIDEA21,35. The inverse patterns of regulation for the hepatic expression of CIDEA (down-regulated) and FSP27β (up-regulated) is robustly amplified with the NAFLD progression (FSP27β/CIDEA ratio ranges from 1.6 ± 0.6 in simple steatosis (HFD mice) to 21 ± 2 in steatohepatitis (2 weeks MCDD mice) and 48 ± 7 with advanced steato-hepatitis (7 weeks MCDD mice)). This opposing regulatory pattern could also modify the role of the C domain of FSP27β, which could be more involved in the alteration of lipid droplets or the initiation of the apoptotic pro-gram, rather than binding with CIDEA.
Interestingly, the role of FSP27/CIDEC has recently been investigated in alcoholic steatohepatitis. Xu et al. have reported that the elevation of FSP27 (both isoforms with FSP27β 1000-fold higher than FSP27α) was likely to induce steatosis and liver injury in mouse model of chronic plus binge ethanol feeding. In this mouse model, the expression of CIDEA and CIDEB was not modified, hepatic FSP27 was strongly upregulated and the down regulation of FSP27 in hepatocytes prevented liver injury combined with the mitochondrial production of ROS. The authors also reported that hepatic expression of CIDEC mRNA increased more than 40-fold in samples from patients with alcoholic hepatitis and correlated with severity of the disease19. The authors further reported that the sustained FSP27 elevation in hepatocytes likely causes chronic liver injury and inflammation, and may subse-quently induce fibrosis in a mouse model that combines chronic and acute-on chronic liver injury19.
Finally, we also report that the hepatic expression of CIDEB (at the mRNA level) is independent of obesity, as previously reported31,36, and also independent of hepatic steatosis and steahepatitits in mouse and human studies. While the level of gene expression was stable, CIDEB was the most highly expressed among the 3 members of the CIDE family in hepatocytes (2000x more than CIDEA and 400x more than FSP27/CIDEC in mice and humans) and could be an important player in the development of hepatic steatosis since it regulates the formation of triacylglycerol-enriched VLDL particles36.
In this current study, we demonstrated that the hepatic expressions of the members of the CIDE family are differentially regulated according to the development and the severity of NAFLD in mouse and human studies. The gradual elevation of FSP27β/CIDEC2 expression with the development of hepatic steatosis and subsequent steatohepatitis reinforces our interest in this protein as a potential therapeutic target. It would need to be targeted only when robustly upregulated, and in a hepatocyte-specific manner in order to maintain its beneficial role in the storage of lipids in adipocytes37.
Material and MethodsHuman samples. In this study, human samples (blood, liver biopsy) were from twenty-eight morbidly obese patients and five lean subjects. All information relative to the patients are described in Supplementary Methods, Table 1 and Ethics approval section.
Mice. Male mice were used in all experiments described in Supplementary Methods. All animal experiments were approved by the CIEPAL and Use committee.
Real-time quantitative PCR analysis has been performed as previously described38,39 and described in the Supplementary Methods.
Immunoblotting. Cells or frozen tissues were solubilized in lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaF, 2 mM sodium orthovanadate, 10 mM pyrophosphate, proteases inhibitors cocktail,
without NAFLD with steatosis with NASH p
n 5 14 9
Age (years) 39.4 ± 5.9 37.4 ± 2.4 45.8 ± 3.6 0.186
Sex (F/M) 4/1 14/0 4/5 0.005
BMI (kg/m²) 43.4 ± 0.7 44.1 ± 1.4 43.3 ± 1.8 0.851
ALT (IU/L) 18.20 ± 4.48 26.47 ± 2.95 81.44 ± 26.19*,# <0.001
Insulin level (mIU/L) 7.00 ± 1.10 15.46 ± 3.21 28.67 ± 4.56*,# 0.003
Glucose level (mmol/L) 4.88 ± 0.14 5.44 ± 0.13* 6.70 ± 0.72* 0.014
HOMA-IR 1.52 ± 0.24 3.77 ± 0.80* 8.51 ± 1.36*,# 0.001
HbA1c (%) 5.34 ± 0.22 5.62 ± 0.12 6.40 ± 0.38*,# 0.028
Triglycerides (mmol/L) 1.05 ± 0.15 1.41 ± 0.17 3.42 ± 1.07*,# 0.007
HDL cholesterol (mmol/L) 1.53 ± 0.18 1.52 ± 0.10 1.07 ± 0.37*,# 0.006
NAFLD Activity Score (n) 0(5) 1(4)/2(4)/3(6) 5(9)
Grade of steatosis (n) 0(5) 1(4)/2(4)/3(6) 3(9)
Lobular inflammation (n) 0(5) 0(14) 1(9)
Hepatocellular ballooning (n) 0(5) 0(14) 1(9)
Table 1. Characteristics of 28 morbidly obese patients. Without NAFLD: patients with normal liver histology; Steatosis: patients with steatosis; NASH: patients with severe steatosis and NASH. Data are expressed as mean ± SEM and compared using the non parametric Kruskal-Wallis test (column p) and Mann Whitney test (*, #) for quantitative values and or Khi-deux test for qualitative values. *p < 0.05 compared with “Without NAFLD”. #p < 0.05 compared with “Steatosis”.
8Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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and 1% Triton X-100) for 45 min at 4 °C. Lysates were cleared (14 000 rpm, 15 min). Proteins were quantified (BCA Protein assay kit, 23225 Thermo Fisher Scientific Inc.), separated by SDS-PAGE and immunoblotted as previously described38. The proteins were probed with anti-CIDEA (NBP1-76950, Novus Biologicals), anti-FSP27 (ab77115, ab198204 Abcam), and anti-HSP90 (#4877, Cell Signaling) antibodies at 1 µg/mL.
Without NAFLD NASHLean Steatosis
A
B
0
1
2
3
4
5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0102030405060708090
100
0
50
100
150
200
250
300
AEDIC/2CEDIC2CEDICAEDICratio
CIDEB
p=0.003
p=0.017
P=0.011P=0.011
p=0.007
p=0.016
P=0.003P<0.001
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
CID
EC2
(fold
)
SANHSAN)%(sisotaetS
rs=0.742p<0.001n=28
rs=0.573p=0.001n=28
rs=0.686p<0.001n=28
rekramcitotpopA)L/U(TLA(K18 fragment)(U/L)
Cell death marker (K18)(U/L)
CID
EC2
(fold
) rs=0.679p<0.001n=28
rs=0.500P=0.011n=25
rs=0.611P=0.011n=25
C
Figure 5. Hepatic CIDEC2 expression progressively increased with steatosis and NASH in obese patients. (A) Liver CIDEA, CIDEB and CIDEC2 mRNA expression levels were analyzed by real-time quantitative PCR in lean patients (n = 5), in morbidly obese patients without NAFLD (n = 5), with hepatic steatosis (n = 14) and with NASH (n = 9). The gene expression values were normalized to RPLP0 mRNA levels. Results are expressed relative to the expression level in controls (means ± SEM) and statistically analyzed using the Mann–Whitney test. (B, C) Correlation between hepatic CIDEC2 expression (fold) with hepatic steatosis (%), ALT, NASH and NAFLD activity score (NAS), serum markers of hepatocyte apoptosis (caspases-generated keratin 18 fragment) and hepatocyte death (keratin 18) in 25–28 obese patients were analyzed using the Pearson’s correlation test.
9Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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Cellular models and treatments. Down regulation of FSP27. Down regulation of FSP27 was achieved using ON-TARGET plus SMART pool technologies (L-040997, Mouse FSP27, NM_178373 or non-targeting siRNA as a control, Darmacon, CO) and Lipofectamine RNAiMAX technologies (MSS236551, Mouse FSP27 Life Technologies) in AML-12 hepatocytes (ATCC, CRL-2254). Following a 24-hour transfection, oleic acid (0.5 mM) was applied to cells for 16 hours. Cells were then rinsed twice with PBS and fixed with 4% formaldehyde solution. Lipid droplets were stained by Oil-Red O solution for 5 min. Microscope slides were prepared (x60 magnification) for lipid droplet quantification. The area of the lipid droplets was quantified (in pixels squared) and normalized by the number of nuclei on the slides.
Overexpression of FSP27β. HEPG2 cells (ATCC HB-8065) were transfected with pCMV-HA FSP27β or the empty plasmid (provided by Drs Xu Xu and Ann-Hwee Lee18) using a Jet PEI-hepatocyte mix assay (102-05NOzyme). After 48 h, cells were treated with TNFα (20 ng/ml), actinomycin D (0.1 µg/ml) with TNFα (20 ng/ml) or palmitic acid (1 mM) for 16 h. Gene expression, cell viability and cell death were then evaluated as indicated.
MTT assay. The assay is dependent on the ability of viable cells to metabolize a water-soluble tetrazolium salt into a water-insoluble formazan product. Following the indicated treatments, cells were incubated for 2 h with 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) in serum-free medium (DMEM). After removing the supernatant, DMSO was added to completely dissolve the formazan product. Aliquots of the resulting solutions were transferred to 96-well plates and the absorbance was recorded at 550 nm using the microplate spectrophotometer system (ELX800, Bio-TEK instruments). Results are presented as a per-centage of the control values.
Cell death. Flow cytometry was used to evaluate cell death following double staining with annexin-V-PE and 7-AAD according to the manufacturer’s instructions (Annexin V-PE apoptosis detection kit I, BD Biosciences, Pont de claix, France).
si Fsp27si Ctrl
BA
Lipi
d dr
ople
t num
ber
(nor
mal
ized
by
nucl
ei n
umbe
r)
0
10
20
30
40
0 1-10 11-30 31-50 51-100 100-300 >300
Lipid droplet area (Pixel^2)
C
si Fsp27
si Ctrl
mR
NA
leve
l(r
elat
ive
expr
essi
on)
0
10
20
30
40
50
60
70
Fsp27β vs α Fsp27β Fsp27α
P<0.001
*
0
0.5
1.0
1.5
mR
NA
leve
l (vs
Fsp
27β)
Figure 6. Down regulation of FSP27β resulted in the fractionation of lipid droplets in AML12 hepatocytes. AML12 hepatocytes after control (siCtrl) or FSP27 silencing (si FSP27) were stimulated with oleic acid (0.5 mM) for 16 h (n = 3). (A) FSP27α and FSP27β mRNA expression levels were analyzed by real-time quantitative PCR. The gene expression was normalized to RPLP0 mRNA levels. (B,C) Lipid droplets were stained by Oil-Red O solution for 5 min. (B) Representative pictures are shown. (C) Lipid droplet areas were quantified (in pixels squared) and normalized according to the number of nuclei on the slides. Results are expressed relative to the control (siCtrl) as means ± SEM. Data were statistically analyzed using the Student’s t-test. *, versus siCtrl, p < 0.05.
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Statistical analysis. Statistical significance between two human or mouse study groups was determined using the nonparametric Mann–Whitney test. Data from cell lines were statistically analyzed using the Student t-test. Pearson’s correlation test has been used for the correlative analysis. Significance has been considered for P < 0.05.
Ethics approval. All subjects gave their informed written consent to participate in this study in accord-ance with French legislation regarding Ethics and Human Research (Huriet-Serusclat law). The “Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Nice” approved the study (07/04:2003, N° 03.017). The guidelines of laboratory animal care were followed. The local CIEPAL committee (Comité Institutionel d’Ethique Pour l’Animal de Laboratoire, national agrement n° 28) has approved the animal exper-iments (NCE/2013-108, APAFIS#51 00–20 15121 1 10477413 v6). (Authorization of the C3M animal facility: B06-088-20).
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Figure 7. Overexpression of FSP27β enhanced cell death in response to TNFα and palmitic acid in HEPG2 hepatocytes. (A) HEPG2 cells were transfected with pCMV-HA and pCMV-HA-FSP27β as indicated. After 48 h, the human BCL2, mouse FSP27 and human CIDEC mRNA expression levels were analyzed by real-time quantitative PCR. The gene expression values were normalized to RPLP0 mRNA levels (n = 4). (B,C) After overexpression of FSP27β with pCMV-HA-FSP27β transfection in HEPG2 cells, (B) cell death (flow cytometry)(n = 4) were evaluated in the basal state and in response to TNFα (20 ng/ml) and actinomycin D (0.1 µg/ml) with TNFα (20 ng/ml) for 16 h and (C) cell viability (MTT assay)(n = 3), in response to palmitic acid (1 mM) for 16 h. Results relative to the control (pCMV-HA) are expressed as means ± SEM. Data were statistically analyzed using the Student’s t-test. *, versus pCMV-HA p < 0.05.
1 1Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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AcknowledgementsOur thanks to (i) the INSERM U1065 animal facility staff and Dr V.Corcelle and (ii) Abby Cuttriss from the Office of International Scientific Visibility for comments on the English version of the manuscript. This work was supported by grants from INSERM (France), the University of Nice, the PHRC (Centre Hospitalier Universitaire of Nice), and charities (Association Française pour l’Etude du Foie (AFEF)/LFB to PG, AFEF/Aptalis to BBM, Société Francophone du Diabète (SFD) to PG, SFD/Roche Pharma to PG, SFD/MSD to BBM. This work was
1 2Scientific RepoRts | (2019) 9:7501 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7
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also funded by the French Government (National Research Agency, ANR): #ANR-15-CE14-0016-01, #ANR-18-CE14-0019-02 and through the “Investments for the Future” LABEX SIGNALIFE (#ANR-11-LABX-0028-01) and the UCAJEDI Investments in the Future project (#ANR-15-IDEX-01).
Author ContributionsP.G., A.S. and A.I. designed the research and wrote the paper. A.S., S.P., D.R., S.B., K.M. and P.L. performed the experiments. C.M.C., R.A., A.I. and J.T.V.N. contributed to human sample and data collection. X.X. and A.N.L. provided the fsp27 tools. B.B.M., A.T. and all the other authors edited and approved the final submitted draft.
Additional InformationSupplementary information accompanies this paper at https://doi.org/10.1038/s41598-019-43928-7.Competing Interests: The authors declare no competing interests.Publisher’s note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
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