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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO, EXTENSÃO E CULTURA -
ProPPEC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
ROSILENE APARECIDA DA SILVEIRA
PROPOSIÇÃO DE UMA METODOLOGIA PARA MENSURAÇÃO DO POTENCIAL
DE BIODEGRADAÇÃO INTRÍNSECA DE AMOSTRAS LÍQUIDAS
INDUSTRIAIS/AMBIENTAIS
Itajaí (SC), 2010.
ROSILENE APARECIDA DA SILVEIRA
PROPOSIÇÃO DE UMA METODOLOGIA PARA MENSURAÇÃO DO POTENCIAL
DE BIODEGRADAÇÃO INTRÍNSECA DE AMOSTRAS LÍQUIDAS
INDUSTRIAIS/AMBIENTAIS
Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental. Orientador: Prof. Dr. Claudemir Marcos
Radetski.
Itajaí (SC), 2010.
Dedico esta obra a minha filha Ana Flavia
e ao meu esposo Renato pelo apoio e
estímulo nos momentos difíceis.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus;
Ao meu Orientador, Prof. Dr. Claudemir Marcos Radetski, pela paciência,
compreensão, dedicação, amizade e pelo exemplo de pessoa. Meus sinceros
agradecimentos.
À UNIVALI, na pessoa da secretária Cristiane de Sousa Bilobran, pelo apoio
administrativo, pelo carinho, apoio e amizade. Meu muito obrigado.
À todos meus colegas de mestrado, em especial ao Fabiano Villatore, Aline
Meurer, Marla e Luis Augusto pela força e pela amizade.
À equipe do laboratório de Remedição Ambiental, Profª. Albertina, Fernanda
e Renan.
À minha família, meus pais pela colaboração; ao meu marido, pela
paciência, apoio e compreensão, e em especial, a minha filha, Ana Flavia, pela
compreensão na minha ausência e principalmente pelo seu amor.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi o de testar a viabilidade técnica do método de hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a atividade microbiológica em 6 diferentes amostras ambientais/industriais: esgoto doméstico, efluentes têxtil, agro-industrial e hospitalar, águas cinzas e águas de um rio fracamente poluído. Esta atividade microbiológica das bactérias autóctones pode servir como indicador da biodegradabilidade intrínseca da matéria orgânica. Para tanto, comparou-se a linearidade dos valores obtidos com a hidrólise da FDA com os valores de DQO, Oxigênio Consumido e DBO5. Os resultados demonstraram que a linearidade das respostas da hidrólise da FDA são comparáveis às da DQO e melhores do que a linearidade das respostas dos métodos do Oxigênio Consumido e DBO5, com exceção do efluente têxtil com corantes e das águas cinzas ricas em materiais graxos. A metodologia proposta não apresenta inconvenientes como é o caso da metodologia da DBO5, pois o método da hidrólise da FDA é simples, rápido, de baixo custo, sem necessidade de adequação da amostra para a realização do teste, sem necessidade de inóculo bacteriano, além de apresentar uma variabilidade pequena dos resultados. Estes resultados permitem concluir que a hidrólise da FDA pode ser usada como método para avaliação do potencial intrínseco da biodegradabilidade de uma amostra, o que pode ser de interesse nos sistemas de biorremediação de amostras ambientais/industriais.
PALAVRAS-CHAVE: Matéria orgânica. Biodegradabilidade. Fluoresceína. DBO. DQO.
ABSTRACT
The goal of this study was to evaluate the feasibility of FDA (fluorescein diacetate) hydrolysis method for the determination of enzymatic activity in 6 different wastewaters: domestic wastewater, textile, agro-industrial and hospital effluents, grey water, and water from a slight polluted stream water. This hydrolytic method using autochthonous microorganisms can indicates the intrinsic biodegradability of organic matter present in the samples. To achieve this information, the linearity of the response obtained with this new methodology was compared to the linearity response of different methodologies for organic matter determination in aqueous samples (e.g., COD, BOD, and Oxygen Demand methods). The results showed that linearity responses of the hydrolytic method are comparable to the COD linearity responses and are more precise than linearity responses of other tested methods, with exception of responses for textile effluents with dyes and grey waters with fatty materials. The hydrolytic methodology used to evaluate intrinsic biodegradable organic matter of samples presented in this study do not show some inherent problems found in other classical methodology used for this purpose (e.g., BOD). Furthermore, the hydrolytic methodology is rapid to carry out and present low cost for execution, and reflect real environment in terms of sample conditions. These results and characteristics allow us to conclude that FDA hydrolysis can be used for the determination of intrinsic biodegradability of samples with organic constituents, which can be of interest in the bioremediation process and in the monitoring of wastewater treatment plants.
KEYWORDS: Organic matter. Biodegradability. Fluorescein. BOD. QOD.
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1: Coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as
amostras ambientais..............................................................................37�
Tabela 1: Diluições feitas nas amostras analisadas no presente trabalho. ...............39�
Tabela 2: Influencia da concentração da fluoresceína na variação temporal da
absorbância de duplicatas das amostras de um efluente agroindustrial
bruto. ......................................................................................................43�
Tabela 3: Influencia da autoclavagem nas absorbâncias medidas após 2 e 24 h das
amostras após autoclavagem com e sem a adição prévia de 200µµµµL de
fluoresceína no meio reacional...............................................................44�
Tabela 4: Variação da absorbância em diferentes tempos para diferentes inóculos
bacterianos, com adição de 200 µL de FDA...........................................46�
Tabela 5: Influência do meio nutritivo na atividade hidrolítica das bactérias B.
polymixa, C. violacea e de uma Bactéria Liofilizada sem identificação em
diferentes intervalos de tempo................................................................47�
Tabela 6: Variabilidade dos pHs das amostras estudadas nos ensaios hidrolíticos..48�
Tabela 7: Médias dos valores de FDA, DQO e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................50�
Tabela 8: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de FDA
e DQO em função dos valores de MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................52�
Tabela 9: Médias dos valores de FDA, OC e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................54�
Tabela 10: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de
FDA e OC em função dos valores de MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................55�
Tabela 11: Médias dos valores de FDA, DBO e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................57�
Tabela 12: Equação da reta e coeficiente de correlação linear (R2) para os valores
de FDA e DBO em função dos valores de MOO medidos nas diluições
das diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas. .........................58�
Tabela 13: Valores de FDA, DBO, DQO e MOO medidos nas diluições das diferentes
amostras industriais analisadas no estudo paralelo. ..............................60�
Tabela 14: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de
FDA, DQO e DBO em função dos valores de MOO medidos nas
diluições das diferentes amostras industriais usadas no estudo paralelo.
...............................................................................................................60�
Tabela 15: Relações entre os valores de FDA, DBO e MOO das diferentes amostras
analisadas neste estudo. ........................................................................65�
LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS
Gráfico 1: Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de
hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições
testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial). ......45�
Figura 1: Reação 1....................................................................................................31�
Figura 2: Fórmula estrutural do Diacetato de Fluoresceína. .....................................32�
Figura 3: Reação de hidrólise do FDA. .....................................................................33�
Figura 4: Pontos das coletas das amostras...............................................................38�
LISTA DE ABREVIATURAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
APHA American Public Health Association
COT Carbono Orgânico Total
CO2 Dióxido de Carbono
C.V. Coeficiente de Variação
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
DBOu Demanda Última de Oxigênio
DBO 5 Demanda Bioquímica de Oxigênio padrão de 5 dias
DQO Demanda Química de Oxigênio
ETE Estação de Tratamento de esgoto
FDA Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína
FD Fator de Diluição
M Molar
MOO Matéria Orgânica Oxidável
OD Oxigênio Dissolvido
OC Oxigênio Consumido
pH Potencial Hidrogeniônico
PCP Pentachlorophenol
Ppm Partícula por Milhão
STE Sistema Transportador de Elétrons
SUMÁRIO
1� INTRODUÇÃO....................................................................................................13�
1.1� Contextualização ............................................................................................13�
2� OBJETIVOS........................................................................................................17�
2.1� Objetivo Geral .................................................................................................17�2.2� Objetivos Específicos......................................................................................17�
3� JUSTIFICATIVA .................................................................................................18�
4� REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................19�
4.1� Matéria orgânica em amostras industriais/ambientais ....................................19�4.2� Microrganismos envolvidos no tratamento aeróbio da matéria orgânica ........21�4.3� Métodos de Mensuração da Matéria Orgânica em Meio Líquido....................27�4.3.1� Demanda Química do Oxigênio (DQO) ........................................................28�4.3.2� Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO) ....................................................29�4.3.3� Oxigênio Consumido (OC)............................................................................29�4.3.4� Carbono Orgânico Total (COT).....................................................................30�4.4� Aplicações da Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) ........................31�
5� MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................37�
5.1� Descrição das áreas de estudo.......................................................................37�5.2� Coleta e Preparação das Amostras ................................................................38�5.3� Metodologia de quantificação da matéria orgânica.........................................39�5.3.1� Procedimento para a determinação da DBO5...............................................39�5.3.2� Procedimento para determinação da DQO...................................................40�5.3.3� Procedimento para determinação da Matéria Orgânica Oxidável (MOO) por
Calcinação ....................................................................................................41�5.3.4� Determinação do Oxigênio Consumido. .......................................................41�5.3.5� Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA......................42�
6� RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................43�
6.1� Otimização da metodologia de quantificação da matéria orgânica intrinsecamente biodegradável pela hidrólise da FDA....................................43�
6.2� Comparações dos resultados da Demanda Química do Oxigênio (DQO), Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO), Matéria Orgânica Oxidável (MOO), Oxigênio Consumido (OC) e hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) na estimação da matéria orgânica das amostras ................................................49�
6.2.1� Comparação da eficiência da DQO e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela calcinação (MOO).........................................................................................50�
6.2.2� Comparação da eficiência da Oxigênio Consumido e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela calcinação (Matéria Orgânica Oxidável - MOO).................53�
6.2.3� Comparação da eficiência da DBO e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica biodegradável de amostras industriais/ambientais líquidas mensurada pela calcinação (MOO) ..............................................................56�
6.3� Estudo paralelo (FDA x DQO x DBO) .............................................................59�6.4� Discussão geral ..............................................................................................61�
7� CONCLUSÃO .....................................................................................................68�
REFERÊNCIAS.......................................................................................................70�
ANEXO ...................................................................................................................77�
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Contextualização
Para se ter um ambiente mais sustentável é preciso investir, entre outras
coisas, no tratamento de efluentes, buscando alternativas e soluções inovadoras nas
análises e nas técnicas de tratamento dos mesmos. O lançamento de efluentes sem
o devido tratamento na natureza pode resultar impactos bastante significativos para
os recursos hídricos, desencadeando vários problemas sócio-ambientais. Para que o
efluente tenha um destino adequado é necessário que seja coletado, analisado e
tratado. A matéria orgânica presente nos corpos d’água e nos esgotos é uma
característica de primordial importância, sendo a causadora do principal problema de
poluição das águas: o consumo do oxigênio dissolvido pelos microrganismos nos
seus processos metabólicos de utilização e estabilização da matéria orgânica (VON
SPERLING, 1996). Geralmente, utilizam-se métodos diretos e indiretos para
determinação do potencial poluidor ou quantificação da matéria orgânica de um
efluente. Entre os métodos indiretos, pode-se medir o consumo do oxigênio pela
DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio); DBOu (Demanda Última de Oxigênio) e
DQO (Demanda Química de Oxigênio). Com relação aos métodos diretos, pode-se
medir o COT (Carbono Orgânico Total).
O parâmetro mais usual de medição de poluição orgânica aplicado às águas
é a DBO cinco dias (DBO5), sendo que esta determinação envolve a medida do
oxigênio dissolvido utilizada pelos microrganismos na oxidação bioquímica da
matéria orgânica (BRAILE; CAVALCANTI, 1993). Esta técnica consiste em medir em
laboratório o consumo de oxigênio que um volume padronizado de esgoto ou outro
líquido exerce em um período de tempo pré-fixado, retratando a quantidade de
oxigênio requerido para estabilizar, através de processos bioquímicos, a matéria
orgânica carbonácea, uma indicação indireta, portanto, do carbono orgânico
biodegradável (VON SPERLING, 1996). A DBO é então uma determinação da
quantidade aproximada de oxigênio que será necessária para oxidar biologicamente
a matéria orgânica presente na amostra analisada. O período de incubação é de
cinco dias a 20° C, podendo-se utilizar outros períodos e temperaturas. Após a
14
incubação, o oxigênio dissolvido da amostra é medido, repetindo-se a medida no
final do período-teste, sendo então calculada a DBO. A oxidação bioquímica é um
processo vagaroso, dentro de um período de vinte dias a oxidação é de 95 a 99% do
total e de 60 a 70% num período de cinco dias (BRAILE; CAVALCANTI, 1993).
Segundo Von Sperling (1996), as principais vantagens do teste da DBO5, e
ainda não igualadas por nenhum outro teste de determinação de matéria orgânica,
são relacionadas ao fato de que o teste da DBO permite: a) indicação aproximada
da fração biodegradável do despejo; b) indicação da taxa de degradação do
despejo; c) indicação da taxa de consumo de oxigênio em função do tempo; d)
determinação aproximada da quantidade de oxigênio requerido para a estabilização
biológica da matéria orgânica presente; e) pode-se encontrar baixos valores de
DBO5 caso os microrganismos responsáveis pela decomposição não estejam
adaptados ao despejo. Como inconvenientes podem ser citados: a) os metais
pesados e outras substâncias tóxicas podem matar ou inibir os microrganismos; b)
há a necessidade de inibição dos organismos responsáveis pela oxidação da
amônia, para evitar que o consumo de oxigênio para a nitrificação (demanda
nitrogenada) interfira com a demanda carbonácea; c) relação DBOu / DBO5 varia,
para um mesmo despejo, ao longo da linha de tratamento da ETE (estação de
tratamento de esgoto); d) o teste demora 5 dias, não sendo útil para efeito de
controle operacional de uma estação de tratamento; e) os critérios de
dimensionamento das unidades, assim como, legislação para lançamento de
efluentes, são baseadas na DBO e não levam em consideração os inconvenientes
acima citados.
O teste de DBOu é muito similar à DBO5 padrão de 5 dias variando apenas
ao tempo de determinação do oxigênio dissolvido, que é determinado aos 20 dias,
pois no final de 5 dias de teste da DBO5, a estabilização da matéria orgânica não
está completa, continuando por dias ou semanas. Então, a DBOu está relacionada
ao consumo de oxigênio até este tempo onde presume-se que houve a
biodegradação completa.
O teste da DQO consiste na oxidação enérgica de uma amostra de esgoto
pelo dicromato de potássio, em meio ácido, sob elevada temperatura (DACACH,
1991). A diferença do teste de DBO e DQO é que a DBO está relacionada com a
oxidação bioquímica da matéria orgânica que é realizada por microrganismos,
15
enquanto, a DQO corresponde à oxidação química da matéria orgânica, realizada
por um oxidante (e.g., dicromato de potássio) em meio ácido.
Segundo Von Sperling (1996), as principais vantagens do teste DQO são: a)
gasta apenas 2 a 3 horas para ser realizado; b) o resultado do teste dá uma
indicação do oxigênio requerido para a estabilização da matéria orgânica; c) o teste
não é afetado pela nitrificação. O grande inconveniente deste tipo de medida é que
ela não tem nenhuma relevância ambiental, pois o que foi medido pela DQO, não
necessariamente ocorrerá na natureza.
A DQO ocorre em condições mais energéticas, temperaturas acima de
150°C e meio muito ácido, sendo que os seus resultados são normalmente maiores
que do Oxigênio Consumido com permanganato que ocorre em temperaturas
inferiores a 100°C e condições menos ácidas (VALENTE; PADILHA; SILVA, 1997).
Normalmente, o valor da DQO supera o da DBO pelo fato de que a reação com o
dicromato oxida tanto a matéria orgânica putrescível como a não biodegradável
(DACACH, 1991).
No método direto de teste de carbono orgânico (COT) o carbono orgânico é
medido de forma direta, o que é diferente dos outros métodos que indiretamente
determinava o oxigênio consumido na oxidação. O teste do COT mede todo o
carbono liberado na forma de CO2. Para garantir que o carbono medido seja
realmente o carbono orgânico, as formas inorgânicas de carbono (CO2, HCO3-
entre outros) devem ser removidas antes da análise ou corrigidas quando do cálculo
(VON SPERLING, 1996).
Considerando os inconvenientes dos métodos da DBO e da DQO, o
propósito desta pesquisa é de estudar, de forma preliminar, a viabilidade do método
de hidrólise de FDA (Diacetato de Fluoresceína) para determinar matéria orgânica
biodegradável de amostras ambientais. A hidrólise de FDA é um método que avalia
a atividade hidrolítica indiscriminada das bactérias e dos fungos. A hidrólise de FDA
tem sido correlacionada positivamente com a respiração do solo (SCHNÜRER;
ROSSWALL, 1982). Em particular, a atividade enzimática no solo proporciona
catálise de diversas reações que são necessárias ao ciclo de vida dos
microrganismos, na decomposição de resíduos orgânicos durante o ciclo de
nutrientes e na formação da matéria orgânica e na estrutura do solo (BURNS, 1978).
Diversas pesquisas utilizando FDA para determinar a atividade enzimática do solo já
foram evidenciadas. As atividades enzimáticas (FDA, urease e � – glicosidase)
16
serviram como indicadoras do potencial da funcionalidade dos ecossistemas e,
aliadas aos demais atributos biológicos, tornam-se boas indicadoras da qualidade do
solo (CARVALHO, 2005).
Desta forma, pretende-se através deste trabalho analisar a viabilidade e a
eficiência do método da hidrólise de FDA na determinação da matéria orgânica de
amostras industriais/ambientais, assim como, comparar esta nova metodologia com
outros métodos de análises como DBO e DQO, no sentido de verificar se a hidrólise
do FDA pode ser mais uma opção de análise para determinação da atividade
microbiana em efluentes líquidos, o que está relacionada com a presença de matéria
orgânica nestas amostras. Em suma, o método da hidrólise do FDA pode nos
fornecer uma indicação da biodegradabilidade intrínseca da amostra, a qual já pode
conter os microrganismos adaptados para oxidar a matéria orgânica específica de
cada tipo de amostra ambiental/industrial.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a aplicabilidade de um método baseado na hidrólise do Diacetato de
Fluoresceína (FDA) na determinação de matéria orgânica biodegradável em
amostras líquidas industriais/ambientais.
2.2 Objetivos Específicos
- Propor uma metodologia de quantificação da matéria orgânica biodegradável em
amostras industriais/ambientais usando o Diacetato de Fluoresceína (FDA) como
molécula base.
- Verificar a biodegradabilidade intrínseca das amostras industriais/ambientais no
sentido de prever quais amostras tem maior potencial intrínseco de
biodegradação e quais amostras necessitam de uma biodegradação assistida.
- Estabelecer valores de linearidade das respostas da Demanda Química de
Oxigênio, Demanda Bioquímica de Oxigênio, Oxigênio Consumido e Hidrólise da
FDA em função da diluição das amostras ambientais/industriais.
18
3 JUSTIFICATIVA
Esta pesquisa tem por finalidade avaliar a aplicabilidade de um método de
hidrólise de FDA (Diacetato de Fluoresceína) para determinação da matéria orgânica
biodegradável em amostras líquidas industriais/ambientais, subsidiando com dados
técnicos inéditos um melhor entendimento da biodegradação ou mesmo propondo a
substituição dos métodos convencionais utilizados para medição do potencial de
biodegradação das amostras líquidas estudadas. Estudos com FDA na
determinação de matéria orgânica biodegradável de efluentes em amostras
industriais/ambientais ainda não foram realizados.
A investigação do método de hidrólise de FDA vem sendo empregada como
importante técnica para análise da qualidade microbiológica dos solos. Assim, o
método do Diacetato de Fluoresceína, mostrou-se eficiente como bioindicador da
qualidade microbiológica de solos submetidos a reflorestamento (SILVA; SIQUEIRA;
COSTA, 2004). Outros autores também utilizaram o método em suas pesquisas com
solos, como OLIVEIRA et al (2007) que utilizou o método no monitoramento
ambiental de agroecossistemas do semi-árido, constatando que as concentrações
de Diacetato de Fluoresceína utilizadas foram positivamente correlacionado com a
quantidade microrganismos no solo.
O conhecimento gerado no presente estudo sobre a hidrólise do FDA em
amostras líquidas industriais/ambientais é estratégico para comparação dos
resultados obtidos com outros métodos já existentes na determinação de matéria
orgânica biodegradável para diferentes tipos de amostras. Assim, este será o
primeiro trabalho que estudará a viabilidade de se determinar a matéria orgânica
intrinsecamente biodegradável em efluentes utilizando o método da hidrólise de
FDA, tentando levantar os aspectos positivos e negativos desta nova metodologia,
permitindo o uso da mesma de forma mais segura e chamando para novos estudos
que permitam aperfeiçoar esta nova metodologia.
19
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Matéria orgânica em amostras industriais/ambientais
A matéria orgânica nas águas é uma característica de primordial importância
nas questões ambientais, sendo a causadora do principal problema de poluição das
águas (VON SPERLING, 1996). Os principais compostos orgânicos presentes nas
amostras industriais/ambientais são as proteínas, carboidratos, gorduras, óleos,
uréia, fenóis, pesticidas entre outros, porém dificilmente se caracteriza a matéria
orgânica em termos de componentes individuais. Em termos práticos, a matéria
carbonácea pode ser dividida em biodegradável e não biodegradável, ambas em
suspensão e dissolvida, utilizando-se métodos indiretos para quantificar a matéria
orgânica total, como por exemplo, a DBO, DQO e COT, os quais são os parâmetros
mais utilizados para caracterizar a matéria orgânica das águas residuárias, das
águas industriais (brutas e tratadas) e dos corpos d’água. A matéria orgânica é
responsável pelo consumo do oxigênio dissolvido na água pelos microrganismos
decompositores, mas todos os efeitos da matéria orgânica só acontecem se a
mesma está biodisponível e bioacessível para os (micro)organismos aquáticos.
Contudo, estes termos (biodisponibilidade e bioacessibilidade) devem ser
bem entendidos, pois não só a taxa de biodegradação é dependente desta
disponibilidade/acessibilidade da matéria orgânica, bem como os métodos de
quantificação dessa matéria também são dependentes da
disponibilidade/acessibilidade da matéria orgânica para com os reagentes químicos
ou biológicos usados na quantificação da mesma.
Em geral, o termo biodisponibilidade é empregado em muitas áreas
científicas onde se necessita considerar as interações entre os seres vivos e as
substâncias químicas. Como resultado, cada área científica define este termo em
função da conveniência específica da área, levando à certa confusão quando se
comparam as definições de diferentes áreas. Algumas das definições gerais mais
aceitas sobre o termo biodisponibilidade são mostradas a seguir, começando por
Spacie e Hamelink (1995), os quais sugeriram a seguinte definição: “Biodisponível é
uma porção de uma totalidade de uma substância química no meio ambiente, ou
20
porção do total que está potencialmente disponível para a ação biológica”. A
biotransformação é controlada pela atividade bioquímica dos microrganismos e pela
transferência de massa da substância química para os microrganismos. Levando em
consideração estes 2 fatores, Bosma et al (1997) definiram o Número da
Biodisponibilidade (Bn), o qual é a relação entre a transferência de massa de uma
substância para a célula e a atividade intrínseca da célula usando esta substância
como substrato principal.
Na área da Ecotoxicologia terrestre, o termo Biodisponibilidade é de suma
importância, pois a parte biodisponível de uma substância é que tem o potencial de
causar danos tóxicos. Assim, Warrington e Skogley (1997) propuseram que este
termo fosse definido como “a quantidade da substância no solo que está presente
em uma forma química que o organismo pode absorver durante sua vida”. Já Ehlers
e Luthy (2003), em um relatório para o National Research Council, evitaram usar o
termo “Biodisponibilidade” de forma isolada, preferindo relatar um “Processo de
Biodisponibilidade” por falta de uma definição consistente e aplicável para o termo.
Mais recentemente, o termo Biodisponibilidade foi descrito como sendo “o
grau pelo qual substâncias químicas presentes no meio pode ser absorvido ou
metabolizado por humanos ou receptores ecológicos, ou que estão disponíveis para
interações com sistemas biológicos” (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION, 2006). Reichenberg e Mayer (2006) sugerem que
Biodisponibilidade “é composto pelo que é acessível (i.e., o que é extraído por um
extrator suave), juntamente com sua atividade química no meio (i.e., sujeição a um
processo físico-químico espontâneo, tais como difusão, sorção e partição)”.
Semple et al (2004) publicaram que a Biodisponibilidade representa a
“quantidade máxima de um contaminante disponível para absorção por um
organismo em um dado intervalo de tempo” e que este conceito pode ser
desdobrado em dois sentidos: Biodisponibilidade e Bioacessibilidade. O primeiro
sentido foi definido mais precisamente como “aquela fração que está disponível
livremente para atravessar a membrana de um organismo a partir do meio onde o
organismo vive em um determinado tempo”, enquanto o segundo sentido foi definido
como
aquela fração que está disponível para atravessar a membrana de um organismo a partir do meio onde o organismo vive, caso o organismo tenha acesso à substância; entretanto, esta fração pode
21
ser fisicamente removida do organismo ou somente estará disponível depois de um certo tempo. (SEMPLE et al, 2004).
Para mostrar que a distinção entre estes termos não é só semântica, para o
presente tema de dissertação pode-se dizer que a Biodisponibilidade de uma
substância (no sentido de poder ser degradada por um organismo) é um bom
descritor da taxa de biodegradação potencial, enquanto que a Bioacessibilidade de
uma substância (no sentido de que vai ser degradada por um organismo) é um bom
descritor da taxa de biodegradação real da substância. Em outras palavras, quando
toda a substância Biodisponível estiver Bioacessível, os valores quantitativos das
mesmas serão iguais.
Estas definições básicas para a biodegradação são válidas também para os
processos de extração química da matéria orgânica de uma amostra, bem como
para quantificação da matéria orgânica de uma amostra, pois para ambos os casos,
a “disponibilidade” e a “acessibilidade” podem não resultar, em termos quantitativos,
nos mesmos valores, sendo que isto será retomado na discussão dos resultados
obtidos nesta dissertação.
4.2 Microrganismos envolvidos no tratamento aeróbio da matéria orgânica
Para melhor compreensão do processo de biodegradação aeróbia de
amostras contendo matéria orgânica é importante conhecermos o funcionamento e
reações que ocorrem nos mesmos. As bactérias, os protozoários e os fungos são os
principais microrganismos envolvidos. Porém a massa microbiana é constituída
principalmente por bactérias e protozoários, sendo que os fungos e rotíferos são
raramente encontrados (ALEXANDER, 1994). Estes últimos suportam pHs baixos
com pouco nitrogênio, fazendo com que os mesmos sejam importantes no
tratamento de despejos industriais, porém alguns fungos podem prejudicar na
decantabilidade dos lodos. Assim como os fungos, os rotíferos são eficientes no
consumo de bactérias dispersas e de pequenas partículas de matéria orgânica e a
presença dos mesmos nos efluentes indica um eficiente processo de purificação
biológica (METCALF; EDDY, 1991). Contudo, os microrganismos aeróbios, quando
22
muito numerosos, podem reduzir o OD (Oxigênio dissolvido) até o nível zero, o que
pode causar transtornos nos meios ricos em organismos deste tipo.
Especificamente, cada tipo de amostra líquida contendo matéria orgânica
gera uma comunidade específica de bactérias. Uma destas bactérias geralmente é a
Zoogloeae ramigera, a qual sintetiza e secreta um gel polissacarídico onde outros
micróbios se aglomeram em flocos de grande atividade metabólica para
decomposição da matéria orgânica, originando o que se chama de lodo ativado, o
qual é o principal meio onde ocorre a biodegradação. O processo bioquímico da
biodegradação aeróbia é complexo e se processa em várias reações seqüenciais,
sendo a principal a Hidrólise onde o material orgânico é convertido em compostos de
menor peso molecular: proteínas se transformam em aminoácidos, carboidratos em
açúcares solúveis e lipídeos em ácidos graxos poliméricos e glicerina. Do ponto de
vista cinético, a biodegradação pode ocorrer em diferentes temperaturas e nesse
sentido, as bactérias podem ser classificadas de acordo com a faixa ótima de
temperatura para seu desenvolvimento. Assim, as que sobrevivem em temperaturas
entre 12 e 18°C são denominadas Psicrofílicas, entre 25 e 40°C são Mesofílicas e
entre 55 e 65°C são as Termofílicas (ALEXANDER, 1994). As Mesofílicas são as
bactérias que degradam matéria orgânica de forma mais rápida.
Do ponto de vista mais taxonômico, os microrganismos presentes nos
sistemas de biodegradação aeróbia por lodos ativados são, segundo Von Sperling
(1996):
- Bactérias: as bactérias são organismos unicelulares que se apresentam isolados
ou em cadeias e cuja forma varia de esférica a bastonetes ou espiradas. Seu
tamanho normalmente não excede 1,5 �m de comprimento. Quando se agrupam
formando filamentos, estes podem atingir centenas de micrômetros. No processo
de lodos ativados elas se dividem em bactérias não filamentosas e filamentosas.
Os principais gêneros de bactérias não filamentosas são: Bacillus, Aerobacter,
Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter,
Citromonas e Zooglea. Já as bactérias filamentosas estão presentes no processo
de lodos ativados no interior dos flocos formando a macroestrutura. Sua presença
contribui para uma boa eficiência do processo, já que possuem alta capacidade
de consumir matéria orgânica e, consequentemente, produzir um efluente final de
boa qualidade. Os microrganismos filamentosos mais freqüentes em lodos
23
ativados são: Sphaerotilus natans, Thiothrix, Beggiatoa, Microthrix parvicella,
Nocardia, etc.
- Fungos: os fungos não são habitantes freqüentes em lodos ativados. Seu
desenvolvimento pode ser estimulado quando prevalecem determinadas
condições nos reatores biológicos, tais como: pH baixo (ao redor de 5), presença
de grande quantidade de carboidratos e deficiência de nutrientes. Os fungos são
tão eficazes quanto as bactérias na estabilização da matéria orgânica. Dentre os
gêneros que podem aparecer em lodos ativados podemos citar: Geotrichum,
Fusarium, Penicillum e Cladosporium.
- Algas: embora não seja o ambiente propício para o crescimento devido a
ausência de luz provocada pela turbidez do meio, algumas algas podem estar
presentes em sistemas de lodos ativados. Apesar de desempenharem um papel
significante em lagoas de estabilização, pouco se sabe da sua contribuição em
processos de lodos ativados. As algas presentes em esgotos são as mesmas que
comumente habitam águas poluídas. Os principais grupos encontrados em
sistemas de tratamento são: algas azuis, algas verdes e diatomáceas.
- Protozoários: são microrganismos unicelulares, microscópicos. Algumas
espécies formam colônias, sendo suas células fundamentalmente independentes
e similares na estrutura e função e com formas variadas: esférica, oval, alongada
ou achatada. São tipicamente translúcidos (transparentes), mas algumas
espécies podem apresentar coloração devido à ingestão de alimento, material de
reserva ou pigmento (clorofila). Alimentam-se de bactérias, outros protozoários e
de matéria orgânica dissolvida e particulada. Os protozoários podem ser
subdivididos em grupos de acordo com o tipo de organela utilizada para a
locomoção e captura de alimentos:
a) Ciliados: possuem cílios que são organelas curtas e numerosas em forma de
fio, que se projetam da parede da célula. Os cílios encontram-se arranjados
em sentido longitudinal, diagonal e oblíquos, apresentando movimentos
ondulatórios e coordenados ao longo da célula. Podem ser agrupados em
Livre Nadantes (são os ciliados que possuem cílios distribuídos regularmente
por toda a célula e nadam livremente entre os flocos presentes), Predadores
de Flocos (são microrganismos cuja célula é achatada dorso-ventralmente e
seus cílios são modificados e agrupados na parte que fica em contato com o
substrato para retirar alimento dos flocos pelo batimento dos cílios ventrais
24
sobre o sedimento), Fixos ou Pedunculados (podem ser isolados ou coloniais
e estão ligados ao substrato por um pedúnculo e seus cílios encontram-se
concentrados na região anterior, próximo à boca).
b) Flagelados: são os protozoários que se locomovem através do flagelo, que
são organelas em forma de filamento alongado, pouco numerosos, que se
projetam de pontos específicos da célula (geralmente na parte anterior).
Executam movimento ondulatório na água, propelindo a célula para o próprio
lado ou para o lado oposto da inserção do flagelo. Sob condições adversas, o
flagelo pode se perder, mas sua regeneração ocorre prontamente. São
subdivididos em dois grupos: Fitoflagelados e Zooflagelados.
c) Amebas: locomovem-se através de organelas transitórias, os pseudópodes,
que são simplesmente prolongamentos do protoplasma, formados em
qualquer ponto da célula. Geralmente são transparentes e não possuem
forma bem definida. Nas espécies que apresentam carapaça, a forma varia de
arredondada a globosa e podem apresentar coloração parda quando ocorre
impregnação por sais de ferro. A carapaça pode ser secretada pela própria
ameba ou ser formada de partículas retiradas do meio. Podem ser de
natureza calcária, silicosa ou orgânica. São microrganismos lentos e sua
visualização muitas vezes fica comprometida, pois podem ser confundidas
com os flocos aos quais se ligam. A forma estrelada adotada por muitas
espécies está relacionada com o stress sofrido quando da manipulação da
amostra em que se encontra.
d) Micrometazoários: são microrganismos formados por várias células que,
agrupadas, formam verdadeiros tecidos. Células diferentes possuem funções
diferentes. No processo de lodos ativados são representados pelos anelídeos,
rotíferos, nematóides e tardígrados.
Todo este conjunto de (micro) organismos sintetiza e secreta enzimas, as
quais contribuem, algumas mais e outras menos, na hidrólise de compostos
químicos, incluindo-se aí o FDA, pois esta molécula é hidrolisada indistintamente por
lípases, esterases e proteases (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982).
Com relação às características microbianas importantes para a
bioacessibilidade e biodisponibilidade aos/dos compostos orgânicos de uma
amostra, devemos nos lembrar que são muitos os fatores que influenciam estes
25
processos, bem como são muitos os fatores microbiológicos para se chegar a uma
biodegradação completa de uma substância intrinsecamente biodegradável. Assim,
entre as características microbiológicas relevantes estão a morfologia, fisiologia e
comportamento adaptativo das células e populações e, mesmo a dinâmica e a
ecologia da comunidade natural onde se encontra a substância a degradar. O modo
como os microrganismos mobilizam as substâncias orgânicas é muito similar ao que
acontece com uma extração química e estes dois aspectos são importantes na
metabolização como também na metodologia para quantificação da matéria
orgânica, sendo portanto de interesse aprofundar um pouco estas questões.
Interações morfológicas entre substância orgânica e microrganismos dizem
respeito ao tamanho e forma, como também da abundância e distribuição espacial
de ambos (JOHNSEN; WICK; HARMS, 2005). Subentende-se uma boa mobilização
do substrato como um rápido acesso do microrganismo à substância a ser
degradada e caso não houver barreiras entre eles, podemos falar então de fácil
acessibilidade desta substância ao microrganismo. Em termos morfológicos, um
aumento da área superficial associado a uma maior quantidade de “dobras” na
arquitetura das paredes celulares, assim como uma melhor adequação do espaço
tridimensional ajudam nesta mobilidade-acessibilidade interfacial da substância
orgânica com o microrganismo (WICK et al, 2002). Caso houver a fixação da
substância orgânica em algum tipo de material (e.g., formação de biofilme em
geomaterial), a acessibilidade do microrganismo à substância poderá aumentar
grandemente a eficiência da biodegradação pelo aumento da transferência de
massa, fenômeno este conhecido como sorção (SPÄTH; FLEMMING; WUERTZ,
1998).
Com relação aos aspectos fisiológicos dos microrganismos que influenciam
na metabolização da matéria orgânica, o primeiro aspecto que deve ser considerado
é a aquisição evolucionária do sistema de alta absorção das susbtâncias que pode
se dar por difusão rápida de um composto (BUTTON, 1991). Nesse sentido, há uma
relação direta entre a afinidade específica e a taxa de difusão onde a disponibilidade
do substrato é limitada (HARMS; ZEHNDER, 1994). Produtos químicos presentes no
meio-ambiente em baixas concentrações ou que se transferem por com baixas taxas
de difusão não abrem novos caminhos metabólicos nos microrganismos. Nesse
sentido, o crescimento da biomassa dos organismos via uma nova rota metabólica
também é afetada por uma baixa acessibilidade aos compostos orgânicos (BOSMA
26
et al, 1997), o que pode ser remediado quando os microrganismos usam misturas de
substratos para a metabolização, o que se percebe claramente com os fungos e
também com algumas bactérias em condições oligotróficas (KOVAROVA-KOVAR;
EGLI, 1998). Uma outra possibilidade fisiológica para aumentar a biocessibilidade é
a síntese e excreção de moléculas ativas na superfície celular, similares à
detergentes, mas com modo de ação bem distinto destes, pois estes biosurfactantes
e bioemulsificadores agem em micro-escala dentro de microporos (RON;
ROSENBERG, 2001). Os mecanismos que aumentam a bioacessibilidade incluem
aumento da dissolução da matéria orgânica, dispersão de aglomerados de matéria
orgânica e dispersão da fase líquida não-aquosa (NEU, 1996; VOLKERING;
BREURE; RULKENS, 1997). Uma outra adaptação fisiológica negligenciada até o
presente momento em termos de biocessibilidade diz respeito à capacidade
intrínseca do organismo para degradar a matéria orgânica natural pela desorção
(EKSCHMITT et al, 2005), o que seria equivalente a uma oxidação suave por
persulfato.
A Quimiotaxia é uma adaptação do comportamento que permite ao
microrganismo localizar fontes de substâncias e aumentar a biodisponibilidade das
mesmas (desde que as substâncias estejam bioacessíveis) por movimentação a
favor do gradiente (quimiotaxia positiva) (PANDEY; JAIN, 2002). Para substâncias
poliméricas naturais foi relatado que o comportamento quimiostático em combinação
com o uso de enzimas extracelulares representa o meio mais rápido para o
microrganismo encontrar alimento particulado (VETTER et al, 1998), ou por outro
lado, fugir de substâncias com poder tóxico para os microrganismos (quimiotaxia
negativa), levando ao termo de equilíbrio entre a necessidade de alimento e fuga do
tóxico. Embora a quimiotaxia requeira uma solubilidade mínima da substância,
teoricamente é possível que a vizinhança composta pela parte insolúvel dê origem a
quimiotaxia via agentes solubilizantes e/ou ação de exoenzimas (VETTER et al.,
1998).
Com relação à importância da dinâmica da comunidade microbiana e das
interações ecológicas na biodegradação, estas podem influenciar via os
mecanismos supra-citados, contudo, deve ser salientado que a comunidade possui
uma maior flexibilidade e uma maior variabilidade do que os microrganismos que
agem isoladamente. Assim, mudanças dentro da comunidade influencia no balanço
destes mecanismos, o que pôde ser notado pela sucessão que ocorreu na
27
comunidade quando da biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos polinucleares
de diferentes tamanhos moleculares (UYTTEBROEK et al, 2006). A observação
freqüente de mudança de dominância na comunidade de esfingomonas para
micobactérias parece refletir a adaptação da comunidade aos diferentes níveis de
biodisponibilidade de substratos (LEYS et al, 2005; UYTTEBROEK et al, 2006). Isto
pode ser demonstrado para o caso das interações ecológicas que ocorrem quando
organismos bioturbadores remexem, por exemplo, os solos, aumentando a
bioacessibilidade das substâncias no meio (HARMS; WICK, 2006).
Em suma, a biodegradação de substâncias orgânicas em um meio é
dependente da bioacessibilidade e da biodisponibilidade desta substância para os
microrganismos. Contudo, vários fatores abióticos e bióticos influenciam neste
processo e o que se mede nos testes de biodegradação é o saldo de todas estas
interações.
4.3 Métodos de Mensuração da Matéria Orgânica em Meio Líquido
Para poder quantificar a biodegradação, geralmente faz-se medidas (diretas
ou indiretas) da quantidade de matéria orgânica presente no meio em determinados
tempos. Para tanto, existem inúmeras técnicas analíticas que possibilitam também
identificar o tipo de substância orgânica presente no meio, podendo identificar por
exemplo se é um metabólito oriundo da biodegradação. Outras técnicas fazem uso
de mensurações de outros parâmetros relacionados com as reações de
biodegradação (e.g., liberação de CO2 ou consumo de O2), porém não se conhece
nenhuma técnica que faça uso de atividade enzimática para mensurar a
biodegradabilidade da matéria orgânica de uma amostra tanto sólida como líquida.
A estimativa (direta ou indireta) da matéria orgânica por atividade enzimática
é de grande interesse, pois englobaria tanto o aspecto da bioacessibilidade, quanto
da biodisponibilidade das substâncias para os microrganismos, o que é de muito
interesse para o conhecimento da biodegradabilidade real (ou intrínseca) da
amostra. Em termos de biodegradação nos solos, isto pode ser considerado a
melhor medida do potencial de remediação de um solo contaminado, fato este que
nenhuma análise química pode ajudar a prever, pois esta se serve de métodos de
28
extração da matéria orgânica que pode ser limitado pela questão da acessibilidade
do solvente para extrair a matéria orgânica que será analisada (SEMPLE; MORRIS;
PATON, 2003). Nesse sentido, idealmente a extração deveria não ter problemas de
acessibilidade aos compostos químicos, mas isto não é o caso real, pois toda
extração deve ser acompanhada pelos valores de percentagem de recuperação dos
compostos extraídos da amostra. Também não devemos nos esquecer que a
extração química e a mobilização microbiológica de compostos químicos acontecem
em diferentes condições, tanto espaciais, quanto temporais. O aspecto espacial é o
mais importante, pois a extração química acaba por destruir a amostra, enquanto
que a mobilização microbiológica não altera as propriedades da amostra analisada.
Se ainda for levado em consideração o aspecto custo, então a medida/estimação
microbiológica da matéria orgânica em uma amostra passa a ser mais vantajosa
ainda do que a análise química. Uma diferença que deve ser enaltecida quanto à
natureza da molécula que está sendo extraída/analisada é que a parede celular
geralmente não absorve moléculas cuja massa molar é superior a 600 g mol-1 por
causa do tamanho dos poros onde acontece a difusão (WEISS et al, 1991).
Para efeitos de discussão posterior, haja visto as implicações deste trabalho
sobre a quantificação da matéria orgânica, as principais técnicas de mensuração da
matéria orgânica são descritas a seguir.
4.3.1 Demanda Química do Oxigênio (DQO)
Pode ser conceituada como a quantidade de oxigênio necessária para
oxidação da matéria orgânica realizada por um agente químico (dicromato de
potássio). Os valores da DQO normalmente são maiores que os da DBO5,20, sendo o
teste realizado num prazo menor (cerca de 3 horas). O aumento da concentração de
DQO num corpo d'água se deve principalmente a despejos de origem industrial,
sendo indispensável nos estudos para caracterizar esgotos sanitários e de efluentes
industriais. A DQO é muito útil quando utilizada conjuntamente com a DBO5,20 para
observar a biodegradabilidade de despejos. A oxidação do dicromato de potássio é
maior do que resulta da ação de microrganismos na DBO, exceto raríssimos casos
como hidrocarbonetos aromáticos e piridina. Por isso os resultados da DQO de uma
29
amostra são superiores aos de DBO5,20. Como na DBO5,20 mede-se apenas a fração
biodegradável, quanto mais este valor se aproximar da DQO significa que mais
facilmente biodegradável será o efluente. É comum aplicar-se tratamentos biológicos
para efluentes com relações DBO5,20 /DQO > 2,0 (METCALF; EDDY, 1991).
Conforme já salientado, apesar de ser um método de determinação da matéria
orgânica de uma amostra que possui muitas vantagens, a DQO sofre a crítica que
não é um método natural e que, portanto, só é válido para estudos de ETES, mas
não para estudos ambientais.
4.3.2 Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO)
A DBO é a quantidade de oxigênio necessária para oxidar a matéria
orgânica por decomposição microbiana aeróbia para uma forma inorgânica estável.
A DBO5,20 é normalmente considerada como a quantidade de oxigênio consumido
durante um determinado período de tempo, numa temperatura de incubação
específica. Um período de tempo de 5 dias numa temperatura de incubação de 20°C
é freqüentemente usado e referido como DBO5,20. Pelo fato de a DBO5,20 somente
medir a quantidade de oxigênio consumido num teste padronizado, não indica a
presença de matéria não biodegradável, nem leva em consideração o efeito tóxico
ou inibidor de materiais sobre a atividade microbiana, o que pode limitar seriamente
a aplicação desta metodologia (VON SPERLING, 1996).
4.3.3 Oxigênio Consumido (OC)
O método do Oxigênio Consumido é quimicamente similar ao teste de DQO,
mudando o oxidante, o qual é o permanganato de potássio. Em termos de definição,
o OC é a quantidade de oxigênio necessária para oxidar a matéria orgânica
carbonada da amostra. Assim o oxigênio consumido é um indicador da concentração
de matéria orgânica que pode ser oxidada em condições menos energéticas. A
30
oxidação com permanganato é mais utilizada para águas limpas, com baixa
concentração de matéria orgânica, sendo a reação principal descrita a seguir:
MnO42- (aq) + 8 H+
(aq) + 5 e- → Mn2+ (aq) + 4 H2O Eo = + 1,55 V
Como a oxidação é mais suave do que no caso da DQO, os resultados do
teste DQO são normalmente maiores que do Oxigênio Consumido usando
permanganato, pois neste caso a oxidação ocorre em temperaturas inferiores a
100°C e em condições menos ácidas.
4.3.4 Carbono Orgânico Total (COT)
Nesta técnica, a análise direta do teor de matéria orgânica é avaliada por
meio da medida da concentração de carbono orgânico total (COT). A técnica é
baseada na oxidação da matéria orgânica pela introdução da amostra numa câmara
de reação aquecida a uma temperatura de aproximadamente 670°C empregando-se
um catalisador de platina adsorvido sobre óxido de alumínio. Desta forma, a água é
vaporizada e o carbono do analito transformado em CO2, sendo posteriormente
quantificado em um analisador de infravermelho não dispersivo. O carbono
inorgânico é medido utilizando-se uma câmara de reação que contém ácido
fosfórico, que permite a sua transformação em CO2, que é quantificado da mesma
forma descrita anteriormente. O carbono orgânico total é então deduzido pela
diferença entre o carbono total e o inorgânico (REEVE, 1994). A análise de COT
emergiu como uma alternativa rápida e segura às clássicas mas lentas análises da
demanda bioquímica de oxigênio (DBO) e da demanda química de oxigênio (DQO),
tradicionalmente reservados para avaliar a contaminação potencial das águas
residuais (REEVE, 1994).
31
4.4 Aplicações da Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA)
As informações que seguem sobre a Fluoresceína foram extraídas da
Wapedia (WAPEDIA, 2010).
A fluoresceína é um xanteno, uma classe de compostos largamente utilizados
como corantes. Foi sintetizada pela primeira vez pelo químico alemão Johann
Friedrich Adolf von Bayer. Ela recebeu este nome em função da coloração
fluorescente amarelo-esverdeada que apresenta em solução alcalina, também
conhecida como uranina. Seu ponto de fusão é de 314-316°C. Apresenta-se como
sólido alaranjado escuro. Mesmo na forma sódica é apenas levemente solúvel em
água. Solúvel em álcool. A fluorescência desta molécula é muito alta, sua excitação
ocorre a 494 nm e a emissão a 521 nm.
A fluoresceína tem uma pKa de 6,4 e seu equilíbrio de ionização conduz a
absorção e emissão dependente do pH na faixa de 5 a 9. Assim, os tempos de vida
das formas protonadas e deprotonadas fluorescentes são aproximadamente 3 e 4
ns, as quais permitem a determinação do pH de medidas não intensamente básicas.
Os tempos de vida podem ser recuperados usando contagem de fótons isolados ou
por fluorometria de modulação de fases. A fluoresceína é sintetizada pela reação
entre anidrido ftálico e resorcinol, em presença de cloreto de zinco ou ácido sulfúrico
concentrado, que atuam como agentes desidratantes, via a reação de Friedel-Crafts
ou ainda pelo ácido metanossulfônico como ácido de Lewis e catalisador (Figura 1).
Figura 1: Reação 1. Fonte: Wapedia, 2010.
Esta síntese pode ser usada numa identificação qualitativa entre fenol e
resorcinol. Após a condensação do fenol em teste com o anidrido ftálico, a posterior
32
reação com solução hidróxido de sódio dará cor rosa para fenolftaleína (portanto
fenol) e forte fluorescência verde, para fluoresceína (portanto resorcina).
A fluoresceína, especialmente na forma de seu sal sódico, a uranina, é
comumente usada como corante de desinfetantes, assim como para traceamento de
tubulações e tanques, tanto de água tratada, quanto de esgoto, para detecção de
vazamentos, pela forte fluorescência que apresenta, mesmo em soluções muito
diluídas. A fluoresceína é largamente utilizada na determinação de bromo e iodo,
formando os compostos: eosina (coloração rosa) e eritrosina (coloração rosa-
arroxeado), respectivamente. A eosina é utilizada para tingir lã e seda, cosméticos,
tintas e papéis, além de ser um "corante microscópico", colorindo um grupo de
leucócitos existentes no sangue, os eosinófilos. A eritrosina, tem amplo uso na
coloração de alimentos e em dentifrícios indicadores de placa bacteriana. Em
oftalmologia, fluoresceína é aplicada topicamente na forma de uma gota no olho,
dada oralmente, ou injetada intravenosamente para produzir um angiograma de
fluoresceína.
A hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) é um método que avalia a
atividade hidrolítica indiscriminada de microrganismos sobre a molécula de FDA, a
qual é hidrolisada por várias enzimas (lípases, proteases e esterases) presentes nos
microrganismos do meio onde se encontra a molécula do FDA (Figura 1). Assim, a
medida do grau da hidrólise serve como uma medida da atividade microbiana total
do solo (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982), o que pode estar relacionado com a
quantidade de matéria orgânica presente na amostra.
Figura 2: Fórmula estrutural do Diacetato de Fluoresceína. Fonte: Sigma-Aldrich (200?).
Atualmente a hidrólise de FDA é usada em pesquisas para determinar a
atividade enzimática do solo e tem apresentado resultados confiantes. A
33
mensuração da atividade enzimática do solo usando a hidrólise de Diacetato de
Fluoresceína (FDA) tem como princípio a determinação colorimétrica da
Fluoresceína hidrolisada que é o resultado da ação de uma série de enzimas
hidrolíticas encontradas no solo (MAIA, 2004 (Figura 2). O método de hidrólise de
Diacetato de Fluoresceína pode medir a taxa de desenvolvimento da biomassa
microbiana através da coloração desenvolvida pela Fluoresceína, o que pode ser
quantificada espectofotometricamente. O método FDA tem sido utilizado para medir
a atividade microbiana total do solo, lixo doméstico e o crescimento filamentoso de
fungos (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982), sendo que este estudo é considerado
como ponto de partida para toda uma série de estudos que o sucederam, visto que
ele introduziu a aplicação mais abrangente desta técnica nas questões ambientais.
Como não se encontrou estudos da FDA na determinação da atividade enzimática
em amostras industriais/ambientais e nem se encontrou estudos de mensuração da
biodegradabilidade intrínseca de amostras contendo matéria orgânica em meio
líquido, a revisão bibliográfica focou-se nos estudos mais recentes com a matriz solo
para a qual existe uma literatura substancial desde 1970.
Figura 3: Reação de hidrólise do FDA. Fonte: Green, Stott e Diack (2006).
Fontvieille, Outaguerouine e Thevenot (1992) propuseram um protocolo para
aplicar a hidrólise da FDA como método para medir a atividade enzimática e/ou para
a contagem bacteriana em lodos ativados de estações de tratamento de esgotos .
Estes autores compararam os resultados obtidos com os resultados de outros
métodos baseados na atividade do sistema transportador de elétrons (STE) e
consumo de oxigênio (CO). Os autores concluíram que a hidrólise da FDA não foi
proporcional ao consumo de oxigênio, enquanto o STE o foi, mas salientaram que a
hidrólise da FDA permite avaliar a atividade microbiológica em situações de
34
monitoramento onde o tempo e o espaço dificultam o uso de outras metodologias
para este objetivo.
Já no trabalho de Lestan et al (1996), foi utilizado o método da hidrólise da
FDA para determinar o potencial biológico de um fungo para degradar o
Pentaclorofenol (PCP), assim como avaliar o potencial de proliferação da biomassa
fúngica produzida no substrato. Os autores concluíram que este método foi útil para
estimar a biomassa, assim como para avaliar o potencial biológico e de proliferação
de fungos em solos contaminados por este fenol, indicando que a composição do
substrato, temperatura e estrutura do solo são importantes fatores que contribuem
para a alta atividade metabólica e de proliferação do fungo P. chrysosporium.
Leszczy�ska e Oleszkiewic (1996) estudaram a presença de substâncias
químicas tóxicas nos lodos ativados que prejudicavam os microrganismos usando a
hidrólise da FDA como critério de efeito. Os resultados mostraram uma relação
dose-dependente inversa na atividade enzimática, ou seja, maior a concentração do
tóxico, menor a atividade enzimática. Os valores tóxicos encontrados foram
comparáveis com os dados da literatura para os tóxicos 2-Monoclorofenol; 2,4-
Diclorofenol e 3,5-Diclorofenol, mas não para o 4-Monoclorofenol. Os autores
concluíram que o método da inhibição da atividade esterásica da FDA mostrou ser
exato e preciso (reprodutível) para determinação da toxicidade química em lodos
ativados.
Em um estudo conduzido por Silva, Siqueira e Costa (2004), testou-se o
método de hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a atividade
microbiológica de um solo submetido a quatro tratamentos: reflorestamento com
espécies nativas da mata atlântica, reflorestamento com espécies exóticas,
reflorestamento com nim, sucupira e pau-pombo, solo não submetido a
reflorestamento, além de solo sob mata atlântica nativa que foi utilizada como
padrão de comparação. Os tratamentos que apresentaram maior atividade
microbiológica foram os solos reflorestados com espécies nativas e exóticas. Os
autores concluíram que a hidrólise de FDA foi eficaz como indicador da atividade
microbiológica nos solos submetidos a reflorestamentos.
Em um estudo realizado no nordeste do Brasil, Oliveira et al (2007) usaram o
método da hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) para diferenciar
microbiologicamente os solos de cinco agroecossistemas quanto à atividade
microbiana na região do Semi-Árido do Brasil, sendo que a hidrólise ocorreu em
35
todos os tipos de solos. Assim, a atividade microbiológica foi notadamente alta em
solos sob cultivo de Gliricidia sepium, com 0,605 �g FDA hidrolisada min-1 g-1 de
solo, e foi baixa em solos nativos sob a caatinga, que atingiu o valor de 0,355 �g
FDA hidrolisada min-1 g-1 de solo, que por sua vez, foi semelhante ao solo sob palma
forrageira Opuntia fícus indica, obtendo-se um valor de 0,387 �g FDA hidrolisada
min-1 g-1 de solo. Os níveis de atividade microbiológica dos agroecossistemas
constituídos pelos solos sob pastagem cultivados com Urocloa mosambicensis e
áreas reflorestadas com leguminosas arbóreas (Mimosa caesalpiniaefolia) também
foram similares entre si apresentando valores de 0,544 e 0,519 �g FDA hidrolisada
min-1 g-1 de solo, respectivamente.
Silveira (2007) determinou as atividades enzimáticas em solos agrícolas
representativos de 11 localidades do Rio Grande do Sul e relacionou-as com
atributos químicos, físicos e químicos dos diferentes tipos de solos. Em cada local
foram avaliadas áreas sob vegetação nativa de mata e campo (utilizadas como
referência) e áreas cultivadas sob sistema de manejo conservacionista e
convencional, sendo determinadas as atividades das enzimas �-glucosidase,
fosfatase ácida, urease e hidrólise de FDA, o carbono da biomassa microbiana e a
respiração microbiana nas amostras de solo superficial. De maneira geral, os solos
com maiores teores de carbono orgânico apresentaram os maiores valores para as
atividades de �-glucosidase, fosfatase ácida e urease, com alta correlação positiva.
Entretanto, esta relação com o teor de carbono orgânico não foi observada com
carbono da biomassa, nem com a respiração microbiana. Os solos sob vegetação
nativa em geral apresentaram maior atividade enzimática, seguidos daqueles sob
sistemas mais conservacionistas, como o plantio direto. Os menores valores
geralmente ocorreram em solos sob sistema de plantio convencional. Os valores de
atividades enzimáticas tenderam a ser maiores nos períodos mais quentes. A �-
glucosidase, urease e fosfatase ácida mostraram-se sensíveis em detectar
mudanças, não só entre os sistemas de manejo de solo, mas também entre os
locais avaliados. Segundo esta autora, a hidrólise de FDA não se mostrou adequada
para indicar a qualidade do solo por apresentar valores similares nos diferentes
locais e sistemas de manejo.
Um estudo mostrou que o método da hidrólise da FDA pode ter
interferências por substâncias químicas na medida em que a atividade microbiana é
medida na camada superficial do solo (serrapilheira) (ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al,
36
2007). Para entender a origem destas interferências, algumas amostras de
serrapilheira foram esterilizadas por radiação � e por autoclavagem e algumas
amostras foram contaminadas com diferentes substâncias (aminoácidos, glicose,
sorbitol e ácidos húmicos). As amostras irradiadas não mostraram diferença
significativa comparativamente às amostras-controle não-irradiadas na hidrólise da
FDA, permitindo concluir que a radiação � não interfere com as enzimas.
Contrariamente, o aquecimento no autoclave diminuiu consideravelmente a hidrólise
da FDA nas amostras contaminadas, indicando interferências non-enzimáticas nesta
hidrólise. Como a humificação aumenta com a profundidade da serrapilheira e a
interferferência na hidrólise da FDA diminuiu em função da profundidade da
serrapilheira, os autores concluíram que a degradação das substâncias interferentes
e/ou quelação das mesmas pelos ácidos húmicos deveria estar ocorrendo, o que
permitiu aventar a hipótese de que alguns aminoácidos (lisina, arginina, histidina e
cisteina) foram os principais interferentes. Diante disso, os autores sugeriram que o
uso da tampão fosfato (50 mM, pH 7.0) com tempo de incubação < 30 minutos, em
temperaturas entre 30 e 40°C, interferem minimamente na hidrólise da FDA nas
amostras de serrapilheira.
37
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Descrição das áreas de estudo
Os pontos amostrais foram escolhidos de acordo com a disponibilidade
logística, autorização para coletas e categoria de efluente, para poder testar
amostras com diferentes condições de pH original, diferentes composições químicas
e diferentes bactérias que “contaminam” estes tipos de efluentes. Os pontos de
estudo foram selecionados aleatoriamente, tendo em vista, facilidade de acesso aos
diferentes pontos de coletas dos efluentes. A seguir são apresentadas as
coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as diferentes amostras
ambientais, sendo utilizado GPS modelo G520 slim, 2009, Orange Coll, para melhor
precisão dos resultados.
Amostras Ambientais Coordenadas Efluente Doméstico (ED) [S 26°14’19.83” x O 49°21’14.32”] Efluente Hospitalar (EH) [S 26° 53’41.35” x O 48°40’36.26”] Rio Poluído (RP) [S 27°33’35.03’’ x O 48°29’37.13”] Água Cinza (AC) [S 27°33’35.05” x O 48°29’48.35”] Agro-Industrial (AI) [S 28°44’36.49” x O 49°28’48.51”] Indústria Têxtil (IT) [S 27°4’25.76” x O 48°53’51.98”]
Quadro 1: Coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as
amostras ambientais. Fonte: Elaborado pela autora.
38
Figura 4: Ponto das coletas das amostras Fonte: Google, 2010.
5.2 Coleta e Preparação das Amostras
Para a realização dos ensaios foram coletados esgotos domésticos da fossa
séptica e caixa de gordura, efluentes de um hospital, rio poluído, efluentes industriais
têxtil e agro-industrial. Foram coletados volumes necessários para os diferentes
tipos de análises, em diferentes condições, sendo que os experimentos foram
repetidos em 3 datas diferentes, a fim de contemplar a variabilidade na composição
dos efluentes. Todas as três coletas realizadas foram do tipo simples, ou seja, as
coletas ocorreram em um único período do dia. Foram coletados 5 L de cada
efluente, acondicionados em frascos de âmbar, sendo que as coletas ocorreram em
diferentes condições ambientais. Os frascos foram identificados e encaminhados ao
laboratório de Remediação Ambiental da UNIVALI para serem processadas,
primeiramente separado o volume suficiente para cada análise (DBO, DQO, MOO,
OC e FDA), seguido pela medida do pH, filtradas com filtro de papel grosso e
acondicionadas em erlenmeyers para a realização dos experimentos. Antes de
colocar nos erlenmeyers definitivos foram feitas diluições de acordo com a coloração
39
das amostras numa proporção de: 1/1; 1/4; 1/8; 1/16 e 1/32 (em amostras com
coloração como o têxtil) como mostra a Tabela 1. Para o controle foram feitas
triplicatas estéreis, esterilizadas com autoclave (sem fluoresceína) ou choque de pH.
Para cada diluição também foram feitas triplicatas, medido e controlado o pH. Um
estudo paralelo foi desenvolvido em laboratórios particulares para avaliação da
metodologia proposta neste trabalho, onde foram testadas 4 amostras industriais
denominadas de A, B, C e D, segundo as mesmas metodologias descritas neste
capítulo.
Tabela 1: Diluições feitas nas amostras analisadas no presente trabalho.
Origem da Amostra Diluições Doméstico 1/1 1/4 1/8 Têxtil 1/1 1/4 1/8 1/16 1/32 Hospitalar 1/1 1/4 1/8 Rio 1/1 1/4 1/8 Água Cinza 1/1 1/4 1/8 Agroindústria 1/1 1/4 1/8
5.3 Metodologia de quantificação da matéria orgânica
Para determinação da matéria orgânica das amostras foram utilizados 3
metodologias diferentes: DBO5, DQO, Oxigênio Consumido, Calcinação e hidrólise
da FDA, as quais são descritas sucintamente a seguir.
5.3.1 Procedimento para a determinação da DBO5
A metodologia para determinação da Demanda Bioquímica de Oxigênio
(DBO5) foi baseada no protocolo de (APHA; AWWA; WEF, 1998). A amostra foi
diluída entre as concentrações de 100 e 1,6% em frascos de DBO. Foi feita a
quantificação imediata da concentração de OD (Oxigênio Dissolvido) e após
intervalos de 24 h, durante 5 dias. A incubação foi feita à 20°C e na obscuridade.
40
Foram feitas diluições das amostras conforme previsto pela metodologia
para cada tipo de amostra. Os valores de DBO foram corrigidos pelo fator de diluição
(FD).
O cálculo da demanda bioquímica de oxigênio após cinco dias de incubação
(DBO5) foi calculado como segue:
DBO5 = OD inicial – OD final
FD
Onde:
DBO5 = demanda bioquímica de oxigênio após cinco dias de incubação;
OD inicial = medida de oxigênio dissolvido no início do experimento;
OD final = medida de oxigênio dissolvido após cinco dias de incubação da
amostra;
FD = fator de diluição utilizado para o ensaio.
5.3.2 Procedimento para determinação da DQO
As determinações de DQO foram realizadas de acordo com a metodologia
padrão (APHA et al., 1998) que consiste em digestão em tubo fechado, seguida de
determinação espectrofotométrica (espectrofotômetro Instrutherm) em 490 nm.
Como reagentes usou-se as amostras além de peróxido de hidrogênio e sulfato
ferroso heptaidratado de grau analítico (marca Vetec). Em todos os experimentos,
desde a adição dos reagentes até a introdução da amostra nos tubos de DQO,
gastou-se o tempo máximo de 20 s. Foram feitas duplicatas de todos os
experimentos do estudo de interferência inorgânica na DQO. O cálculo para
determinação da DQO foi determinado a partir da informação da NBR 10357 que diz
que o biftalato de potássio tem um valor teórico de DQO de 1176 mg O2 /mg.
DQO em mg/L = (Concentração de biftalato de potássio X 1,176 X 1000) mL de amostra
41
Onde:
ml de amostra = 5 mL
5.3.3 Procedimento para determinação da Matéria Orgânica Oxidável (MOO) por
Calcinação
Para o procedimento da determinação da matéria orgânica oxidável das
amostras usou-se o processo de calcinação de um volume conhecido da amostra,
no caso 1 L. Este procedimento de calcinação da amostra foi realizado na
temperatura de 400°C, segundo a metodologia proposta por Adad (1982).
Assim, as amostras foram filtradas e 1 Kg de cada amostra foi
acondicionada em becker de 2 L. Após a evaporação da água em caixa de areia e
na estufa a 110°C, o material restante foi pesado e levado para estufa durante 2 h a
400°C. Após resfriamento, o conjunto foi pesado novamente e o material volatilizado
foi considerado como sendo matéria orgânica oxidável, a qual foi relacionada com o
volume de 1 L da amostra. Na determinação da MOO não foram feitas diluições,
pois este método não está sujeito a nenhuma interferência na determinação da
matéria orgânica.
5.3.4 Determinação do Oxigênio Consumido.
A metodologia para determinação da matéria orgânica pelo método do
Oxigênio Consumido foi baseada na metodologia publicada por Adad (1982).
Os reagentes utilizados foram: Permanganato de potássio 0,0125N; oxalato
de sódio 0,0125N; solução de ácido sulfúrico 1:3. Após a adição dos reagentes,
deixous-se ocorrer a oxidação por 30 min e calculou-se o Oxigênio Consumido na
amostra (em p.p.m.), usando-se a expressão:
O.C = ( (K – N) – (k – n) ) . 10 Vol. da amostra (mL)
42
Onde:
K = volume total em mililitros de KMnO4, gasto na amostra, incluindo o
adicionado antes da digestão;
N = volume em mililitros de oxalato usado na amostra;
k = volume em mililitros de KMnO4 usado em branco;
n = volume em mililitros de oxalato usado no branco.
5.3.5 Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA
Este método consiste em quantificar a hidrólise do Diacetato de
Fluoresceína [3’,6’-diacetilfluoresceina (FDA)] em amostras que contém matéria
orgânica com bactérias. Basicamente, o teste foi iniciado com a preparação de uma
solução tampão de fosfato de sódio 60 mM, pH 7,6 (8,7g de K2HPO4 + 1,3g KH2PO4
para 1 L de água), sendo que o pH foi ajustado com o HCl 0,01M. As amostras
coletadas em campo foram filtradas em papel-filtro semi-quantitativo e em seguida
foram distribuídas em tubos de ensaios (5 mL de amostra) em três repetições para
cada diluição de cada amostra. Concluída esta fase, acrescentaram-se 0,2 mL da
solução de diacetato de fluoresceína (concentração final 2 mg.mL-1). No caso das
diluições sucessivas, as amostras (2,5 mL) foram diluídas pela adição de 2,5 mL de
tampão fosfato. A preparação da solução de FDA foi feita pela dissolução de 40 mg
de Diacetato de Fluoresceína (FLUKA 31545) em 5 mL acetona p.a. e 15 mL água
destilada. Posteriormente a esta etapa os frascos foram fechados com folhas de
alumínio, a mistura foi incubada na temperatura de 27°C por até 36 h. A cada
intervalo de tempo desejado foram tomadas as alíquotas para análise no
espectrofotômetro à 490 nm (Espectrofotômetro INSTRUTHERM, Modelo UV 1100).
Os resultados foram expressos de forma bruta, em valores de variação das unidades
de absorbância.
43
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Otimização da metodologia de quantificação da matéria orgânica
intrinsecamente biodegradável pela hidrólise da FDA
O primeiro passo consistiu na determinação da quantidade de reagente
hidrolítico que deveria ser adicionado à amostra. Esta quantidade não poderia ser
muito grande devido a presença da acetona como diluente e nem muito pequena,
para não comprometer a hidrólise por falta de reagente hidrolítico. Como veremos
posteriormente, estas concentrações podem ter afetado alguns resultados. Assim, a
Tabela 2 nos mostra como variou a absorbância em função da quantidade de FDA
adicionado aos 5 mL de amostra no tubo de ensaio.
Tabela 2: Influencia da concentração da fluoresceína na variação temporal da
absorbância de duplicatas das amostras de um efluente agroindustrial
bruto.
Absorbância (490 nm) Amostra/tempo 0 h 1h 2h 3h 4h 5h
0,188 0,173 0,126 0,136 0,143 0,147 Efluente + FDA 80 µL/mL 0,185 0,169 0,123 0,133 0,137 0,145
0,200 0,192 0,130 0,120 0,172 0,167 Efluente + FDA 60 µL/mL 0,197 0,142 0,086 0,052 0,127 0,130
0,451 0,437 0,483 0,549 0,656 1,399 Efluente + FDA 40 µL/mL 0,441 0,438 0,419 0,440 0,456 0,950
A Tabela 2 nos mostra que os resultados da absorbância variaram
consideravelmente em função da quantidade de FDA adicionada. Quando estas
quantidades acrescentadas aos tubos foram de 300 ou 400 µL de FDA não houve
uma evolução da absorbância, indicando alguma interferência físico-química no
processo hidrolítico, muito provavelmente ligado à presença de acetona usada na
solubilização da FDA que pode ter inibido a atividade enzimática, o que não se
percebeu quando foram adicionados 200 µL de FDA. Deve ser ressaltado que a
44
acetona presente nos 200 µL de FDA pode ter afetado o valor da absorbância, mas
mesmo assim, os resultados mostram que é possível se obter respostas decorrentes
das atividades hidrolíticas ao se usar esta concentração.
Para testar se a autoclavagem poderia ou não influenciar na hidrólise da
fluoresceína foi feita uma experiência com amostras autoclavadas dos 5 tipos de
amostras estudadas neste trabalho de dissertação (Tabela 3), com e sem adição
prévia de FDA.
Tabela 3: Influencia da autoclavagem nas absorbâncias medidas após 2 e 24 h das
amostras após autoclavagem com e sem a adição prévia de 200µL de
fluoresceína no meio reacional.
Com adição prévia de FDA Sem adição prévia FDA Amostra 2 h 24 h 2 h 24 h
0,270 0,245 0 0 0,316 0,296 0 0
H2O destilada
0,261 0,216 0 0 2,278 2,286 0,053 0,041 2,282 2,284 0,055 0,043
Rio Poluído
2,295 2,297 0,056 0,059 2,294 2,304 0,160 0,149 2,311 2,314 0,154 0,144
Efluente Hospitalar
2,321 2,319 0,153 0,141 2,258 2,273 0,062 0,047 2,254 2,258 0,051 0,058
Efluente Agro-Industrial
2,262 2,260 0,055 0,047 2,542 2,558 0,364 0,326 2,548 2,569 0,356 0,356
Efluente Têxtil
2,538 2,567 0,355 0,345 2,274 2,279 0,031 0,022 1,299 0,956 0,027 0,026
Esgoto Doméstico
2,279 2,290 0,023 0,022 Obs. Não foi medida a absorbância no t = 0 h.
A Tabela 3 nos mostra que a adição prévia à autoclavagem, resultou em
valores elevados de absorbância, o que significa que a fluoresceína sofre hidrólise
total ao ser autoclavada, isso para todos os tipos de amostras testadas, enquanto
45
que a adição da fluoresceína após a autoclavagem demonstra que a hidrólise não
avançou por causa da esterilidade da amostra. Este resultado é congruente com o
dado publicado por Alarcón-Gutiérrez et al (2007), os quais também constataram
uma influência da autoclavagem sobre a hidrólise da FDA. Desta experiência
também pode-se concluir que nenhum componente físico-químico das amostras
interfere com a hidrólise da FDA, ao menos depois de ter sofrido a autoclavagem.
Contudo, há de se salientar que a autoclavagem usada pode não ter sido
suficientemente para degradar quimicamente as moléculas que poderiam interferir
com a hidrólise da FDA.
Outro tipo de resposta testado com o método FDA foi o tempo de resposta
conforme a atividade hidrolítica para 3 dos 6 tipos de efluentes usados no trabalho
de dissertação (Gráfico 1) (Anexo A).
Gráfico 1: Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial).
Nota-se no Gráfico 1 que o tempo de resposta hidrolítica foi variável para
cada tipo de amostra. Assim, para amostra da Água Cinza, a resposta passou a ser
útil depois de 21 h de hidrólise, enquanto para amostras do Rio Poluído e do
efluente Agro-Industrial a resposta já é útil a partir de 3 – 6 h de hidrólise, segundo a
diluição. Esta questão da resposta analítica já pode ser pensada em termos de
quantidade de bactérias hidrolíticas presentes em cada amostra, como também em
termos de bioacessibilidade e biodisponibilidade de matéria orgânica para as
46
bactérias, o que resultou nos diferentes tempos hidrolíticos. Outra conclusão deste
experimento diz respeito ao fato de que o crescimento bacteriano que pode haver na
amostra, ou mesmo a geração de metabólitos não perturbam de forma contundente
a evolução da hidrólise, conforme já demonstrado por Frankenberger e Tabatabai
(1980) quando trabalharam com a enzima L-glutaminase. Nesse sentido, as reações
catalisadas por enzimas mostram uma relação linear entre a quantidade de produto
formado e o tempo de incubação (DENG; TABATABAI, 1994), tendo um decaimento
à medida que o substrato é consumido (SKUJINS, 1967). Com relação à
temperatura dos experimentos (27°C), Adam e Duncan (2001) determinaram que a
temperatura ótima para a hidrólise da FDA foi de 30°C, muito próxima daquela
usada no presente trabalho.
Uma outra bateria de teste foi realizada para determinação do poder
hidrolítico de diferentes bactérias sobre o FDA e para tanto, foram escolhidas três
tipos de bactérias bem distintas: Bacilus polymixa; Cromobactéria violácea e uma
Bactéria liofilizada (não identificada), as quais foram inoculadas em meio aquoso
sem aporte nutricional. Nestes experimentos foram usados 100 µL de cada inóculo
bacteriano e ajustou-se o pH para 7. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela
4.
Tabela 4: Variação da absorbância em diferentes tempos para diferentes inóculos
bacterianos, com adição de 200 µL de FDA.
Bactéria Abs. inicial 2h 4h 6h 24h 26h 30h 48h
0,022 0,030 0,035 0,031 0,086 0,120 0,160 0,450 0,021 0,024 0,038 0,032 0,081 0,122 0,169 0,559
Bacilus polymixa
0,023 0,025 0,035 0,031 0,085 0,129 0,163 0,439 0,114 0,163 0,164 0,170 0,199 0,209 0,217 0,272 0,101 0,160 0,165 0,169 0,195 0,204 0,212 0,259
Cromobacteria violácea
0,139 0,160 0,172 0,172 0,235 0,254 0,268 0,328 0,012 0,020 0,027 0,013 0,036 0,037 0,054 0,106 0,007 0,020 0,031 0,019 0,038 0,044 0,055 0,109
Bactéria liofilizada
0,012 0,045 0,033 0,023 0,059 0,046 0,060 0,137
Percebe-se na Tabela 4 que as atividades hidrolíticas destas bactérias foram
fracas, muito provavelmente devido à pobreza do meio reacional, o que impediu o
47
crescimento bacteriano em função da falta de nutrientes. Mesmo assim, percebe-se
que houve atividade hidrolítica independentemente do tipo da cepa bacteriana. A fim
de verificar se haveria um aumento da atividade hidrolítica destas bactérias caso o
meio nutritivo fosse rico, realizou-se uma segunda série de ensaios, cujos resultados
são mostrados na Tabela 5. Neste novo ensaio o meio de cultura composto por
peptona de gelatina (5 mL), extrato de carne (3 mL), pH = 6,9 e 100 µL de inóculo
bacteriano de Bacilus polymixa ou Cromobacteria violacea, ou Bactéria Liofilizada
foram usados. Também testaram-se as seguintes diluições: 1/1; 1/4; 1/8; 1/16 e
1/32. Os tubos foram deixados na estufa por 24 h a 27°C e depois acrescentado 200
µL de FDA.
Tabela 5: Influência do meio nutritivo na atividade hidrolítica das bactérias B.
polymixa, C. violacea e de uma Bactéria Liofilizada sem identificação em
diferentes intervalos de tempo.
Bactéria Abs. Inicial da amostra
Abs. Inicial amostra + FDA 1h 3h 5h 22h
B. polymixa bruto
0,063 1,455 1,394 1,672 1,330 0,955
1/1 0,033 1,188 1,247 1,388 1,145 0,614
1/4 0,018 0,676 0,685 0,861 0,663 0,548 1/8 0,018 0,455 0,479 0,615 0,469 0,680
1/16 0,014 0,376 0,372 0,506 0,381 0,447
1/32 0,013 0,295 0,285 0,398 0,295 0,354 C. violacea
bruto 0,161 1,529 1,476 1,849 1,455 1,277
1/1 0,039 1,064 1,017 1,317 1,005 0,650
¼ 0,034 0,606 0,594 0,815 0,611 0,543
1/8 0,027 0,383 0,361 0,518 0,375 0,437 1/16 0,024 0,283 0,265 0,387 0,274 0,383
1/32 0,013 0,385 0,350 0,506 0,358 0,390 B. liofilizada.
Bruto 0,058 1,731 1,670 1,850 1,569 1,222
1/1 0,032 0,956 0,920 1,124 0,864 0,607 ¼ 0,028 0,729 0,739 0,978 0,739 0,802
1/8 0,022 0,691 0,698 1,050 0,721 0,938
1/16 0,013 0,326 0,326 0,467 0,317 0,345 1/32 0,005 0,365 0,357 0,512 0,351 0,351
48
Como pode ser visto na Tabela 5, o experimento da atividade hidrolítica das
bactérias com adição do caldo nutriente fez a absorbância aumentar rapidamente,
para depois diminuir, o que pode ser explicado provavelmente pela presença no
caldo de moléculas que provocam a degradação do FDA, conforme já relatado na
literatura (ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al, 2007)
Outro parâmetro relatado na literatura que influencia grandemente na
hidrólise da FDA é o pH (BRUNIUS, 1980; ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al, 2007). A
taxa de biodegradação é muito dependente do pH do meio e isto é válido tanto para
os sistemas aeróbios como para os sistemas anaeróbios, sendo que o melhor valor
para este parâmetro é próximo à neutralidade, isto é, em torno de 7 unidades
(FERREIRA-FILHO; CHUI, 2006). Assim, uma das condições para escolha dos
diferentes tipos de amostras testadas neste trabalho foi a possibilidade de testar a
metodologia com amostras de diferentes pH, subentendendo por aí, diferentes
condições hidrolíticas que representam o espectro de condições ambientais. Os pHs
das amostras brutas estudadas nesta dissertação são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6: Variabilidade dos pHs das amostras estudadas nos ensaios hidrolíticos.
pH pH Amostra
1ª Campanha 2ª Campanha Indústria Têxtil 11,96 13,01 Efluente Hospital 9,36 6,65 Agro-Indústria 9,63 6,18 Efluente Doméstico 9,43 7,58 Água Cinza 4,38 5,56 Rio Poluído 9,55 7,45
Em função dos valores do pH, que poderiam influenciar nos valores
hidrolíticos, optou-se por fazer todas as reações tamponadas com o tampão fosfato,
onde as diluições levaram o pH para cerca de 7,5 unidades, anulando qualquer
interferência na atividade hidrolítica que este parâmetro poderia exercer. Isto se
justifica porque o FDA se degrada espontaneamente em pH superior a 8,0 ou inferior
a 5,0 unidades (BRUNIUS, 1980; SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982). O efeito tampão
é crítico na hidrólise do FDA porque a ionização das proteínas/enzimas e o estado
de ionização dos substratos podem alterar significativamente a conformação
49
(estrutura espacial) de ambos, impedindo que o sítio ativo da enzima promova seu
efeito catalisador.
6.2 Comparações dos resultados da Demanda Química do Oxigênio (DQO),
Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO), Matéria Orgânica Oxidável
(MOO), Oxigênio Consumido (OC) e hidrólise de Diacetato de
Fluoresceína (FDA) na estimação da matéria orgânica das amostras
Os diferentes parâmetros usados para quantificar a matéria orgânica de uma
amostra sempre irão divergir entre si com relação aos valores encontrados, pois
cada parâmetro mede um processo diferente.
De todas as mensurações realizadas neste trabalho, aquela da Matéria
Orgânica Oxidável (MOO) é a única que mede diretamente a quantidade de
carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre na forma orgânica, ou em outras palavras,
mensura a calcinação da matéria orgânica que se transforma em gases voláteis.
Apesar de ser um método sujeito a pequenas interferências, estas podem ser
desprezíveis com relação à quantidade de matéria orgânica presente nas amostras.
Conforme já descrito anteriormente, a DQO mede a quantidade de O2
consumido para oxidar quimicamente a matéria orgânica, enquanto o OC mede o
mesmo parâmetro, mas consumido em uma oxidação mais suave com
permanganato. A DBO mede a quantidade de O2 consumido pelas bactérias na
biodegradação da matéria orgânica. Já a hidrólise da FDA é a medida da atividade
enzimática competente para hidrolisar a FDA, sendo objeto desta dissertação.
Assim, nas próximas seções estes tipos de mensurações serão comparados sempre
com a MOO e com a hidrólise da FDA para ver qual metodologia pode melhor
representar a quantidade de matéria orgânica de uma amostra, focando
principalmente no aspecto da quantificação da biodegradação intrínseca das
amostras, pois esta é a informação mais relevante para o entendimento do aspecto
ambiental envolvendo o despejo de amostras ricas em matéria orgânica nas águas
receptoras dos nossos rios.
50
6.2.1 Comparação da eficiência da DQO e da hidrólise da FDA na determinação da
matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela
calcinação (MOO)
A Tabela 7 mostra os valores mensurados pela DQO, hidrólise do FDA e
MOO nas diferentes diluições das diferentes amostras utilizadas neste estudo para
avaliar qual das metodologias é mais eficiente na determinação da matéria orgânica
presente nestas amostras, o que pode ser visto na tabela 9.
Tabela 7: Médias dos valores de FDA, DQO e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
DQO (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/1 1029 1290 490 1/4 790 698 245
1
1/8 609 244 122 1/1 621 814 350 1/4 578 500 175
Efluente Têxtil
2
1/8 474 208 87,5 1/1 563 512 220 1/4 407 314 110
1
1/8 278 131 55 1/1 524 558 201 1/4 297 210 100
Efluente Hospitalar
2
1/8 98 138 50 1/1 252 288 127 1/4 202 191 63
1
1/8 163 98 32 1/1 335 291 125 1/4 242 177 62
Agro-Indústria
2
1/8 169 80 31 1/1 125 577 231 1/4 50 267 115
1
1/8 19 166 58 1/1 63 711 256 1/4 52 298 128
Água Cinza
2
1/8 25 183 64 1/1 940 1368 520 1/4 490 843 260
1
1/8 80 209 130 1/1 1217 1067 480
Efluente Doméstico
2 1/4 832 333 240
51
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
DQO (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/8 524 180 120 1/1 165 353 155 1/4 122 217 77
1
1/8 86 78 38 1/1 238 367 136 1/4 66 200 68
Rio Poluído
2
1/8 10 77 34
A análise de DQO é bastante utilizada para avaliar o teor de matéria
orgânica presente em efluentes, pois o método apresenta muitas vantagens, como
por exemplo, rapidez (apenas 3 horas de teste), realizável mesmo com materiais
tóxicos (desde que não afetem o oxidante) e também permite avaliar a relação
DBO/DQO para prever a porcentagem de matéria orgânica biodegradável presente
na amostra estudada. Porém existem alguns problemas relativos a execução do
teste DQO, pois a presença de haletos interferem nos resultados podendo levar à
subestimação dos resultados pela inibição do catalisador (precipitação da prata) ou
superestimação dos valores de DQO devido a oxidação do cloreto a gás cloro
(VAIDYA et al, 1997). Assim, os métodos oficiais recomendam a adição de sulfato
de mercúrio para minimizar esta interferência pela precipitação dos haletos (APHA,
1998) A adição do mercúrio encarece a análise, apresenta risco de toxicidade ao
laboratorista e ao meio-ambiente. Também alguns íons inorgânicos como: Fe2+, S2-,
SO32-, entre outros, são oxidados pelo dicromato usado no teste, favorecendo uma
DQO inorgânica, superestimando os valores encontrados no teste da DQO.
Independentemente disto, a relação MOO/DQO para as amostras estudadas (Tabela
7) são similares com a relação de aproximadamente 0,4 encontrada na literatura
para a relação Carbono Total/DQO (SCHMIDELL et al, 2007).
Com relação aos objetivos deste trabalho, a linearidade das metodologias
estudadas, isto é, a proporcionalidade da resposta mensurada em função da
quantidade de MOO pode ser avaliada pelo coeficiente de correlação linear (R2) da
equação da reta obtida com os dados gerados, os quais são mostrados de forma
comparativa na Tabela 8 entre os valores mensurados da hidrólise da FDA e do
teste de DQO para as duas campanhas analíticas envolvendo os 6 tipos de
amostras ambientais/industriais. Obviamente que um método de hidrólise de um
composto adicionado ao meio reacional não nos permitirá a estimação da
quantidade de matéria orgânica presente na amostra, mas o objetivo de tal
52
comparação é compreender a linearidade da resposta fornecida pela metodologia,
comparativamente a um teste clássico bem estabelecido na literatura, como é o caso
do teste da DQO.
Tabela 8: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de FDA
e DQO em função dos valores de MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Equação da reta (R2) Amostra Campanha
FDA DQO Y = 0,8839.X – 429,73 y= 0,3549.X + 21,63 1 R² = 0,9540 R² = 0,9936 y = 1,610.X - 694,2 y = 0,434.X – 16,38
Efluente Têxtil
2
R² = 0,9109 R² = 0,9857 y = 0,5832.X - 114,3 y = 0,435.X – 10,34 1 R² = 0,9908 R² = 0,9860 y = 0,356.X + 7,771 y = 0,337.X + 15,06
Efluente Hospitalar
2
R² = 0,9880 R² = 0,9855 y = 1,077.X – 147,5 y = 0,501.X – 22,39 1
R² = 0,9919 R² = 0,9828 y = 0,571.X – 69,38 y = 0,448.X – 9,278
Agro-Indústria
2 R² = 0,9922 R² = 0,9891 y = 1,616.X + 30,15 y = 0,410.X – 3,341 1
R² = 0,8992 R² = 0,9958 y = 4,547.X – 62,88 y = 0,349.X + 10,53
Água Cinza
2
R² = 0,9095 R² = 0,9922 y = 0,455.X + 74,06 y = 0,332X + 35,52 1 R² = 0,9867 R² = 0,9703 y = 0,524.X – 169,2 y = 0,381.X + 79,38
Efluente Doméstico
2
R² = 0,9921 R² = 0,9853 y = 1,492.X – 95,47 y = 0,425X - 1,783 1
R² = 0,9903 R² = 0,9808 y = 0,435.X + 33,79 y = 0,355.X + 3,142
Rio Poluído
2 R² = 0,9954 R² = 0,9947
A análise da Tabela 8 nos mostra que das 6 amostras estudadas, quatro
apresentaram linearidades comparáveis entre a hidrólise da FDA e o teste da DQO,
enquanto 2 amostras (Efluente Têxtil e Águas Cinzas) mostraram uma linearidade
53
inferior para o caso da hidrólise da FDA. Para o caso específico do Efluente Têxtil, a
falta de linearidade da metodologia baseada na hidrólise da FDA pode ser explicada
pela interferência da coloração do efluente na leitura da absorbância na faixa do
visível onde a fluoresceína absorve (490 nm). No caso de se perceber interferência
da amostra neste comprimento de onda (490 nm), deve-se então ler as
absorbâncias na região do ultra-violeta no comprimento de onda de 320 nm ou usar
um espectrofluorímetro onde a excitação ocorre a 494 nm e a emissão a 521 nm. .
Esta interferência pode ser tanto pela absorção do raio no comprimento de
onda específico, como também pela reação dos componentes do efluente com o
diacetato ou mesmo com a própria fluoresceína. Já no caso da falta de boa
linearidade da amostra de Água Cinza, esta continha material graxo, o que dificultou
o acesso das bactérias ao material gorduroso e ao diacetato de fluoresceína. Assim,
apesar de haver matéria orgânica e o composto hidrolisável nesta amostra, estes
compostos poderiam não estar bioacessíveis ou mesmo indisponíveis para a
microbiologia presente neste tipo de amostra. Conforme já frisado por diversos
autores, o diacetato de fluoresceína pode ser degradado por lípases (geralmente
presente em resíduos gordurosos), mas o composto tem que estar bioacessível aos
microrganismos para que a hidrólise seja feita (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982;
SEMPLE et al, 2004).
Em função dos resultados mostrados na Tabela 8, podemos concluir que,
com exceção do Efluente Têxtil e da amostra de Águas Cinzas, a linearidade do
método da hidrólise da FDA é similar à linearidade apresentada pelo teste da DQO,
demonstrando haver uma proporcionalidade entre a resposta da hidrólise enzimática
com a matéria orgânica oxidável da amostra.
6.2.2 Comparação da eficiência da Oxigênio Consumido e da hidrólise da FDA na
determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais
mensurada pela calcinação (Matéria Orgânica Oxidável - MOO)
Os valores de matéria orgânica mensurados pelo método OC, hidrólise do
FDA e MOO nas diferentes diluições das diferentes amostras utilizadas neste estudo
para avaliar qual das metodologias apresenta uma linearidade de resposta com
54
relação à quantidade de matéria orgânica presente nestas amostras aparecem na
Tabela 9.
Tabela 9: Médias dos valores de FDA, OC e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
OC (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/1 1029 533 490 1/4 790 315 245 1 1/8 609 72 122 1/1 621 408 350 1/4 578 170 175
Efluente Têxtil
2 1/8 474 110 87,5 1/1 563 210 220 1/4 407 135 110 1 1/8 278 59 55 1/1 524 205 201 1/4 297 133 100
Efluente Hospitalar
2 1/8 98 57 50 1/1 252 12 127 1/4 202 10 63 1 1/8 163 7 32 1/1 335 27 125 1/4 242 19 62
Agro-Indústria
2 1/8 169 11 31 1/1 125 70 231 1/4 50 45 115 1 1/8 19 10 58 1/1 63 30 256 1/4 52 22 128
Água Cinza
2 1/8 25 12 64 1/1 940 306 520 1/4 490 190 260 1 1/8 80 64 130 1/1 1217 95 480 1/4 832 69 240
Efluente Doméstico
2 1/8 524 35 120 1/1 165 17 155 Rio Poluído 1
1/4 122 13 77
55
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
OC (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/8 86 9 38 1/1 238 12 136 1/4 66 9 68
2 1/8 10 6 34
Conforme se observa na Tabela 9, os valores de OC são nitidamente
inferiores aos valores da DQO mostrados na Tabela 7, o que se explica pela
oxidação da matéria orgânica em condições mais suaves do que no caso da DQO.
Com relação à comparação da linearidade entre os métodos FDA e OC, os
resultados obtidos são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de
FDA e OC em função dos valores de MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Equação da reta (R2) Amostra Campanha
FDA OC Y = 0,884.X – 429,73 y= 0,793.X + 42,57 1 R² = 0,9540 R² = 0,9758 y = 1,610.X - 694,2 y = 0,839.X + 11,64
Efluente Têxtil
2
R² = 0,9109 R² = 0,9899 y = 0,583.X - 114,3 y = 1,092.X – 18,71 1
R² = 0,9908 R² = 0,9812 y = 0,356.X + 7,771 y = 1,017.X – 16,89
Efluente Hospitalar
2 R² = 0,9880 R² = 0,9784 y = 1,063.X – 147,1 y = 18,31.X – 103,0 1
R² = 0,9764 R² = 0,9514 y = 0,571.X – 69,38 y = 5,875.X – 38,96
Agro-Indústria
2
R² = 0,9922 R² = 0,9812 y = 1,616.X + 30,15 y = 2,803.X + 17,88 1 R² = 0,8992 R² = 0,9581 y = 4,547.X – 62,88 y = 10,49.X – 74,49
Água Cinza
2 R² = 0,9095 R² = 0,9679 y = 0,455.X + 74,06 y = 1,603.X + 4,058 1
R² = 0,9867 R² = 0,9772
Efluente Doméstico
2 y = 0,524.X – 169,2 y = 5,876.X – 109,8
56
Equação da reta (R2) Amostra Campanha
FDA OC R² = 0,9921 R² = 0,9645
y = 1,492.X – 95,47 y = 14,62.X – 100,1 1 R² = 0,9903 R² = 0,9820 y = 0,435.X + 33,79 y = 17,00.X – 73,67
Rio Poluído
2
R² = 0,9954 R² = 0,9819
A Tabela 10 mostra uma melhor linearidade do método de hidrólise da FDA
comparativamente à linearidade do método OC para 4 tipos de amostras (EH, AI, ED
e RP). Isto pode ser explicado pelo fato de que a oxidação via permanganato no
método OC não consegue degradar de forma homogênea os compostos orgânicos
presentes nestas amostras devido às condições suaves de oxidação. Já para os
Efluentes Têxteis e para a Água Cinza, a mesma explicação dada quando da análise
da DQO é válida, ou seja, a interferência de corantes e a presença de material graxo
dificultam a mensuração óptica ou o acesso à matéria orgânica.
6.2.3 Comparação da eficiência da DBO e da hidrólise da FDA na determinação da
matéria orgânica biodegradável de amostras industriais/ambientais líquidas
mensurada pela calcinação (MOO)
A metodologia da DBO é a mais usada para determinação da quantidade de
matéria orgânica via decomposição bacteriana. A digestão completa da matéria
orgânica se faz no organismo da bactéria, através de uma reação bioquímica que
necessita de oxigênio para ser realizada. Assim, quando é fornecido como alimento
à uma bactéria uma quantidade de matéria orgânica, ela precisará de uma
determinada quantidade de oxigênio para que seu organismo transforme a matéria
orgânica em outra substância (no caso, mineralize a matéria orgânica). Apesar de
poder se medir vários parâmetros neste teste de DBO, não se mede diretamente a
quantidade de bactérias e sim o consumo de O2 pelas bactérias. Uma alternativa
para se mensurar a quantidade de matéria orgânica biodegradável é a quantificação
da atividade enzimática na amostra, o que pode ser feito pela adição de um
57
composto facilmente hidrolisável (neste caso, o diacetato de fluoresceína). Para uma
avaliação mais criteriosa desse tipo de resposta, na Tabela 11 são mostrados os
valores mensurados pela DBO, hidrólise do FDA e MOO nas diferentes diluições das
diferentes amostras utilizadas neste estudo. A comparação da linearidade das
respostas mensuradas em função das diluições usadas permite avaliar qual das
metodologias é mais eficiente na determinação da matéria orgânica biodegradável
presente nas amostras estudadas.
Tabela 11: Médias dos valores de FDA, DBO e MOO medidos nas diluições das
diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
DBO (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/1 1029 207 490 1/4 790 143 245
1
1/8 609 30 122 1/1 621 196 350 1/4 578 75 175
Efluente Têxtil
2
1/8 474 61 87,5 1/1 563 230 220 1/4 407 80 110
1
1/8 278 51 55 1/1 524 110 201 1/4 297 82 100
Efluente Hospitalar
2
1/8 98 35 50 1/1 252 20 127 1/4 202 13 63
1
1/8 163 4 32 1/1 335 16 125 1/4 242 10 62
Agro-Indústria
2
1/8 169 4 31 1/1 125 30 231 1/4 50 28 115
1
1/8 19 10 58 1/1 63 36 256 1/4 52 29 128
Água Cinza
2
1/8 25 4 64 Efluente Doméstico
1 1/1 940 110 520
58
Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)
DBO (mgO2/L)
MOO (mg/L)
1/4 490 78 260
1/8 80 40 130 1/1 1217 400 480 1/4 832 250 240
2
1/8 524 70 120 1/1 165 68 155 1/4 122 30 77
1
1/8 86 22 38 1/1 238 20 136 1/4 66 14 68
Rio Poluído
2
1/8 10 8 34
Os valores mensurados pelo método da DBO (Tabela 11) são inferiores aos
valores mensurados pela DQO (Tabela 7), o que é congruente, pois enquanto esta
mede toda a matéria orgânica oxidável, a DBO só mede a parte da matéria orgânica
biodegradada pelas bactérias. A questão de qual das metodologias apresenta uma
melhor linearidade na quantificação da matéria orgânica pode ser avaliada
consultando-se a Tabela 12, a seguir.
Tabela 12: Equação da reta e coeficiente de correlação linear (R2) para os valores
de FDA e DBO em função dos valores de MOO medidos nas diluições
das diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.
Equação da reta (y = B.X + A) (R2) Amostra Campanha
FDA DBO Y = 0,884.X - 429,73 y= 1,965.X + 36,73 1 R² = 0,9540 R² = 0,9401 y = 1,610.X - 694,2 y = 1,749.X + 10,57
Efluente Têxtil
2 R² = 0,9109 R² = 0,9716 y = 0,583.X - 114,3 y = 0,860.X + 24,84 1
R² = 0,9908 R² = 0,9835 y = 0,356.X + 7,771 y = 1,915.X - 27,90
Efluente Hospitalar
2
R² = 0,9880 R² = 0,9434 y = 1,063.X - 147,1 y = 5,821.X + 2,205 1 R² = 0,9764 R² = 0,9638
Agro-Indústria
2 y = 0,571.X - 69,38 y = 7,833.X - 5,667
59
Equação da reta (y = B.X + A) (R2) Amostra Campanha
FDA DBO R² = 0,9922 R² = 0,9812
y = 1,616.X + 30,15 y = 6,481.X - 12,23 1
R² = 0,8992 R² = 0,8097 y = 4,547.X - 62,88 y = 5,088.X + 32,30
Água Cinza
2
R² = 0,9095 R² = 0,8755 y = 0,455.X + 74,06 y = 5,505.X - 115,0 1 R² = 0,9867 R² = 0,9714 y = 0,524.X - 169,2 y = 1,077.X + 21,54
Efluente Doméstico
2
R² = 0,9921 R² = 0,9707 y = 1,492.X - 95,47 y = 2,389.X - 5,563 1
R² = 0,9903 R² = 0,9856 y = 0,435.X + 33,79 y = 8,500.X - 39,67
Rio Poluído
2 R² = 0,9954 R² = 0,9820
A Tabela 12 mostra uma melhor linearidade do método de hidrólise da FDA
comparativamente à linearidade do método DBO para os 6 tipos de amostras, com
exceção da segunda campanha com o Efluente Têxtil. As amostras que
apresentaram as piores linearidades para a hidrólise da FDA foram os Efluentes
Têxteis e as Águas Cinzas, pois há a interferência de corantes na hidrólise do
diacetato ou na mensuração óptica e a presença de material graxo nas Águas
Cinzas dificulta a acessibilidade à matéria orgânica, o que pode tornar os compostos
biodegradáveis não-biodisponíveis, o que se percebe pelos baixos valores de
correlação linear para ambos os métodos testados.
6.3 Estudo paralelo (FDA x DQO x DBO)
Paralelamente ao estudo desenvolvido na UNIVALI, foram realizadas
análises de DQO, FDA, DBO e MOO em laboratórios particulares, utilizado a mesma
metodologia do FDA proposta neste trabalho. Os ensaios foram realizados com
quatro diferentes amostras líquidas industriais (A, B, C e D).
60
Tabela 13: Valores de FDA, DBO, DQO e MOO medidos nas diluições das diferentes
amostras industriais analisadas no estudo paralelo.
Amostra Diluições DQO
(mgO2/L)
DBO
(mgO2/L)
FDA
(� Abs x 10-3)
MOO
(mg/L)
1/1 825 522 154 350
1/4 367 50 86 175
A
1/8 36 22 51 87,5
1/1 181 30 183 680
1/4 83 20 153 340
B
1/8 49 3 140 170
1/1 218 80 303 920
1/4 95 47 245 460
C
1/8 26 14 210 230
1/1 640 305 614 2420
1/4 302 192 320 1210
D
1/8 175 110 148 605
Com estes dados da Tabela 13, pôde-se calcular a equação da reta para as
respostas obtidas com as diferentes diluições das amostras e assim estabelecer o
coeficiente de correlação linear que permite calcular a variabilidade das respostas
dos diferentes métodos (Tabela 14).
Tabela 14: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de
FDA, DQO e DBO em função dos valores de MOO medidos nas
diluições das diferentes amostras industriais usadas no estudo paralelo.
Equação da reta (R2) Amostra
FDA DBO DQO Y= 2,552.X - 43,37 Y= 0,457.X + 113,7 Y= 0,336.X + 66,73 A R2= 0,9999 R2= 0,9600 R2= 0,9952 Y= 1,177.X – 147,0 Y= 1,794.X + 7,968 Y= 0,377.X + 0,271 B
R2= 0,9994 R2= 0,9432 R2= 0,9966 C Y= 0,747.X – 135,1 Y= 1,045.X + 4,530 Y= 0,361.X + 12,86
61
R2= 0,9988 R2= 0,9819 R2= 0,9996 Y= 0,002.X + 0,001 Y= 1,054.X + 53,50 Y= 2,595.X + 6,00 D
R2= 0,9992 R2= 0,9951 R2= 0,9978
Os resultados da Tabela 14 confirmam os resultados obtidos no
laboratório da UNIVALI, demonstrando que para as amostras testadas em paralelo,
a linearidade das respostas obtidas pela hidrólise da FDA (3 respostas na casa do
0,999) são melhores (mas, similares) do que as respostas obtidas com a
metodologia da DQO e bem melhores do que as linearidades apresentadas pelo
método da DBO (nenhuma resposta na casa do 0,999).
6.4 Discussão geral
Antes de iniciar uma discussão mais detalhada sobre os resultados obtidos,
devemos nos lembrar que os métodos usados no presente trabalho, apesar de
procurarem quantificar a matéria orgânica, sempre acabam quantificando materiais
distintos. Assim, de um lado temos os métodos de oxidação como MOO, DQO e OC
e de outro lado, métodos que medem a atividade microbiológica, como a DBO e a
Hidrólise da FDA. Contudo, as eficiências das duas vertentes estão condicionadas à
acessibilidade e a disponibilidade (especiação química/estrutura química) das
substâncias a serem oxidadas.
Os primeiros métodos citados acima na realidade oxidam tudo o que for
oxidável em função dos seus poderes de oxidação. Assim, na metodologia da MOO
o aquecimento a 500°C oxida a matéria orgânica carbonácea (e.g., glicídios) e
nitrogenada (e.g., proteínas), assim como a matéria mineral oxidável a esta
temperatura (e.g., carbonatos). Já no caso da DQO, a oxidação medida pelo
consumo do agente oxidante forte (i.e., dicromato em meio ácido) diz respeito
principalmente à oxidação da matéria orgânica carbonácea e nitrogenada, mas que
pode sofrer interferências de certos minerais (e.g., haletos). No caso do OC, o poder
oxidante do ânion permanganato em condições de oxidação mais suaves é mais
fraco, ocasionando uma oxidação da matéria mais limitada e são por estas razões
que se pode explicar a hierarquia de linearidade observada para estas três
62
metodologias analíticas: a MOO apresenta a menor variabilidade devido as
condições fortemente oxidantes, com a menor intensidade de interferência e por isto
mesmo, escolhido como método de referência; a DQO apresentou, com relação à
MOO, os melhores coeficientes de correlação entre os valores mensurados em
função das diluições das amostras usadas e por último, o fraco poder oxidante da
metodologia OC levou aos piores valores de correlação entre os valores
mensurados em função das diluições das amostras. Naturalmente pode-se pensar
que um menor poder de oxidação significa que a reação química de oxidação está
mais sujeita às variações da acessibilidade/disponibilidade da matéria a ser oxidada.
Assim, espera-se que matéria orgânica insolúvel ou parcialmente solúvel (e.g.,
matéria orgânica em suspensão) seja oxidada em menor extensão/intensidade do
que uma matéria orgânica dissolvida, a qual tem uma área de contato muito maior,
facilitando o contato dos reagentes, ou em outras palavras, a matéria a ser oxidada
está acessível/disponível para as moléculas oxidantes.
No caso das metodologias que mensuram a atividade dos microrganismos, a
questão da maior ou menor taxa de biodegradação depende quase que
exclusivamente de 3 fatores: da bioacessibilidade, da biodisponibilidade (incluindo aí
a estrutura molecular, a qual pode ou não ser degradada pelos organismos
presentes no meio onde ocorre a biodegradação).
Do ponto de vista físico-químico, várias explicações foram dadas para se
entender a acessibilidade ou disponibilidade de uma molécula para reagir com outra
molécula ou ser absorvida por um microrganismo, sendo que todas estas
explicações passam pelo fenômeno de adsorção/desorção das moléculas oxidáveis
(PIGNATELLO; XING, 1996; XING; PIGNATELLO, 1997). De forma simplificada, a
desorção rápida e completa de uma molécula que está adsorvida está associada às
fracas interações químicas presentes neste fenômeno (e.g., forças de van der
Waals, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de Hidrogênio), fazendo com
que a acessibilidade a esta molécula fracamente adsorvida seja facilitada. As
desorções lentas e parciais estão associadas às fortes interações entre as
moléculas adsorvidas e os adsorventes (e.g., ligações químicas parcialmente
covalentes e em alguns casos, iônicas). Existem também os casos onde as
moléculas não serão oxidadas por falta de acessibilidade e/ou disponibilidade destas
moléculas, geralmente por estarem fortemente adsorvidas por ligações covalentes a
um adsorvente ou por estarem protegidas no interior de uma molécula maior
63
(CALDERBANK, 1989). Ainda, no caso da disponibilidade, o estado de oxidação da
estrutura química a ser decomposta é o principal parâmetro que determinará se
haverá ou não a oxidação, seja química, seja microbiológica.
Com relação à otimização da metodologia proposta para avaliar a
quantidade de matéria orgânica intrinsicamente biodegradável nas amostras, este
estudo demonstrou que o volume de FDA na preparação do reagente é importante,
pois uma quantidade maior de acetona para dissolver mais FDA pode causar uma
toxicidade importante nas bactérias responsáveis pela biodegradação. Testes
alternativos poderiam ser feitos utilizando outro tipo de solvente, como por exemplo
o DMSO a 5%. Deve-se observar também o pH e a possível presença de
substâncias na amostra que possam hidrolisar o FDA, o que pode ser visto
imediatamente, pois em poucos minutos a absorbância aumenta bastante e se torna
estável. Nesse sentido, um ensaio preliminar ao começar o trabalho com uma
amostra é altamente recomendável, pois também se conhecerá o tempo necessário
para que o produto da hidrólise possa ser quantificado de forma segura e como
consequência, se os microrganismos presentes na amostra tem a capacidade de
hidrolisar o FDA. Todas as amostras testadas possuíam microrganismos
competentes para hidrolisar o FDA e nos ensaios realizados, também uma espécie
de bactéria liofilizada foi competente para realizar a hidrólise nas condições do teste.
Como o FDA é uma substância fluorescente, pode-se aumentar consideravelmente
o limite de detecção da metodologia ao se trabalhar com um espectrofluorímetro na
detecção do produto da hidrólise.
Como os métodos de DQO e OC possuem objetivos distintos da
metodologia do FDA, não cabem discussões comparativas entre estas
metodologias, porém, no caso da DBO, uma comparação mais criteriosa é de
importância para clarificar os aspectos positivos e negativos de cada metodologia.
Os dados mostrados na Tabela 12 deixaram claro que das 12 amostras
testadas, somente uma apresentou uma melhor linearidade para a DBO,
comparativamente aos valores da Hidrólise da FDA. Esta melhor linearidade da FDA
significa que a metodologia responde de forma mais precisa quando se usam
diferentes diluições para se avaliar a quantidade de matéria orgânica. Uma crítica
que pode ser feita para as condições usadas nos testes é a de que não foi feita a
diluição adequada da amostra para a realização do teste da DBO. Apesar disto ser
verdadeiro, isto na realidade demonstra a grande versatilidade do método da
64
hidrólise da FDA que não requer obrigatoriamente uma diluição para fornecer uma
resposta confiável.
Deve-se salientar que o teste da DBO é amplamente aceito como indicador
da biodegradabilidade da matéria orgânica presente em uma amostra, sendo de
grande importância quantitativa a relação DQO/DBO (BRAILE; CAVALCANTI, 1993).
Contudo, apesar da grande importância da informação gerada pelo teste de DBO,
algumas críticas metodológicas sempre persistiram quanto à aplicabilidade desta
metodologia. As principais críticas ao teste DBO são (DART, 1977; LOGAN;
WANGENSELLER, 1993; ADAMS; BEALING, 1994):
− tempo de resposta relativamente longo: o teste padrão de DBO demora 5 dias,
mas a biodegradação natural pode não ser completa em 5 dias ou pode ser em
um tempo menor do que este período;
− reprodutibilidade pobre: os resultados para a mesma amostra apresentam valor
do coeficiente de variação em torno de 20%, o que é relativamente alto;
− inconsistência de resultados quando substâncias tóxicas estão presentes nas
amostras estudadas;
− inóculo: quando se acrescenta um inóculo de microrganismos, estes podem ser
diferentes daqueles que estarão em contato com a amostra no meio-ambiente;
− diluições: quando se faz diluições, estas também geralmente não correspondem
com a realidade ambiental, onde geralmente se tem um gradiente bem maior de
diluição na área de despejo;
− laboriosidade: o procedimento clássico do teste de DBO é laborioso, inclusive
com necessidade de se realizar um pré-teste;
− co-metabolismo: os organismos mortos durante o teste contribuem para aumentar
o valor da DBO, mas estes não fazem parte da matéria orgânica das amostras;
− falta de representatividade ecológica: os microrganismos usados no inóculo para
ocorrer a biodegradação podem não existir no meio-ambiente, sendo que o
mesmo pode ser dito com relação às condições de realização do ensaio
laboratorial.
Assim, com os valores obtidos pelo método da Hidrólise da FDA pode-se
fazer a proposição de outra relação para se avaliar a especificamente a quantidade
de matéria orgânica intrinsecamente biodegradável de uma amostra, a qual seria a
relação entre o valor da matéria orgânica oxidável pelo processo térmico de
65
calcinação e a variação da absorbância do teste da FDA (MOO/FDA). Os valores
desta relação, assim como a relação entre MOO e DBO para as diferentes amostras
e suas diluições são mostrados na Tabela 15.
Tabela 15: Relações entre os valores de FDA, DBO e MOO das diferentes amostras
analisadas neste estudo.
Amostra Campanha Dados MOO/DBO MOO/FDA X ± � 6,41 ± 1,63 2,49 ± 0,44 1 C.V. 25,5 17,7 X ± � 4,74 ± 1,71 2,52 ± 0,29
Efluente Têxtil
2
C.V. 36,0 11,7 X ± � 2,91 ± 0,89 2,52 ± 0,29 1
C.V. 30,7 11,4 X ± � 3,86 ± 1,26 2,55 ± 0,39
Efluente Hospitalar
2 C.V. 32,6 15,2 X ± � 17,86 ± 5,75 2,79 ± 0,45 1
C.V. 32,2 16,1 X ± � 18,63 ± 1,21 2,59 ± 0,26
Agro-Indústria
2
C.V. 6,5 10,0 X ± � 15,12 ± 5,02 2,56 ± 0,27 1 C.V. 33,2 10,7 X ± � 25,26 ± 18,37 2,66 ± 0,29
Água Cinza
2
C.V. 72,7 10,7 X ± � 9,49 ± 3,79 2,49 ± 0,82 1
C.V. 39,9 33,0 X ± � 2,19 ± 0,75 1,70 ± 0,45
Efluente Doméstico
2 C.V. 34,1 26,5 X ± � 5,32 ± 1,85 2,38 ± 0,39 1
C.V. 34,7 16,6 X ± � 14,08 ± 4,37 2,63 ± 0,34
Rio Poluído
2
C.V. 31,0 13,1 X ± � 2,72 ± 1,79 2,00 ± 0,28 A 1 C.V. 65,8 14,0 X ± � 32,11 ± 21,4 2,38 ± 1,26 B 1
C.V. 66,8 52,8 X ± � 12,57 ± 3,45 2,00 ± 0,98 C 1
C.V. 27,4 49,0 D 1 X ± � 6,58 ± 1,24 3,94 ± 0,15
66
Amostra Campanha Dados MOO/DBO MOO/FDA C.V. 18,8 3,9
Nota-se claramente na Tabela 15 que a relação MOO/FDA para uma mesma
amostra é muito mais regular do que a relação MOO/DBO. Observa-se ainda na
Tabela 15 que das 16 amostras testadas, somente em 2 amostras (uma amostra
Agro-industrial e outra amostra industrial C) o coeficiente de variação (C.V.) para as
diluições da mesma amostra foram maiores na relação MOO/FDA do que na relação
MOO/DBO, mostrando que o método de Hidrólise da FDA apresenta uma menor
variabilidade quando se usa uma diluição para estabelecer a relação de
biodegradabilidade da matéria orgânica presente na amostra estudada. Mais
importante ainda é o fato de que os valores dos coeficientes de variação das
relações são muito mais aceitáveis para o caso da relação MOO/FDA (4 casos
depassando um C.V. de 20%) do que no caso da relação MOO/DBO que apresentou
12 casos em 16 com C.V. maior do que 30%.
Contrariamente a tendências tecnológicas sofisticadas, a aplicação da
metodologia da Hidrólise da FDA é simples, sem necessidade de muitos reagentes,
sem necessidade de equipamento adicional, sendo que o espectrofotômetro pode
ser substituído por uma escala colorimétrica impressa em papel. Além do mais, caso
se queira expandir a qualidade da informação obtida, isto é, além de poder se
conhecer a biodegradabilidade intrínseca da amostra, pode-se conhecer o potencial
de biodegradação da amostra ao se adicionar um inóculo específico (ou mistura) de
microrganismos, facilitando assim a escolha do tipo de microrganismo mais
competente para a degradação da matéria orgânica de uma amostra específica, o
que pode ser de muito interesse para os operadores de estações de tratamento de
águas residuárias ou de efluentes industriais. Nesse sentido, as leituras em
intervalos de tempo podem fornecer dados para se conhecer a cinética da
biodegradação, permitindo otimizar rapidamente as condições de operação do
sistema de tratamento em uso.
A literatura registra também outras metodologias para a avaliação da
quantidade e qualidade da material orgânica em amostras líquidas, tanto naturais
quanto industriais. Assim, a necessidade de métodos rápidos, portáteis,
economicamente acessíveis e, principalmente aplicáveis de forma on-line, tem
estimulado a produção e desenvolvimento de biosensores (RASTOGI et al, 2003).
67
Como exemplo, podemos citar o trabalho de Wang et al (2010), os quais
desenvolveram um biosensor do tipo bio-reator, usando mistura de células de
microrganismos imobilizados em esferas colocadas em uma câmera ao invés da
imobilzação clássica feita em membranas. Estas células imobilizadas nas esferas
dentro de câmaras foram colocadas em suspensão para o máximo contato com a
matéria orgânica e oxigênio presentes no meio líquido, podendo-se ajustar o número
de microrganismos nas esferas em função das condições do meio onde os
microrganismos serão expostos. Esta proposição metodológica de Wang et al (2010)
significativamente aumentaram o limite de detecção, a exatidão e a precisão na
determinação da matéria orgânica biodegradável. Para uma freqüência de 8 análises
diárias de DBO, as esferas tiveram uma vida útil de 70 dias, mas o aparato analítico
inclui equipamento informático, o que encarece sensivelmente a aplicação desta
metodologia.
68
7 CONCLUSÃO
Este trabalho de dissertação apresenta uma nova metodologia para avaliar a
biodegradabilidade intrínseca da matéria orgânica de uma amostra líquida de origem
industrial/ambiental, a qual tem larga aplicabilidade em termos de diferentes classes
de efluentes industriais (têxtil, hospitalar, agro-industrial) ou amostras ambientais
que possuem matéria orgânica (águas residuárias cinzas, esgotos domésticos e
águas de rio poluído). Esta metodologia é baseada na hidrólise do diacetato de
fluoresceína, hidrólise esta que pode ser feita por uma ampla variedade de
microrganismos que possuem em seu metabolismo lipases, esterases e proteases.
A otimização parcial da metodologia permitiu estabelecer um conjunto de condições
mínimas para a aplicação desta metodologia. Assim, quantidade do reagente FDA
(200 µl.mL-1), pH (entre 7,0 – 8,0), sistema tamponante (fosfato de sódio 60 mM, pH
7,6), volume de amostra e diluição (5 mL e diluições de 1/1; 1/4 e 1/8), tempo de
biodegradação (24 h) foram estabelecidos para que todas as amostras testadas
pudessem ser analisadas pela nova metodologia. Já foi determinado que amostras
contendo corantes que interferem na leitura do FDA hidrolisado (�max= 490 nm) e
amostras ricas em material graxo podem interferir significativamente na
eficiência/precisão da metodologia proposta.
A comparação das respostas de amostras diluídas e analisadas por
diferentes metodologias de avaliação da matéria orgânica permitiram estabelecer
que a hidrólise da FDA apresenta uma precisão melhor (mas próxima) daquela da
metodologia da DQO e muito melhor do que a precisão apresentada pelo método do
Oxigênio Consumido (OC). Em termos de mensuração da biodegradabilidade
intrínseca da matéria orgânica de uma amostra líquida, a comparação entre as
relações da hidrólise da FDA e DBO com a Matéria Orgânica Oxidável termicamente
(MOO) mostraram que a hidrólise da FDA fornece valores bem mais precisos do que
a DBO quando se trabalha com uma série de diluição para cada amostra. Nesse
sentido, os valores dos coeficientes de variação das relações são muito mais
aceitáveis para o caso da relação MOO/FDA (4 casos depassando um C.V. de 20%)
do que no caso da relação MOO/DBO que apresentou 12 casos em 16 com C.V.
maior do que 30%. A explicação para isto repousa no fato de que a matéria orgânica
(incluído o diacetato de fluoresceína) está mais acessível (em termos de contato) e
69
disponível (em termos de especiação química e absorção) para os microrganismos
nas condições em que o ensaio é realizado. Desta forma, é razoável concluir que,
independentemente da perspectiva de uso (monitoramento de uma estação de
tratamento em indústria ou monitoramento de um sistema de biorremediação in
locus), a hidrólise do FDA conjuga a avaliação da bioacessibilidade e da
biodisponibilidade, as quais estão sujeitas a uma série de influências por fatores
físico-químicos do meio onde ocorre a oxidação.
De forma resumida, o ensaio com a FDA é mais ambientalmente realístico
do que o teste de DBO, além de ser rápido, de baixo custo, de fácil execução técnica
e com necessidade mínima de equipamento.
Além do fato de ser mais conveniente em termos de aplicação
industrial/ambiental, o desenvolvimento da coloração pela hidrólise permite medidas
mais precisas e mais reais (em termos de condições ambientais) para se conhecer a
cinética da biodegradação de uma amostra específica. A eficiência da
biodegradação pelo uso de diferentes microrganismos ou misturas de
microrganismos poderá ser feita de forma rápida e precisa, ajustando-se assim
rapidamente as condições ótimas para promover a biodegradação.
Certamente outros fatores deverão ser estudados para melhor compreender
as limitações técnicas desta nova metodologia, porém, os dados levantados
permitem afirmar que a metodologia é viável tecnicamente e de fácil execução
laboratorial. Por outro lado, além das possíveis deficiências, os estudos
complementares poderão ajudar no aperfeiçoamento desta nova metodologia que
poderá ser incorporada no cotidiano dos técnicos que trabalham na área da
biodegradação.
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ANEXO
Anexo A – Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial).
Amostra Abs. inicial
3h 6h 9h 21h 24h 27h 30h AC 1/1 0,095 0,085 0,092 0,096 0,183 0,220 0,236 0,275 AC 1/4 0,053 0,040 0,049 0,046 0,090 0,104 0,119 0,134 AC 1/8 0,023 0,023 0,029 0,022 0,034 0,042 0,060 0,075 RP 1/1 0,134 0,184 0,226 0,243 0,293 0,299 0,320 0,348 RP 1/4 0,081 0,104 0,132 0,144 0,192 0,202 0,227 0,259 RP 1/8 0,042 0,049 0,061 0,067 0,099 0,109 0,115 0,140 AI 1/1 0,164 0,166 0,213 0,228 0,322 0,345 0,366 0,379 AI 1/4 0,054 0,086 0,125 0,140 0,248 0,265 0,279 0,292 AI 1/8 0,031 0,046 0,071 0,082 0,173 0,184 0,203 0,214