Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. 204, 45-55 (1977)

Graefes Archiv for klinische und experimentelle

Ophthaln' logie �9 by Springer-Verlag 1977

R(ickbildung von cornealen Neovaskulaten durch Laserbehandlung ?*

H. Baurmann, G. Chioralia und F. Kremer

Univ.-Augenklinik Bonn (Direktor: Prof. Dr. W. Best), D-5300 Bonn-Venusberg, Bundesrepubllk Deutschland

Regression of Corneal Neovaseularization by Laser Treatment?

Summary. The corneal neovascularization produced by NaOH burns was examined in two groups of pigmented rabbits following laser treatment. The t reatment was carried out with energy level 500 roW, spot diameter 200 ~m, and exposure time 1 s throughout. In the first group, a single newly formed vessel was coagulated in each ease. Subsequent fluorescein angiography invariably showed an incomplete occlusion of the vessel. In the second group, we coagulated a section of the neovas- cularization network at its origin in the corneal limbus. After 48 h, fluorescein per- fusion was once again observed, but the vessels involved were predominantly finer than before. Fluorescence microscopy revealed a rich neovascularization of the more superficial layers of the corneal stroma. To be successful, laser t reatment must involve both supplying and draining vessels.

Zusammenfassung. An pigmentierten Kaninchen untersuchten wir durch NaOH- )~tzung erzeugte Hornhautgeffigneubildungen nach Laserbehandlung mit konstan- ten 500 mW Energie, 200 micron spot-Durchmesser und 1 sec Expositions- zeit. Bei einer Tiergruppe koagulierten wir jeweils ein einzelnes Gef~g. Fluores- zenzangiographisch erwies sich dieses Gef/ig nie als vollst~ndig verschlossen. Bei einer 2. Tiergruppe koagulierten wir an der Basis der vom Limbus netzf6rmig sich ausbreitenden Neovaskulate. 48 Stunden sp/~ter waren die Neovaskulate wieder fluoresceindurchg~ingig; ihre St~mme waren jedoch zarter als zuvor. Fluoreszens- mikroskopisch fanden wit reichlich Neovaskularisation insbesondere der ober- fl~ichlicheren Stromaschichten. Eine Laserbehandlung yon neugebildeten Gef~igen mug die zu- und abffihrenden Gef~ge erfassen, wenn sie erfolgreich sein soil.

* Herrn Prof. Dr. E Weigelin zum 60. Geburtstag

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Einleitung

In letzter Zeit wurde wiederholt versucht, im Fatle der Ausbildung von Neovaskulaten bei Hornhautaffektionen eine Argon-Laserbehandlung durchzuffihren, um die neugebil- deten Gef/ige zu verschliegen (u.a. Cherry u. Garner, 1976). Dar/iber hinaus hat man bei cornealen Affektionen versucht, den Laser als therapeutisches Mittel anzuwenden, wenn keine begleitenden Neovaskulate ausgebildet wurden (u.a. Tokumaru u. Fromer, 1975). Auch auf experimentellem Sektor fand die Anwendung des Argon Laser zur Bek/impfung yon Neovasculaten Interesse (Ey u. Mitarb., 1968; Reed u. Mitarb., 1975 ; Cherry u. Garner, 1976). Als Versuchstier diente das Kaninchen. Die Untersuchungs- und Versuchsbedingungen waren dabei recht unterschiedlich sowohl hinsichtlich der Laser-Parameter als auch hinsichtlich der Erfolgsregion. Die Laserdaten schwankten beziiglieh aller wesentlichen Parameter, n/imlich spot-Durchmesser, Expositionszeit und Energie sowie Anzahl der Lasereffekte. Reed u. Mitarb. (1975) verwandten 4 5 0 - 500 mW Energie, einen spot-Durchmesser yon 100 micron und 2 sec Expositionszeit in Form eines ,painting' entlang dem Gef~igverlauf, wobei die Bewegungsgeschwindigkeit nicht bekannt ist. Cherry u. Garner (1976) wandten nach Fluoresceininjektion 100 bis 300 mW Energie auf bei einem spot yon 50-100 micron und einer Expositionszeit yon 0,2 sec; sie setzen 2869 Einzeleffekte in 6 Sitzungen und 4322 Einzeleffekte in 3 Sitzungen. - Wir fanden es unter diesen Umstiinden sinnvoll, das Verhalten experi- mentell erzeugter Gefitgneubildungen im Bereich der Cornea des Kaninchens unter weitgehend gleichbleibenden Bedingungen der Laserapplikation zu beobachten.

Material und Methode

Zun~ichst ffihrten wir eine intracorneale Injektion von 0,05 ml 0,1 n NaOH aus bei 6 pigmentierten Kaninchen yon 2000 bis 3750 g. K6rpergewicht; der Eingriff wurde in Lokalanaesthesie mit Kokaintropfen 5 %ig unter Fixierung des Bulbus mit einer Fixierpinzette vorgenommen. Die Tiere wurden danach 3 Wochen beobachtet. So- dann wurde in Ketanest-Allgemeinanaesthesie eine Fluoreszenz-Kontrollangiographie der Hornhaut einschlieglich des Limbus mit Aufnahmesequenz 2/sec angefertigt. Die Allgemeinanaesthesie wurde wie folgt vorgenommen: 1. Praemedikation mit 4 m120 % Urethan/kg + 1 ml Atropin 0,0005 g pro Tier sub- cutan; 2. Anaesthesie mit 1 ml Ketanest (Ketamin hydrochlorid)/kg + 0,1 ml Combelen/kg K6rpergewicht intramuskul~r. Fiir die Angiographie verwendeten wir jeweils die auf das K6rpergewicht der Kanin- chen umgerechnete menschliche Normaldosis (5--8 ml 10% bei 70 kg durchschnittl. K~Srpergewicht). 48 Std naeh dem Kontro|langiogramm wurde eine Laserbehandlung vorgenommen. Wir bildeten 2 Untersuehungsgruppen, yon denen bei der einen jeweils ein isoliertes Neovaskulat nahe dem Limbus koaguliert wurde; bei der 2. Gruppe koagulierten wir iiber 1 -2 Std der Limbuszirkumferenz mehrere einander benach- bart ausgehildete Neovaskulate. Die Laserbehandlung erfolgte unter konstanten Be- dingungen: Intensit~t 500 roW, spot-Durchmesser 200 micron, Expositionszeit 1 Sekunde. Die Beobachtung erstreckte sich fiber 6 Monate nach der Laserapplikafion

Corneale Neovaskulate

u n d wurde du rch C o l o r a u f n a h m e n u n d Schwarz-Weig-Angiographien sowie f luores-

z e n z m i k r o s k o p i s c h e A u f n a h m e n d o k u m e n t i e r t .

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2

Abb. 1. Gebiet der cornealen Neovaskulate direkt nach Laserkoagulation (500 mW, 200 micron spot-Durchmesser, 1 sec Exposition, ein spot auf ein Gefiig (Pfeil))

Abb. 2. Das gleiche Gef~l~gebiet wie in Abbildung 1. Fr/ihphase des Fluoreszenzangiogramms (4--6 sec n. Inj.). Der Pfeil weist auf das koagulierte Gef~ig, das kein Fluorescein fOhrt. Ang4o- gramm direkt nach Laserkoagulation

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Resultate

I. Makroskopiscber Hornbautbefund nacb intracornealer Injektion yon NaOH

W/ihrend und direkt nach Injektion yon 0,05 ml NaOH 0,1 n in einen parazentralen Hornhautbezirk beobachteten wir jeweils eine scheibenf6rmige opake Trfibung yon ca. 1 cm Durchmesser. Dieser Bezirk hellte sich innerhalb der ersten 2 bis 3 Beob- achtungswochen etwas auf bei zunehmender Vaskularisation, ausgehend vom Limbus. Nach den im folgenden beschriebenen Laserbehandlungen (2. und 3.)/~nderte sich am Zustand der Hornhaut nichts bei makroskopischer Betrachtung; auch die umschrie- benen Trfibungsbezirke ver~nderten sich makroskopisch nicht mehr. In der weiteren, 3 bis 6 Monate dauernden Beobachtungszeit trat eine teilweise )~nderung insofern ein, als der opake Bezirk sich auf etwa 1,3 bis 1,5 cm vergr6gerte, wobei der Eindruck bestand, dag ein Zusammenhang mit der sich/indernden Neovaskularisation gegeben w/~re. Bei allen Augen zeigte die Neovaskularisation zu keiner Zeit einen station/~r bleibenden Befund.

2. Isotierte Laserkoagulation an einem Neovaskulat

Wie aus Abbildung 1 stellvertretend fOx alle anderen Aufnahmen dieser Serie hervor- geht, wurde dutch den Laserspot eine deutliche Beeintr~ichtigung des betroffenen Gef/il~katibers produziert (Pfeil). Sie erweist sich als eine betr/ichtliche Stenosierung

Abb. 3. Spittphase des Angiogramms. Das koagulierte Gef~f~ ffihrt jerzt (10-12 sec. n, lnj,) etwas Farbstoff

Corneale Neovaskulate 49

c

Abb. 4 a--e a Kontrollangiogramm 3 Wochen nach NaOH parazentral intracorneal. Reiches Netz neu- gebildeter, yore Limbus auf die Cornea vorwachsender Gefiif~e mit Diffusionseignung b Fluoreszenzangiogramm unrnittelbar nach Laserkoagulation. Es wurden fiber 2 Std der Limbuszirkumferenz aneinander anschlief~ende Laserkoagulationen mit 500 roW, 200 micron Durehmesser und 1 sec Exoositionszeit gesetzt. Bemerkenswerter Fiillungsmangel der Gefiif~e c Angiogramm 48 Std naeh Laser. Mehrere Blutungen heben sich gegen die wieder gut mit Farb- - stoff gef'tiUten Neovaskulate ab (Abb. 4 d u. e s. S. 50)

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des Gef~ges (Pfeil in Abb. 2 u. 3). W/ihrend der Frfihphase der Angiographie fiillt sich das laserkoagulierte Gef~f~ nicht mit Farbstoff. In der sp~iten Phase erfolgt eine geringe Ffillung des Gef~/f~es mit Fluorescein. Sowohl die Abbildung 1 als auch die Abbildung 3 lassen auch unter Fluorescein (Abb. 3) erhebliche Kaliberunregelmiif~ig-

keiten des laserbehandelten Gef~/gastes erkennen. Die unter Fluorescein sehr gut

hervortretenden Neovaskulate zeigen eine sehr schnelle Diffusion des Farbstoffs,

die vorzugsweise in dem distal vom Limbus gelegenen Schlingennetz stattfindet.

3. Laserkoagulationen an einander benacbbarten Neovaskulaten

Es wurde versucht, im Basisbereich der vom Limbus aus sich netzf6rmig entwickeln- den Neovaskulate fiber etwa 2 Std der Limbuszirkumferenz sowohl feinere als auch st/irkere und starke Gef/ilgst~mme zu koagulieren (Abb. 4a). Abbildung 4b zeigt das

d

e Abb. 4 d u. e

d Kontrollangiogramm nach 2 Wochen. Restitution des Netzes der Neovaskulate. Die Gefalg- st/imme slnd jedoch zarter als ehedem e 6 Monate nach Laserbehandlung. Im Angiogramm erkennt man deutlich die feineren Gefiig- st~imme und das gegenfiber den Vorangiogramm unver~indert gebliebene Diffusionsverhalten der Neovaskul ate

Corneale Neovaskulate 51

Resul ta t im Vergleich zur Abbi ldung 4a. Bemerkenswer t ist hier der Mangel an Fiil-

lung der Gef~/ge mit Fluorescein. Stellenweise waren bei den Koagula t ionen Blutungen

aufgetreten, die sich 48 Stunden nach der Laserbehandlung gegenfiber den sich nun

wieder reichlich mit Farbs toff fiillenden Neovaskulaten abheben (Abb. 4c). Die wei tere

6

Abb. 5. Fluoreszenzmikroskopisches Bild eines Hornhautschnittes (Kaninchen) 3 Monate nach NaOH-Atzung 0,1 ml NaOH 10%; aus 40 real. Die Neovaskularisation des Corneastromas hat insbesondere die dem Epithel zugewandten Anteile betroffen.

Abb. 6. Fluoreszenzmikroskopisches Bild einer Hornhaut der Ratte im Ultraviolettlicht 30 Tage nach Laserkoagulation paralimbaler Neovaskulate; aus 100 mal. Ahnlich wie in Abbildung 5 sind vor allem die epithelw~irts gerichteten Anteile betroffen

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Entwicklung ist gekennzeichnet durch eine Restitution des Netzes der neugebildeten Gef/ilge mit dem Unterschied, dag nunmehr feinere und feine Gef/if~st/imme fiberwogen (Abb. 4d." 2 Wochen, Abb. 4e: 6 Monate nach Laser). Das Diffusionsverhalten blieb in

etwa das gleiche (Abb. 4a-e) .

4. Mikroskopiscbe Befunde

Obereinstimmend mit Befunden, die wir nach NaOH-)~tzungen parazentraler Hornhaut- bezirke bei der Ratte mitteilten (Baurmann u. Mitarb., 1976) fanden wir bei den Ka-

ninchen eine reichliche Neovaskularisierung des Corneastromas, insbesondere in den,

dem Epithel zugewandten Teilen, wie dies in Abbildung 5 beim Kaninchen und in Ab-

Abb. 7. Fluoreszenzmikroskopisehes Bild einer Kaninchenhornhaut eine Woche nach NaOH-~tzung intraeorneal dutch NaOH-Injektion parazentral; aus 40 real. Starke Oedembildung. Bei allen Tleren fiel die im endothelw~irtigen Anteil siehtbare und parallel zum Endothel verlaufende hell fluores- zierende Linie auf, die zeitunabh~ingig war (Pfeil in Abb. 5 u. 7)

Corneale Neovaskulate 5 3

bildung 6 bei der Ratte dargestellt ist. Sehr eindrucksvoll erscheint uns das ausgepr~gte Oedem der Cornea bei zweien unserer Versuchstiere eine Woche nach NaOH-Ktzung durch intracorneale Injektion (Abb. 7). Bei allen Tieren beobachteten wir im endothel- w~irts gerichteten Anteil des Stromas eine jeweils durch das gesamte Pr~iparat endothel- parallel verlaufende, stark leuchtende Linie, die sowohl bei den nach einer Woche als auch bei den erst nach 6 Monaten enucleierten Augen sichtbar war (Pfeile in Abb. 5 u. 7). Hinsichtlich der Verhaltensweise der neugebildeten Gefiige konnten fluoreszenz- mikroskopisch keine ins Gewicht fallenden Unterschiede konstatiert werden. Die wei- ter oben (s. unter 3.) angiographisch beobachtete Transformation des ursprfinglich aus sfiirkeren Gefiigen entspringenden und weitgehend im oberen Stroma sich ausbreiten- den Gefiif~netzes in ein feinmaschiges Netz konnte fluoreszenzmikroskopisch nicht so eindeutig differenziert werden.

Diskussion

Um die Verhaltensweisen experimentell entstandener Gefiigneubildungen der Hornhaut beurteilen zu k/Snnen, mug man yon m/Sglichst gleichbleibenden Faktoren der Ver- suchsanordnung und der Versuchsbedingungen ausgehen. Bei den hier beschriebenen Versuchen wurden als fixe Daten flit die Laserapplikation ermittelt: 500 mW Energie, 200 micron spot-Durchmesser, eine Sekunde Expositionszeit. Diese Daten ergaben sich aus voraufgegangenen Versuchsreihen. Bei Anwendung einer geringeren Energie als 500 mW und bei einem spot-Durchmesser vonweniger als 200 micron erzielten wir in keinem Fall eine zuverl/issige Gefiigokklusion. Unsere Bilder zeigen, dag selbst unter Anwendung von 500 mW Energie, 200 micron spotdiameter und Exposition 1 see noch keine vollstdndige Okklusion zustande kam. Bei der Kombination.. gleichbleibende Energie yon 500 mW, Verringerung des spotdurchmessers entstanden betr~ichtliche Irissch~iden, ~iber die auch Cherry und Garner berichtet haben; sie diirffen u.a. mit der st~irkeren Fokussierung zu erkl~iren sein. In Obereinstimmung mit Cherry u. Garner (1976) beobachteten wit bei unseren pigmentierten Versuchstieren keine Netzhaut- seh/iden. Wie Cherry u. Garner berichteten, ist tier Effekt des Argon Laserstrahls an den Neovaskulaten sfiirker, wenn man die Laserapplikation nach intravenSser Injek- tion von Fluorescein-Natrium vornimmt. Dies erkl~irt sich aus der vermehrten Absorp- tion der Laserstrahlen durch das Fluorescein, da der Farbstoff ~ihnliche Wetlenl/ingen wie tier Laserstrahl aufweist. Wit haben den Farbstoff nut zur Dokumentation der Permeabilifiitsverh/iltnisse und des Diffusionsverm~Sgens des Farbstoffes nach Laserbe- handlung verwendet. Wir stellten fest, dag das hohe Diffusionsverm/Sgen des Fluores- ceins dazu fiihrte, dalg wir die Gefiige nur relativ kurze Zeit unter Farbstofffillung be- obachten konnten, bzw. nur etwa 30 bis 60 sec lang.

In Obereinstimmung mit Cherry und Garner (1976) beobachteten wir, dab die Okklusion eines Einzelgefiiges durch Laser nur yon vortibergehendem Erfolg sein kann, da meist reichlich Kollateralen bestehen. Um die Funktion von Neovaskulaten auszu- schalten, mug man sorgfiiltig m6glichst alle zu- und abfiihrenden Gefiige koagulieren, was in vielen F~illen ~iugerst schwierig, wenn nicht unm6glich ist. Bei unseren Versu- chen konnten wir eine solche totale Blockierung erzeugen; abet schon nach einer Woche konnten wir unter Fluorescein eine erneute Durchg~ingigkeit eines Grogteils der laserbe-

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handelten Gef/ige erkennen. Hierbei beobachteten wir jedoch einen ver/inderten Ver- teilungsmodus dieser Gef/ifge, wie die Abbildung 4 a - 4 e gut demonstriert. Beim Ver- gleich dieser Bilder k6nnte man annehmen, es handle sich um verschiedene Augen, was aber nicht der Fall ist. Auf die stimulierende Wirkung der Laserbehandlung auf Neovas- kulate am Fundus, insbesondere in der Chorioidea, haben wir hingewiesen (Baurmann u. Mitarb., 1976). Sie sollte beriicksichtigt werden, auch wenn direkte Vergleiche zwi- schen Limbus und Fundus nicht ohne weiteres zul/issig sind. Auch die Erzeugung von Neovaskulaten mit dem Laser - wie dort beschrieben - und mit chemischen Stoffen kann nicht ohne weiteres korreliert werden. - Eine in unseren Pr/iparaten regelm/igig auftretende, stark fluoreszierende Linie innerhalb des Corneastromas und endothelpa- rallel verlaufend, k6nnen wir nicht mit Sicherheit interpretieren (vgl. Abb. 5 u. 7). Am ehesten scheinen uns 2 M6glichkeiten ihrer Entstehung in Betracht zu kommen: Es k6nnte sich um jene Stromaschichten handeln, in welche lamell//r die NaOH-Injektion erfolgte, wodurch eine Verdichtung des Gewebes mit entsprechend verst/irkter Auto- fluoreszenz des Gewebes entstand; oder es k6nnte sich um den Grenzbereich des Oedems im Stroma handeln.

Bei der histologischen Betrachtung der im Gefolge der Laserapplikation auftreten- den Narbenbildungen im Stroma der Cornea k6nnen wir durchaus verstehen, daf~ ein Vorgehen, wie es yon Cherry u. Garner (1976) angegeben wurde, n/imlich in mehreren Sitzungen bis zu 4322 Lasereffekte zu installieren, die Bildung einer Narbenbarriere erzeugen k6nnte. Eine solche w~re vielleicht geeignet, eine funktionelle Restitution der Neovaskulate oder ihre weitere Ausbildung zu verhindern. Indessen bleibt das An- bzw. Aufhalten von Neovaskulaten insofern problematisch, als feinmaschige Gef//gnetze kaum zu beherrschen sind. Der Erfolg wird umso fragw/irdiger, je weniger ,,greifbar" Gef/ig- st/imme als Ausgangspunkte und/oder Abflulgwege f/ir den Inhalt des Gef~tgnetzes vor- handen sind. Zu ber/icksichtigen ist ferner, dag die starke Diffusion des Farbstoffs in die Umgebung der Neovaskulate das Hornhautgewebe zu einer diffusen Absorptionsfl/iche macht. Es ist auch abzuw/igen, was f/Jr eine eventuelle Keratoplastik nachteiliger ist: eine durch Narben ver//nderte oder mit neugebildeten Gef/igen durchsetzte Wirtshorn- haut. - Auch ein anderer Behandlungsmodus fiihrte bei uns nicht zu einem Abbau eornealer Vaskulate: Wir okkludierten mit dem Argon Laser bei pigmentierten Ratten wie bei pigmentierten Kaninchen arealweise s/imtliche erfagbaren Limbusgef~/ge; trotz- dem blieben Neovaskulate mit Funktionsttichtigkeit/ibrig. Dies erkl/tren wir dadurch, dag wir nur relativ oberfl~ichlich gelegene Gef~ige zu erfassen vermochten. Tiefer gele- gene Gef~ge wurden, wie histologische Untersuchungen zeigten, nicht oder nur unwesent- lich berfihrt. In Obereinstimmung mit Cherry u. Garner (1976) fanden wit histologisch, dag die Ausbildung der Neovaskulate sich deutlich in den oberfl/ichlicheren Stromaan- teilen vollzieht. Hinsichtlich der Erfassung dutch den Laser geh6ren sie aber teilweise zu den oben erw/thnten ,,tiefer gelegenen" Gef/igen, die nicht erfagt werden konnten.

Nota. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die Unterstiitzung unserer Unter- suchungen; Frau Barbara Polenz und Frau Elke Oellers danken wit herzlich f/Jr ihre wertvolle Untersttitzung bei unseren fluoreszenz-phototechnlschen Untersuchungen.

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Literatur

Baurmann, H., Sasaki, K., Schomacher, L., Chioralia, G.: Rdactions vasculaires et tissulaires de l'oeil provoqudes par la cryocautdrisation et par la coagulation au laser. Doc. Ophthal., Proc. ISFA, Ghent, 1976, 525-527 (1976)

Cherry, P.M.H., Garner, A.: Corneal neovascularization treated with Argon laser. Brit. J. Ophthal. 60 ,464-472 (1976)

Ey, R., Hughes, W.F., Bloome, M.A.: Prevention of corneal vascularization. Amer. J. Ophthal. 66, 1118-1131 (1968)

Reed, J.W., Fromer, C., Klintworth, G.K.: Induced corneal vascularization remission with Argon laser therapy. ~.M.A. Arch. Ophthal. 93, 1017-1019 (1975)

Tokumaru, T., Fromer, C.: Herpetic epithelial keratitis: Conditions for photo- coagulation treatment by Argon laser as analysed by binding of dye and radio- labeled antiherpes ~,-globuline into corneal ulcerus. Ophthalmic Res. 7,181--188 (1975)

Eingegangen am 23. April 1977