Embed Size (px)
Citation preview
T.C.
SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
TIBBİ MİKROBİOLOJİ ANABİLİMDALI
SALT ANTİ HEPATİT B VİRUS CORE ANTİKORU
POZİTİF KAN DONÖRLERİNDE HEPATİT B VİRUS DNA
TESPİTİ
Dr. Tekin TAŞ
UZMANLIK TEZİ
DANIŞMAN
Doç. Dr. Selçuk KAYA
Bu tez Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından 1487-TU-07
Proje numarası ile desteklenmiştir.
2009-ISPARTA
i
İÇİNDEKİLER
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................ i
KISALTMALAR ...........................................................................................................iii
ŞEKİLLER ve TABLOLAR DİZİNİ........................................................................... iv
ÖNSÖZ ............................................................................................................................ v
1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER.................................................................................................... 3
2.1. Tarihçe ................................................................................................................... 3
2.2. Sınıflandırma ......................................................................................................... 4
2.3. Hepatit B Virusu .................................................................................................... 4
2.3.1. Hepatit B Virusu’nun Genom Yapısı.............................................................. 7
2.3.2. Viral Yaşam Siklusu ....................................................................................... 9
2.3.3. Replikasyon .................................................................................................... 9
2.3.4. Viral Proteinler ............................................................................................. 12
2.3.4.1. Kılıf (Yüzey) Proteinleri ........................................................................ 12
2.3.4.2. Kor Proteinleri ....................................................................................... 15
2.3.4.3. P Proteini................................................................................................ 17
2.3.4.4. X Proteini ............................................................................................... 18
2.3.5. HBV Genotipleri........................................................................................... 18
2.3.6. İmmun Kaçış Mekanizmaları........................................................................ 19
2.3.7. HBV Mutasyonları........................................................................................ 21
2.3.7.1. Yüzey (Kılıf) Mutasyonları ................................................................... 22
2.3.7.2. Prekor/Kor Bölgesi Mutasyonları .......................................................... 24
2.3.7.3. Polimeraz Geni Mutasyonları ................................................................ 26
2.3.7.4. X Geni Mutasyonları ............................................................................. 27
2.4. Hepatit B İnfeksiyonu Epidemiyolojisi ............................................................... 28
2.4.1. Bulaşma Yolları ............................................................................................ 28
2.4.1.1. Perkütan Bulaşma .................................................................................. 28
2.4.1.2. Cinsel Temasla Bulaşma........................................................................ 29
2.4.1.3. Perinatal Bulaşma .................................................................................. 29
2.4.1.4. Horizontal (Yatay) Bulaşma .................................................................. 29
2.4.2. Dünyada HBV İnfeksiyonu Prevalansı ......................................................... 31
ii
2.4.3. Türkiye’de HBV İnfeksiyonu Prevalansı...................................................... 31
2.5. Hepatit B İnfeksiyonu Patogenezi ....................................................................... 32
2.6. Akut Hepatit B’de Klinik Bulgular ve Tanı......................................................... 35
2.7. Kronik Hepatit B’de Klinik Bulgular ve Tanı ..................................................... 37
2.8. Ocult Hepatit B İnfeksiyonu ................................................................................ 39
2.8.1. Ocult Hepatit B İnfeksiyonu ve HBV İnfeksiyonunun Bulaşması ............... 40
2.9. HBV İnfeksiyonunun Serolojik Tanısı ................................................................ 40
2.10. HBV İnfeksiyonlarının Moleküler Tanısı.......................................................... 44
2.10.1. Hibridizasyon Yöntemleri........................................................................... 44
2.10.2. Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri.................................................... 44
2.10.2.1. PCR Uygulamasındaki Temel Aşamalar ............................................. 45
2.10.3. HBV-DNA Testinin Amaca Uygun Kullanımı........................................... 46
2.11. Tedavi ................................................................................................................ 48
2.11.1. Kronik Hepatit B’de İnterferon Tedavisi.................................................... 48
2.11.2. Akut Hepatit B’de İnterferon Tedavisi ....................................................... 48
2.11.3. İnterferon Dışı Tedaviler ............................................................................ 48
2.12. Korunma ............................................................................................................ 49
3. MATERYAL VE METOD ...................................................................................... 50
4. BULGULAR.............................................................................................................. 54
5. TARTIŞMA............................................................................................................... 58
6. ÖZET ......................................................................................................................... 65
7. SUMMARY ............................................................................................................... 66
8. KAYNAKLAR .......................................................................................................... 67
iii
KISALTMALAR
Ab : Antikor
ABD : Amerika Birleşik Devletleri
Ag : Antijen
ALT : Alanin aminotransferaz
AST : Aspartat aminotransferaz
Anti-HBs : Hepatit B yüzey antijenine karşı oluşan antikor
Anti-HBc : Hepatit B core antijenine karşı oluşan antikor
Anti-HBe : Hepatit B e antijenine karşı oluşan antikor
cccDNA : Covalently-closed-circularDNA
CDC : Center for Disease Control
DNA : Deoksiribonükleik asit
DR : Direct Repeats
EIA : Enzyme Immunoassay
GRE : Glucocorticoid Responsive Element
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
HBsAg : Hepatit B surface (yüzey) antijeni
HBcAg : Hepatit B core antijeni
HBeAg : Hepatit B e antijeni
HBV : Hepatit B virusu
HCC : Hepatocelluler carsinoma
Ig G : İmmünglobülin G
Ig M : İmmünglobülin M
IFN : Interferon
ORF : Open reading frame
OD : Optik dansite
PBMC : Periferal blood mononüklear ceels
PCR : Polymerase chain reaction
RNA : Ribonükleik asit
SD : Standart deviasyon
iv
ŞEKİLLER ve TABLOLAR DİZİNİ
Şekil 1: HBV partikül yapısı............................................................................................. 6
Şekil 2: HBV partiküllerinin elektron mikroskobundaki görünümü ................................ 6
Şekil 3: Genom yapısı....................................................................................................... 9
Şekil 4: Hepatit B virusunun replikasyonu ..................................................................... 12
Şekil 5: HBV infeksiyonunda olası patogenezin süreçleri ............................................. 35
Şekil 6: Akut HBV infeksiyonunun seyri ....................................................................... 43
Şekil 7: Kronik HBV infeksiyonunun seyri.................................................................... 43
Şekil 8: Viral Hepatit B’de serolojik-moleküler tanı...................................................... 47
Tablo 1: HBV genotip ve subtiplerinin coğrafi dağılımı ................................................ 19
Tablo 2: HBV İnfeksiyonun bulaşma yolları ve risk grupları ........................................ 30
Tablo 3: HBV-DNA, HBeAg ve Anti-HBe serolojik profilinin yorumu ....................... 37
Tablo 4: HBV infeksiyonu olan hastalarda tipik serolojik profil ................................... 42
Tablo 5: HBV infeksiyonlarının serolojik tanısında karşılaşılan olağan dışı profiller ... 42
Tablo 6: HBsAg negatif donörlerde Anti-HBs, Anti-HBc, Anti-HBe, HBeAg durmları
ve HBV DNA pozitiflikleri............................................................................................. 54
Tablo 7: Serolojik profillerine göre HBV DNA oranları................................................ 55
Tablo 8: HBV DNA pozitif olanlarda HBeAg ve Anti-HBe oranları ............................ 55
Tablo 9: HBV DNA pozitif serumların serolojik profilleri ve viral yük miktarı ........... 56
Tablo 10: Viral yük miktarına göre HBV DNA pozitiflik oranları ................................ 57
v
ÖNSÖZ
Uzmanlık eğitimi süresince bana yakın ilgi ve desteklerini esirgemeyen, yol
gösteren değerli hocalarım; anabilim dalı başkanımız sayın Doç. Dr. Buket CİCİOĞLU
ARIDOĞAN’a tez çalışmalarımın büyük bir titizlikle yürütülmesini sağlayan çok
değerli danışman hocam Doç. Dr. Selçuk KAYA’ya, Doç. Dr. Mustafa DEMİRCİ’ye,
Doç. Dr. Ali Kudret ADİLOĞLU’na ve Yrd. Doç. Dr. Emel SESLİ ÇETİN’e
teşekkürlerimi sunarım.
Birlikte çalıştığımız Dr. Süleyman ÖNAL, Dr. Hasan KESBİÇ, Dr. Nurettin
GÖNÜLATEŞ, Dr. Mehmet Salih ARIKAN, Dr. İlker PAKBAŞ, Dr. Hayati GÜNEŞ,
Dr. Tülay TETİK, Dr. Ayşe AYNALİ, Dr. Osman KILINÇ ve Dr. Ayşe Gül
ÖZSEVEN’e asistanlık eğitimim sırasında bana sağladıkları katkı ve desteklerinden
dolayı teşekkür ederim.
Laboratuar çalışanlarından Cengiz KAYAER, Hakan DOĞANGÖNÜL ve
Bediha OĞUZ başta olmak üzere tüm biyolog ve teknisyen arkadaşlara yardımlarından
dolayı teşekkür ederim.
1
1. GİRİŞ
HBV dünya genelinde mortalite ve morbidite nedeni olan önemli bir halk
sağlığı sorunudur. Dünyada 350 milyondan fazla HBV taşıyıcısı olduğu tahmin
edilmektedir. Türkiyede %6,8 oranında HBs Ag pozitifliği bildirilmektedir. Bu oran
kronik KC hastalarında %55-60 düzeyindedir (1).
HBV Hepadnaviridae ailesinin Orthohepadnavirus cinsinde yer alan
hepatotropik, zarflı ve kısmen çift sarmallı bir DNA virusudur. 3200 nükleotidden
oluşan genomik bir yapısı vardır ve bilinen tüm hayvan virusları içerisinde en küçük
olanıdır (2). Serum hepatiti, uzun kuluçka süreli hepatit, MS-2 hepatiti ve viral hepatit B
diye isimlendirilen enfeksiyon hastalığının etkenidir. Sadece insanları infekte eder.
Doğadaki kaynağı, bu virusla infekte kişilerdir (3, 4).
Bütün dünyada yaygın olarak görülen HBV’ye bağlı akut hepatitin ortalama %
5’inin kronikleştiği ve bunların önemli bir bölümünün siroza dönüştüğü; sirozlu
olguların ise hepatosellüler karsinom gelişme riskinin oldukça yüksek olduğu
bilinmektedir (5).
HBsAg’nin serumdan kaybolup anti-HBs gelişinceye kadar geçen süreye
pencere dönemi denir. Bu dönemde anti-HBcIgM’in varlığı akut infeksiyonu gösteren
en önemli markerdir. Anti-HBcIgM’in sebat etmesi hastalığın kronikleşeceğine işaret
eder. Kronik HBV infeksiyonunda anti-HBcIgM düşük titrede bulunur (6, 7, 8, 9).
Serumda HBsAg’nin varlığı akut ya da kronik HBV infeksiyonunu gösterir.
Akut HBV infeksiyonunun varlığında HBsAg pozitifliğinin süresi değişkendir, 6 aydan
fazla devam etmesi kronikleşmenin göstergesidir. Serumda HBV-DNA pozitifliği
HBsAg pozitifliğinden önce saptanır (3, 10, 11). HBV-DNA viral replikasyonun en
sensitif göstergesidir. HBsAg varlığında PCR ile serumda HBV-DNA tespiti viremi
düzeyini ortaya koyan en iyi markerdir ve serum transaminaz düzeyleri ile koreledir (6,
8, 9).
Spontan veya tedavi ile HBsAg’si kaybolan bazı hastalarda serum ve/veya
karaciğerde hassas PCR teknikleri ile düşük düzeyde HBV-DNA varlığı gösterilmiştir
(12). Böylece saptanamayan HBsAg ile birlikte kronik HBV infeksiyonunu tanımlayan
bu durum okült: sessiz veya latent HBV infeksiyonu olarak adlandırılmaktadır. Okült
2
HBV infeksiyonluların bir kısmında anti-HBc ve/veya anti-HBs pozitifdir. Hastaların
önemli bir kısmında her ikisi de negatifdir (13).
Rutin olarak yapılan HBsAg taramaları ile bulaşma riski düşük olmasına
rağmen, hala transfüzyon ile HBV infeksiyonu bulaşma riski mevcuttur. Okült HBV
infeksiyonunun buna katkısı vardır. Organ nakilleri sırasında, vericideki okült HBV
infeksiyonu, alıcıya HBV infeksiyonunu bulaştırabilir (14).
HBsAg nin negatif olması çok düşük HBsAg konsantrasyonlarından
kaynaklanabileceği gibi HBsAg nin majör antijenik determinantlarındaki
mutasyonlardan da kaynaklanabilir (15).
Serolojik tanı testleri günümüzde yüksek duyarlılığa sahip olduğu halde
transfüzyon yoluyla bulaşan hepatitler hala büyük risk taşımaktadır (16). İzole anti-HBc
pozitif kişiler post-transfüzon hepatitine yol açabilmektedirler (17).
Kan bankaları donör kabulünde asemptomatik gönüllülerde HBsAg testi
uygulamaktadır. Asemptomatik gönüllülerden HBsAg negatif tesbit edilenler sağlıklı
donör olarak kabul edilmektedir. Ancak HBsAg negatif olan bir kişi virusla karşılaşmış
olabilir.
HBsAg negatif anti-HBc pozitif olan kan ve organ donörlerinin HBV
infeksiyonunu bulaştırabileceği bildirilmektedir (18). Bu yüzden HBV infeksiyonunun
herhangi bir serolojik göstergesinin saptanamadığı ya da yalnız anti-HBc pozitifliğinin
bulunduğu kişilerin incelenmesi önemlidir (19).
Kan bankalarında anti-HBc araştırılması rutin olmadığından gizli hepatitli veya
pencere periyodundaki bazı vakalar tespit edilemeyebilir. Bu durum transfüzyon yoluyla
hepatit bulaştırılmasına yol açabilir.
Bu çalışmada amacımız kan bankasına başvuran HBsAg negatif/anti-HBc
pozitif donörlerden salt anti-HBc pozitif olanlarda ve farklı hepatit serolojisine sahip
olanlarda viral yük ve HBV bulaştırma riskini araştırmaktır.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Tarihçe
Viral hepatit ilk defa milattan önce 5. yüzyılda tanımlanmıştır (4). Sarılıktan ilk
söz eden Babil Talmudları ve Hipokrat olmasına rağmen Çinliler tarafından bulaşıcı
sarılığa ait ilk veriler birkaç bin yıl önce olmuştur (1).
Kan ve kan ürünleri ile bulaşan hepatit şekli ilk kez Lurman tarafından 1883
yılında tanımlanmış, Bremen'de çiçek aşısı yapılan 1289 tersane işçinin 191'inde aşı
uygulamasından sonra, bir kaç hafta ile 8 ay arasındaki süre içinde sarılık ortaya çıktığı
görülmüş olup aşılanmamış kişilerin ise sağlıklı olduğu gözlemlenmiştir (4).
Gönüllü mahkûmlar üzerinde 1930’1u yıllarda yapılan çalışmalar, infeksiyöz
hepatiti ve serum hepatiti etkenlerinin günümüzde herkes tarafından bilinen bazı
özellikleri hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. 1943 yılında A.B.D.'de bulaşıcı hepatit
“infeksiyöz hepatit” olarak isimlendirilirken, İngiltere Sağlık Bakanlığı aynı yıl bir
duyuru ile kan, plazma ve serum naklinden sonra gelişen sarılıkları “homolog serum
sarılığı” olarak isimlendirilmiş, Mc Callum 1947 yılında, infeksiyöz hepatit için “hepatit
A”, serum hepatiti için ise “hepatit B” terimlerini kullanmıştır (20).
Krugman ve ark. (21), 1950'li yılların sonu ile 1960’1ı yılların ilk yarısında,
yaptığı çalışmalar sonucunda; epidemiyolojik, klinik ve immünolojik olarak birbirinden
tamamen farklı iki ayrı hepatit virüsünün varlığım doğrulamışlardır. iki virusla farklı
zamanlarda infekte “M.S.” isimli çocuktan sarılığın başlamasından hemen önce alınan
serum örnekleri MS-1 ve MS-2 olarak adlandırılmıştır. Bunların (MS-1 ve MS-2) başka
çocuklara oral ve intramusküler yoldan verilmesi neticesinde inkübasyon süreleri farklı
olan iki tip etkenin varlığının anlaşılmasından sonra MS-1'in hepatit A (kısa kuluçka
süreli hepatit, infeksiyöz hepatit) MS-2'nin ise hepatit B (uzun kuluçka süreli hepatit,
serum hepatiti) virüsü olduğu anlaşılmıştır.
HBV’ nin tarihçesinde 1965 yılı dönüm noktasıdır. Serum proteinlerinde
kalıtımsal polimorfizmi araştıran Blumberg ve arkadaşları Avustralyalı bir yerlinin
serumunda, çok sayıda kan transfüzyonu yapılmış bir hastanın serumu ile ağar jelde
presipitasyon veren bir antijen bulunduğunu göstermişler ve günümüzde “hepatit B
yüzey antijeni HBsAg” olarak bilinen bu proteine “Avustralya antijeni-Au antijeni”
4
adını vermişlerdir. Dane ve arkadaşları 1970'de HBV'nun kısmen saflaştırılmış
preparasyonlarının elektron mikroskobik incelemelerinde üç değişik partiküle
rastlamışlardır. Bunlardan infektif özelliğe sahip, 42 nm çapında olanlara “Dane
partikülü” adı verilmiştir (20).
Krugman 1971 yılında ısı ile inaktive edilen hepatit B yüzey antijeni pozitif
serumların immünojenik olduğunu ve aşı olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
1972’de Magnius ve Espmark virusun “e antijeni”ni tanımlamışlardır (22). Kaplan ve
ark. 1973 yılında virusun kor bölgesinde DNA’ ya bağımlı DNA polimeraz varlığını
saptamışlardır (23). Robinson ve ark. ise HBV genomunun çeşitli özelliklerini deneysel
olarak göstermişlerdir. Aynı yıllarda immun elektron mikroskobu ile virusun çeşitli
antijenlerinin hepatositlerdeki yerleşim özellikleri belirlenmiş; HBsAg’nin hepatosit
stoplazmasında HBcAg’nin ise nükleusta depolandığı tesbit edilmiştir (24).
Hepatit B virusunun doku kültüründe üretilemediğinden ve hayvan
deneylerinin belirli maymun türleri ile sınırlı olduğundan bu virusun yapısını ve
replikasyon mekanizmasını saptamak oldukça zaman almıştır. 1980’li yıllarda bazı
hayvanlarda HBV benzeri virusların neden olduğu İnfeksiyonların gösterilmesi ve
moleküler biyoloji’deki ilerlemeler sayesinde virusun epidemiyolojisi, yapısı,
infeksiyonun seyri anlaşılırmıştır (25).
2.2. Sınıflandırma
Hepadnaviridae ailesinde bulunan virusların, konak farklılığı, viryon ince
yapısı, polipeptit büyüklüğü, gen sayısı, genom nükleotid sekans homolojisi ve antijenik
çapraz reaksiyonlar dikkate alındığında memeli hayvan viruslarının bulunduğu
Orthohepadnavirus (HBV, WHV, GSHV) ve kanatlı hayvan viruslarının bulunduğu
Avihepadnavirus (DHBV) olmak üzere iki cins altında sınıflandırılması önerilmektedir
(26, 27, 28).
2.3. Hepatit B Virusu
HBV, Hepadnaviridae ailesinin orthohepadnavirus cinsinde yer alan
hepatotropik, zarflı ve kısmen çift sarmallı DNA virüsüdür. 3200 nükleotidden oluşan
genomik yapısı ile bilinen tüm hayvan DNA virusları içinde en küçük olanıdır.
5
Hepadnaviridae ailesinin üyeleri içinde insanlarda infeksiyona neden olan tek tür HBV’
dur. İnfekte hücrelerde birden fazla sayıda partikül tipi oluşumuna neden olmasıyla
diğer hayvan viruslarından farklı bir yere sahip olan HBV'nun, kısmen saflaştırılmış
preparasyonları elektron mikroskobunda incelendiğinde, büyüklük, yapı ve miktar gibi
değişik özellikleri bakımından birbirinden farklı üç tip partiküle rastlanır (2, 26, 27, 28).
a- Yaklaşık 42 nm. (42-47 nm.) çapında, infektif özellikte, tam bir viryon
yapısında, küresel şekilli, Dane partikülleri;
• Bir adet sirküler, kısmi çift sarmallı DNA, DNA polimeraz ve Rnase H
aktiviteli enzim,
• İkozahedral yapıda, tek bir fosfoproteinin (HBcAg) kopyalarından oluşan
kapsid,
• Virusun kodladığı üç adet protein (HBsAg) ve hücreden kazanılan,
lipitlerden meydana gelen zarf bulunur.
b- Yaklaşık 22 nm. (16-25 nm.) çapında, içinde nükleik asit bulunmayan, non-
infektif, küresel partiküller;
c- Özellikle replikasyonun olduğu kişilerin serumunda bulunan, 22 nm.
çapında, 50-500 nm uzunluğunda nükleik asit ihtiva etmeyen, non-infektif; tübüler
partiküller.
Non infektif küresel partiküller sadece yüzey antijeninden (HBsAg)
oluşmuştur. Her üç formda infekte konak serumunda yüksek miktarda (200-500 mg/ml)
tespit edilebilen ve HBsAg olarak isimlendirilen ortak yüzey antijenine sahip olup,
immünojeniktir. Anti-HBs antikorları ile reaksiyon verirler. Non-infektif formlar daha
fazla miktarda üretilir ve kanda dolaşan HBsAg'nin büyük kısmını 22 nm'lik küresel
partiküller oluşturur. Dane partiküllerinin sayısı lO4- lO9/ml arasında iken, non-infektif
küresel partiküllerin miktarı 1013ml veya daha fazladır. Küçük yuvarlak HBsAg
partikülleri sezyum klorürde 1.18 g/ml’lik bir yoğunluğa sahiptir (2, 27,28, 29).
6
Şekil 1: HBV partikül yapısı
Şekil 2: HBV partiküllerinin elektron mikroskobundaki görünümü
HBV zarflı bir virus olmasına rağmen diğer zarflı viruslara göre çevre
koşullarına daha dirençlidir. Eter, asit (pH 2,4) de en az 6 saat ve ısı (98oC’de 1 dakika,
60 oC’de 10 saat)’da immunojenite ve antijenik özellik kaybolmadığı halde infektivite
kaybolmaktadır. Eğer virus yoğunluğu çok fazla ise bu işlemler sonucu inaktivasyon
7
tam olmamaktadır. HBsAg, %2,5 sodyum hipoklorit varlığında 3 dakikada antijenik
özelliğini ve infektivitesini kaybetmektedir. Serumda infektivite doğrudan kaynatmakla
2 dakikada, 121 oC’de 0,5 atm basınç altında 20 dakikada, 160oC’de 10 saatte
kaybolmaktadır. Son çalışmalar HBV’nun sodyum hipoklorit (500mg serbest Cl/ml) ile
10 dakikada, %0,1–2 aköz gluteraldehit, %70 izopopil alkol, %80 etil alkolde 2
dakikada inaktive olduğunu göstermiştir. HBV, 30-32oC’de saklandığında en az altı ay,
-20 oC’de 15 yıl infektif özelliğini korur. İnfektif plazmadan elde edilen fibrinojen,
protrombin, gama globulin ve plazma proteinlerinde çeşitli miktarlarda HBsAg bulunur
ve HBsAg içeren kan ve kan ürünlerinin ultraviyole ışınlarına tabi tutulması
infektiviteyi etkilemez (2, 27, 30).
2.3.1. Hepatit B Virusu’nun Genom Yapısı
Hepatit B virusu kısmen çift sarmallı, sirküler bir DNA molekülüne sahiptir.
DNA'nın mol. ağırlığı 2,3x106 dalton, G+C oranı yaklaşık % 49'dur. HBV DNA 3.200
nükleotid taşıyan uzun (L veya negatif) ve 1800-2700 nükleotid içeren kısa (S veya
pozitif) zincir olmak üzere iki sarmaldan meydana gelmiştir. Bu zincirler ortak baz
çiftlerine sahip olup, sirküler bir yapı halinde bulunmasına rağmen her birinin 3' ve 5'
uçları birleşik olmadığından aslında lineer moleküllerdir. Pozitif zincirin 5' ucu sabit
olup 3' ucunun uzunluğu senteze bağlı olarak farklılık gösterir. İki sarmal arasında
değişik uzunlukta tek sarmallı bir bölge vardır. Negatif zincirin 5' ucunda, sentez
sırasında “primer” olarak görev yapan terminal bir protein bulunurken pozitif zincirin 5'
ucunda aynı işlevi yerine getiren bir RNA oligomeri yer alır. Negatif sarmalın 3' ucu ise
9-10 nükleotidlik artık uç (terminal redundancy) ile sonlanır. Bu alan viral replikasyon
sırasında pozitif DNA sarmalının sentezindeki “template switching” işleminde DNA
polimerazın da etkisi ile kısa zincirin tamamlanmasında ve sonuçta süper kıvrımlı,
tamamen çift sarmallı, çember şeklindeki DNA molekülünün oluşumunda rol oynar (4,
26, 31, 32 ).
Her iki zincirin 5' uçlarında bulunan koheziv bölgelerinin birbirlerine
tutunmaları ile Viral DNA'nın yapısal bütünlüğü sağlanır. Bu bölgeler 10-12
nükleotidlik yinelenen dizinlerden meydana gelmiş sabit bölgeler olup DR (direct
repeats) olarak adlandırılırlar. HBV'nda iki adet DR vardır. Uzun zincirin 5'ucu 1826.
8
nükleotidde DR1 içinde, kısa olanın 5'ucu ise 1592. nükleotidde DR2 içinde yer alır.
DR2 uzun zincirin 3'ucuna yakın bir yerde bulunur (27, 28).
HBV'nda genetik bilginin tamamı uzun sarmal üzerinde kodlanmış olup bu
sarmal S, C, X ve P kısaltmaları ile gösterilen dört farklı protein kodlayan nükleik asit
dizisine (open reading frame: ORF) sahiptir. ORF'lerin transkripsiyonu promoter
(prom=başlatıcı) ve enhancer (enh= güçlendirici) olarak adlandırılan düzenleyici
dizinler tarafından kontrol edilmektedir. HBV genomunda fonksiyonel olarak
tanımlanmış en az 4 promoter (pre-Sl prom, S prom, X prom ve pre-C prom) ve 2
enhancer (Enh l ve Enh 2) bölgesi vardır. Ayrıca S geni içinde varolan ve Enh l ile
bağlantılı olarak glukokortikoid varlığında gen ekspresyonunu yaklaşık 5 kat kadar
arttıran bir elemanın (GRE: glucocoticoid responsive element) varlığı da gösterilmiştir
(31, 33).
HBV-DNA'daki genler, bazı bölgelerde içiçe girmiş, birbirleriyle çakışmış
durumdadırlar. Genomun en uzun geni olan P geni; X ve C genleri ile kısmen, S geni ile
tamamen çakışmış halde bulunmakta ve uzun sarmal 1,5 defa okunmaktadır. Bu özelliği
nedeniyle HBV, bilinen hayvan virusları içinde en küçük genomik yapıya sahip
olmasına rağmen kendini kodlama kapasitesi en fazla olan virusdur (4, 28).
Genom içerisinde proteinleri kodlayan genler şunlardır (34).
1. S geni: Büyük, orta ve küçük yüzey proteinlerini kodlamaktadır.
2. C geni: İki ayrı protein (kapsid proteinleri) sentezletir. Bunlardan biri
çekirdek proteini (HBcAg) diğeri ise preC ürünü taşıyan infektivite
proteini (HBeAg)’dir.
3. P geni: DNA polimeraz, revers transkriptaz ve Ribonükleaz H aktivitesine
sahip viral polimeraz enzimini kodlamaktadır.
4. X geni: X proteinini kodlamaktadır.
Başlangıç kodonları farklı olduğundan S geni üzerinde pre-Sl, pre-S2 ve S
olmak üzere üç, C geni üzerinde ise pre-C ve C olmak üzere iki bölge bulunmakta;
dolayısıyla farklı başlangıç kodonlarından sentezlenen proteinler de farklı olmaktadır.
Bu nedenle 4 adet ORF'e sahip olmasına rağmen HBV tarafından yedi değişik
polipeptid üretilmektedir (31, 35, 36).
9
Şekil 3: Genom yapısı
2.3.2. Viral Yaşam Siklusu
HBV’nun plazma yarı ömrü 24 saat olup her gün vücuttaki virusların %50’si
yeniden oluşmaktadır. Günlük virus üretimi 1011 virion olan HBV’nun replikasyonu
başlıca hepatositlerde gerçekleşmektedir. Safra kanalı epitel hücreleri, pankreasın bazı
endokrin ve ekzokrin hücreleri, böbrek ve lenfoid doku da replikasyon yeri
olabilmektedir. Fakat hepatosit dışı replikasyon yerlerinin viral patogenezde rolü
olmadığı düşünülmektedir. Lenfositlerdeki replikasyon virus perzistansı için ikinci bir
rezervuar olabilmektedir (36).
2.3.3. Replikasyon
DNA replikasyonu bir RNA kalıbı aralıcılığı ile reverstranskripsiyonla olur.
Viral replikasyon stoplazmada gerçekleşir ve (-) iplikçik RNA aracından, (+) iplikçik
ise (-) iplikçikten sentezlenir (1, 37).
HBV replikasyonu virusun hücre yüzeyine tutunması ve hücre içine girmesi ile
başlamaktadır. HBV'nun konak hücreye bağlanmasında rol oynadığı düşünülen
fibronektin, apolipoprotein H, transferrin reseptörü, polimerize insan serum albümini,
10
pre-S2 glikan, HBV bağlayan faktör gibi birçok reseptör adayı tanımlanmaktadır (38,
39, 40, 41, 42, 43). Son yıllarda, her ne kadar, S proteinine özgü bazı reseptörlerin
(endonexin II, siyaloglikoprotein gibi) varlığı gösterilmiş olsa da, HBV'nun
hepatositlere tutunmasında L ve M proteinlerinin de önemli olduğu saptanmıştır, in
vitro olarak pre-Sl ve pre-S2 bölgelerinde hepatosite spesifik tutunma yerleri
saptanmıştır (27, 28). Pre-Sl ürünü olan L protein, karaciğer plasma membranına ve
mononükleer hücrelere bağlanabilir. Mononükleer hücrelerde saptanmaktadır fakat
HBV'nun bu hücrelerde aktif olarak replike olduğuna dair bir kanıt yoktur. L ve M
proteinleri hepatositlere direkt olarak tutunabilir (28).
Hepadnavirusların replikasyonu için 3 önemli özellik vardır (44):
1- DNA sarmallarının sentezi sırasında negatif iplikçiliğin sentezi pozitif
iplikçiliğin sentezinden önce tamamlanmalıdır.
2- Viral polimeraz aynı zamanda, revers trankriptaz olarak fonksiyon görür.
3- Negatif iplikçiliğin sentezinde 5' ucuna kovalent olarak bağlı terminal
protein öncül olarak kullanılırken pozitif iplikçiliğin öncülü viral genomik RNA'dan
türeyen bir oligoribonükleotiddir.
HBV muhtemelen reseptöre bağımlı endositoz yoluyla hücre içine girmekte,
viral DNA ile nükleokapsid viryondan ayrılmakta ve işlenmeden konak hücre
çekirdeğine taşınmaktadır. Kısmen çift sarmallı, her iki ucu serbest halde bulunan
DNA'nın kısa sarmalının eksik olan bölümü endojen DNA polimeraz tarafından
tamamlanır. Bu sırada uzun sarmalın 5' ve 3' uçları arasındaki açıklık onarılmış ve
tümüyle çift sarmallı, süper kıvrımlı, uçları kapalı, sirküler yapıda bir HBV-DNA
(cccDNA) meydana gelir. Replikasyonun normal seyri sırasında HBV-DNA'nın konak
genomuna integrasyonu görülmez. HBV ile infekte bazı kişilerin serumunda nadir
olarak HBcAg'nin varlığı gösterilmiş olsa da bu antijen viral replikasyon sırasında
konak hücre çekirdeğinde genellikle tespit edilebilmektedir. Bu nedenle HBcAg'nin
nukleusa girmesinin cccDNA'nın ortaya çıkmasından önce olduğu sanılmaktadır (27,
38, 44). Kalıp olarak cccDNA'dan konak hücre RNA polimerazının (RNA polymerase
II) yardımı ve viral düzenleyicilerin (4 adet promoter; 2 adet enhancer) etkisiyle viral
RNA'lar sentezlenir. HBV-RNA'ların hepsinin 3' uçlan aynı nükleotidde (1934.
nükleotid)'dir. Bunlar C genine ait ORF'den gelen sinyalin özelliğine göre mRNA veya
11
genom görevi yaparlar. HBV'nda fonksiyonu bilinen 4 mRNA transkripti
tanımlanmıştır. Bunlar:
1- 3.5 kb mRNA: En uzun parçadır. Genom replikasynonu için kalıp görevi
görmekte, preC/C (precore/core) ve polimeraz (pol) proteinlerinin sentezini
sağlar
2- 2.4 kb mRNA: Pre-S1, pre-S2 ve S proteinlerinin sentezini sağlar
3- 2.1 kb mRNA: Pre-S2 ve S proteinlerinin sentezini sağlar.
4- 0.7 kb mRNA: X proteinlerini sentezler.
Translasyon sırasında oluşan pregenom, kor partikülü içine yerleşir. Konak
hücre sitoplazmasında devam eden replikasyon boyunca 3,5 kb'lık RNA (+RNA)'dan (-)
DNA sarmalı sentezlenir (44).
Negatif iplikçiğin sentez işlemi; DRl'in 3' ucundaki terminal proteinin
bulunduğu yerden başlar. Sentez ilerledikçe RNA, RNase H etkisiyle tahrip edilir. Kısa
zincirin (+ iplikçik) sentezinde kalıp olarak uzun sarmal (- iplikçik) kullanılır. Sentez
DR2'nin 3' ucundan başlar ve uzun zincirin 5' ucundaki terminal protein geçilinceye
kadar devam eder. Genomun sirkülasyonu (-) iplikçiğin 3' ucundaki 9-10 nükleotidlik
terminal artık sayesinde olur. Kısmen çift sarmallı sirküler yapıdaki kor kısmının kılıf
proteinleri tarafından çevrelenmesi ve aynı zamanda polimerazın da tükenmesi
nedeniyle kısa zincirin sentezi tamamlanamaz ve bu sarmal eksik kalır (27, 31, 38).
HBs proteinleri, endoplazmik retikulumda öncelikle transmembran proteinleri
olarak sentezlenir. Oligomerizasyon, molekül içi ve moleküller arası disülfid
köprülerinin oluşmasıyla olgunlaşır, tomurcuklanma sırasında membran lipidleri ile
birlikte kor partiküllerini çevreleyip hücre dışına çıkarlar. HBV replikasyonu sırasında
stoplazmada yeni sentezlenen viral DNA’ların bir kısmı çekirdeğe taşınarak orada
sürekli olarak cccDNA havuzu oluşturulmasını sağlar. Pe-Sl'in hücre içinde
birikmesinin HBsAg sekresyonunu inhibe ettiği gözlenmiştir. HBsAg ise cccDNA
formasyonunu inhibe ettiğinden bunun HBV replikasyonunda negatif feedback
mekanizması olduğu kabul edilir (26, 27, 28, 36, 45).
12
Şekil 4: Hepatit B virusunun replikasyonu
2.3.4. Viral Proteinler
Viral proteinler dörde ayrılırlar. Bunlar; kılıf (yüzey) proteinleri, kor
proteinleri, P proteini ve X proteinidir.
2.3.4.1. Kılıf (Yüzey) Proteinleri
HBV-S geni tarafından kodlanan kılıf (yüzey) proteinleri (HBs), hem Dane
partiküllerinin yüzeyinde hem de infekte hastaların karaciğer ve serumlarında
saptanabilen 22 nm çapındaki küresel ve tübüler (eksik viral) partiküllerin yapısında
bulunmaktadır. Yüzey proteinleri değişik molekül ağırlıklarında (24.000–42.000 dalton
arasında), glikolize ve nonglikolize altı farklı polipeptidin değişik oranlarda biraraya
gelmesi ile oluşmaktadır. Tek bir gen tarafından kodlanan bu proteinlerdeki farklılıklar
sentezin aynı gen üzerindeki farklı başlangıç kodonlarından başlamasıyla oluşmaktadır.
(26, 35).
13
Büyük Yüzey Proteini (L protein: LHBs): Okuma işlemi gen üzerindeki ilk
kodondan başlarsa pre-Sl + pre-S2 +S bölgelerinin tümü okunacağından kılıfın büyük
proteini (L protein: LHBs) sentezlenir. Bu protein 39 kDa molekül ağırlığında 389
aminoasitten (bazen 400 aminoaside kadar uzayabilir) oluşmuş bir polipeptiddir. LHBs
en çok Dane partiküllerinin yüzeyinde bulunur. Tübüler partiküllerin kılıfında orta
miktarda L proteinine rastlanırken küçük küresel partiküllerde çok az miktarda rastlanır
(27, 38).
Viryonun konak hücreye bağlanmasında L proteininin rolü olduğu
düşününülmektedir. LHBs'nin 21-47. aminoasitleri arasındaki bölgenin hepatositlere
tutunma özelliğine sahip olduğu tespitedilmiş ve bu bölgeye karşı oluşturulan
antikorların bağlanmayı engellediği gösterilmiştir. Dane partiküllerinin oluşumu,
biraraya gelmesi (assembly) ve konak hücreden salınması için M proteininin varlığı şart
olmamakla birlikte S ve L proteinlerinin mutlaka sentezlenmiş olması gerekmektedir
(39, 40).
Asemptomatik HBsAg taşıyıcılarında düşük düzeyde fakat devamlı üretilen
LHBs'in hepatositlerde lezyon oluşumuna ve HCC gelişimine neden olabileceği
düşünülmektedir. Hepatosit içinde pre-Sl ürünlerinin birikmesiyle endoplazmik
retikulumda dilatasyona oluşmakta, hücreler balonlaşmakta, hidropik ve eozinofilik
özellik kazanarak buzlu cam (ground glass) görünümü almaktadır. Sonuç olarak
koagulasyon nekrozu ile hücreler ölmektedir (27).
LHBs, B ve T hücreleri için önemli antijenik bölgeler içerir ve viral
infeksiyondan korunmada önemli bir role sahiptir (46).
Orta Yüzey Proteini (M protein: MHBS): Okuma işlemi S geni üzerindeki
ikinci kodondan başlarsa pre-S2+S bölgelerinin ürünü olan orta protein (M protein:
MHBS) sentezlenir. Bu protein 33 kDa molekül ağırlığında 281 aminoasitten oluşmuş
bir polipeptid (p33s) olup, çoğunlukla bir veya iki bölgesinden glikolize edilmiş
haldedir (44).
MHBs'nin miktarı viryon ve tübüler partiküllerde en az, küresel partiküllerde
ise LHBs'den biraz daha fazladır. Replikasyonun olmadığı durumlarda HBsAg içinde
bulunmaz. Bu nedenle pre-S2 antijeninin varlığı viral replikasyonun bir göstergesi
olarak kabul edilir (38).
14
L ve M proteinleri infeksiyonun erken döneminde ortaya çıkmakta olup
bunlara karşı oluşan antikorların gösterilmesi iyileşmenin habercisi olarak kabul
edilmektedir (47).
Küçük Yüzey Proteini (SHBs): Okuma işlemi sadece S bölgesini içerir ise kılıfın
küçük proteini (S protein: SHBs) sentezlenir. Bu protein 24 kDa molekül ağırlığında 226
aminoasitten oluşmuş bir peptiddir. HBsAg'nin büyük kısmını oluşturan SHBs kılıfın
majör proteini olarak bilinir ve B lenfositleri için epitopik bölgeye sahiptir (28, 38).
HBsAg, S proteininden başka değişik oranlarda diğer kılıf proteinlerini (L ve
M) de içermektedir. Kanda dolaşan S geni ürünlerinin yaklaşık %5-15'i M, % 1-2'si L
ve geri kalan kısmı S proteinidir. Bu üç protein, çeşitli HBV partikül tipleri arasında eşit
miktarda dağılmamaktadır. Her üç partikül tipinde de predominant olarak S proteinleri
bulunurken; subviral 22 nm'lik partiküllerde değişebilen miktarlarda M polipeptidleri ve
çok az miktarda da L zincirleri bulunur. Küçük partiküllerde bazen LHBs'e hiç
rastlanmayabilir ama Dane partiküllerinde L proteini herzaman vardır. Dane partikülleri
içerdikleri L proteinleri sayesinde hepatositlere kolaylıkla bağlanabilmektedir. Dane
partiküllerinde L:M:S oranı yaklaşık 1:1:4 şeklindedir. Otantik infeksiyonda L/S oranı
biraz daha fazla olabilir. Farklı izolatlarda küçük bazı değişiklikler olsa da viryon ve
tübüler partiküllerde S>L>M, küçük partiküllerde ise S>M>L düzeni çoğunlukla
korunur (26, 27).
SHBs'yi oluşturan aminoasitlerin belli bölgelerdeki diziliş farklılıklarına göre
HBsAg üzerinde en az 5 antijenik determinant (a, d/y ve w/r) bulunmaktadır. Bütün
subtiplerde ortak olarak bulunan gruba özgül “a” determinantı, 124–147. aminoasitler
arasındaki hidrofilik bir bölgedir. Konvalesan serumdaki antikor bağlayan aktivitenin
%80'i bu bölgede olup “a” determinantına karşı oluşan antikorlar HBV'nun hepatositlere
bağlanmasını önler ve tüm subtiplere karşı etkili bir bağışıklık sağlar. Viryonun dış
yüzünde bulunan “a” determinantı, aşı veya doğal infeksiyon sonrası oluşan anti-
HBs'lerin büyük kısmını bağlama özelliğine sahiptir (47).
S determinantına karşı gelişen humoral immun cevabın HBV'ndan korunmada
etkili olması ve tüm HBsAg preperasyonlarında “a” determinantının bulunması, farklı
veya benzer subtiplerle oluşan reinfeksiyonlardan korunmanın “a” determinantına karşı
gelişen cevap ile olduğunu göstermektedir (48).
15
HBsAg subtipleri arasında biyolojik farklılıklar yoktur. Yeryüzündeki
dağılımları benzer değildir. Bu nedenlerle epidemiyolojik çalışmalarda, HBsAg
subtiplerinin saptanması, infeksiyon kaynağının tespiti ve HBV'nun bireyler veya
toplumlar arasındaki yayılımının izlenmesinde önemli ipuçları verir (49, 50).
2.3.4.2. Kor Proteinleri
HBV genomu C geninde bir ÖRF bulunur fakat gen üzerinde okuma işleminin
başladığı iki farklı kodon (nükleotid 1816 ve nükleotid 1903) vardır. Bu nedenle C geni,
pre-C ve C olmak üzere iki bölgeye ayrılır ve antijenik özellikleri farklı iki değişik
protein (HBeAg ve HBcAg) sentezleyebilir (26, 28).
Her iki bölgeye ait stop kodon aynı nükleotidde (2452. nükleotid) bulunur.
Dolayısıyla protein sentezi sırasında okuma işlemi hangi başlangıç kodonundan başlarsa
başlasın aynı ortak noktada sonlanır. Pre-C'den başlayan okuma işleminde her iki bölge
de okunarak 212 aminoasitden (29 aa+183aa) oluşan, molekül ağırlığ 25 kDa olan bir
polipeptid (p25c) sentezlenir. İşlenmemiş haldeki bu proteinin aminoasit sekansı; N
terminal ucundaki 29 aminoasitlik ek parça dışında, HBcAg sekansı ile tamamen
benzerdir. Bu ek sekans, sentez sırasında giderek uzamaya başlayan pre-C polipeptidini
(p25c) endoplazmik retikuluma yönlendirir. Burada bir peptidaz tarafından C terminal
bölgesindeki 34 aminoasitlik bölüm kesintiye uğrar ve işlenmiş protein haline gelerek
golgi cisimciği üzerinden HBeAg olarak sekrete edilir veya nukleusa yönlendirilir (35,
47, 51). Sonuç olarak pre-C sekansı, aynı gen (pre-C/C) tarafından sentezlenen
polipeptidlerin stoplazmada mı kalacağı yoksa endoplazmik retikuluma mı gideceğinin
belirlenmesinde, karboksi uçtaki DNA bağlayan kısmın konak hücre tarafından
uzaklaştırılmasında, hücre membranlarında protein birikmesi ve sentezlenen proteinlerin
kaderini belirleyen bir yapıdır (28).
HBeAg ile HBcAg ortak determinantlar içerir. Kanda dolaşan HBeAg spesifik
olarak serum albümini, immünglobulin ve α-antitripsine bağlanabildiğinden yapısındaki
HBcAg ile ilgili determinantlar maskelenir ve özgül olarak anti-HBe'ye bağlanabilir
ancak anti-HBc ile reaksiyona girmez. Ayrıca HBcAg'nin antikor bağlama özelliği bu
antijenin yapısını oluşturan proteinin bütünlüğü ve konformasyonuna bağlıdır. HBcAg,
viral DNA'ya sıkıca bağlı bir molekül olduğundan anti-HBc ile reaksiyona girebilmesi
için kor partiküllerinin parçalanması ve serbest polipeptid zincirlerinin açığa çıkması
16
gerekmektedir. HBV ile infekte hasta serumlarında solubl bir antijen olarak tanımlanan
HBeAg'nin fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. İnvitro araştırmalar sonucunda
HBeAg'nin viral replikasyon için gerekli olmadığı ispatlanmıştır (28, 35, 44).
C geninin ikinci bölgesi tarafından sentezlenen polipeptidin (p23c) ön kısmı 29
aminoasitlik ek sekans olmadığı için endoplazmik retikuluma gidemez ve konak hücre
sitoplazmasmda kalır. Pre-C olmadan p23c'nin ekspresyonu, hücre içinde kora benzer
partiküllerin birikimine neden olur. Hücre sitoplazmasmda değişikliğe uğrayan p23c,
HBcAg olarak bilinen yapı haline gelir ve karboksiterminal ucundaki 34 aminoasitlik
kısım sayesinde viral DNA'ya sıkıca bağlanır. HBcAg sıklıkla intranükleer
yerleşimlidir. Fakat hastalığon aktif döneminde ve aşırı viral replikasyon durumunda
sitoplazmada da yaygın olarak saptanabilir (27, 28, 29).
HBeAg ekstrasellüler ortama (serum) sekrete edildiği halde dolaşımda serbest
halde HBcAg'ne rastlanmaz. Kanda sadece Dane partiküllerinin içinde bulunur. Serum
defalarca dondurulup, çözülür veya lipid eriticiler ile muamele edilir ise viryonlar
parçalanır ve HBcAg serbestleşir (29, 38). Doğal infeksiyonun seyri sırasında
HBcAg’nin çok kısa bir süre de olsa, serumda serbest halde bulunduğu düşünülmüş,
Chermello ve ark (52), bu durumu kanıtlamışlardır. Ancak HBcAg ile anti-HBc süratle
birleşip, kompleks oluşturduğu için serolojik tanıda HBcAg'nin tespitetmeye çalışmak
uygun değildir.
HBcAg partikülleri ve viryon korlarında protein kinaz ve proteaz aktivitesi
bulunmaktadır. Kor polipeptidleri içinde sadece p23c'nin bu özelliğe sahiptir. Protein
kinaz, polipeptidin serin ve treonin artıklarını fosforilize ederek HBeAg oluşumunda rol
oynamaktadır (26, 28).
HBeAg ve HBcAg oldukça immunojendir. HBcAg'nin immunojenitesi
HBsAg'den daha fazladır ve T hücre-bağımsız antijen özelliği gösterir. HBV ile infekte
hastaların tamamına yakınında HBeAg ve HBcAg'ne karşı hem hücresel hem de
humoral cevap gelişir. Farklı çalışmalar her iki antijenin de T ve B hücrelerini tanıyan
epitoplara sahip olduğunu göstermiştir (28, 35, 44). Üzerinde birçok immünodominant
epitop tanımlanan HBV nükleokapsid proteini, kronik hepatit B'de konak immün
cevabında başlıca hedeftir. (53, 54, 55).
17
HBcAg'ne özgül T hücreleri; HBsAg humoral cevabını başlatabilir veya bu
yanıta fonksiyonel olarak yardım edebilir. Bu şekilde genetik kaynaklı S epitop
cevapsızlığının giderilmesine yardım eder. Bunlardan dolayı S antijen aşılarına HBcAg
eklenmesinin insanlardaki etkinliği arttırabileceği ve S antijenine cevapsızlığın olduğu
bireylerde antikor cevabı oluşturabileceği düşünülmektedir (56, 57).
HBcAg'ne karşı oluşan antikorlar koruyucu değildir. Erken beliren ve uzun
süre kalıcı olan anti-HBc antikorları, HBV infeksiyonu geçiren sağlıklı bireylerde ve
persistan HBV infeksiyonlu hasta serumlarında bulunur. Anti-HBc IgM akut dönemde;
HBsAg'nin kaybolup anti-HBs'nin henüz belirmediği dönemde (pencere dönemi)
pozitifleşir. Ancak bu antikorun tek başına akut infeksiyon göstergesi olarak
düşünülmesi yanlış olur. Çünkü bazı HbsAg taşıyıcıları ve çoğu kronik hepatitli hastada
düşük titrelerde de olsa bu antilorlar vardır. Dolayısıyla anti-HBc IgM'nin
pozitifliğinden çok negatif bulunması daha anlamlıdır (35, 38, 57).
2.3.4.3. P Proteini
P geni, HBV genomunun yaklaşık 3/4'ünü kaplayan en uzun gendir. 92 kDa
molekül ağırlığında P proteinini sentezler (26, 35, 58). P proteini; revers transkriptaz,
endonükleaz (RNase H) ile DNA ve RNA'ya bağımlı polimeraz aktivitesine sahiptir. Bu
proteinin farklı işlevere sahip 4 bölgesi vardır (28, 58).
a) Terminal protein; negatif DNA sarmalının sentezlenmesinde RNA
pregenomunun revers transkripsiyonu için “primer” olarak hizmet verir.
b) Spacer bölge; bu bölgenin enzim aktivitesi üzerine direkt etkisi yoktur,
çıkarılması durumunda aktivite kaybı olmaz.
c) DNA polimeraz / revers transkriptaz aktivitesi olan bölge
d) RNase H bölgesi; RNA pregenomunun sindirilip yok edilmesinde
endonükleaz görevi üstlenir.
P proteininin immunojen özelliği vardır. Hasta serumunda bulunan anti-DNA
polimeraz antikorları, sentetik peptid antijenleri ile gösterilebilmektedir (38).
18
2.3.4.4. X Proteini
X geni, HBV genomundaki en küçük gen bölgesidir. X geni iki protein
sentezler. Bu gen tarafından sentezlenen HBxAg, 154 aminoasitten meydana gelmiş, 16
kDa molekül ağırlığında, küçük, bazik bir proteindir (27, 36, 59). X proteini; inferferon
enhancer elementlerince kontrol edilen transkripsiyonu, HIV tip I ve SV 40 virüsünü
aktive eder (26, 28). Ayrıca X proteini tümör supressör gen ürününün (p 53) işlevini
bozar. Bu durum HBV ile ilişkili hepatokarsinogenez sürecinin ilk aşamasında, X
proteininin etkili olduğunu düşündürmekte ve HBxAg'nin hepatosellüler karsinom
gelişiminde rol oynayabileceğini akla getirmektedir.
HBxAg'nin HBV transkripsiyonunu da aktive ettiği gösterilmiştir. Ancak bu
proteinin gen ekspresyonu veya HBV replikasyonu için mutlaka gerekli değildir. X
sekansına karşı oluşan antikorlar, HCC ve HBV ile infekte karaciğer dokularındaki X
proteininin saptanmasında kullanılmış ve HBxAg, yüzey ve kor antijenlerinden çok
daha az olarak tespit edilebilmiştir. X sekansına ait sentetik peptidler, hasta
serumlarında anti-HBx antikorlarının tespitinde kullanılmış ve bu markerın HCC'un
erken tanısında faydalı olabileceği düşünülmüştür (60, 61).
2.3.5. HBV Genotipleri
Moleküler düzeyde yapılan çalışmalar sonucunda; HBV genomları arasında
farklılıklar olduğu görülmüş ve birbirlerine benzerlik oranı %92 ve daha fazla olan
HBV suşları aynı grupta toplanarak 6 farklı genotip (A-F) tespitedilmiştir. Yakın
zamanda Fransa ve ABD’de diğer genotiplerden tüm genom düzeyinde %11,7 ile %15,3
farklılık gösteren yeni bit genotip bulunmuş ve genotip G olarak adlandırılmıştır. Bu
genotipler ile HBsAg subtipleri arasındaki ilişkiyi saptamak için genom sekansları ile S
geni sekansları karşılaştırılmış; S geni düzeyinde genotip farklılık sınırı %4 olarak
saptanmıştır ve genotip-subtip dağılımı yapılmıştır (27, 62).
HBV taşıyıcılık oranları dünyanın değişik bölgelerinde önemli farklılıklar
gösterir. Bu, genetik dağılım farklılığı ile paraleldir. HBV prevalansının düşük olduğu
Kuzeybatı Avrupa ve A.B.D.'deki persistan taşıyıcılarda genotip A baskındır. Amazon
bölgesi ve Peru gibi yüksek HBV prevalansına sahip ülkelerde ise genotip F'nin sık
olduğu görülmüştür. HBV bulaşında vertikal geçişin ilk sırada olduğu Doğu Asya
19
ülkelerinde genotip B ve C'nin prevalansı yüksektir. Bu durum kısmen, vertikal geçişten
sorumlu olan HBeAg pozitif (replikatif) dönemin daha uzun olmasıyla açıklanır.
Vertikal geçiş yoluyla infekte olan çocuklarda kronikleşme oranı yaklaşık %80'dir. Bu
nedenle hepatit B'nin endemik olduğu bölgelerde, yüksek taşıyıcılık oranının en önemli
sebebi vertikal geçiş olduğu kabul edilir. Akdeniz ve Sahra altı Afrika ülkelerinde
genotip A ve D baskın olup buralarda horizontal geçiş daha önemlidir (49, 50).
Tablo 1: HBV genotip ve subtiplerinin coğrafi dağılımı
Genotip Subtip En sık görüldüğü coğrafi bölge
A adw2 ayw1
Kuzeybatı Avrupa, Afrika
B adw2 ayw1
Endonezya, Çin, Vietnam
C adw2 adr ayr
Doğu Asya, Japonya, Kore, Çin, Polinezya
D ayw2 ayw3
Akdeniz Bölgesi, Hindistan
E ayw4 Batı Afrika
F adw4 adw
Orta ve Güney Amerika, Polinezya
G adw2 ABD, Avrupa
2.3.6. İmmun Kaçış Mekanizmaları
Konağa ve virusa ait bazı özellikler HBV'nun immun sistem tarafından
tanınmasını engelleyebilmektedir. HBV, reverse transcriptase enzimine sahip
olduğundan intrasellüler olduğu dönemde kendi DNA'sını konak hücre genomuna
integre etmekte ve bağışık yanıtın ortaya çıkması sırasında görünmez hale gelmektedir.
Prekor/kor geninde mutasyonlar meydana getirerek immün yanıt için anahtar
hedeflerden biri olan HBeAg ekspresyonunda kayba yol açarak saklanabilmektedir (63,
64). HBV, başta karaciğer olmak üzere birçok dokuda bulunabilir. Pankreas ve
böbreklerde karaciğerden farklı olarak mikrovasküler bariyer sistemi vardır.
Mikrovasküler bariyerler bu dokulardaki HBsAg eksprese eden hücrelere HBsAg
spesifik sitotoksik T hücrelerin girişini ve saldırısını engelleyebilir. Virüsün bu
organlarda bulunması immun kaynaklı doku hasarına yol açmaz. Fakat pankreas ve
20
böbrekler potansiyel bir rezervuar haline gelir. Karaciğer HBV ile tekrar tekrar infekte
olur, viral temizlenme azalır. Bu durum viral persistansı kolaylaştırır (64).
Akut HBV infeksiyonunda, kılıf proteinlerine karşı oluşan antikorlar serbest
halde bulunan viruslara bağlanarak bir kompleks oluştururlar ve kan dolaşımı virustan
temizlenir. Bu aşamada, HBsAg ekspresyonunda bir kayıp olur veya yüzey proteinlerini
kodlayan genlerde mutasyon oluşur ise anti-HBs varlığına rağmen infeksiyon devam
eder (65, 66). Viral genomun kopyalanması sırasında bir hata oluşursa bu durum farklı
aminoasitlerin oluşması ve farklı proteinlerin sentezlenmesi ile sonuçlanır. Hayati
önemi olmayan proteinleri sentezleten kod değişikliklerinde, virüs yaşamını sürdürmeye
devam eder. Fakat virusun immün epitopları mutasyona uğramıştır ve bu mutasyonlar
immün kaçış mutasyonları olarak adlandırılır, immün kaçışta birbirinden farklı en az üç
mekanizma vardır (67, 68).
1. MHC ile bağlanmayı sağlayan bölgedeki peptid epitoplarını oluşturan
aminoasitlerdeki mutasyonel değişiklikler antijen sunumunu etkileyebilir.
2. TCR temas residülerinde veya bu bölgenin konformasyonundaki
mutasyonlar sonucu TCR'ün MHC-peptid kompleksine afinitesi kaybolur. T hücreleri
kendine sunulan antijenleri tanıyamaz ve T hücre aktivasyonu önlenir.
3. Proteinin peptid bağlarında değişiklikler (APL; altered peptid ligands)
meydana gelebilir. Bu durumda antijen aynı MHC molekülüne bağlanır ve antijene
özgü aynı TCR ile ilişkiye girer. Etkili bir T hücre aktivasyonu için MHC- peptid
kompleksi ve TCR etkileşimi yanında birçok ligand/reseptör molekül ilişkisini de
gerektirir. Bu moleküller hem APC ve T hücre adezyonuna hem de T hücrelerinde
kostimülasyonuna katkıda bulunur. Normalde MHC-peptid kompleksi ile TCR
arasındaki ilişkiler T hücre aktivasyonuna neden olduğu halde APL ile kurulan ilişkiler
T hücre cevapsızlığına yol açar. Class I ve class II sınırlı T hücreleri için tanımlanmış
olan bu duruma antagonizm adı verilmektedir. (69, 70, 71).
Viral genomun translasyonuna ihtiyaç göstermeyen viral proteinleri (erken
veya erken-acil) sunma yeteneği olmayan HLA molekülünü eksprese eden bir hasta,
infeksiyonun ilk basamağına karşı cevap oluşturamaz. Bu durumda immün kaçış ve
infeksiyonun kronikleşmesi kolaylaşır (72, 73).
21
Neonatal HBV infeksiyonunda viral proteinler konak tarafından self proteinler
olarak algılanır ve HBV antijeni için spesifik T hücre gelişimi, kronik infeksiyon ve
HBV immun toleransına neden olacak klonal delesyon ile sonuçlanır. Dolayısıyla
vertikal geçişli HBV, immun eliminasyondan kaçar. Fakat bu tolerans bebeğin HBsAg
ile aşılamasını takiben kırılabilir (74, 75).
2.3.7. HBV Mutasyonları
HBV, kısmen çift sarmallı bir DNA virusu olup yaşam siklusu sırasında
pregenomik RNA'dan revers transkripsiyonla DNA'ya dönüşür. Hızlı replikasyon
yeteneğine sahip bir virus olmasına rağmen revers transkriptaz enziminin ilk okuma
yeteneğindeki zayıflık nedeni ile bu aşamada nükleotid yerleşiminde yanlışlıklar
olmakta ve sonuçta genom yapısında moleküler düzeyde küçük mutasyonlar
oluşmaktadır. Bundan dolayı HBV diğer DNA viruslarından 10 kat fazla mutasyona
sahiptir (32).
Klinik seyir, tedavi ve korunma bakımından önemli sorunlar oluşturan HBV
mutasyonları (76);
a) Virusun replikasyonunu artırabilir.
b) Virusun antijenik yapısını değiştirerek bağışık yanıttan kaçmasına neden
olabilir.
c) Virusun hücreye girişini ve integrasyonunu kolaylaştırabilir.
d) Antiviral ilaçlara direnç gelişimine neden olabilir.
Genom üzerindeki herhangi bir yerde (S, pre C/C, X, P, promotor ve enhancer)
ortaya çıkabilen bu mutasyonlar;
a) Tek bir taban bazınının değişimi (nokta mutasyonu)
b) Bir veya daha fazla sayıda nükleotidin silinmesi
c) Aynı sekansın düz veya ters biçimde tekrar edilmesi
d) Nükleotid sekanslarının yeniden düzenlenmesi gibi farklı genetik
mekanizmalarla oluşabilir (47, 77).
22
Aktif bağışık cevap varlığına rağmen virusta meydana gelen genetik
değişiklikler mutant suşun hayatiyetini devam ettirmesine imkan sağlamakta; bu durum
tanıda karışıklıklara, aşı çalışmalarında ise başarısızlıklara yol açmaktadır (1).
2.3.7.1. Yüzey (Kılıf) Mutasyonları
HBV kılıf varyantları ile ilgili olarak tanımlanan ilk önemli mutasyon;
allellerdeki subtip determinant çiftlerinde (d/y veya w/r) tespitedilmiştir. Bu
immünolojik farklılık olarak 519. nükleotid ve 633. nükleotideki değişiklikten
kaynaklanmaktadır. Sentez sırasında 519. nükleotideki değişime bağlı olarak
HBsAg'nin 122. aminoasidinde bulunan lizinin arginin ile yer değiştirmesi durumunda
“d” determinantı “y” determinantına dönüşmektedir. 633. nükleotidin sorumlu olduğu
160. aminoasitteki lizinin yerine arginin konması “w” determinantının “r” ye dönmesine
sebep olmaktadır. HBsAg subtiplerinde (adw, adr, ayw, ayr gibi) “a” determinantı ortak
olmak şartıyla en az iki farklı determinant daha bulunursa da nadiren bu
determinantlardan biri kaybolabilmektedir (49, 50).
HBsAg’nin tüm subtiplerinde “a” determinantı ortak olduğundan ve bu
bölgeye karşı oluşan antikorlar HBV'nun hepatositlere bağlanmasını engellediğinden,
aşı, veya doğal infeksiyonun geçirilmesi ile herhangi bir subtipe karşı gelişen humoral
bağışıklık tüm serotiplere karşı koruyuculuk sağlar. Ancak “a” determinantındaki
değişiklik durumunda klasik HBsAg subtiplerine karşı oluşan antikorlar koruyucu
değildir (27, 47).
Yüzey mutasyonlarının klinik açıdan önemli sonuçları vardır. Bunlar;
1.Aşılanmış kişilerde HBV infeksiyonunun oluşabilmesi: Aşı ile ilişkili ilk
kaçak mutanta 1988 yılında İtalya'da rastlanmıştır. HBeAg pozitif anneden doğan bir
bebeğe pasif ve aktif immünizasyon uygulandıktan sonra yeterli düzeyde anti-HBs'ye
sahip olduğu halde bir süre sonra HBsAg ve HBeAg pozitif hale geldiği ve kronik
hepatit geliştiği saptanmıştır (78). Aynı aşının uygulandığı bazı kişilerde anti-HBs
varlığına rağmen geçici HBs antijenemisi görülmüş ve bir çocukta da HBeAg pozitifliği
ile hastalık ortaya çıkmıştır (79). Sekans analizleri sonucunda anneye ait “a”
determinantının 145. pozisyonunda glisin bulununurken çocuğunkinde arginin
bulunmuştur. Normalde 587. nükleotidde bulunan taban bazı guanin (G)'dir fakat
23
mutant suşlarda guanin, adenin (A) ile yer değiştirmekte, sonuçta GGA (glisin) yerine
AGA (arginin) sentezlenmektedir. Bu durumda klasik HBsAg subtipleri ile hazırlanan
aşıların koruyuculuğu yeterli olmamaktadır (80). Daha sonra yapılan değişik
çalışmalarda HBeAg pozitif anneden doğan ve doğumda immunproflaksi uygulanan
çocuklardan elde edilen serumların incelenmesi sonucunda “a” determinantının değişik
pozisyonlarında kombine mutasyonlara rastlanmış bu mutasyonları bazı olgularda 145.
aminoasitteki glisin arginin değişimi ile birlikte görüldüğü bildirilmiştir (81).
2.HB immunglobulini ile karaciğer transplant alıcılarında HBV infeksiyonu
reaktivasyonu: Korunma amacıyla “monoklonal anti-a” veya “poliklonal anti-HBs”
verilen karaciğer transplantlı bazı hastalarda bir süre sonra HBV DNA pozitifleşmiştir.
Bu olgularda 145. aminoasitte glisin arginin mutasyonu ve S proteininin diğer
pozisyonlarında(137., 142., 144., 146.) da mutasyonel değişiklikler olduğu görülmüştür.
S proteininin 145. aminoasit dışında kalan mutasyonları normal antijenik yapıya sahip
olup karaciğer transplantasyonu yapılan hastalarda bu mutantların reinfeksiyona yol
açtığını ve ciddi sorunlar yarattığını ortaya koymuştur (47, 66, 82).
Kılıf geni ile ilgili mutasyonlar, bir sekansın silinmesi, yer değiştirmesi veya
yeniden düzenlenmesi şeklinde pre-Sl ve pre-S2 bölgelerinde de daha az sıklıkta ortaya
çıkabilmektedir. Anti-HBs ve HBsAg'nin birlikte pozitif olduğu kronik hepatitli bir
hastada pre-S2 bölgesinin 9-22. aminoasitleri arasında 14 aminoasitlik kısmın silindiği
ve “a” determinantının ilk kıvrımında üç, ikinci kıvrımında ise bir aminoasidin yer
değiştirdiği bir mutant tanımlanmıştır (27). İleri çalışmalar, özellikle kronik ve
fulminant hepatitli olgularda pre-S gen mutasyonlu defektif HBV varyantlarına, daha
sık rastlandığını ortaya koymuştur (66, 82, 83). Pre-S2 defektif mutantları karaciğer
yetmezliğinde rol oynayabilmekte ve sıklıkla fulminant hepatit ile ilişkilidir (84). S
promoter regülatör CCAAT motifinde meydana gelen mutasyon viral retansiyondan
sorumludur (85).
HBV yüzey geni mutasyonları çok çeşitli olup infeksiyöz ve patojendir.
HBsAg'nin “a” determinantındaki mutasyonların immünproflaksi uygulanan
taşıyıcılarda ortaya çıktığı düşünülmüştür. Aşılama güçlü bir humoral yanıt
oluşturmasına rağmen sitotoksik T hücre cevabı oluşturmaz. HBV ile doğal infeksiyon
sonucunda humoral bağışıklık ve sitotoksik T hücre cevabı oluşmaktadır. Bu tip
24
mutantların aşı ile indüklendiği ileri sürülmüş ve bunlara “aşı ile indüklenen kaçak
mutantlar” adı verilmiştir. Fakat “a” determinant mutantlarına aşısız taşıyıcılarda da
rastlanmıştır (86).
3. HBsAg tespitinde kullanılan ELİSA testlerinin saptayamayacağı antijenik
yapıların varlığı ve atipik serolojik profiller: S bölgesinde ortaya çıkan mutasyonlar
serolojik tepkimeleri de etkilemekte, tek başına HBV DNA pozitifliği, tek başına
HBsAg pozitifliği, anti-HBs ve HBsAg'nin birlikte pozitifliği gibi alışılmışın dışında
serolojik profillerin görülmesine sebep olmaktadır (77).
Sonuç olarak yüzey geni mutasyonları aşının ve HBIG’nin korumasından
kaçabilen HBsAg negatif HBV infeksiyonlarına neden olabilen ve fulminan seyirle
ilişkisi olabilen virusları meydana getirebilir (87).
2.3.7.2. Prekor/Kor Bölgesi Mutasyonları
HBV’nin ilk tespit edilen ve üzerinde durulan mutasyonları bu bölgede oluşan
mutasyonlardır. Viral replikasyon kaybı olmaksızın anti-HBe serokonversiyonu
gösteren bazı hastalardan izole edilen HBV DNA'ların incelenmesi ile prekor/kor geni
üzerindeki mutasyonların varlığı ortaya konmuştur. Prekor bölgesinde görülen en
önemli mutasyon HBeAg'nin üretilememesi ile karakterize olan stop kodon
oluşumudur. Normalde prekor bölgesinde stop kodon bulunmaz ve prekor bölgesinin
başlangıç kodonundan başlayan sentez işlemi kor bölgesinin başlama kodonu ile devam
eder. Eğer prekor bölgesinin 1896. nükleotidindeki guaninin (G) yerine adenin (A)
gelirse triptofan kodonu da denilen kodon 28 (TGG), stop kodon (TAG) haline gelir ve
HBeAg'nin prokürsör proteini (p250) oluşamaz. Söz konusu nokta mutasyonu kor
bölgesinin başlama kodonundan önce meydana geldiğinden ve HBeAg ile HBcAg farklı
mRNA moleküllerinden sentezlendiğinden HBeAg üretilemez ancak HBcAg'nin sentezi
devam eder (88, 89, 90).
HBV replikasyonu için HBeAg translasyonu gerekli değildir. Prekor alanında
oluşan mutasyonlar viral replikasyonu etkilemez aksine replikasyon yeteneğine sahip
HBeAg negatif mutantların ortaya çıkmasına neden olur. HBeAg'nin fonksiyonu
konağın HBV'na karşı gelişen cevabını kontrol etmektir. HBeAg sentezleyemeyen
mutant suş konağın sitotoksik cevabından kaçarak hayatını sürdürür. Üstünde HBeAg
25
bulunan hepatositler anti-HBe'nin de etkinliği ile bir sûre sonra lizise uğrar ve sonuçta
HBeAg negatif mutant suş dominant hale gelir (77).
Infekte hepatositlerin temizlenmesi membran üstünde bulunan antijenlere karşı
gelişen humoral cevap ile veya viral proteinlerden birindeki peptidlere karşı ortaya
çıkan CTL cevabı ile olur. Akut hepatit B'li olgularda prekor stop kodon mutantlarının
görülmesinde iki faktör rol oynar. Bunlardan ilki bulaş sırasındaki HBeAg pozitif/HBe-
Ag negatif virüs oranı ikincisi ise bu varyantların ortaya çıkışını engelleyen CTL
fonksiyonundaki bozukluktur (47).
Prekor mutantlarının varlığı asemptomatik HBV taşıyıcılarında, kronik viral
hepatit B'li olgularda, ciddi karaciğer hastalığı olanlarda ve fulminant hepatitli
hastalarda gösterilmiştir (59). Kronik hepatit B'nin seyri sırasında ortaya çıkan HBeAg
negatif vireminin hepatosellüler hasarı arttırdığı, prekor/kor mutantlarının fulminant
hepatit ile hızlı progresyon gösteren kronik hepatit oluşumunda rol oynayabileceği
sanılmaktadır. (91, 92).
Prekor promoter bölgesindeki değişiklikler HBeAg sentezini ve viral
replikasyon seviyelerini etkilemektedir. Prekor promoter mutasyonlarında pregenomik
RNA sentezi etkilemeyip HBeAg ekspresyonunu azalmaktadır. Viral replikasyonda ise
orta düzeyde bir azalma olmaktadır. Prekor ORF'de ise doğal yoldan oluşmuş ve
pozisyon 28'de bir terminasyon kodonu taşıyan mutantın nükleokapsid partiküllerindeki
pregenomik mRNA'nın enkapsidasyonunu artmaktadır (93).
Kor promoter/enhancer II alanındaki (nt 1634-1782) nokta mutasyonları kısa
delesyonlar veya insersiyonlar sonucunda pre-mRNA transkripsiyonunda azalma, C-
mRNA'da artış meydana gelmektedir. HBeAg sentezi iptal olurken kor ve pol
proteinlerinin üretimi artmakta ve sonuçta viral partiküller daha fazla oluşmaktadır. Bu
bölgede en sık tanımlanan nokta mutasyonları AT'den zengin ilk bölgeyi (nt 1758-1762)
etkileyen A-T 1762 ve G-A 1764 mutasyonlarıdır (94, 95, 96).
HBeAg negatif mutantlar ile infekte kişilerde alışılmadık serolojik profiller ile
karşılaşılır. HBeAg'nin kaybolmasıyla HBV DNA'da belirgin bir azalma olmaktadır.
HBV DNA testleri kullanılmadan önce HBeAg, vireminin göstergesi olarak kabul
edilmiş ancak HBeAg negatif mutantların varlığını gösterilince, HBeAg ve anti-HBe'nin
vireminin çok güvenilir parametreleri olmadığı anlaşılmıştır. Bu nedenle klinik
26
uygulamalarda anti-HBe antikorlarının gösterilmesi HBV replikasyonu ve karaciğer
hastalığı olmadığı anlamına gelmediği unutulmamalıdır. Viral replikasyonunun direkt
göstergesi HBV DNA'dır (53, 77). Anti-HBe pozitif kronik aktif hepatitli hastalardaki
prekor mutantlar, HBeAg pozitif hastalarda da saptanmıştır (97, 98). Prekor HBe
negatif mutantların, normal karaciğer fonksiyonlarına sahip anti-HBe seropozitif kronik
taşıyıcılarda da sık olduğu gösterilmiştir (99, 100, 101, 102).
Kor bölgesi ile ilgili mutasyonlar sıklıkla T helper ve B hücre epitoplarında
ortaya çıkar. Ancak CD8+CTL epitopunda da mutasyonlar tanımlanmıştır. Kor
bölgesinin T helper epitopu içinde yer alan aminoasit 12 pozisyonundaki treonin'in serin
ile yer değiştirmesi, HBV'nun CD4+T hücre cevabından kaçmasını sağlamaktadır (27,
53, 103, 104).
Kor promoter mutasyonları, prekor mutasyonları ile birlikte veya bunlar
olmadan da ortaya çıkabilir. HBV DNA üzerindeki kor promoter, X geninin 3'
terminalinde yer alır ve 3,5 kb'lık mRNA'nın (pregenom-kor/polimeraz mRNA)
transkripsiyonunu kontrol eder. Bu mRNA pregenom gibi davranarak kor proteini ve
DNA polimeraz-revers transkriptaz'ın sentezinde rol oynar. Kor promoter aynı zamanda
HBeAg prokürsörünü kodlayan ve biraz daha uzun olan 3,5 kb'lık mRNA (prekor
mRNA)'nın transkripsiyonunu da kontrol eder (44). Bu nedenle kor promoter'da ortaya
çıkan mutasyonlar hem RNA (pregenom-kor/polimeraz mRNA veya prekor mRNA)
hem de bunların gen ürünlerinin ekspresyonunu etkiler. Spesifik mutasyonlarda sadece
bir tip mRNA'nın transkripsiyonu etkileneceğinden tek başına HBeAg'nin üretimi durur
veya kor proteinleri ile DNA polimerazın üretimi bloke olur. HBV kor promoter'undaki
iki komşu mutasyonun (nükleotid 1768'de C yerine T ve nükleotid 1770'de T yerine A
geçmesi) pregenomik RNA transkripsiyonunda küçük artış (yaklaşık 2-3 kat) ve bu
transkripsiyondan bağımsız olarak viral enkapsidasyonda büyük artışla (on katdan daha
fazla) sonuçlanmaktadır. Oluşan mutant ise fulminant hepatit ile yakından
ilişkilidir (105).
2.3.7.3. Polimeraz Geni Mutasyonları
Polimeraz geni HBV’nin en büyük geni olup diğer üç genlede overlap’lar
yapmaktadır. Bu nedenle gen üzerindeki değişiklik genellikle diğer genlerde de
değişikliğe neden olmaktadır. Bunun için doğal olarak polimeraz mutasyonlarına çok az
27
rastlanır. Bugün için polimeraz geni mutasyonları dendiğinde akla nükleozid analogları’
na karşı direnç sağlayan mutasyonlar gelmektedir (106).
HBV replikasyonunu inhibe etmek için gansiklovir, lamivudine ve famsiklovir
gibi pek çok antiviral ilaç kullanılmaktadır. Bu ajanlar HBV replikasyonunu
baskılasalarda uzun süreli kullanımlarından sonra ilaca dirençli HBV suşları
oluşmaktadır. Şimdiye kadar ilaca bağlı en iyi tanımlanmış HBV mutantları lamivudine
(LAM)'e dirençli olanlardır ve bunlar HIV suşları ile aynı mutasyona sahiptirler (53,
107).
2.3.7.4. X Geni Mutasyonları
X gen bölgesi virüsün replikasyonu ve ekspresyonu için çok önemlidir. X
proteini HBV genlerini transaktive etmekte ve kor promoter, enhancer II, DR1 ile DR2
bu bölgede yer almaktadır. Dolayısıyla burada oluşan mutasyonlar bu yapıları da
etkilemektedir (108):
a- X-ORF'de meydana gelen nokta mutasyonlar ve delesyonlar daha az viral
gen ekspresyonu ve replikasyonuna sahip bir fenotip oluşturur. Sonuçta HBV'na ilişkin
serolojik göstergelerin çoğu veya tümü negatif bulunur.
b- X bölgesindeki mutasyonlar, DR sekanslarının biri veya her ikisinde
delesyona yolaçabilir.
c- X-ORF'nin 3' delesyonları kor promoter'ı elimine eder. Ancak bu durumda
kor polipeptidi, X promoter ve virus enhancer'in üst kısımlarında yapılmaya devam
edebilir.
d- Normalde pre-C sekansındaki delesyonlar viral replikasyonu etkilemez.
Fakat X bölgesindeki delesyon, pre-C bölgesi girişine kadar uzanır ise viral polimerazın
pregenomik bağlanma alanları ve pregenomik paketlenme sinyalini etkileyebilir.
e- X bölgesinin orta kısmından yukarıya doğru uzanan delesyonlar polimeraz
ORF'nin 3' ucunu da içine alır ve polimerazın kısmi delesyonu atenüasyona katkıda
bulunur (60).
X geninde meydana gelen değişik mutasyonların fonksiyonel önemi tam
bilinmemekle birlikte bu tip varyantların infektiviteleri zayıf, replikasyon seviyeleri
28
düşüktür. Kronik HBV infeksiyonlu, HCC'lu, fulminant hepatitli ve sirozun son
döneminde bulunan hastalarda X geni üzerindeki 130. ve 131. kodonlarda nokta
mutasyonları bildirilmiştir (61). 1770–1777. nükleotidleri arasındaki 8 nükleotidlik
delesyonunun DNA ekspresyon ve replikasyonunu baskıladığı ve sonuçta HBsAg'nin
negatif hale geldiği bildirilmiştir (108).
HBx mutantları, beklenen serolojik profilden sapmalar gösteren hastalar, anti-
HBc negatif-yüksek düzeyde viremik hepatitliler, renal diyalize giren kişiler ve çok kan
transfüzyonu yapılan hastalarda da gösterilmiştir (42, 109). Serolojik olarak sessiz
nonB-nonC hepatitli olgulardan bu tip mutantların sorumlu olabileceği tahmin
edilmektedir (110).
2.4. Hepatit B İnfeksiyonu Epidemiyolojisi
Bütün dünyada yaygın olarak görülen HBV’ye bağlı akut hepatitin ortalama %
5’inin kronikleştiği ve bunların önemli bir bölümünün siroza dönüştüğü; sirozlu
olguların ise hepatosellüler karsinom gelişme riskinin oldukça yüksek olduğu
bilinmektedir (5).
2.4.1. Bulaşma Yolları
HBV'nun 4 ana bulaşma şekli vardır: İnfekte kan ya da vücut salgıları ile
parenteral temas (perkütan), cinsel temas, infekte anneden yeni doğana bulaşma
(perinatal vertikal), infekte kişilerle cinsellik içermeyen yakın temas (horizontal).
HBV'nun bulaşmasında mevsim ve yaş faktörlerinin rolü yoktur. HBV fekal
oral yolla bulaşmadığından infeksiyonun yayılmasında su ve gıdalar önemli değildir.
Oral yolla bulaşma ancak infekte kanın hasarlanmış oral mukozaya temasıyla
gerçekleşebilir. Göz ve bütünlüğü bozulmuş deri de virusun geçişinde önemli rol
oynar (6).
2.4.1.1. Perkütan Bulaşma
Virusun perkütan inokülasyonu, kan ve kan ürünlerinin transfüzyonu,
hemodiyaliz, endoskopi, yapay solunum cihazı gibi tıbbi aletlerin kullanımı, akupunktur
uygulaması, aynı enjektörün farklı bireylerde kullanımı ve dövme yaptırmayla
29
olmaktadır. Ayrıca infekte kan bulaşmış havlu, jilet, tıraş makinesi, diş fırçası, banyo
malzemeleri gibi günlük eşyaların ortak kullanımı da perkütan bulaşmaya neden
olabilir (6).
2.4.1.2. Cinsel Temasla Bulaşma
Homoseksüeller arası cinsel temas, HBV için en riskli seksüel bulaşma
yoludur. Rektal mukoza mikrotravmalarına bağlı olarak infekte kan veya infekte semen
teması riski arttırmaktadır. Genital sekresyonlar kandan daha az konsantrasyonlarda
virüs içermelerine karşın bu sekresyonlar heteroseksüel temas sırasında bulaşmaya
neden olmaktadırlar (111).
2.4.1.3. Perinatal Bulaşma
Taşıyıcı annenin perinatal dönemde infeksiyonu bebeğine geçirme ihtimali
%40-50'dir (6). HBeAg pozitif bir annede bu oran daha yüksektir (27). Annenin HBV
taşıyıcı olması durumunda hamileliğinin üçüncü trimesterinde veya doğumdan sonraki
ilk iki ay içinde akut hepatit B infeksiyonu geçirmesi de perinatal bulaşmaya neden
olabilir. Anneden çocuğa bulaşma, doğum esnasında veya doğumdan sonra oluşabilen
deri ve mukoza sıyrıklarının infekte maternal sıvılarla teması, vaginal kanaldan geçiş
sırasında anne kanının yutulması, sezaryen sırasında anne kanıyla temas veya plasenta
hasarı sonucu maternal dolaşımın fötal dolaşıma karışmasıyla olur. İntrauterin bulaşma
oranı ise nadirdir (%5-10) (112).
2.4.1.4. Horizontal (Yatay) Bulaşma
Parenteral, cinsel veya perinatal temasla bulaşmanın olmadığı durumlarda
oluşan bulaşmaya horizontal bulaşma denir. HBV'nun hepatositlerden başka periferik
kandaki mononükleer hücrelerde de replike olabilmesi nedeniyle, çok küçük
miktarlardaki infekte kanın, yakın temastaki bireylerin hasarlı derileriyle temasının
horizontal bulaşmaya yol açabileceği düşünülmektedir (113).
Tükürük gibi vücut sıvılarının defektli deriyle teması da bulaşmaya sebep
olabilir. Horizontal yol özellikle ev içi bulaşmada önemlidir. HBV'nun zeka özürlü
çocuk bakımevleri, anaokulu, kreş, yatılı okul, kışla, yurt, hapishane gibi yerlerde de
30
kolay yayıldığı görülmüştür. Kalabalık yaşam şartları, kötü hijyen ve düşük sosyo-
ekonomik düzey HBV'nun bulaşma oranını arttırmaktadır (6).
Tablo 2: HBV İnfeksiyonun bulaşma yolları ve risk grupları
Perkütan (parenteral) bulaşma
• Çoğul transfüzyon yapılan hastalar
• Hemodiyaliz hastaları
• Damar içi uyuşturucu bağımlıları
• Dövme (tatuaj) yaptıranlar
• Sağlık personeli
Cerrahlar
Diş hekimleri
Hemşireler
Hastabakıcıları
Laboratuvar teknisyenleri
Ilk yardım çalışanları
Cincel temasla bulaşma
• Erkek eşcinseller
• HBV taşıyanların cincel partnerleri
• Fahişeler
• Çok partnerli heteroseksüeller
Perinatal bulaşma
• HBV taşıyıcısı annenin bebekleri
Horizontal bulaşma
• Kalabalık topluluklar halinde kötü hijyen ve düşük sosyoekonomik durumda
yaşayanlar
• Mental özürlüler
31
2.4.2. Dünyada HBV İnfeksiyonu Prevalansı
HBV infeksiyonunun dünyadaki dağılımı coğrafi bölgelere göre farklılıklar
göstermektedir. Bundan dolayı dünya, düşük, orta ve yüksek endemisite bölgelerine
ayrılmıştır (111).
Düşük endemisite olan bölgelerde HBV taşıyıcılık prevalansı %2'den azdır.
Erişkinler açısından infeksiyonla karşılaşma oranı da %20 dir. Cinsel temas en önemli
bulaşma nedenidir. HBV ile çoğunlukla erişkin dönemde karşılaşılır. Perinatal ya da
erken çocukluk dönemlerindeki bulaşma da önemli ölçüde HBV taşıyıcılığına neden
olur. Kuzey Amerika, Kuzey ve Batı Avrupa, Avustralya, Yeni Zelanda gibi gelişmiş
ülkelerde HBV düşük endemisite göstermektedir. Bu ülkelerde genel popülasyonda
hepatit B insidansı düşük iken eşcinseller, çok partnerli heteroseksüeller, damar içi
uyuşturucu bağımlıları gibi risk gruplarında ve Eskimolar, Yeni Zelanda Maorileri,
Avustralya yerlileri, ABD zencileri gibi bazı etnik gruplarda infeksiyon endemiktir (6).
Orta endemisite profili Güney ve Doğu Avrupa, Güney ve Orta Amerika, Orta
Asya ile Türkiye'nin de içinde yeraldığı Ortadoğu’da görülmektedir. Bu grupta
toplumdaki HBsAg pozitifliği %2-10 arasındadır ve erişkinlerin %20-60'ında anti-HBs
pozitifliği bulunmaktadır, infeksiyon çoğunlukla çocukluk, ergenlik veya genç
erişkinlik dönemlerinde alınmaktadır. Başlıca bulaşma yolu horizontal olmakla birlikte
diğer bulaşma yollan da infeksiyonun yayılmasında rol oynarlar (114).
Yüksek endemisite Afrika ve Asya gibi bölgelerde HBV infeksiyonunun
epidemiyolojik paterni oldukça farklıdır. Toplumun %10'dan fazlası HBV ile kronik
olarak infektedir ve erişkinlerin %70'den fazlasında anti-HBs pozitifdir. Bu bölgelerin
insanları yaşamlarının 10-20 yaşları arasında %50'nin üzerine çıkan oranlarda anti-HBs
pozitifliği edinirler (6). Yüksek endemisite bölgelerinde perinatal veya horizontal
bulaşma ana bulaşma yoludur. Asya'da perinatal bulaşma daha önemli iken Afrika'da ise
bulaşma bir yaşından büyük çocuklarda aile içi horizontal yolladır (111).
2.4.3. Türkiye’de HBV İnfeksiyonu Prevalansı
Türkiye'deki HBsAg seroprevalansı, bölgeden bölgeye değişmek üzere ELISA
yöntemi ile %3,9–12,5 olarak belirlenmiştir. Özellikle Diyarbakır'dan olmak üzere
Güneydoğu Anadolu bölgesinde genellikle %10'un üzerindedir (27). Bu sonuçlara göre
32
Türkiye orta derecede endemik bir bölgedir ve 4 milyon civarında taşıyıcı
bulunmaktadır (115). Kızılay Kan Merkezi 1998 yılında 396.141 donörde %1,4
oranında HBsAg pozitifliği belirlemiştir. Sağlık Bakanlığı verilerine göre 1998 yılında
Türkiye genelinde çalışılan 1.377.688 kanda ise %1,0 oranında HBsAg pozitifliği
saptanmıştır (115).
Ülkemiz çocuklarında %2,0–12,1 oranlarında HBsAg pozitifliği saptanmıştır
(115). 2-12 yaş arasındaki 495 çocukta yapılan bir çalışmada HBsAg seroprevalansı
%4,9 olarak belirlenmiştir (116). Bu grupta yapılan çalışmalar içinde en yüksek olgu
sayısının bulunduğu araştırma (1190 olgu %7,1 HBsAg seropozitifliği, %21,9 anti-HBs
seropozitifliği) Pasha ve ark. tarafından yapılmıştır (115).
Anti-HBs'nin tarandığı çalışmalardan elde edilen verilere göre anti-HBs
pozitifliği oranı %20,6–52,3 arasında değişmektedir (115). Böylece Türkiye'de HBV
infeksiyonu seroprevalansının (HBsAg pozitifliği+anti-HBs pozitifliği) %25-60
arasında olduğu söylenebilir ki bu oranlar gelişmiş ülkelere göre oldukça yüksektir.
HBV infeksiyonu seroprevalansının en çok araştırıldığı olgular içerisinde risk
grupları, özellikle sağlık personeli ilk sırayı almaktadır. Bu grupta ortalama %8 (3,5–
16,4) HBsAg pozitifliği ve %40 (17,9–52,9) anti-HBs pozitifliği bulunmuştur (115).
2.5. Hepatit B İnfeksiyonu Patogenezi
HBV infeksiyonu çok değişken bir spektruma sahiptir. Virusun akut, fulminan
veya kronikleşerek siroza ve hepatosellüler karsinomaya gidebilen formda hepatit
tabloları yapabildiği gibi persistan viremiye rağmen aminotransferazların ve karaciğer
histolojisinin normal olduğu “sağlam taşıyıcılık” diyebileceğimiz bir tablo olarakda
kalabilir (117).
HBV’ne karşı konağın immun cevabı ortaya çıkan klinik patolojinin ve
virustan kurtulmanın temel nedenidir. HBV’nun hepatositlere nasıl girdiği tam
anlaşılmamıştır. Virusun pre-S2 domeni ile polimerize insan serum albümini’ne ve pre-
S1 domeni ile bir transmembran enzimine veya IgA reseptörüne veya IL-6 reseptörüne
yada asialoglikoprotein reseptörüne bağlanarak hücreye girdiği düşünülmektedir. Ayrıca
virusun pre-S1 aracılığı ile karaciğer hücresi membranın da türe spesifik bir protein olan
anneksinV aracılığıyla membrana bağlandığı ve anti-anneksinV antikorlarının
33
HBsAg’nin intakt hepatositlere bağlanmasını inhibe ettiği gösterilmiştir (117). Konak
hücrelerine virusun girmesin engellemek için serbest HBV partiküllerinin
nötralizasyonu önemlidir. Zarf antijenlerine karşı oluşan antikorlar akut infeksiyonun
ortadan kalkmasından sonra kalıcı hale gelirler. B hücrelerinden antikor üretimi CD4+ T
hücrelerinin yardımıyla üretilen sitokin aracılı bir süreçtir (72, 118, 119).
HBV direkt sitopatik etki göstermez. Hepatosit nekrozu, sellüler ve humoral
immun cevaplar sonucu gelişir. Akut olgularda, CD4+ T hücre proliferasyonu, IL-2,
INF-γ, TNF-α yapımı ile karakterize Th1 tipinde güçlü bir T hücre yanıtı vardır.
Nükleokapsid antijenleri viral klirens için immun tepkinin hedef molekülleridir (117).
CD4+ hücreler antiviral immun yanıtı başlatan hücrelerdir. Bu hücrelerden
salınan sitokinlerin hem virusun oluşturacağı hastalık tipini hemde viral infeksiyonun
sonucunu belirlemede oldukça önemli oldukları düşünülmektedir.
HBcAg, HBeAg’den daha immunojendir ve HBeAg’den farklı olarak HBcAg
direkt virus spesifik B hücrelerini uyararak anti-HBc antikorlarını oluşturabilir. Yüksek
titrede anti-HBc yanıtı erken dönemde ortaya çıkıp uzun sürede yavaş yavaş azalır.
Buna karşın anti-HBe serokonversiyonu geç oluşup HBeAg kaybolmasından yıllar
sonra kalır. HBeAg neonatal infeksiyondaki toleranstan sorumlu olduğu gibi yetişkinde
immun yanıtı modüle etmektedir. Böylece HBeAg sekresyonu virus eliminasyonu veya
konak hasarına yol açmadan infeksiyonun uzun süre devamına yol açar. Asemptomatik
HBV taşıyıcılarında Th2 profili gözlenir. HBcAg/HBeAg-spesifik Th1/Th2 hücrelerin
dengesi karaciğer hasarını ve viral klirensi regüle etmede önemli görünmektedir (117).
Erken (preklinik) dönemde düşük titrede anti-HBs antikorlarının sentezlendiği
gösterilmiştir. Bu antikorlar HBsAg ile kompleks yapmış durumda bulunurlar. Nitekim
prodromal dönemde ateş yükselmesi, döküntü ve artrit ile seyredebilen ekstra hepatik
sendromun bu immun komplekslerle oluştuğu bildirilmiştir. Genellikle ticari kitlerle
gösterebilir düzeyde ortaya çıkışları HBsAg’nin kaybolmasını (spesifik CTL etkisinin
kalkmasını) gerektiren bir pencere dönemi izler. İyileşme olduğu halde HBsAg nadiren
pozitif kalabilir. Bunun, S geninin konak hepatosit genomuna entegrasyonundan ileri
geldiği düşünülür (117). Bu durumda anti-HBs antikorlar HBV klirensinden sonra bile
tespit edilmeyebilir (48).
34
Viral klirenste sitotoksik T lenfositleri (CTL) kritik rol oynar. HBV
infeksiyonunun nasıl sonlanacağı CTL yanıtı ile belirlenir. Akut HBV infeksiyonunda
CD8+ T hücre proliferasyonu ve aktivasyonu artmıştır. HBsAg, etkin bir CTL yanıtını
indükler; kronik infeksiyonda bu yanıt sınırda kalır. Kronik infeksiyonda nükleokapsid
antijenlere spesifik T hücre yanıtının viral klirensten sorumlu olduğu sanılmaktadır.
Anti-viral (non-sitolitik) immun mekanizmalar, akut gidişli HBV infeksiyonu süresince
desrüktif (sitolitik) mekanizmalardan daha önce ve daha etkin biçimde rol alır. Böylece
viral DNA’nın en az %90’nı bu yolla elimine edilir. Ancak non-sitolitik yolun virusun
kalmasınada yol açabileceği düşünülmektedir (117).
Akut HBV infeksiyonundan iyileşmede sellüler ve humoral immun yanıtlar
önem taşır. T hücre yanıtları infekte hücreleri temizler, humoral yanıtlar ise dolaşımdaki
viryonları bloke eder ve infeksiyona karşı korunmayı sağlar. HBV persistansı
infeksiyonun alındığı yaşa yüksek düzeyde bağımlı görünmektedir. Bebeklik ve erken
çocukluk çağında alınan infeksiyon çoğunlukla persiste ettiği halde erişkin yaş
infeksiyonunun %95 kadarı kendiliğinden iyileşmektedir. HBV’nun viral klirensten
kurtulmasında kabul gören yollar bilinmektedir (117);
1) Virusun T hücreleri tarafından tanınmaktan kurtulması; zayıf peptid
sunumu, antijenik değişim, virusun immun sistemden korunmuş yerlerde
saklanması,
2) Konak immun yanıtın baskılanması; Th1 sitokin fonksiyonunun azalması,
virus spesifik T hücrelerinin tolerize olması veya tükenmesi,
3) Bazı class II allelerinin HBV persistansı ile ilişkili olabileceği düşünülmüş.
Örneğin; HLA DR2 ve DR7’nin persistan HBV ile ilişkili olduğu, DR6’nın
ise persistandan koruduğu,
4) Konakta opsonik indeksin düşmesine yol açan mannoz bağlayan lektin
kodonlarındaki mutasyon,
5) CTL antijen sunumdaki yetersizlik,
6) Yetişkinde T hücrelerinin spesifik antijene yoğun biçimde maruz kalmaları
ile T hücre apoptozisinin olması.
35
Sonuç olarak immun yanıtın şiddeti ve kalitesi HBV infeksiyonunda doğal
seyri belirleyen en önemli faktörlerdir. İmmun yanıt, infeksiyonun sonlandırılması için
gerekli olmakla birlikte HBV’nun elimine edilemediği durumlarda viral replikasyon ile
immun yanıt arasındaki ilişki karaciğer hasarına neden olmaktadır. Kronik hepatosit
hasarına eşlik eden inflamasyon ve rejenerasyon DNA hasarına neden olarak HCC
gelişimi ile sonlanabilmektedir. Viral DNA’nın konak DNA’sına entegrasyonu da
konak genleri üzerine etki ederek kanser gelişimine katkıda bulunabilmektedir (120).
Şekil 5: HBV infeksiyonunda olası patogenezin süreçleri
2.6. Akut Hepatit B’de Klinik Bulgular ve Tanı
Akut hepatit B infeksiyonunun inkübasyon dönemi 4-28 hafta olarak
belirlenmiş, fakat çoğu vaka da bu aralık 60-180 gündür. Hepatitin ortaya çıkması
serumda HBsAg’nin saptanmasından ortalama 4 hafta (1-7 hafta) sonradır (6, 34).
Viral hepatitler asemptomatik infeksiyondan fulminan hastalığa kadar değişen
farklı klinik seyir göstermektedir. Hastalık çocuklarda ve gençlerde yetişkinlere göre
daha hafif ve asemptomatik olarak seyretmektedir. HBV infeksiyonunun 4 yaşın
altındaki çocuklarda % 90, 30 yaşın üzerindeki yetişkinlerde ise 2/3 oranında
asemptomatik olarak geçirilmektedir (7). Akut hepatitin başlangıç semptomları
nonspesifiktir. Semptomatik akut hepatit B, hafif ve anikterik veya daha ciddi ve ikterle
birlikte olabilir. HBV’li erişkinlerin % 5-20’sinde belirgin akut hepatit belirtileri ortaya
36
çıkmaktadır (6, 34). Sklerada ikter, serum bilirubin düzeyi % 2,5–3 mg üstünde olunca
görülür. Tipik semptomları, halsizlik ve yorgunluk, iştahsızlık, bulantı, kusma ve sağ
üst kadranda hafif künt bir ağrıdır. Preikterik dönemdeki bu semptomlar genellikle 3-10
gün sürer. Sarılığın başlaması ve koyu idrar çıkması ile ikterik dönem başlar. İkterik
vakalarda semptomlar ilerleyebilir, değişmeden kalabilir veya hızlıca düzelebilir.
Sarılığın başlamasıyla hastalar genellikle kendilerini daha iyi hissederler. Hastaların bir
kısmında birkaç gün süren hafif kaşıntı oluşur, nadiren kaşıntı uzayabilir, idrar koyu,
dışkı açık veya çamur rengindedir Sarılığın süresi genellikle 1-3 haftadır ve 4 haftayı
nadiren aşar (6).
Akut hepatit B’li hastaların % 10-20’sinde belirgin karaciğer hastalığı
semptomlarının başlamasından birkaç gün veya hafta önce eritematöz makülopapüler
raş, ürtiker, artralji, nadiren artrit ve bazen de ateş ile kendini gösteren “serum
hastalığına benzer sendrom” olarak isimlendirilen bir tablo vardır. Preikterik
dönemdeki bu belirtiler hepatit B yönünde teşhis koydurucudur. Bu durum HBV’una
bağlı olarak gelişen immün kompleks ile ilişkilidir. Bu semptomlar genellikle 2-10 gün
sürüp sarılığın ortaya çıkmasıyla kalıcı değişiklik bırakmadan hızla ortadan kaybolurlar,
nadir olarak haftalar veya aylarca sürebilir. Akut hepatit B’li çocuklarda bu sendrom ile
ilşkili bir hastalık papüler akrodermatit (Gianotti hastalığı) olarak tanımlanmıştır (6,
121).
HBV infeksiyonu nadir olarak karaciğer fonksiyon anormalliği olmadan ortaya
çıkar ve sadece virus için spesifik serolojik tetkiklerle teşhis edilebilir. Fizik muayenede
sağ üst kadranda hassasiyet, hepatomegali, sklera, mukoza ve deride ikter mevcuttur.
Hastaların % 10-15’inde splenomegali olabilir. Servikal lenfadenopati olabilir. Geçici
jinekomasti olabilir fakat nadirdir. Çocuklar genellikle 2 haftada, erişkinler ise 4-6
haftada iyileşir (6).
Akut hepatit B’de laboratuvar testleri normal gözlenir veya orta derecede
azalmış hematokrit veya hemoglobin’e rastlanır. Lokosit sayısı normal, granulositopeni
ve relatif lenfositoz olabilir. Geçici steatore erken hastalık döneminde olabilir (6). Total
serum bilirubini genellikle 10-14 gün yüksek kalır. Akut viral hepatitin esas göstergesi
serum transaminaz aktivitesindeki hızlı yükseliştir. Transaminazların yükselmesi
semptomlar başlamadan önce başlar ve genellikle semptomların birinci haftasında pik
37
yapar. Serum pik düzeyi genellikle 1000 Ü/ml’nin üzerindedir ve alanin
aminotransferaz (ALT), genelde aspartat aminotransferaz (AST)’dan daha fazla
yüksektir (6, 34). Pik seviyeleri karaciger hastalığı ile doğru orantılıdır, fakat prognostik
faktör değildir. Serum alkalen fosfataz seviyesi normal veya hafif yükselmiştir. Serum
albumin ve globulin konsantrasyonu genelde normaldir (6).
2.7. Kronik Hepatit B’de Klinik Bulgular ve Tanı
Sağlıklı yetişkinlerde akut infeksiyondan sonra kronikleşme riski % 5
civarındadır (122). Altı aydan uzun süre serumda HBsAg tespit edilmesi taşıyıcılığı
ifade eder. Serum transaminaz değerleri normal olan ve karaciğer hastalığının diğer
belirtileri olmayan HBsAg pozitif kişiler sağlıklı taşıyıcı olarak isimlendirilmektedir (9,
123). Kronik HBsAg taşıyıcılarının % 1-2’sinin her yıl HBsAg negatif olacakları tahmin
edilmektedir. HBeAg kaybolduğunda HBV replikasyonu sona erer ve kronik HBsAg
taşıyıcıları infeksiyonun nonreplikatif dönemine geçerler. HBeAg-AntiHBe
serokonversiyonunun yıllık % 2,7–25 oranlarında gerçekleştiği bildirilmektedir (9).
Genellikle taşıyıcılarda Anti-HBc pozitiftir. HBeAg’nin pozitif, Anti-HBe’nin
negatif olması viral replikasyonun olduğunu; HBeAg’nin negatif Anti-HBe’nin pozitif
olması replikasyonun sona erdiğini gösterir. Ancak bazı durumlarda Anti-HBe pozitif
olmasına rağmen HBV-DNA’nın pozitif olması mutant bir HBV infeksiyonunu gösterir
(123). Bu durum kronik hepatitlerde prognozun ve tedavinin belirlenmesi bakımından
oldukça önemlidir. Anti-HBe pozitif olgularda % 20, HBeAg pozitif olgularda % 80
oranında HBV-DNA’nın gösterilmesi, HBsAg pozitif vakalarda viral replikasyonun
varlığını göstermesi bakımından özellikle kronik hepatitlerde PCR ile HBV-DNA
bakılmasını zorunlu hale getirmiştir (124).
Tablo 3: HBV-DNA, HBeAg ve Anti-HBe serolojik profilinin yorumu
HBV DNA HBeAg Anti-HBe Yorum
+ + - Replikasyon mevcut
+ - + Replikasyon mevcut, Muhtemel mutant HBV
+ - - Replikasyon mevcut, Muhtemel mutant HBV
- - + Replikasyon sona ermiş
38
HBeAg pozitif olan annelerde HBV'nun bebeklere geçiş riski % 80-90 kadardır
ve HBV infeksiyonuna yakalanan yenidoğanların % 85-90’ında kronik HBsAg
taşıyıcılığı ve daha sonrada kronik karaciğer hastalığı gelişmektedir (125, 126).
Hastalığın kronikleşmesi karaciğerde viral replikasyonun devam etmesine ve
hastanın immünolojik durumuna bağlıdır. Virusun atılamaması muhtemelen HBV
antijenini tanıyan spesifik T hücre yetersizliğine bağlıdır. Konağın immün cevabı zayıf
ise, karaciğer hasarı oluşmaksızın normal karaciğer fonksiyonu ile birlikte virus
çoğalmaya devam eder ve bu hastalar sağlıklı taşıyıcı olarak isimlendirilir. Hücresel
immün cevabı biraz daha iyi olan hastalarda hepatosellüler nekroz devam eder, fakat
hücresel cevap virusu temizlemek için yetersiz olduğundan hastalık kronik hepatitle
sonuçlanır. Kronik hepatit sıklıkla sessiz bir hastalıktır. Hastaların çoğu akut bir hastalık
dönemi geçirdiğinin farkına varmazlar. Teşhis genellikle donör olarak kan verirken
veya rutin kan taraması sırasında HBsAg pozitif bulunduğu ve serum
transaminazlarında orta derecede yükseklik tespit edildiği zaman konabilir. Semptomlar
karaciğer hasarının ciddiyeti ile korele değildir. Kronik hepatit B de en önemli genel
semptom yorgunluktur. Diğer semptomlar bulantı, üst karın ağrısı, kas ve eklem ağrıları
şeklindedir. Klinik bulgular sarılık, nadiren örümcek nevüs, büyük veya küçük
karaciğer ve splenomegalidir. Ascit ve özefagus varis kanamaları geç ortaya çıkan
portal hipertansiyon belirtileridir. ALT, AST ve gamaglobulin orta derecede
yükselmektedir. Serum bilirubin ve albumini ciddi hastalık dışında normaldir. Serum
transaminazları karaciğerdeki hastalığın ciddiyetini tam olarak yansıtmaz ancak
yaklaşık bir fikir vermesi açısından hafif şiddetde < 100 IU, orta şiddetde 100-400 IU,
ağır şiddetde > 400 IU olarak kullanılmaktadır (127).
Kronikleşme daha çok yenidoğan, homoseksüel, AİDS’li, lösemi ve kanser,
böbrek yetmezliği ve immünsüpressif tedavi alanlar gibi immün sistemi yetersiz olan
hastalarda görülür (8). HBsAg taşıyıcılığı ile kronik hepatit arasındaki ayırım,
karaciğerdeki kronik nekroinflamatuar hastalığın histolojik olarak ortaya konması ile
mümkündür. HBsAg pozitif, serum transaminazları yüksek olan kronik hepatitli bir
hastada immünohistokimyasal yöntemlerle HBsAg ve HBcAg’nin gösterilmesi kesin
teşhis koydurucudur (123).
39
2.8. Ocult Hepatit B İnfeksiyonu
Akut kendini sınırlayan veya kronik infeksiyonda ya da başarılı anti HBV
tedavisi sonrası HBsAg’nin kaybolmasından sonra bazı hastalarda düşük düzeylerde
HBV DNA serum veya karaciğer dokusunda kalabilir. Bu klinik durum ocult, sessiz
veya latent HBV infeksiyonu olarak tanımlanır. Serum HBV DNA düzeyi 104
copya/ml’den düşüktür ve bu düzey HBsAg pozitif kişilerden anlamlı olarak düşüktür
(148, 149).
Ocult hepatit B’li kişilerde HBsAg negatif bulunurken, HBeAg nadiren tesbit
edilebilir düzeylerdedir. Anti-HBs ve anti-HBc değişik oranlarda pozitiftir. % 20 vakada
ise geçirilmiş HBV infeksiyonuna ait tüm markerlar negatiftir (13).
Ocult hepatit B infeksiyonu; kan transfüzyonu, hemodiyaliz ve organ
transplantasyonu sırasında geçişte risk oluşturur. Kriptojenik karaciğer hastalığı, kronik
hepatit B’nin akut ekserbasyonu veya fulminan hepatite neden olabilir. Hepatoselüler
karsinom gelişimiyle ilişkilidir. Kronik hepatit C de hastalık progresyonunu ve tedaviye
yanıtı etkiler.
Ocult HBV infeksiyonu için çeşitli hipotezler ortaya atılmıştır
I- HBV DNA’da mutasyon
II- Kişinin kromozomlarına HBV DNA’nın integrasyonu
III- Periferal kan monomüklear hücrelerin HBV ile infeksiyonu
IV- HBV içeren immün kompleks formasyonu
V- Kişinin immün cevabının değişmesi
VI- HBV’nin diğer viruslarla karışması
Ocult hepatit B, anti-HBc pozitif kişilerde yüksek sıklıkla görülmektedir (19).
Ocult hepatit B’li kişilerde intrahepatik HBV DNA tesbiti, serum HBV DNA
tespitinden sıktır (148, 149). Bu durum karaciğerin HBV replikasyonunda santral olarak
yer almasıyla açıklanabilir. Buna karşın ocult HBV infeksiyonunda serumda HBV DNA
tesbit edilebilirken, intrahepatik olarak tesbit edilemeyebilir. Bu durum ise ya ocult
hepatit B’nin geçiş fazıdır ya da HBV replikasyonu bilinmeyen bir lokalizasyonda
devam etmektedir (150).
40
2.8.1. Ocult Hepatit B İnfeksiyonu ve HBV İnfeksiyonunun Bulaşması
HBsAg negatif kişilerden kan transfüzyonuyla HBV’nun geçiş riski
bilinmektedir. Ocult hepatit B infeksiyonu olan annelerden çocuklara vertikal geçiş;
insan ve woodchuk modellerinde gösterilmiştir (151, 152). Organ transplantasyonunda
HBV bulaşması ve ocult hepatit B’den de nova infeksiyonun yeri vardır. Ocult hepatit B
infeksiyonlu kişilerdeki PBMCS’nin HBV replikasyonunu sürdürmesindeki yeteneği bu
hastalarda recurrent HBV infeksiyon gelişmesinde rezervuar rol oynadığını
düşündürmektedir (148). Ocult hepatit B’li karaciğer donörlerinden HBV infeksiyon
kazanma riski %25- 94 arasındadır (153, 154, 155). Ocult hepatit B prevalansı
hemodiyaliz hastalarında %14-19 arasındadır (156, 157). HBV infeksiyonunu ocult
HBV’li böbrek donörlerinden kazanma riski, karaciğer donörlerinden kazanmaya göre
daha azdır (158). Kemik iliği transplantasyonu sonrası HBV kazanma riski düşüktür,
ama yinede bazen latent enfeksiyonun reaktivasyonu ve fulminant hepatite yol açabilir
(159).
2.9. HBV İnfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Akut viral hepatit B’yi klinik olarak diğer hepatitlerden ayırmak güçtür ve
tanısı spesifik serolojik testlerle konulmalıdır.
HBsAg/Anti-HBs sistemi: HBV ile temastan 1-12 hafta sonra veya
semptomların başlangıcından 2-8 hafta önce inkübasyon peryodu boyunca HBsAg
serumda saptanır ve 3 ay sonra kaybolur (6, 7, 8). HBsAg’nin belirmesinden ortalama
dört hafta sonra klinik hepatit tablosu oluşmaktadır. Belirtilerle birlikte serumda
HBeAg, DNA polimeraz ve HBV DNA saptanabilmektedir (128).
HBsAg’nin 3 aydan daha uzun süre sebat etmesi kronik hepatit B infeksiyonu
gelişeceğini işaret etmektedir. Yetişkinlerin % 95’inde HBsAg kaybolur, % 5’inde
Kronik HBsAg taşıyıcılığı oluşur. Kronik HBsAg taşıyıcılığı, infekte olan
yenidoğanlarda % 90, bebeklerde % 50 ve çocuklarda % 20 oranlarında
gerçekleşmektedir (7, 9, 127).
Anti-HBs, HBsAg kaybolduktan sonra ve genellikle hastalığın başlangıcından
3 ay sonra ortaya çıkar, iyileşmeyi ve immüniteyi gösterir (akut dönemde anti-HBs
oluşmakta fakat antijen fazlalığı nedeniyle rutin testler ile bu dönemde tespit
41
edilememektedir). Anti-HBs çoğu kişilerde hayat boyu kalıcıdır. Anti-HBs ile birlikte
Anti-HBcIgG pozitifliği doğal immüniteyi, sadece Anti-HBs pozitifliği aşılama ile
oluşan koruyuculuğu gösterir. İmmunkompleks formasyonu ile birlikte artrit ve raş
gelişen hastaların % 10-20’sinde klinik hepatit bulguları başlamadan önce ve antijenemi
esnasında anti-HBs ortaya çıktığı gösterilmiştir. Ayrıca HBsAg taşıyıcılarının % 10-
40’ında düşük titrede anti-HBs olabilir. Bu durumun mekanizması muhtemelen farklı
subtiplerle aynı zamanda infeksiyon olmasına bağlanmaktadır (6, 7, 8, 9, 34, 128).
HBcAg/Anti-HBc sistemi: HBcAg’nin serumda saptanması oldukça güçtür.
Bu nedenle kor bölgesiyle ilgili pratik önemi olan tek gösterge Anti-HBc antikorlarıdır.
Anti-HBcIgM ve IgG semptomların başlamasıyla ortaya çıkar, IgM birkaç ay pozitif
kalır ve hastalığın başlangıcından 4-8 ay sonra serumda tespit edilemez. HBsAg’nin
serumdan kaybolup anti-HBs oluşuncaya kadar geçen pencere döneminde Anti-
HBcIgM’in varlığı akut infeksiyonu gösteren en önemli markerdir. Anti-HBcIgM’in
sebat etmesi hastalığın kronikleşeceğinin işaretidir. Anti-HBcIgM kronik HBV
infeksiyonunda düşük titrede bulunur. Anti-HBcIgM’in 7-8S formunun kronik HBV
infeksiyonunda, 19S formunun ise akut infeksiyonda dominant olduğu bidirilmektedir
(6, 7, 8, 9, 129).
HBV’ne maruz kalanlarda Anti-HBcIgG yıllarca veya hayat boyu pozitif
kalabilir. HBsAg taşıyıcılarında Anti-HBcIgG yüksek titrede bulunur. Anti-HBs
olmadan yüksek titrede anti-HBcIgG olması viral infeksiyonun devam ettiğini gösterir.
Anti-HBs ile birlikte Anti-HBcIgG’nin düşük titrelerde bulunması hepatit B
infeksiyonunun çok eskiden geçirildiğini gösterir (8, 9, ).
HBeAg/Anti-HBe sistemi: HBeAg viral replikasyonun devam ettiğini ve
infektiviteyi gösterir, HBsAg’den kısa bir süre sonra pozitifleşir HBsAg’den daha önce
kaybolur. 10 haftadan daha uzun süre devam etmesi infeksiyonun kronikleşeceğinin
belirtisidir. Anti-HBe düşük infektivitenin ve hastalığın tamamen iyileşeceğinin güçlü
bir göstergesidir. Anti-HBe genellikle akut infeksiyondan yıllar sonra kaybolur. HBV-
DNA viral replikasyonun en sensitif göstergesidir. HBsAg varlığında PCR ile serumda
HBV-DNA tespiti viremi düzeyini ortaya koyan en iyi markerdir ve serum transaminaz
düzeyleri ile koreledir (6, 8, 9, 130).
42
Pre-S/Antipre-S sistemi: Son yıllarda yapılan ön çalışmalar pre-S1 ve pre-S2
antijenlerinin varlığının, HBeAg’ye oranla replikasyonun daha kesin göstergeleri olarak
değerlendirilmesine yol açmaktadır. Bu antijenler, HBsAg ile birlikte ortaya çıkmata ve
iyileşme ile sonlanan olgularda, çok daha erken yerlerini antipre-S antikorlarına
bırakmaktadalar. Bu durumda, henüz HBsAg pozitif olgularda saptanan pre-S/antipre-S
serokonversiyonu, kronikleşmenin olmayacağının erken bir göstergesi olarak kabul
edilmektedir. İstanbulda yapılan bir çalışmada da, akut hepatiti B geçiren ve iyileşme ile
sonlanan 34 olguda pre-S antijenlerinin HBsAg’den çok daha erken kaybolduğu
saptanmıştır (131).
Tablo 4: HBV infeksiyonu olan hastalarda tipik serolojik profil
Serolojik test Aşı Akut
HBV Geçirilmiş
HBV Kronik HBV
İnaktif taşıyıcı
Ocult HBV
Anti-HBs + - + - - -/+ Anti-HBc - + + + + -/+ Anti-HBe - - + - + -/+ HBsAg - + - + + - HBeAg - + - + - -/+ HBV DNA - + - + + +
Tablo 5: HBV infeksiyonlarının serolojik tanısında karşılaşılan olağan dışı profiller
Tek başına HBsAg pozitifliği
HBV varyantının varlığı
Anti-HBc antikorlarının oluşmamasına neden olan immun defektin varlığı
Tek başına Anti-HBc pozitifliği
Yalancı pozitiflik
Pencere dönemi
Hümoral yanıtta bozukluk
Anti-HBc antikorlarının anneden bebeğe pasif olarak aktarılması
Tek başına anti-HBs pozitifliği
Aşılama
Hiperimmunglobulin
Kan ve kan ürünlerinin tranfüzyonu
HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitifliği
Hemodiyaliz hastalarında
Asemptomatik damar içi uyuşturucu kullananlarda
Anti-HBs pozitifliğinin yerini HBsAg pozitifliğine bırakması
HBV-DNA’nın hücrelerde saklı kalması ve uygun ortam bulduğunda tekrar ortaya çıkması (38).
43
Şekil 6: Akut HBV infeksiyonunun seyri
Şekil 7: Kronik HBV infeksiyonunun seyri
44
2.10. HBV İnfeksiyonlarının Moleküler Tanısı
HBV infeksiyonunda, replikasyonun göstergesi olan HBV DNA’nın
gösterilmesi son yıllarda gittikçe önem kazanmıştır. Bu yöntemler başlıca; viral yükün
belirlenmesinde, serolojik testlerin yetersiz kaldığı durumlarda tanıya ulaşmada, anti
viral tedavinin izlenmesinde, çeşitli mutasyonların araştırılmasında veya hepatosellüler
karsinoma oluşum mekanizmasının aydınlatılmasında kullanılmaktadır. Bu amaçla
kullanılan yöntemler, hibridizasyon ve nükleik asit amplifikasyon yöntemleri olarak iki
başlık altında toplanabilir (132).
2.10.1. Hibridizasyon Yöntemleri
Hibridizasyon, birbirine uyumlu şifreye sahip iki molekülün özgül olarak
birleşmesi anlamına gelir. Hibridizasyon yöntemlerinde, DNA veya RNA’dan
oluşturulmuş, çeşitli enzimler, antijenler, kemiluminesan bileşikler ya da
radyoizotoplarla işaretlenmiş ve aranan hedef nükleik aside özgüllükle bağlanan dizilere
sahip problar kullanılır. HBV DNA’nın serumda gösterilmesi için kullanılan slot
hibridizasyon yönteminde duyarlılık sınırı 10–500 pg/ml, (1 pg/ml yaklaşık 105
kopya/ml’ye eşdeğerdir) likit faz hibridizasyon yönteminde ise yaklaşık 1,6–5 pg/ml’dir
(133).
2.10.2. Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri
Kary Mullis’in 1985 yılında, temel dinamiklerini hayal edip tasarladığı ve
hasta örneğinde az sayıda bulunan “etkene özgü nükleik asitlerin (DNA/RNA) in-vitro
çoğaltılarak saptanması” esasına dayanan PCR (Polymerase Chain Reaction =
Polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi, son yıllarda yaygın olarak kullanılmaya başlanan
bir moleküler biyoloji uygulamasıdır (134, 135, 136).
PCR bilinen en eski amplifikasyon yöntemlerinden birisidir. HBV DNA’nın
belirlenmesinde en özgül ve en duyarlı yöntem PCR yöntemidir. Bu yöntemle çok
düşük miktarlarda HBV DNA (10-50 kopya/ml) tespit edilebilmektedir (133). Diğer
taraftan hibridizasyon tekniğinde tespit edilebilen 1 pg/mL, yaklaşık 105 kopya/ml’ye
tekabül eder. Hibridizasyon tekniği duyarlılığının fazla olmaması nedeniyle, tanı koyma
ve tedavi takibinde kullanımı sınırlıdır (38) .
45
2.10.2.1. PCR Uygulamasındaki Temel Aşamalar
PCR uygulanacak olan hasta örneği (serum, balgam, bronkoalveolar lavaj,
idrar, mide suyu, biyopsi materyali, kemik iliği aspiratı, BOS, parafin blok) uygun
koşullarda alındıktan sonra sırasıyla aşağıdaki aşamalardan geçirilir.
1-Ekstraksiyon aşaması: PCR uygulamasına geçilmeden önce, incelenen hasta
örneğinde var olduğu düşünülen DNA/ RNA‘nın ekstrakte edilerek yoğunlaştırılması
gereklidir. Ekstraksiyon için, fenol ve kloroform gibi çeşitli organik çözücüler ve etanol
kullanılır (137). Ancak son yıllarda NaI ve N-loril sarkozinat gibi madelerin kullanıldığı
teknikler, ya da RNAzol veya IsoQuick gibi ticari reaktiflerin kullanıldığı yöntemler de
geliştirilmiştir (138, 139).
2-Master-Mix Aşaması: DNA/RNA ektraksiyonundan sonraki amaç,
elimizdeki nükleik asidi çoğaltmak ve saptanabilir düzeye getirmektir. DNA’nın
sentezlenebilmesi ve çoğaltılabilmesi için, bir arada bulunması zorunlu olan bazı yapı
taşları vardır. Bu elemanlar:
*Sentez için kalıp görevi görecek olan DNA molekülü( ekstraksiyon ürünü),
*DNA molekülünün komplementer zinciri sentezlemek için gerekli “primer”
adını verdiğimiz ve aranılan DNA’ nın küçük bir bölümüne spesifik olan oligonükleotid
dizisi,
*Sentezi gerçekleştirilecek olan ‘ Taq DNA polimeraz’ enzimi
*Yeni zincire eklenecek olan çeşitli nükleotidler (dNTP: DATP, dGTP, dTTP,
dCTP).
3-Amplifikasyon (çoğaltma) aşaması: Bu aşamada neler olup bittiğini
anlamamız için DNA’ nın nasıl replike olduğunu hatırlamamız yeterlidir. DNA
replikasyonu sırasında, önce iki zincir birbirinden ayrılır; sonra zincirlerin her birisi
kalıp olarak kullanılarak, DNA polimeraz enzimi yardımıyla ortamdaki nükleotidler
birbirlerine eklenerek eski zincirlerin birer kopyası yapılır. PCR’ da sentez ve çoğalma,
ısı ve zaman ayarlı “Thermal cycler” adı verilen otomatik cihazlar kullanılarak
birbirini izleyen 3 aşamanın tekrarlayan siklusları ile gerçekleştirilir (140, 141, 142).
46
I-Denatürasyon: DNA molekülünün iki zinciri birbirlerine hidrojen bağları ile
tutunmuşlardır. Isı 92-94 °C‘ye programlanarak bu bağlar koparılır ve iki zincir
birbirinden ayrılır.
II-Bağlanma (annealing): Isının aniden düşürülmesi ile (37-65°C), ortama
eklenmiş olan “primerler” sadece aranan DNA’ nın özgün bölgelerine bağlanırlar.
III. Uzama (Extension): Isının tekrar 72 C’ye yükseltilmesi ile Taq DNA
polimeraz adı verilen ve ısıya dayanıklı bir bakteri olan Thermus aquaticus’dan elde
edilmiş DNA polimerazın yardımı ile ortama eklenmiş olan nükleotidler kullanılarak
yeni zincir sentezi gerçekleşir.
Bu 3 aşamadan meydana gelen tek bir siklus 40 kez tekrarlandığında,
başlangıçta tek bir adet olan DNA molekülü reaksiyon sonunda 240 kez arttırılmış olur.
4-Saptama ve Analiz: Yukarıda kısaca açıklanan biçimde çoğaltılan DNA
molekülü daha sonra, DNA agaroz jel elektroforezi yapılarak ayrılır ve Ethidyum
bromür ile boyanarak, UV transilluminatörde incelenerek değerlendirilir. Son yıllarda
PCR ürünlerinin miktar tayinlerinde de kullanılan ELISA uygulamaları ile (biotin-
streptovidin sistemi) ürünlerin incelenmesi işlemi yapılmaktadır (134).
Ayrıca, PCR uygulaması sırasında florösan maddeler kullanılarak hedef
ürünlerin kantitatif olarak miktarlarının belirlenmesi sağlanabilmektedir. PCR florösan
boya ile uygulanılırsa, çift zincirli DNA varlığında florösan daha güçlü boyanır ve DNA
çoğaltılması uygun optik ve görüntüleme sistemleri kullanılarak eş zamanlı monitorize
edilebilir. PCR işleminin tamamlanmasından sonra elde edilen görüntüler analiz
edilerek çoğalma oranı gösterilebilir. Standartlar gibi kantite edilmiş DNA örnekleri ile
aynı anda bilinmeyen orijinal örnekler çalışılırsa, bilinmeyen örneklerin kalıp miktarı
saptanabilmektedir.
2.10.3. HBV-DNA Testinin Amaca Uygun Kullanımı
1. HBsAg negatif HBV infeksiyonunun tanısı: Kan/organ donörlerinin
taranması veya gizli (okült) HBV infeksiyonu tanısı amacını taşır (143).
2. HBV infeksiyonun evrelendirilmesi: Kronik HBV infeksiyonu ile inaktif
HBsAg taşıyıcılığının ayırd edilebilmesinde diğer faktörlerin (HBeAg veya anti-HBe
47
varlığı, ALT/AST düzeyi, karaciğer biyopsisi) yanısıra serum HBV-DNA miktarı da
anlamlıdır (144).
3. Tedavi başarısının izlenmesi: Kronik HBV infeksiyonu tedavisinde ana
hedeflerden biri HBV replikasyonunu baskılamak olduğu için kantitatif HBV-DNA
izlemi önemlidir. Antiviral tedavi ile viral yükün hızlı ve etkin düşürülmesi, başarı
şansını arttırmaktadır (145, 146).
4. cccDNA’nın saptanması ve kantitasyonu: Özgüllük ve standardizasyon
sorunları nedeniyle yöntemin kullanımı sınırlı ve genellikle araştırma amaçlıdır (147).
Şekil 8: Viral Hepatit B’de serolojik-moleküler tanı
48
2.11. Tedavi
2.11.1. Kronik Hepatit B’de İnterferon Tedavisi
1970’lerden beri denenen ve üzerinde en çok araştırma yapılan ajanlardan
interferon (IFN) alfa2b kronik hepatit B’de kullanım için onay alan ilk ilaçtır (160). IFN
tedavisi için en uygun zaman, replikasyon döneminin immunaktivasyon fazıdır. Yani
amaç; II. fazdan III. faza geçişi önlemek, replikatif virusu hepatositlerden
temizlemektir. IFN’dan öncelikle beklenen etki, viral replikasyonu inhibe ederek
progressiv karaciğer harabiyetini durdurmak olmalıdır (35, 161, 162).
2.11.2. Akut Hepatit B’de İnterferon Tedavisi
Akut hepatit B’de az sayıda çalışmada IFN denenmiştir. Bununla beraber akut
hepatit B’de IFN tedavisi gereksiz ve faydasız kabul edilmektedir (163).
2.11.3. İnterferon Dışı Tedaviler
İmmünomodülatör ilaçlar:
1- Kortikosteroidler,
2- Timozin alfa–1,
3-Diğer immünomodülatör ilaçlar:
Levamizol,
IFN beta ve IFN gama,
İnterlökin–2,
Koloni stimüle edici faktörler (164).
4-Nükleozid Analogları: HBV, RNA virusları gibi “reverse transcriptase”
enzimi sayesinde RNA’dan DNA sentezi yapabilmektedir. Bu enzimi inhibe eden pek
çok ilaç son yıllarda kronik HBV infeksiyonunda denenmeye başlanmıştır. Bugün için
kronik B hepatiti tedavisinde en çok ümit verici görünen lamivudin ve famsiklovirdir
(165).
49
2.12. Korunma
Pasif immünizasyon: Pasif olarak aktarılan Anti-HBs antikorlarının akut
hepatit B gelişmesini önlemesi gereğine dayanarak HBV ile temastan sonra kısa süre
içinde yüksek titrede Anti-HBs içeren hepatit B hiperimmünoglobilini (HBIG)
uygulanması infeksiyondan korunmada etkili olmaktadır. HBV ile karşılaşma
sonrasında HBV aşısı ile birlikte uygulanan HBIG, HBsAg pozitif annelerin
bebeklerinin korunmasında, HBsAg pozitif kan veya vücut sıvılarıyla perkutan veya
mukozal temaslıların korunmasında ve HBsAg pozitif kişi ile cinsel temaslıların
korunmasında etkili olmaktadır. HBIG karaciğer nakli sonrasında HBV infeksiyonu
rekürrensini önlemek için uzun süre uygulanmaktadır (4, 45).
Aktif immünizasyon: İlk geliştirilen aşılar HBV taşıyıcılarının plazma
örneklerinden saflaştırılmış HBsAg içermekteydi. Daha sonra gen teknolojisi
kullanılarak, HBsAg kodlayan genin maya veya memeli hücrelerine transfeksiyonu
yoluyla elde edilen saflaştırılmış HBsAg rekombinant aşılar geliştirildi. HBV aşısının
etkinliği Anti-HBs gelişmesi ile izlenebilmektedir. Temas öncesi aktif bağışıklamada
hepatit B aşısı tüm yenidoğan ve infantlara, daha önce aşılanmamış çocuk ve
adolesanlara, yüksek risk grubunda olan erişkinlere önerilir (166, 167).
Aşılamada 0, 1, 6. aylarda uygulanan üç dozlu şema genellikle
kullanılmaktadır. Rekombinant aşının üç doz kas içi uygulanması sonucu % 95-99’unda
koruyucu düzeyde antikor oluşur. Primer aşılama şemasından sonra 10 IU/ml üzerindeki
Anti-HBs yanıtı veren kişilerde klinik hastalık ve kronik infeksiyona karşı tam koruma
sağlanmaktadır. Anti-HBs düzeyi aşıdan sonra 6 ay içinde ölçülen en yüksek antikor
düzeyi ile ilişkilidir. 1000 mıu üzerindeki antikor yanıtı saptananlar 5 yıldan daha uzun
süre korunmaktadır. Çocuklar ve adolesanlar daha yüksek antikor yanıtı oluşturdukları
için, uygun antikor düzeyi erişkinlere göre daha uzun süre devam etmektedir. Anti-HBs
yaklaşık 5 yıl sonra koruyucu düzeyin altına inmiş olsa bile, aşılama sonrası
immünolojik bellek geliştiğinden HBV ile karşılaşıldığında anamnestik yanıt
verilmektedir eğer bu dönemde tek doz aşı yapılırsa bu yanıt daha da artmaktadır, rapel
doza gerek yoktur (45, 168). HBsAg pozitif annelerin bebeklerinde HBIG ile birlikte
HBV aşısının uygulanması ile %79–98 oranında korunma sağlanabilmektedir (45).
50
3. MATERYAL VE METOD
Şubat 2007 –Mayıs 2007 tarihleri arasında Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp
Fakültesi Hastanesi Kan Merkezi’ne başvuran 18-65 yaş arası 2500 HBsAg negatif kan
donörünün 401 tanesinde anti-HBc pozitif olarak bulundu. Bunlardan “anti-HBs negatif
45 donör (bunların 36’sı salt anti-HBc pozitif donör), “anti-HBs pozitif/anti-HBe
pozitif’ 116 donör ve “anti-HBs pozitif/HBeAg pozitif 8 donör, HBV DNA araştırılması
için çalışmaya alındı. Bu donörlerin hepsi aynı zamanda anti-HCV ve HIV negatifti.
HBV DNA PCR
DNA ekstraksiyonu: Sacace Biotechnologies HBV Real-TM Quant kiti
(Caserta, Italy) kullanılarak uygulandı. Uygulaması;
• İzolasyona başlanmadan önce bütün serumlar oda sıcaklığına getirildi
• Lizis solusyonu ve Yıkama solusyonu 60–65 0C‘ye kadar buz kıristalleri
kaybolana kadar ısıtıldı
• % 70 lik etanol hazırlandı
• İki tüp ekstraksiyonun pozitif kontrolu ve bir tüpte negatif kontrolü olacak
şekilde gerekli miktarda 1,5 ml’lik epandorf tüplerini hazırlandı
• Örnek ve kontrollerden oluşan 12 numunelik her bir grup için bir lizis
solusyonu şişesine 65 µl internal control (İC) eklendi ve 10-15 kez ters
çevirmek suretiyle iyice karıştırıldı.
• Erimiş numuneler 5 saniye kadar vortekslendi
• Etiketli tüplerin her birine 450 µl IC’ li Lizis solusyonu eklendi
• Tüplere 100 µl serum kondu
• Kontroller aşağıdaki gibi hazırlandı
Cneg etiketli tüpe 100 µl C- (Negative Control) eklendi
Cpos1 etiketli tüpe 90 µl C -(Negative Control) ve 10 µl HBV Rec Pos1
eklendi
51
Cpos2 etiketli tüpe 90 µl C -(Negative Control) ve 10 µl HBV Rec Pos2
eklendi
• Tüpler vortekslendi ve 7-10 saniye kadar santrifüj edildi
• Sorbent kuvvetlice vortekslendi ve her tüpe 25 µl eklendi
• Bütün tüpler 5-7 saniye kadar vortekslendi ve oda ısısında 10 dk inkübe
edildi. Belli aralıklarla vortekslendi
• Bütün tüpler 1 dk 10000 g de santrifüj edildi ve pellet karıştırılmadan,
pipet kullanarak dikkatlice süpernatant uzaklaştırıldı ve atıldı. Her tüp için
ayrı uç kullanıldı.
• Her tüpe 500 µl yıkama solusyonu eklendi. Kuvvetlice vortekslendi ve 1
dk 10000 g de santrifüj edildi ve pellet karıştırılmadan, pipet kullanarak
dikkatlice süpernatant uzaklaştırıldı ve atıldı. Her tüp için ayrı uç
kullanıldı.
• Her tupe %70 lik etanolden 500 µl eklendi. Kuvvetlice vortekslendi ve 1
dk 10000 g de santrifüj edildi ve pellet karıştırılmadan, pipet kullanarak
dikkatlice süpernatant uzaklaştırıldı ve atıldı. Her tüp için ayrı uç
kullanıldı. Bu basamaktaki işlemler bir defa tekrarlandı.
• Her tüpe 500 µl Acetone eklendi. Kuvvetlice vortekslendi ve 1 dk 10000 g
de santrifüj edildi ve pellet karıştırılmadan, pipet kullanarak dikkatlice
süpernatant uzaklaştırıldı ve atıldı. Her tüp için ayrı uç kullanıldı.
• Bütün tüpler kapağı açık olarak 10 dk 56 0C de inkübe edildi.
• Pellet 50 µl DEPC-H2O ile sulandırıldı. 56 0C de 10 dk inkube edildi ve
periodik olarak vortekslendi. Tüpler 2 dk 16000 g de santrifuj edildi.
Süpernatant amplifikasyona hazır DNA içermekteydi.
Reaksiyon Miksinin Hazırlanması
Reaksiyon miksinde HBV DNA’nın X-GENE bölgesiden elde edilen primerler
ve prob kullanıldı.
52
• Bir set reagent eritildi, vortekslendi ve kısaca santrifüj edildi. 0.2 ml’lik
tüpler hazırlandı.
• PCR-mix 1 tm tüpüne, 200 µl PCR mix 2 tm ve 20 µl hot start DNA
polimeraz eklendi.
• Her tüpe 25 µl Reaksiyon miksi konuldu
• Ekstrakte edilmiş DNA örneklerinden 25 µl, reaksiyon miksi içeren tüplere
konuldu ve pipetleyerek karıştırıldı.
• 6 standart ve 1 negatif kontrol aşağıdaki gibi hazırlandı
a. Quantitation Standart HBV(QS1 HBV, QS2 HBV, QS3 HBV) den 25
µl, 3 tüpe eklendi
b. Quantitation Standart IC (QS1 IC, QS2 IC, QS3 IC) den 25 µl, 3 tüpe
eklendi.
• 25 µl TE-buffer negatif kontrol tüpü olarak yazılan tüpe eklendi
Amplifikasyon ve Deteksiyon
Tüplerin üstü kapatılarak iQ5 Real Time PCR Detection System (BIO-RAD)
cihazına yerleştirildi. 15 dk 95 0C de bekletildikten sonra 20 sn 95 0C ve 1 dk 60 0C den
oluşan siklustan 42 tekrar yapılacak şekilde programlandı. Bu program yardımıyla
Amplikasyon ve Deteksiyon otomatik olarak yapıldı
Değerlendirme
Herbir kontrol ve hasta numunesi için HBV DNA konsantrasyonu aşağıdaki
formül kullanılarak hesaplandı:
*katsayı her bir lot için özeldir ve bizim kitimizde 2.4 x 105 dir.
HBV Real-TM Quant iQ, 5 x 102 kopya/ml’den 1 x 108 kopya/ml’ye lineerdir.
100.000.000 kopya/ml’den daha büyük test sonuçları testin ölçme kapasitesinin üst
sınırının üzerindedir ve “100.000.000 kopya/ml’den daha büyük “ olarak bildirildi. 500
53
kopya/ml’den daha düşük test sonuçları testin ölçme kapasitesinin alt sınırının
aşağısındadır ve 500 kopya/ml’den daha düşük” olarak bildirildi.
Amplikasyon ve deteksiyon sonucunda 0 kopya/ml olan sonuçlar negatif, 500
kopya/ml’nin altındaki sonuçlar düşük pozitif, 500 kopya/ml ile 100.000.000 kopya/ml
arasındaki sonuçlar pozitif, 100.000.000 kopya/ml üstündeki sonuçlar yüksek pozitif
olarak değerlendirildi
54
4. BULGULAR
Kan Merkezine başvuran yaş ortalaması 37,9 ve 117’si bayan olan 2500
HBsAg (-) olan kan donörü araştırıldı. 401(%16,4) donörde anti-HBc total (+) bulundu.
Anti-HBc total (+) olarak bulunan donörlerin 356’sında anti-HBs (+) olarak belirlendi.
Anti-HBs (+) olan donörlerin 116’sında anti-HBe (+)/HBeAg (-),8’inde ise anti-HBe (-)
/HBeAg (+) olarak tespit edildi. Anti-HBc total (+) olarak bulunan 45 donörde ise
anti-HBs (-) olarak bulundu ve bu donörler “İzole anti-HBc pozitifliği” olarak;
anti-HBe/HBeAg (-) bulunan 36 donör ise “Salt anti-HBc pozitifliği” olarak
değerlendirildi. Salt anti-HBc pozitifliği olan donörlerde anti-HBc total hariç diğer
serolojik belirteçlerin hepsi (HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe) negatifdi. (Tablo 6)
Tablo 6: HBsAg negatif donörlerde Anti-HBs, Anti-HBc, Anti-HBe, HBeAg
durmları ve HBV DNA pozitiflikleri
55
İzole anti-HBc pozitif 45 donörün 3(%6,6)’ünde, salt anti-HBc pozitif 36
donörün 2 (%5,5)’sinde HBV DNA pozitif bulundu. Anti-HBs pozitif 124 donörün
32(%25,8)’sinde HBV DNA tespit edildi. Anti-HBs pozitif 124 donör daha ayrıntılı
olarak değerlendirildiğinde 116’sı anti-HBe pozitif olup 29(%25)’unda, 8’i HBeAg
pozitif olup 3(%37,5)’ünde HBV DNA tespit edildi. Anti-HBe pozitif 125 donörün
30(%24)’unda HBV DNA tespit edilirken HBeAg negatif 161 donörün 32(%19,8)’sinde
HBV DNA tespit edildi. HBV DNA araştırılan toplam 169 HBsAg negatif donörün
35(%20,7)’inde HBV DNA pozitif olarak bulundu. (Tablo 7)
Tablo 7: Serolojik profillerine göre HBV DNA oranları
HBV DNA (+)
n %
İzole Anti-HBc (+) n=45 3 6,6
Salt Anti-HBc (+) n=36 2 5,5
Anti-HBs (+) n=124 32 25,8
Anti-HBs (+)/anti-HBe (+) n=116 29 25
Anti-HBs (+)/HBeAg (+) n=8 3 37,5
Anti-HBe (+) n=125 30 24
HBeAg (-) n=161 32 19,8
HBsAg (-) n=169 35 20,7
HBV DNA tespit edilen 35 donörde HBeAg (-), HBeAg (+) ve anti-HBe
(+)’lik oranları sırası ile %91,4 , %8,5 ve 85,7 olarak tespit edildi. (Tablo 8)
Tablo 8: HBV DNA pozitif olanlarda HBeAg ve Anti-HBe oranları
HBV DNA ( n=35)
(+) %
HBeAg (-) 32 91,4
HBeAg (+) 3 8,5
Anti-HBe (+) 30 85,7
56
Tablo 9: HBV DNA pozitif serumların serolojik profilleri ve viral yük miktarı
Donör No: Anti-HBs Anti-HBe HBeAg HBV DNA (kopya/ml)
1579 Negatif Negatif Negatif 7,42x105 2491 Negatif Negatif Negatif <500 21 Negatif Pozitif Negatif 7,87x106 1317 Pozitif Pozitif Negatif 9,38x102 1347 Pozitif Pozitif Negatif 9,90x105 316 Pozitif Pozitif Negatif 8,00x105 2042 Pozitif Pozitif Negatif 8,06x105 1894 Pozitif Pozitif Negatif 6,81x105 1323 Pozitif Pozitif Negatif 5,45x105 1780 Pozitif Pozitif Negatif 1,08x106 1739 Pozitif Pozitif Negatif 7,13x105 1781 Pozitif Pozitif Negatif 5,82x105 1722 Pozitif Pozitif Negatif 5,32x105 1271 Pozitif Pozitif Negatif 7,36x105 1737 Pozitif Pozitif Negatif 6,19x105 334 Pozitif Pozitif Negatif 8,63x102 153 Pozitif Pozitif Negatif <500 172 Pozitif Pozitif Negatif 8,43x102 1041 Pozitif Pozitif Negatif <500 798 Pozitif Pozitif Negatif 2,74x105 1590 Pozitif Pozitif Negatif 7,18x102 1440 Pozitif Pozitif Negatif 6,02x105 139 Pozitif Pozitif Negatif <500 597 Pozitif Pozitif Negatif <500 1097 Pozitif Pozitif Negatif 9,33x105 1358 Pozitif Pozitif Negatif 5,21x105 1325 Pozitif Pozitif Negatif 6,96x105 35 Pozitif Pozitif Negatif 6,81x105 1709 Pozitif Pozitif Negatif 4,85x104 134 Pozitif Pozitif Negatif <500 1008 Pozitif Pozitif Negatif 6,44x105 1600 Pozitif Pozitif Negatif 4,43x105 816 Pozitif Negatif Pozitif 6,43x105 1842 Pozitif Negatif Pozitif 1,63x105 1033 Pozitif Negatif Pozitif 1,77x103
57
HBV DNA araştırılan 169 donörün 35’inde HBV DNA tespit edilmiş olup
6’sında viral yük 500 kopya/ml’nin altında, 4’ünde 102, 1’inde 103, 1’inde 104, 21’inde
105, ve 2’sinde 106 kopya/ml viral yük tespit edildi. Hastalar 105 kopya/ml aralığında
yoğunlaşmıştır. 108 kopya/ml’nin üzerinde viral yük tespit edilmedi. (Tablo 10)
Tablo 10: Viral yük miktarına göre HBV DNA pozitiflik oranları
Viral Yük Miktarı
(Kopya/ml) HBV DNA (+)
%
(n= 35)
< 500 6 17,1
102 4 11,4
103 1 2,8
104 1 2,8
105 21 60
106 2 5,7
108 - -
Toplam 35
58
5. TARTIŞMA
HBV infeksiyonun tanısında HBV serolojik testler yaygın olarak
kullanılmaktadır. Hepatit B infeksiyonunun tanısında başta HBsAg olmak üzere
kullanılan serolojik belirteçler çeşitli farklılıklar göstermektedir. 1980’li yıllarda
moleküler biyolojik tekniklerin gelişmesiyle beraber HBV DNA miktarının
belirlenebilmesiyle, özellikle vireminin varlığını saptamada, tanı, prognoz ve tedavide
HBV DNA’nın araştırılması gündeme gelmiştir. Bu sayede bir çok eksik ortadan
kalkmış, partikül sayısı kantitatif olarak ortaya konulmuştur. Bu durum özellikle
HBsAg’nin negatif olduğu kişilerde HBV infeksiyonu tanısının konmasını sağlamıştır.
Atipik HBV serolojik profillerinin varlığında da durumu açıklığa kavuşturabilmek için
HBV DNA testlerinden faydalanılmaktadır (169, 170, 171).
Genel olarak HBV infeksiyonunda infektivite, Dane partiküllerinin
konsantrasyonuna ve bunun yüksekliği ile sıkı korelasyon gösteren HBeAg pozitifliğine
göre yorumlanır (123).
Moleküler tekniklerinin kullanılmaya başlanması ile HBV'una bağlı
hastalıkların patofizyolojisi ile ilgili anlayış çok genişlemiş, mutant suş infeksiyonları
da göz önünde bulundurulduğunda HBV infeksiyonun tanısı ve prognostik takibinde
eldeki serolojik testlerin yetersiz olduğu görülmüştür (172).
HBV DNA, aktif HBV replikasyonun başta HBeAg olmak üzere tüm diğer
serolojik göstergelere göre daha özgül ve duyarlı bir parametre olduğu yapılan
çalışmalarla anlaşılmıştır. Ayrıca hasta serumunda virus partiküllerinin kantitatif olarak
belirlenmesini sağladığından infeksiyonun faz düzeyinde tanımlanmasında HBsAg,
HBeAg, anti-HBcIgM ve HBV DNA polimeraz testlerine göre daha çok fikir verdiği
açıktır. Bunun yanı sıra özellikle alışılmadık HBV serolojik tablolarının da
aydınlatılması ve infeksiyonun prognozunun belirlenmesi kronik hepatit B tedavisinin
etkinliğini izlemede HBV DNA'nın kantitatif belirlenmesinin önemi büyüktür (130,
173).
HBV DNA testleri kullanıma girmeden önceki dönemlerde HBeAg pozitifliği
vireminin göstergesi olarak kabul edilmiştir. Halbuki son yıllarda viral replikasyon
kaybı olmaksızın anti-HBe serokonversiyonu gösteren hastalar tespit edilmiştir. Bu
hastalarda izole edilen HBV DNA’ların incelenmesi prekor/kor geni üzerindeki
59
mutasyonlar ortaya konmuştur. Prekor bölgesinde görülen en önemli mutasyon
HBeAg'nin üretilememesi ile karakterize olan stop kodon oluşumudur. Bu kodonun
oluşumu ile HBeAg sentezlenmemekte fakat virusun replikasyonu devam etmektedir
(1). Prekor/kor mutantları özellikle Akdeniz Avrupa' sı ve Asya' da olmak üzere
dünyada yaygındır. Bu mutantların dünyadaki oranı tam olarak bilinmemektedir.
Araştırmacılar Akdeniz ve Asya'da bu oranın %40-80 arasında olduğunu tahmin
etmektedirler. (174). Örneğin ülkemizde yapılan bir çalışmada %15,3 oranında prekor
mutant virus bulunmuştur (175).
HBV ile temastan 1-12 hafta sonra veya semptomların başlangıcından 2-8 hafta
önce inkübasyon peryodu boyunca HBsAg serumda saptanır ve 3 ay sonra kaybolur (6,
7, 8). Bizim çalışmamızda HBsAg negatif serumlardan 169’unda HBV DNA araştırıldı
ve 35(%20,7) olguda HBV DNA tespit edildi. Bu durum tüm serolojik göstergeleri
negatif olan kişilerin de HBV DNA taşıyabileceğini iddia eden çalışmaları
desteklemektedir (176, 177). Bu durun özellikle serolojik testlerle negatif olarak
bulunan kanların verildiği hastalarda görülen posttransfüzyonel hepatit B tablosuna
açıklık getirmektedir. Örneğin Thiers ve ark. tüm göstergeleri negatif olan klinik
şüpheli 3 serumu şempanzelere inoküle etmiş, sonra deney hayvanlarında infeksiyonun
geliştiği tespit edilmiş ve bu 3 olguda bir zaman aralığı sonucunda sadece HBV DNA
saptamışlardır (176).
Genel olarak akut ve kronik hepatit tablosu gösterip HBV göstergeleri negatif
bulunan olguların çoğunda PCR tekniği ile yapılan araştırmalarda HBV DNA pozitifliği
elde edilmiş olup, bu duruma DR2 bölgesi ile X gen bölgesinin 3' terminal ucundaki
mutasyonların neden olduğu savunulmuştur (178).
Ülkemizde yapılan çalışmalarda Altındiş (179), HBsAg'si negatif 45 örneğin
2'sinde (%4,4) HBV DNA tespit etmiştir. HBeAg ekspresyonunun saptanabilecek
düzeyin altındaki olgularda, HBeAg negatif prekor mutant infeksiyonlarında ve immün
yetmezlikli olgularda HBV DNA tespit edilebileceğinden söz etmiştir. Dündar ve ark.
(234), çalışmalarında 449 HBsAg negatif olgunun 31' inde (%6,9) HBV DNA
saptadıklarını bildirmişlerdir.
Farklı bir çalışmada seropozitif ve seronegatif kişilerde hepatit B virus
DNA'sının PCR ile ar araştırılması sonucu 30 kontrol grubu (tüm göstergeleri negatif)
60
serumlarda HBV DNA saptanmazken, anti-HBcIgG dışındaki bütün serolojik
göstergeleri negatif olan 36 örneğin 11'inde (%30,5) HBV DNA tespit edilmiştir (180).
Bizim çalışmamızda da anti-HBcIgG dışında tüm serolojik göstergeleri negatif
olan (salt anti-HBc pozitif) 36 örneğin 2’sinde HBV DNA tespit edilmiştir. Bu durum
ülkemizde yapılan benzer çalışmalarla paralellik göstermektedir.
Araştırmacılar, bazen HBsAg'nin saptanmayacak düzeyde olduğu kronik
infeksiyonların söz konusu olabileceğini bildirmişlerdir. Pekbay ve ark. (181), 59
HBsAg'si negatif serumlardan 1’inde (%1,7) HBV DNA pozitifliği saptamışlardır.
“Bazı durumlarda HBV infeksiyonunun varlığı PCR ile gösterildiği halde tüm serolojik
göstergeler negatif olabilmektedir” yorumunu yapmıştırlar. Araştırmacılar literatür
bilgilerine dayanarak, bu olgunun mutant suş infeksiyonlarında olabileceğini
bildirmişlerdir.
Yücesoy ve ark. (182), tüm göstergeleri negatif 10 olguda 10 pg/ml (106
kopya/ml) üzerinde HBV DNA'yı saptadıkları bir çalışmada, günümüzde kullanılan
serolojik testlerden ve mutant suş infeksiyonlarından dolayı “klasik serolojik tabloların
görüntüsü bir hayli değişmiştir”, yorumunu yapmışlardır. Hepatit B infeksiyonunun
tanısında ve viral replikasyonun belirlenmesinde serolojik testlerin yetersiz kaldığını ve
HBV DNA'nın HBV'nun replikasyonun en önemli ve güvenilir belirleyicisi olduğunu ve
mutlaka araştırılması gerektiğini vurgulamışlardır.
Başka bir çalışmada tüm hepatit B serolojisi negatif, HBV DNA'nın saptandığı
akut ve kronik hepatit B olguları bildirilmiştir. Bu olguların, virustaki X genini
kodlayan bölgedeki mutasyonlara, pre-C defektif mutasyonlara ve kor geni
mutasyonlara bağlı olabileceğini vurgulamıştır (183).
Bütün bu araştırmalar sonucunde tüm serolojik göstergeleri negatif kişilerin de
HBV taşıyabilecekleri ve bulaştırıcı olabilecekleri akla getirilmelidir.
HBV replikasiyonun sonlanması, serumda HBV DNA'sının kaybolması ve
anti-HBs antikorlarının oluşumu ile karakterizedir. Fakat bazı çalışmalarda anti-
HBs'lerin varlığında da HBV DNA pozitif bulunmuştur. Michalak ve ark. (184),
yaptıkları çalışmada HBsAg'nin kaybolup anti-HBs'nin oluştuğu ve karaciğer
enzimlerinin normalleştiği tüm akut hepatit B olgularında virolojik temizlenmenin her
zaman tam olmadığını belirtmişlerdir. Çalışmada klinik biyokimyasal ve serolojik
61
iyileşme bulguları olan dört olguda 70 ay sonra bile serum ve mononükleer hücrelerde
HBV DNA varlığı göstermişlerdir. Buna göre akut viral hepatit olguları serolojik ve
klinik olarak iyileşmiş olsalar bile 5 yıldan fazla bir süre mononükleer hucrelerinde aktif
halde viral genom bulunabilecegini ifade edilmişlerdir. Kato ve ark. (65), beş yıl süre ile
izledikleri ve HBsAg'nin kaybolup anti-HBs'nin oluştuğu kronik hepatit B olgularında
PCR yöntemi ile HBV DNA tespit etmişlerdir. Bu tabloya kılıf geninde ve özellikle
preS bölgesinde meydana gelen bir dizi mutasyonun yol açtığını savunmuşlar ve
HBsAg'nin kaybolup anti-HBs'nin oluştuğu her olguda vireminin sonlanmış olduğunun
söylenemeyeceğini ileri sürmüşlerdir. Ülkemizde Altındiş (179), yaptığı çalışmada anti-
HBs'si pozitif 6 serumdan birinde 1-10 pg/ml (105-106kopya/ml) arasmda HBV DNA
tespit ettiğini bildirmiştir. Çalışmamızda anti-HBs’si pozitif olan 124 serum örneğinde
HBV DNA araştırıldı ve 32(%25,8) olguda HBV DNA tespit edildi.
Bütün bu çalışmalar sonucunda bazı olgularda anti-HBs varlığında bile HBV
DNA’nın tespit edilebileceği görülmüştür.
HBV ile ilgili üzerinde durulan ve araştırmacıların dikkatini çeken bir diğer
konu ise HBsAg ve anti-HBs’nin negatif, anti-HBc’nin pozitif olduğu ve izole anti-HBc
olarak adlandırılan (185) olgulardır. Özellikle HBsAg'nin negatif olduğu olgularda
HBV DNA'nın saptanmış olması kan donörlerinde izole anti-HBc pozitifliğinin
araştırılması gerekliliğini ortaya koymuştur. Bundan dolayı izole anti-HBc pozitifliği
birçok ülkede donör tarama kriterleri arasına girmiştir ve pozitif saptanan kişiler donör
olarak kabul edilmemektedirler (186). Donörlerde anti-HBc içeren kanlar ile
infeksiyonun bulaşma oranının %14 olduğu bildirilmiştir (187).
Diğer bir çalışmada da karaciğer transplantasyonu adaylarında HBsAg ve anti-
HBs negatif, anti-HBc total pozitif hastaların karaciğer iğne biyopsilerinin %8,2’sinde
HBV DNA pozitif bulunmuş ve anti-HBc pozitifliğinin red sebebi olması gerektiği
bildirilmiştir (188).
Tunus’tan bildirilen bir çalışmada, izole anti-HBc prevalansı %2,8 iken,
İrlanda’da bu oran %0,51, Almanya’da mahkumlar arasında yapılan bir çalışmada ise
%19,2 olarak bildirilmektedir (189, 190, 191). Ülkemizde yapılan çalışmaları
incelediğimizde, Özacar ve arkadaşları bu oranı %3,23 Mert ve arkadaşları ise %5
olarak saptamışlardır (185, 192).
62
Çalışmamızda 2500 HBsAg negatif donörün 45(%1,8)’inde izole anti-HBc
pozitif olarak tespit edildi. Bu oran ülkenizde yapılan çalışmalarla paralellik
göstermektedir. 45 izole anti-HBc pozitif serumun da 3‘ünde HBV DNA pozitif tespit
edildi.
Hepatit B virüsü serolojik göstergelerinden anti-HBc, virüsle karşılaşmayı
gösteren en duyarlı gösterge olmasına rağmen ticari olarak bulunan ve yaygın olarak
kullanılan enzim immunassay (EIA) kitleri ile yalancı pozitiflik oranı oldukça
yüksektir (185).
Yapılan HBV taramaları esnasında saptanan anti-HBc pozitifliğinin çapraz
reaksiyon veren antikorlara mı yoksa virusla karşılaşmaya mı bağlı olduğunun ayırt
edilmesi, özellikle HBV infeksiyon prevalansının yüksek olduğu ülkelerde önem
taşımaktadır. İzole anti-HBc pozitifliği değişik nedenlerden kaynaklanabilir. Yalancı
pozitiflik izole anti-HBc pozitifliğinin %60–70 nedenini oluşturur. Yalancı pozitifliklere
hepatit C infeksiyonu ve HIV infeksiyonlu olgularda sık rastlarır. Bunun yanı sıra
romatoid artritte oluşan IgM yapısındaki antikorlar ve oto antikorlardan ANA
(antintikleer antikor)' nın özellikle anti-HBc'nin yalancı pozitifliği ile sonuçlanan çapraz
reaksiyonlara neden olduğu birçok çalışmada bildirilmiştir (186). Örneğin Şanlıdağ
yaptığı çalışmada (193), 2500 serum örneğinin 57'sinde (%3,8) izole anti-HBc
pozitifliği tespit etmiş ve bu serumların 5'inde (%7,1) anti-HCV, 8'inde (%11,4)
romatoid faktör, 7'sinde ise (%10) ANA pozitifliği saptadığını bildirmiştir.
Hepatit B virusunun düşük derecede endemik olduğu avrupanın birçok
bölümünde izole anti-HBc pozitifliğinin prevalansı % 1-4 civarındadır. Bu bireylerin
yaklaşık % 10’unda PCR ile HBV DNA saptanabilmektedir. Hepatit C koinfeksiyonlu
insanlarda daha yüksek oran (yaklaşık % 35) gözlemlenir. Aynı oran HIV’le infekte
insanlarda % 85’in üzerine ulaşabilmektedir (194).
HBeAg’nin pozitif, Anti-HBe’nin negatif olması viral replikasyonun olduğunu;
HBeAg’nin negatif Anti-HBe’nin pozitif olması replikasyonun sona erdiğini gösterir
(123). Ancak son yıllarda HBV DNA ile ilgili hibridizasyon ve özellikle PCR
çalışmalarının yaygınlaşması HBeAg/Anti-HBe sisteminin güvenilir replikasyon
göstergeleri olarak ele alınmalarında bazı kuşkuların doğmasına yol açmıştır. Örneğin
HBeAg negatif olgularda aktif replikasyonun göstergesi olan DNA’nın bulunması;
63
özellikle PCR gibi duyarlı yöntemlerle anti-HBe pozitif olguların %80’ninde HBV
DNA gösterilmesi ve nihayet HBeAg pozitif bazı olgularda DNA’ya rastlanılmaması,
mutant bir HBV infeksiyonunu gösterir (123, 130, 195).
Bizim çalışmamızda da HBeAg negatif 161 serumun 32 (%19,8)’sinde HBV
DNA tespit edildi. Anti-HBs/anti-HBe pozitif 116 serumun 29 (%25)’unda HBV DNA
tespit edilmiştir. Toplam anti-HBe pozitif 125 serumun da 30 (%24)’unda tespit edilmiş
olup, bizim sonuçlarımız çeşitli yurt dışı çalışmalarda %28- %63 arasında (196, 197) ve
ülkemizde %26,9 olarak bildirilen (198) oranlardan düşüktür.
HBV DNA'nım pozitif olmasının yanında HBeAg'nin negatif ancak anti-HBe
pozitif olgularda olası nedenler şöyle özetlenmiştir (54, 199, 200):
1) Viral genomunda ki prekor mutasyonu ile HBeAg sentezi durur, serumdan
HBeAg kaybolur ancak viral replikasyon sürer,
2) Serumda bulunan inaktif degrade DNA parçacıklarının da amplifiye edilerek
PCR' da HBV DNA pozitif sonuç verebileceğini, bu nedenlerde saptanan HBV
DNA'nın aktif replikasyonun mutlak göstergesi olamayabileceğini vurgulayan
çalışmalar vardır.
Yücesoy ve arkadaşları (198), HBeAg pozitif olgularda %75 oranında HBV
DNA pozitifliği bildirmişlerdir. Makris ve arkadaşları (197), yaptıkları çalışmada
HBeAg pozitif kronik hepatitli hastaların tümünde HBV DNA’yı pozitif saptamışlar.
Zoulim ve arkadaşları (250), çalışmalarında bu oranın %80 olarak bildirirken, PCR
yöntemiyle yapılan çeşitli çalışmalarda da HBV DNA pozitifliği HBeAg pozitif
olgularda %95,2-%100, anti-HBe pozitif olan olguların tümünde HBV DNA’da pozitif
olarak bulunmuştur. Çalışmamızda HBeAg pozitif serumlarda bulduğumuz %37,5 HBV
DNA pozitifliği yukarıdaki çalışmalara oranla düşüktür. Bunun sebebi çalışmaya
aldığımız bireylerin bilinen bir HBV hastası ya da taşıyıcısı olmadığından
kaynaklandığını düşünmekteyiz. Bununla beraber birçok araştırmacı HBV DNA
titresiyle HBeAg pozitifliğinin de paralel olduğunu bildirmişler (196, 197, 198).
Kuştimur ve arkadaşları (201), HBV DNA pozitif serumlardaki HBeAg
pozitiflik oranını % 38,3 olarak bildirmişlerdir. Çalışmamızda HBV DNA tespit edilen
serumların %91,4’si HbeAg negatif, %85,7’i anti-HBe pozitifdir. HBV DNA pozitif
serumlardaki %91,4’lik HBeAg negatifliği ve %85,7’lik anti-HBe pozitifliği dikkat
64
çekicidir. Bunların muhtemel mutasyon olabileceği, sadece HBeAg/anti-HBe serolojik
belirleyicilerinin sonucuna göre tanının konulamayacağı ve tedaviye karar
verilemeyeceğini ortaya koymaktadır.
Moleküler testlerle HBV DNA tayininin yapılamadığı dönemlerde vireminin
göstergesi olarak HBeAg pozitifliği kabul edilmiştir. Fakat moleküler tekniklerdeki
ilerlemeler, serolojik testlerle birlikte HBV DNA’nın HBV viremisinin
değerlendirilmesinde daha anlamlı olduğunu göstermiştir. Bundan dolayı hepatitli
hastaların tanısında, viral replikasyonun belirlenmesinde, tedaviye karar verilmesinde ve
prognozun tayininde, mutant viruslara bağlı karışık serolojik profillerde göz önünde
bulundurulduğunda hepatit markerları ile birlikte HBV DNA'nın PCR ile araştırılması
daha doğru sonuçlar verecektir.
Sonuç olarak;
1) Çalışmaya alınan 169 HBsAg negatif serumun 35(%20,7)’inde HBV DNA
tespit edilmesi HBsAg'nin negatif olduğu kan donörlerinde de, HBsAg'nin tespit
edilemeyecek düzeylerde olabileceğini ve mutant suşların da infeksiyon yapabileceği
düşünülerek HBV DNA'nın araştırılması,
2) Anti-HBs'si pozitif serumlarda da HBV DNA'nın tespit edilebilmesi
nedeniyle kan transfüzyonu ve organ transplantasyonu gibi durumlarda HBV
bulaştırıcılığının göz önünde bulundurularak HBV DNA'nın araştırılması,
3) HBsAg negatif olan bütün kan donörlerinde salt anti-HBc pozitifliği
görülebildiğinden anti-HBc’nin taranması, yalancı pozitifliğe bağlı olarak kan donör
kaybına neden olabileceğinden özgüllük ve duyarlılık açısından daha gelişmiş anti-HBc
total testlerine ihtiyaç duyulduğu ve tarama sonucunda pozitif olarak bulunan kişilerde
HBV DNA testlerinin yapılması daha uygun olacaktır.
65
6. ÖZET
HBV dünya genelinde mortalite ve morbidite nedeni olan önemli bir halk
sağlığı sorunudur.
HBsAg ve anti-HBs negatifliğinde anti-HBc pozitifliği izole anti-HBc olarak
adlandırılmakta olup tüm serolojik belirteçlerin negatif sadece anti-HBc’nin pozitif
olması ise salt anti-HBc olarak adlandırılmaktadır.
Moleküler tekniklerin kullanıma girmesiyle Hepatit B infeksiyonu için
kullanılan serolojik testlerin tanıda ve takipde yetersiz olduğu görülmüştür. Bu
çalışmada öncelikle salt anti-HBc pozitif donörlerde ve atipik serolojik profildeki
serumlarda HBV DNA araştırılması amaçlandı.
Yaptığımız çalışmada hastanemiz kan merkezine başvuran 2500 HBsAg
negatif donörden 401’inde anti-HBc pozitif olarak tespit edilmiş olup bunlardan da izole
anti-HBc pozitif 45 donör (36’sı salt anti-HBc pozitif), anti-HBs/anti-HBe pozitif 116
donör ve anti-HBs/HBeAg pozitif olan 8 donör olmak üzere toplam 169 donör HBV
DNA araştırılmak üzere çalışmaya alınmıştır.
Çalışmaya alınan anti-HBs pozitif 124 donörün 32 (%25,8)’sinde, izole anti-
HBc pozitif 45 donörün 3 (%6,6)’ünde, bunlarında 36’sı salt anti-HBc pozitif olup 2
(%5,5)’sinde, 161 HBeAg negatif donörün 32 (%19,8)’sinde, 116 HBeAg negatif/anti-
HBe pozitif donörün 29 (%25)’unda, toplam 125 anti-HBe pozitif donörün de 30
(%24)’unda HBV DNA pozitif olarak bulundu.
Sonuç olarak hepatit B infeksiyonun tanısında, viral yükün ve prognozun
belirlenmesinde mutant suşlarla infeksiyon ve tüm serolojik markerları negatif olanlarda
da HBV DNA’nın bulunması göz önünde bulundurulduğunda serolojik testlerin yetersiz
olduğu görülmüştür. Dolayısıyla kan donörlerinde sadece HBsAg negatifliğine
bakılarak kan transfüzyonun yapılmasının yetersiz kaldığı bununla beraber anti-HBc’nin
de bakılmasının da maliyeti arttırması ve yalancı pozitifliğe bağlı olarak kan donör
kaybına neden olabileceğinden özgüllük ve duyarlılık açısından daha gelişmiş anti-HBc
total testlerine ya da maliyeti daha düşük ve uygulanabilirliği daha fazla HBV DNA
testlerine ihtiyaç duyulduğu görülmektedir.
Anahtar kelimeler: İzole anti-HBc, Hepatit B Virus, PCR
66
7. SUMMARY
HBV (Hepatitis B Virus) is one of the most important public health issues
which causes mortality and morbidity all over the world. The absence of HBsAg and
anti-HBs, together with the presence of anti-HBc is defined as isolated anti-HBc. On the
other hand, it is called absolute anti-HBc, if anti-HBc is positive in the absence of all
the serologic markers.
When the molecular techniques were intoduced, it was realized that serologic
analysis were incapable of diagnosing and estimating the prognosis of Hepatitis B
infection. In the present study, the first aim was to investigate HBV DNA in the donors
with absolute anti-HBc and in the sera with atypical serology.
In this study, 2500 donors who applied to our blood transfusion centre were
HbsAg negative and anti-HBc was detected in 401 of these 2500 donors. 45 donors
were isolated anti-HBc positive (36 out of these 45 were absolute anti-HBc positive),
116 donors were anti-HBs/anti-HBe positive and 8 donors were anti-HBs/HBeAg
positive. Totally, 169 out of these 401 donors were taken into the study to investigate
HBV DNA.
HBV DNA was positive in 32 out of 124 anti-HBs positive donors (25,8%), 3
out of 45 isolated anti-HBc positive donors (6,6%), (2 out of 36 absolute anti-HBc
positive donors (5,5%)), 32 out of 161 HBeAg negative donors (19,8%), 29 out of 116
HBeAg negative/anti-HBe positive donors (25%) and 30 out of 125 (24%) anti-HBe
positive donors.
As a result, HBV DNA is positive also in those who have been infected by
mutant strains and whose serologic markers are all negative, indicating that serologic
tests are inefficient for diagnosing Hepatitis B infection, quantitating viremia and
estimating the prognosis. Consequently, blood transfusion is potentially unsafe in the
absence of HbsAg alone in the donors. Moreover, examining anti-HBc together with
HBsAg increases the cost and may become a reason for losing a donor due to the false
positive result. In terms of specificity and sensitivity, more sophisticated anti-HBc IgG
tests or more applicable and cost effective HBV DNA tests are required.
Key words: Isolated anti-HBc, Hepatitis B Virus, PCR
67
8. KAYNAKLAR
1. Kıyan M: Hepatit B virusu. Eds: Kılıçturgay K, Badur S. Viral Hepatit 2001. 1.Baskı, İstanbul. Viral Hepatitle Savaşım Derneği. 2001;85–120.
2. Kıyan M. Viroloji. HBV infeksiyonu. Kılıçturgay K. (Ed.), Viral Hepatit 98. 1998; 66–94.
3. Hollinger FB, Dienstag JL. Hepatitis B and D viruses. İn: Murray PR, Baron EJO, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). Manuel of Clinical Microbiology. 7th Ed. Washington, ASM press. 1999;1025–1042.
4. Mahoney FJ. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. Clin. Microbiol. Rev. 1999;12: 351–366.
5. Lei X, Shigeko N, Deng X., et al. GB virus C/hepatitis G virus infection in Chinese patients with hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 2000;16: 91–97.
6. Robinson WS: Hepatitis B virus and Hepatitis D virus, Principles and Practice of Infectious Diseases, 4.th Ed (Eds: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R), USA, Churchill-Livingstone; 1995: 1406–1439.
7. Koff RS: Viral Hepatitis, Diseases of the Liver, 7.th Ed. (Eds: Schiff L and Schiff ER). Philadelphia, J.B. Lippincott Company, 1993: 492–577.
8. Sherlock S, Dooley J: Virus Hepatitis, Diseases of the Liver and Biliary System, 10.th Ed. London, The Blackwellscience, 1997: 265–302.
9. Sjogren MH: Serologic Diagnosis of Viral Hepatitis, Medical Clinics of North America, Management of Chronic Liver Disease, (Guest Ed: Paul Martin and Lawrence S. Friedman). W.B. Saunders Company, September 1996. 80 (5): 929–956.
10. Bilgiç A, Özacar T. Hepatit B ve D virusları. Ustaçelebi Ş (ed). Temel ve Klinik Mikrobiyoloji, 1. Baskı. Ankara: Güneş Kitabevi, 1999;871–880.
11. Kurt H. HBV enfeksiyonu klinik bulgular. Kılıçturgay K, (ed). Viral Hepatit 98, 1. Baskı. Viral Hepatitle Savaşım Derneği, 1998; 101–106.
12. Hu K. Occult hepatitis B virus infection and its clinical implications. Journal of Viral Hepatitis 2002; 9: 243–257.
13. Torbenson M, Thomas DL. Occult HBV. Lancet Infect Dis 2002; 2: 479–486.
14. Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral Hepatol 1997; 4 (suppl.1): 11–20.
15. Weber B. Diagnostic impact of the genetic variability of the hepatitis B virus surface antigen gene. J Med Virol 2006;78: 59–65.
16. Schreiber GB, Busch MP, Kleinman SH, Korelitz J. The risk of transfusion-transmitted viral infections. N Engl J Med 1996; 334: 1685–1689.
68
17. Hennig H, Puchta I, Luhm J, Schlenke P, Goerg S, Kirchner H. Frequency and load of hepatitis B virus DNA in first-time blood donors with antibodies to hepatitis B core antigen. Blood 2002;100(7):2637–2641.
18. Lok ASF. Occult hepatitis B virus infection: diagnosis, implications and management? J of Gastroenterol Hepatol 2004; 19: 114–117.
19. Chemin I, Zoulim F, Merle P. et al. High incidence of hepatitis B infection among chronic hepatitis cases of unknown etiology. J Hepatol 2001;34: 447–454.
20. Purcell RH. The discovery of the hepatitis viruses. Gastroenterology 1993: 104:955–963.
21. Krugman S, Giles JP, Hammond J. Infectious Hepatitis: evidence for two distinctive clinical, epidemiological and immunological types of infection. JAMA 1967: 200: 365.
22. Vyas G.N. and Yen T.S.B. Hepatitis B virus – Biology, pathogenessis, epidemiology, clinical description, and diagnosis. In: Specter S. Viral Hepatitis –Diagnosis, Therapy, and Prevention. New Jersey: Humana Pres. 1999;35.
23. Kaplan P.M., Greenman R.L., Gerin J.L., Purcell R.H. Robinson W.S. DNA polymerase associated with human hepatitis B antigen. J.Virol., 1973;12: 995-997.
24. Robinson W.S., Clayton D.A., Greenman R.L. DNA of a human hepatitis B virus candidate. J. Virol., 1984;14: 384-388.
25. Thiollais P., Charnay P., Vyas G.N. Biology of Hepatitis B virus. Sciense, 1981;213:404–411
26. Ganem D: Hepadnaviridae and their replication. Fields BN, Knipe DM, HowleyPM (Eds). Fields Virology. 3rd Ed. Lippincoy., Raven Press, 1996; 2703-2737.
27. Yenen OŞ: Viral hepatitler. Topçu AW, Söyletir G, Doganay M (Eds) İnfeksiyon Hastalıkları. 1. Baskı, İstanbul, Nobel Kitapevleri Ltd. Şti. 1996: 641–700.
28. Robinson WS: Hepadnaviridae and their replication. Pields BN, Knipe DM (Eds). Fundamenial Virology. 2 nd Ed. New York, Ravent Press, 1991; 989–1021.
29. Akan E: Viral hepatitler. Genel ve Özel Viroloji. 3. Baskı, İzmir, Saray Kitapevleri 1994; 502–549
30. Ustaçelebi Ş. ve ark. Viroloji. Temel ve klinik mikrobiyoloji, 1999;18: 871–877
31. Thiollais P, Pourcel C, Dejean A. The hepatitis B virus. Nature 1985;317:489–495.
32. Locarnini S, McMillan J, Bartholomeusz A. The hepatitis B virus and common mutants. Semin Liver Dis, 2003;23(1):5–20.
33. Serler D: Hepatit virüsleri ve viral hepatitler. Virus, Riketsiya ve Klamidya Hastalıkları, İstanbul, Nobel Tıp Kitabevleri, 1997;175–206.
34. Terrault N.A., and Wright, T.L. Viral hepatitis A through G. In: Feldman M, Scharschmidt BF, Sleisenger MH (Eds.). Sleisenger & Fordtran’s Gastointestinal and
69
Liver Disease: Pathophysiology, Diagnosis, Management. New York, W.B. Saunders Company, 1998; 1123–1170.
35. Lee WM: Hepatitis B virus infection. 1997; 337: 1733–1745.
36. Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64(1), 51–68.
37. Wang G.H, Seeger C. Novel mechanism for reverse transcription in hepatitis B viruses. J Virol. 1993;6507–6512.
38. Badur S: Hepatit B virusu (HBV): moleküler viroloji ve serolojik tanı. Kılıçturgay K. (Ed) Viral Hepatit '94, İstanbul, Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. 1994: 65–90.
39. Kann M, Lu X, Gerlich WH. Recent studies on replication of hepatitis B virus. J Hepatol 1995; 22 (Suppl 1): 9.
40. Santantonio T, Jung MC, Schneider R, et al. Hepatitis B virus genomes that can not synthesize pre-S2 proteins occur frequently and as dominant virus populations in chronic carriers in Italy. Virology 1992; 188:948–952.
41. Itoh Y, Takai E, Öhnuma H, et al. A symhetric peptide vaccine involving the product of the pre-S(2) region of Hepatitis B virus DNA: protective efficacy in chimpanzees. Proc Nail Acad Sci USA 1986; 83: 9174–9177.
42. Neuraih AR, Kent SBH, Parken K et al. Antibodies to a synthetic peptid from the pre-S(2) 120-145 region of the hepatitis B virus envelope are virus neutralizing. Vaccine 1986; 4: 35.
43. Badur S: Viral Hepatitler (HAV, HBV, HDV) Ustaçelebi Ş, Abacıoğlu H, Badur S (Eds) Moleküler, Klinik ve Tanısal Viroloji, Ankara, Güneş Kitabevi, 2004; 175–202.
44. Lau JYN, Wrighl TL. Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B. Lancet 1993; 342: 1335–1340.
45. Bilgiç A, Özacar T. Hepatit B Virusu. Willke Topçu A, Söyletir G, Doğanay M eds infeksiyon hastalıkları ve mikrobiyoloji. 2. Baskı, Nobel Tıp Kitapevleri. 2002:1350–1370.
46. Milich DR, McLachalan A, Chisari FV, Kent SB, et al. İmmune response to the pre-S1 region of the hepatitis B surface antigen (HBsAg): a pre-S1 specific T cell response can bypass nonresponsivensess to the pre-S2 and S regions of HBsAg. J Immunol, 1986;137(1);315–322
47. Thomas HC. Carman WF. Envelope and precore/core variants of hepatitis B virus. Martin PM, Friedman LS(Eds). Viral Hepatitis. Gastroenterol. Clin. N Amer. 1994; 23: 499–514.
48. Lemon SM, Thomas DL. Vaccines to prevent viral hepatitis. N Engl J Med 1997; 336: 196–204.
49. Arauz-Ruiz P, Norder H, Visonâ KA, Magnius LO. Molecular epidemiology of hepatitis B virus İn Central America reflected in the genetic variability of the small gene. JID 1997: 176:851–858.
70
50. Moraes MT, Gomes SA, Niel C. Sequence analysis of pre S/S gene of hepatitis B virus strains of genotypes A, D, and F isolated in Brasil. Arch Virol 1996: 141: 1763–1767.
51. Ou JH, Yeh CT, Yen TSB. Transport of hepatitis B virus pre-core proteins into nucleus after cleage of its signal peptide. J Virol 1989; 63: 5238–5243.
52. Chermello L, Pontisso P, Schiavon E, Thiers V, Tagariella G, Alberti A: Hepatitis B core antigen İn serum during acute hepatitis B. J Med Virol 1988; 24: 361–365.
53. Torre F, Naoumov NV. Clinical implications of mutations in the hepatitis B virus genome. Eur J Clin Invesi 1988; 28: 604–614.
54. Ferrari C, Bertoteiti A, Penna A, et al. Identification of immunodominant T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid antigen. J Clin Invest 1991; 88: 214–222.
55. Jung MC, Diepolder HM, Pape GR. T cell recognition of hepatitis B and C viral antigens. Eur J Ctin Invest 1994; 24: 641–650.
56. Geissler M, Tokushige K, Chante CC, Zurawski VR, Wands JR. Cellular and humoral immune response to hepatitis B virus structural proteins in mice afler DNA-based immunisation Gastroenterology 1997; 112: 1307–1320.
57. Milich DR, Sallberg M, Maruyama T. The humoral immune response in acute and chronic hepatilis B virus infection. Springer Semin immunopalhol 1995; 17: 149–166.
58. Wang G-H, Seeger C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts asa protein primer for viral DNA synthesis. Cell 1992; 71: 663–670.
59. Hepatitis B virus. IARC Monographs on the evalution of carsinogenic risk to human. Hepatitis viruses. Lyon 1994; 59: 145–163.
60. Feitelson MA, Duan L-X, Guo J, Blumberg BS. X region deletion mutants associated with surface antigen-positive hepatitis B virus infection. Gastroenterolog 1995; 108: 1810–1809.
61. Hsia CC, Yuwen H, Tahor E. Hot spot mutations in hepatitis B virus X gene in Hepatocellular carcinoma. Lancet 1996; 348: 625–626.
62. Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. J G Virol, 2000;81(1):67–74.
63. Klenerman P, Hengartner H, Zinkernagel RM. A non-retroviral RNA virus persist in DNA form. Nature 1997; 390: 298–301.
64. Rosenberg W. Mechanism of immune escape in viral hepatitis. Gut 1999; 44: 759–764.
65. Kato J, HasegawaK, Toru A, et al. A molecular analysis of viral persistence in surface antigen-negative chronic hepatitis B. Hepatology 1996; 23: 389–395.
66. Proizer Knolle U, NaumannU, Bartenschlager R, et al. Hepatitis B virus with antigenically altered hepatitis B surface antigen is selected by high-dose Hepatitis B immun globulin after liver transplantation. Hepatology 1998; 27: 254–263.
71
67. Bachmann MF, McKall Faienza K, Schmils R, et al. Distinct role for LFA–1 and CD28 during activation of native T cells: adhesion versus costimulation. Immunity 1997; 7: 549–557.
68. Kundig TM, Shahinian A, Kawai K, et al. Duration of TCR stimulation determines costimulatory requirment of T cells. immuntiy 1996; 5: 41–52.
69. Carman WF, Boner W Fattovich G, et al. Hepatitis B core protein mutations are concertrated in B cell epitopes in progressive disease and in T helper cell epitopes during clinical remission. J Infect Dis. 1997; 175: 1093–1100.
70. Orstov D, Krieger J, Sidney J, et al. T cell reseptor antogonism mediated by interaction between T cell receptor junctional residues and peptide antigen analogues. J Immun 1993; 150: 4277–4283.
71. Bertoletli A, Sette A, Chisari FV, et al. Natural variants of cytotoxic epitopes are T-cell receptor antogonists for cytotoxic T cells. Nature 1994; 369: 407–410.
72. Thursz MR, Kwiatkowski D, Allsop CEM et al: Association between a MHC class II allele and clearence of B virus in the Gambia. N Egl J Med, 1995; 332: 1065–1093.
73. Thursz MR, Thomas HC, Greewood BM, et al. Helerozygote advanlage for HLA class II type in hepatitis B virus infection. Nat Genel 1997; 17: 11–2.
74. Milich DR, Jones JE, Hughes JL, et al. Is a function of the secreted hepatitis B e antigen to indice immunologic tolerance in utero? Proc Nail Acad Sci USA 1990; 87: 6599–6603.
75. Jamieson BD, Ahmed R. T-cell tolerance: exposure to virus in utero does not cause a permanent deletion of specific T cell. Proc Nail Acad Sci USA 1988; 85: 2265–2268.
76. Chen WN, Oon CJ. Human hepatitis B virus mutants: significance of molecular changes. FEBS Lett, 1999;453(3):237–242.
77. Kılıçturgay K. Hepatit B virusunda (HBV) mutasyon ve getirdiği sorunlar. Viral Hepatit Derg., 1995; l: 1-7.
78. Zanetti AR, Tanzi E, Manzîllo G, et al. Hepatitis B variants in Europe. Lancet 1988; ii: 1132–1133.
79. Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis P, et al. Vaccine induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet 1990; 336: 325–329
80. Thomas H.C. The emergence of envelope and precore/core variants of Hepatitis B virus: the potential role of antibody selection. J Hepatol 1995: 22 (Suppl 1): 1-8.
81. Lee PI, Chang LY, Lee CY, Huang LM, Chang MH. Detection of hepatitis B surface gene mutation in carrier children with or without immunoprophlaxis at birth. JID 1997; 176: 427–430.
82. Ghany MG., Ayola B., Villamil FG, et al. Hepatitis B virus S mutants in liver transplant recipients who were reinfected despite hepatitis B immune globulin prophylaxis. Hepatology 1998; 27: 213–222.
72
83. Hawkins AE, Gilson RJ, Gilberi N, et al. Hepatitis B virus surface mutations associated with infection after liver transplantation. J Hepatol 1996; 24: 8–14.
84. Pollicino T, Zanetti AR, Cacciola l, et al. Pre 52 defective hepatitis B virus infection in patients with fulminant hepatitis. Hepatology 1997: 26: 495–499.
85. Bock C-T, Tillmann HL, Maschek H-J, Manns MP, Trautvvein C. A pre mutation isolated from a patient with chronic Hepatitis B infection leads to virus retention and misassembly. Gastroenterology 1997; 113: 1976–1982.
86. Yamamoto K, Horikika M, Tsudo F, et al. Naturally occuring escape mutants of hepatitis B virus various mutations in the S gene in the carriers seropositive for antibody to Hepatitis B surface antigen. J Virol 1994; 68: 2671-2676.
87. Viral Hepatitle Şavaşım Derneği- www_vhsd_org.htm
88. Li JS, Tong SP, Wen YM, Vuvitski L, Zhang Q, Trepo C. Hepatitis B virus genotype A rarely circulates as an HBe-minus mutant: possible contribution of a single nucleotid in the precore region. J Virol 1993;67: 5402–5410.
89. Rodriguez Prias P, Buli M, Jardi R, et al. Hepatitis B virus infection: precore mutanta and its relation to viral genotypes and core Mutations. Hepatology 1995; 22: 1641–1647.
90. Bagci S, Torre F, Stuyver L, et al. Impotance of Hepatitis B virus genotypes for the development of precore/core gene mutations and the outcome of interferon treatment. Hepatology 1996; 24: 280.
91. Chu CM, Yeh CT, Chiu CT, Sheen IS, Liaw YF. Precore mutants of hepatitis B virus prevails in acute and chronic infections in an area in which hepatitis B is endemic. J Clin Microbiol 1996; 34: 1015–1019.
92. Lee Yi, Hur CM, Şuh DJ, Kim SH. Novel pre C/C gene mutants of hepatitis B virus in chronic active hepatitis: naturally occuring escape mutants. J Gen Virol 1996; 77: 1129–1138.
93. Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR. Biologic properties of hepatitis B viral genomes with Mutations in the precore promoter and precore open reading frame. Virology 1997; 233: 374–381.
94. Moriyama K, Okamoto H, Tsuda F, Mayurni M: reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infection. Virology 1996; 226: 269–280.
95. Moriyama K. Reduced antigen production by Hepatitis B virus harbour in nucleotide deletions in the overlapping X gene and precore-core promotor. J Gen Virol 1997; 78: 1479–1486.
96. Kurosaki M, Enomolo N, Asahina Y, et al. Mutations in the core promotor region of Hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B. J Med virol 1996; 49: 115–123.
73
97. Hamasaki K, Nakata K, Nagayama Y, et al Changes in the prevalance of HBeAg-negative mutant Hepatitis B virus during the course of chronic hepatitis B. Hepatology 1994; 20: 8–14.
98. Nitsuma H, Ishii M, Saito Y, et al. Prevalance of precore-defective mutant of hepatitis B virus in HBV carriers. j Med Virol 1995; 46: 397–404.
99. Laskus T, Rakela J, Tong MJ, et al. Naturally occuring Hepatitis B virus mutants with deletion in the core promotor region. J Hepatol 1994; 20: 837–841.
100. Akarca US, Greene S, Lok AS. Delection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBsAg-positive family members. Hepatology 1994; 19: 1366–1370.
101. Lok AS, Akarca US, Greene S. Predictive value of precore hepatitis B virus mutation in spontaneous and interferon-induced hepatitis B e antigen clearance. Hepalology 1995: 21: 19–24.
102. Lai ME, Solinas A, Mazzoleni AP, et al. The role of precore hepatitis B virus mutants on the long-term outcome of chronin Hepatitis B virus hepatitis: A longitudinal study. J Hepatol 1994; 20: 773–781.
103. Wakita T, Kakumu S, Shibata M, et al. Detection of pre-C and core regions mutants of Hepatitis B virus in chronic hepatitis B virus carriers. J Clin Invest 1991; 88: 1793–1801.
104. Rosmorduc O, Felit MA, Pol S, et al. in vivo and in vitro expression of defective hepatiıis B virus particles generated by spliced Hepatitis B virus RNA. Hepalology 1995; 22: 10–9.
105. Baumert TP, Rogers SA, Hasegawa K, Liang TJ. Two core promoter mutations identified in a hepatitis B virus strain associated with fulminant hepatitis result in enhanced viral replication. J Clin Invest 1996: 98: 2268–2276.
106. Serter D. Hepatit Virusları ve Viral hepatitler. Virus, riketsiya ve klamidya hastalıkları. İstanbul, Nobel Tıp Kitapevleri 1997;175–206.
107. McCaughan GW, Spencer J, Koorey D, et al. Lamivudine therapy in patients undergoing liver transplantation for hepatitis B virus precore mutant-associated infection: high resistance rates in treatment of recurrence but universal prevention if used as prophylaxis with very low dose hepatitis B immune globulin. Liver Transpl Surg 1999; 5: 512–519.
108. Uchida T, Saitoh T, Shinzawa H. Mutations of the X region of hepatitis B virus and their Clinical implications. Pathol int 1997; 47: 183–193.
109. Tennant BC, Mrosovsky N, McLean K, et al. Hepatocellular carsinoma in Richardsdn's ground squirrels (Spermophilus richardso-nii): evidence Tor association with hepatitis B-like virus infection. Hepatology 1991; 13: 1215–1221.
110. Fukuda R, Ishimura N, Kushiyama Y, et al. Hepatitis B virus with X gene mutation is associated with the majority of serologically “silent” non-b, non-c chronic hepatitis. Microbiol Immunol 1996; 40: 481–488.
111. Balık I: Hepatit B epidemiyolojisi. Kılıçturgay K (Ed). Viral Hepatit' 94, 1. Baskı, İstanbul, Nobel Tıp Kitabevleri, 1994: 91–101.
74
112. Hollinger FB: Hepatitis B virüs. Fields BN, Knipe DM (Eds). Virology. 2 nd Ed., New York, Raven Press, 1990: 2171-2238.
113. Lamelin JP, Zaulin F, Trepo C: Lymphotrophism of Hepatitis B and C viruses: An update and a newcomer. Int J Clin Lab Res 1995; 25: 1–4.
114. Greate GB, Giusti G: Epidemiology of chronic viral hepatitis in the Mediterranean area. Infection 1990; 18: 29–33.
115. Mıstık R.: Viral Hepatitle Savaşım Derneği Raporu, 2000.
116. Taşyaran MA, Akdağ R, Akyüz M, Kaya A, Ceviz N, Yılmaz S: Erzurum bölgesi çocuklarında parenteral bulaşan hepatit viruslarının seroprevalansı. Klimik Derg 1994, 7: 76–78.
117. Kılıçturgay K. Viral hepatitte immunopatogenez. Kılıçturgay K, Bafur Sed. Viral hepatit 2001. İstanbul. Viral hepatitle savaşım derneği. 2001: 304–310.
118. Almari A, Batchelor JR: HLA and hepatitis B infection. Lancet, 1994;344: 1194–1195.
119. Thi CL, Carrington M, Marti D et al: Clas II HLA alleles and hepatitis B virus persistance in African Americans. J Infect Dis, 1999;179: 1004–1006.
120. Chisari F, Ferrari C: Hepatitis B virus immunopatogenesis. Annu Rev Immunol, 1995; 13: 29–60.
121. Hsu HH, Feinstone SM, Hoofnagle JH: Acute Viral Hepatitis, Principles and Practice of Infectious Diseases, 4.th Ed. (Eds: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R), USA, Churchill-Livingstone; 1995: 1136–1153.
122. Hyams KC. Risks of chronicity following acute hepatitis B virus infection: a review. Clin Infect Dis 1995; 20(4): 992–1000.
123. Krawit EL: Chronic Hepatitis, Principles and Practice of Infectious Diseases, 4.th Ed. (Eds: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R), Churchill-Livingstone; 1995: 1153–1159.
124. Tekeli E: Hepatit B virus infeksiyonlu hastaların serumlarında HBV-DNA tayini, Ankara Tıp Bülteni, 1988, 10(2):135–150.
125. Simms J, Duff P: Viral hepatitis in pregnancy. Seminars in Perinatology, 1993;17 (6):384–393.
126. Ghendon Y: Perinatal tranmission of hepatitis B virus in high-incidence countries. Journal of Virological Methods, 1987; 17: 69–79.
127. Sherlock S, Dooley J: Chronic Hepatitis, Diseases of the Liver and Biliary System, 10.th Ed. London, The Blackwellscience, 1997: 303–335.
128. Hoofnagle, J.H. schafer, D.F. Serologic markers of hepatitis B Virus infection. Seminars in liver disease, 1986; 6(1): 1–10.
129. Hoofnagle J.H. (). Type B Hepatitis Virology, Serology and Clinical Course. Sem. liver disease, 1981;1: 7–14
75
130. Krogsgaord K. Hepatitis B Virus DNA in serum. Applied molecular biology in the evaluation of hepatitis B infection. Liver 1988;8: 257–283.
131. Fincancı M. ve Badur S. Akut B tipi viral Hepatitte Pre-S1 antijenlerinin ve anti Pre-S2 antikorlarının prognostik değeri. Klinik Dergisi 1992;5: 74–76.
132. Badur S. Hepatit B Virüsü. İnfeksiyon hastalıklarının laboratuvar tanısında moleküler yöntemler. Ağaçfidan A, Badur S, Türkoğlu S ed. Türk mikrobiyoloji cemiyeti yayını. İstanbul. 2002:155–160.
133. Aspinall S, Steele AD, Peenze I. Detection and quantitation of hepatitis B virus DNA: Comparison of two commercial hybridization assays with polymerase chain reaction. J.Viral Hepatitis 1995; 2: 107.
134. Karahan AG, Cicioğlu Arıdoğan B, Çakmakçı ML. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Kılavuzu. 1. Baskı. Süleyman Demirel Üniversitesi Basımevi, Isparta, 2002.
135. Eisenstein BI. The polymerase chain reaction: a new method of using molecular genetics for medical diagnosis. NEJM 1990; 332: 178–183.
136. Mullis K. Unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990; 262: 56–65.
137. Arnheim N, White T. The application of PCR: organismal and population biology. Bioscience 1990; 40: 174–182.
138. Fanson GF, Osmack P, Di Bisceglie AM. A comparison between the phenol-chloroform method of RNA extraction and the QIAamp viral RNA kit in the extraction of hepatitis of hepatitis C and GB virus-C/hepatitis G viral RNA from serum. Journal of Virological Methods 2000; 89: 23–27.
139. Xiang X, Qui D, Hegele RD et al. Comparison of different methods of total RNA extraction for viral detection in sputum. Journal of Virological Methods 2001; 94 (1-2):129-135.
140. Paabo S. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning and enzymatic amplification. Proc Natl Acad Sci USA; 86: 1939–1943.
141. Walker GT, Little MC, Nadeau JG et al. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: 392–396.
142. Arens M. Methods for subtyping and molecular comprison of human viral genomes. Clinical Microbiology Reviews 1999; 12(4):612–626.
143. Mine H, Emura H, Miyamoto M, et al. High throughput screening of 16 million serologically negative blood donors for hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus type–1 by nucleic acid amplification testing with and sensitive multiplex reagent in Japan. J Virol Methods 2003; 112: 145–151.
144. Lok ASF, McMahon BJ. Chronic Hepatitis B. AASLD Practice Guidelines. Hepatology 2001; 34: 1225–1241.
145. Paraskevis D, Haida C, Tassopoulos N, et al. Development and assessment of a novel realtime PCR assay for quantitation of HBV-DNA. J Virol Methods 2002; 03: 201–212.
76
146. Loeb KR, Jerome KR, Goddard J, Huang M, Cent A, Corey L. High-throughput qu-antitative analysis of hepatitis B virus DNA in serum using the TaqMan fluorogenic detection system. Hepatology 2000; 32: 626–629.
147. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 2002; 30: 1292–1305.
148. Cabrerizo M., Bartolome J., Caramelo C., Barril G., Carreno V.: Molecular Analysis of Hepatitis B Virus DNA in Serum and Peripheral Blood Mononuclear Cells from Hepatitis B Surface Antigen-Negative Cases. Hepatology 2000; 32: 116–123.
149. Cacciola I., Pollicino T., Squadrito G., et al: Quantification of İntrahepatic Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Patients with Chronic HBV İnfection Hepatology 2000;31: 507- 512.
150. Loriot M.A., Marcellin P., Bismuth E., et al. Demonstration of Hepatitis B Virus DNA by Polymerase Chain Reaction in the Serum and the Liver after Spontaneus or Therapeutically İnduced HBeAg to anti-HBe or HBsAg to anti-HBs Seroconversion in Patients with Chronic Hepatitis B.: Hepatology 1992; 15: 32-36.
151. Coffin C.S., Michalak T.I.: Persistence of Infectious Hepadnavirus in the Offspring of Woodchuck Mothers Recovered from Viral Hepatitis. J Clin Invest 1999; 104: 203- 212.
152. Saito T., Shinzawa H., Uchida T., et al.:Quantitative DNA Analysis of Low-level Hepatitis B Viremia in Two Patients with Serologically Negative Chronic Hepatitis B. J Med Virol 1999;58: 325-331.
153. Dickson R.C., Everhart J.E., Lake J.R., et al.: Transmission of Hepatitis B by Transplantation of Livers from Donors Positive forAntibody to Hepatitis B Core Antigen. Gastroenterology 1997; 113:1668- 1674.
154. Uemoto, S., Sugiyama, K., Marusawa, H., et al.: Transmission of Hepatitis B Virus from Hepatitis B Core Antibody-positive Donors in Living Related Liver Transplantiont. Transplantation 1998; 65: 494- 499.
155. Chung R.T., Feng S., Delmonico F.L.: Approach to the Management of Allograft Recipients Following the Detection of Hepatitis B Virus in the Prospective Organ Donor. Am J Transplant 2001;1: 185- 191.
156. Dueymes J.M., Bodenes-Dueymes M., Mahe J.L., Herman B.: Detection of Hepatitis B Viral DNA by Polymerase Chain Reaction in Dialysis Patients. Kidney Int 1993; 41(Suppl.): S161- 166.
157. Cabrerizo M., Bartolome J., De Sequera P., Caramelo C., Carreno V.: Hepatitis B Virus DNA in Serum and Blood Cells of Hepatitis B Surface Antigen-negative Hemodialysis Patients and Staff. J Am Soc Nephrol 1997;8: 1443–1447.
158. Wachs M.E., Amend W.J., Ascher N.L., et al.: The Risk of Transmission of Hepatitis B from HBsAg(-), HBcAg(+), HBIgM(-) Organ Donors. Transplantation 1995;59: 230- 234.
159. Pariente E.A., Goudeau A., Dubois F., et al.: Fulminant Hepatitis Due to Reactivation of Chronic Hepatitis B Virus Infection after Allogeneic Bone Marrow Transplantation. Dig Dis Sci 1988;33: 1185- 1191.
77
160. Regenstein F. New approaches to the treatment of chronic viral hepatitis B and C. Am J Med;1996 (suppl 1A): 47–51.
161. Grob PJ. Hepatitis B: Virus, pathogenesis and treatment Vaccine 1998; 16: 11–16.
162. Henry L. Chan et al. Hepatitis B. Eugene R Schiff. Michael F. Sorrell, and Willis C. Maddrey.(ed). Schiff’s Diseases of The Liver, Lippincott-Ravenpublishers 8.Ed. Philadelphia 1990: 757–791.
163. Omata M. Treatment of chronic hepatitis B infection. N Engl J Med 1998; 339: 114.
164. Esteban JJ. Treatment of acute viral hepatitis. Viral hepatitis A to F:an update. AASLD postgraduate course, Chicago, 1994: 266–277.
165. Akarca US. Kronik B hepatitinde interferon dışı tedaviler ve interferon ile yapılan kombinasyonlar. Kılıçturgay K (Editör). Viral Hepatit 98. 1998: 119.
166. Eroğlu Y. Çocukluk çağında akut viral hepatitis A, B, C, D, E. Galenos 1998: 32–41.
167. Halsey NA. Hepatitis B today; new guidelines for pediatrician-discussion. Pediatr İnfect Dis J 1993; 12: 450–453.
168. Özeren G. Okul Çağı Çocuklarında Hepatit B Seroprevalansı. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları ABD. Uzmanlık tezi Isparta 1999.
169. Brechot C, Degos F, Lugassy C, Thiers V, Franco D, Bismuth H, et al. Hepatitis B virus DNA in patients with chronic liver disease and negative test for Hepatitis B surface antigen. N Engl J Med 1985; 312: 270–273.
170. Pao CC, Yao DS, Lin CY, et al. Serum hepatitis B virus seropozitive and seronegative patient with nornal liver function. Am J Clin Pathol 1991; 95: 591–593.
171. Wang JT, Wang TH, Sheu JC et al. Detection of hepatitis B virus DNA by polymerase Chain Reaction in plasma of volunteer blood donors negative for hepatitis B surface antigen. J Infect Dis 1991; 163: 397–399.
172. Zaaijer HL, Borg FT, Cuypers HTM, Hermus MCAH, Leleie PN. Compatison of metod for detection of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol. 1994;32: 2088–2094.
173. Ljuggren KK, Nodenfeldt E, Kidd A. Correlation of HBeAg/Anti HBe, ALT levels and HBV DNA PCR results in HBsAg positive patients. J Med Virol. 1993:39.297–301.
174. Nicolas C, Tassopoulos et al. Efficacy of lamivudine in patients with hepatitis B e Ag negative, HBV DNA positive (precor mutant) chronic hepatitis B. Hepatology. 1999;29: 889–896.
175. Yarkın F, Hafta A. Hepatit B virusun prekor T AG mutantının ARMS (Amplification Refractory Mutation System) ve ACRS ( Amplification Created Restriction site) metodları ile tespiti. Turk J Gastroenterol. 2000;11: 104.
176. Theirs V, Nakajim E, Kremsdorf D et al. Transmission of hepatitis B from hepatitis B sero-negative subject. Lancet. 1988;2: 1273–1276.
78
177. Lai ME, Farci P, Figus A, Balestrieri A et al. Hepatitis B virus DNA in the serum of sardinian blood donors negative for hepatitis B surface antigene. Blood. 1989;73: 17–19.
178. Uchida T, Shimojima M, Gotoh K, Shikata T et al. 'Silent' hepatitis B virus mutans are responsible for non-A, non-B, no -C, non-D, non-E hepatitis. Microbiol Immunol. 1994;38:281–285.
179. Altındiş M. Hepatit B virüs (HBV) serolojik belirleyicileri ile HBV DNA'nın varlığının karşılaştırılması. İnfek Derg. 2002;16: 141–145.
180. Bayram A, Balcı İ. Seropozitif ve seronegatif kişilerde hepatit B virus DNA'sının polimeraz zincir reaksiyonu ile araştırılması. Viral Hepatit Derg. 2000;206–208.
181. Pekbay A, Günaydın M, Eroğlu C, Bedir A ve ark. Hepatit B virus (HBV) serolojik göstergeleri ile HBV DNA arasındaki korelasyon. Viral Hepatit Derg. 2001: 302–304.
182. Yücesoy M, Bahar İH, Yuluğ N. Hepatit B virus serolojik belirleyicileri ile HBV DNA'nın karşılaştırılması. İnfek Derg. 1999;13: 581–584.
183. Uchida T, Aye TT, Becker SO et al. Detection of the precore/core-mutant hepatitis B virus genome in patients with acute or fulminant hepatitis without serological markers for recent HBV infection. J Hepatol. 1993;18: 369–372.
184. Michalak Tl, Pasquinelli C, Guilhot S, Chisari FV. Hepatitis B virus persistence after recovery from acute viral hepatitis. J Clin İnvest. 1997;93: 230–239.
185. Özacar T, Zeytınoğlu A, Erensoy S, Yapar N ve ark. Hepatit B virüs serolojisinde salt anti-HBc olumluIuğu ve HBV aşısına yanıt. Viral Hepatit Derg. 1995;1: 69–71.
186. Mert A, Şentürk H, Süve İ, Tabak F ve ark. HBsAg ve anti-HBs negatif, anti HBc pozitif olguların çeşitli yönlerden incelenmesi. Viral Hepatit Derg. 1996: 92–95.
187. Badur S. Posttransfüzyonel hepatit sorunu. Türk Mikrobiyol Cem Derg 1991; 21: 34–42.
188. Van Theil DH, De Maria N, Colantoni A, Friedlander L. Can hepatitis B core antibody positive livers be used safely for trasplantation: Hepatitis B virus detection in the liver of individuals who are hepatitis B core antibody positive. Transplantation 1999; 68: 519–522.
189. Ben Ayed M, Triki H, Cointe D, et al. The isolated presence of anti-HBc antibodies: Prevalence and interpretation based on the results of viral DNA research and anti-HBs antibodies measurement after vaccination. Ann Biol Clin 2001; 59: 53–60.
190. O’Connell T, Thornton L, O’Flanagan D, et al. Prevalence of hepatitis B anti-core antibody in the Republic of Ireland. Epidemiol Infect 2000; 125: 701–704.
191. Neifer S, Molz B, Sucker U, Kreuzpaintner E, Weinberger K, Jilg W. High percentage of isolated anti-HBc positive persons among prisoners. Gesundheitswesen, 1997; 59: 409–412.
192. Zülfikar B, Öztürk R, Kınık K, et al. İstanbul’da değişik yaş grubundan sağlıklı kişiler, hamileler, diş hekimleri ve berberlerde hepatitis B taraması sonuçları. III. Ulusal Viral Hepatit Simpozyumu. 7–9 Kasım Ankara, 1996: 20.
79
193. Şanlıdağ T, Akçalı S, Aşkın S, Sezgin C, Özbakkaloğlu B. Manisa bölgesinde izole anti-HBc seroprevalansı ve nonspesifik çapraz reaksiyonlarla ilişkisi. Viral Hepatit Derg. 2003;8: 16–19
194. Grob P., Jilg W., Bornhak H., et al.: Serological Pattern ‘Anti- HBc Alone’: Report on a Workshop. J Med Virol 2000;62: 450- 455.
195. Scot J.S., Pace R.A., Sheridan J.W., Cooksley W.G.(). Discordance of hepatitis B e antigen and hepatitis B viral deoxyribonucleic acid. J. Med. Virol 1990;32: 225–231.
196. Zoulim F, Nimms L, Floreani M, et al: New assays for quantitative determination of viral markers in management of chronic hepatitis B virus infection. J Clin Microbiol, 1992;30:1111–1119.
197. Makris AM, Zignego L, Hadziyannis SJ: Measurement of hehpatitis B viral DNA in serum by solution hybridization and comparison with dot-blot hybridization technique. Hemato-gastroenterol, 1991;38: 53–55.
198. Yücesoy M, Bahar İH, Yuluğ N: Kronik B hepatitlilerde hepatit B virus DNA’sının gösterilmesi. Mikrobiyoloji Bült, 1995; 29: 39–46.
199. Lazizi Y., Grangeot-Keros L., Delfraissy JL. et al. Reappearence of hepatitis B virus in immun patients infected with the human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis. 1998; 158: 666–667.
200. Fukunda R., Thanh NX., Jshimura N. et al. X gene and precore region mutations in the hepatitis B virus genome in persons positive for antibody to hepatitis B e antigene; comparison betwen asymptomatic 'healty carriers and patients with severe chronic active hepatitis. J Infect Dis. 1995;172:1191–1197.
201. Kuştimur S., Çırak MY., Külah C., Aydın A., Rota S., Türet S. HBsAg pozitif serum örneklerinde hepatit B virus DNA’sının saptanmasında polimeraz zincir reaksiyonu ve hibridizasyon yöntemlerinin değerlendirilmesi. Mikrobiyol Bült 2001; 35: 581–587.
