CARACTERIZACION DE LA LEVADURA Pichia guilliermondii: POTENCIAL CONTAMINANTE DE VINOS DE LA PATAGONIA

Sangorrín1,2 M., Lopes1,2,3 C., Della Negra1 J.G.; Jofré4 V., y. Caballero1 A.

1- Lab. de Microbiología y Biotecnología, Fac. Ingeniería, U.N.Comahue. 2- CONICET. 3- Lab. de Microbiología Agrícola, Fac. Cs. Agrarias, U.N.Comahue.4- Lab. Aromas y

Sustancias Naturales, INTA Mendoza. Correo electrónico: msangorr@uncoma.edu.ar

RESUMEN / ABSTRACT

Levaduras de los géneros Dekkera/Brettanomyces son capaces de producir en el vino

compuestos fenólicos volátiles responsables de aromas indeseables. Recientemente se ha

reportado esta capacidad en cepas de P. guilliermondii, especie común en mostos

Patagónicos. En este trabajo se confirmó la identidad taxonómica de 22 aislamientos de

levaduras obtenidos de vinificaciones regionales y asignados a la especie P. guilliermondii

por métodos convencionales, se analizó su diversidad intraespecífica y su potencialidad

como contaminantes. Paralelamente se evaluó la sensibilidad de los aislamientos a toxinas

killer con el fin de desarrollar una estrategia de biocontrol.

La identificación se realizó por el método ITS1-5.8S-ITS2 PCR-RFLP y secuenciación de

la región D1/D2 del 26S-ADNr, y la caracterización al nivel de cepa por RAPD-PCR

utilizando 10 cebadores diferentes. Se realizaron micro-vinificaciones (10 mL) con mosto

estéril adicionado con ácido p-cumárico (100 mg/L) para evaluar la producción de 4-etilfenol

(4-EF), 4-etilguayacol (4-EG) y los intermediarios 4-vinilfenol (4-VF) y 4-vinilguayacol (4-VG)

por CG. La sensibilidad killer se evaluó frente a cepas de referencia e indígenas por la

técnica de inhibición de crecimiento en placa de YPD-MB (pH: 4,5).

Por medio de los métodos moleculares utilizados se confirmó la identidad de los 22

aislamientos. En la caracterización intraespecífica con el método RAPD-PCR, de todos los

cebadores y temperaturas de anillamiento evaluados, el cebador OPA 10 a 38° C fue el que

mostró mayor variabilidad (10 perfiles diferentes). Todos los aislamientos produjeron 4-EF, 4-

VG y 4-EG y particularmente elevados niveles de 4-vinilfenol, superiores a los obtenidos con

D. bruxellensis. La aislamientos de P. guilliermondii mostraron un 100% de sensibilidad

frente a la cepa killer de colección Kluyveromyces lactis NCYC 575 y un 75% frente al

aislamiento killer indígena HC.Mai5 de la especie P. anomala. Este último aislamiento se

vislumbra como una interesante herramienta para el biocontrol de cepas de P. guilliermondii

potencialmente peligrosas. El empleo combinado del RAPD y la sensibilidad a levaduras

killer de referencia, permitió asimismo lograr una mejor discriminación a nivel intraespecífico

en los aislamientos de P. guilliermondii, e incluso detectar aquellos capaces de producir las

mayores concentraciones de 4-EF.

Palabras clave: fenoles volátiles, toxinas killer, identificación.

INTRODUCCION Trabajos recientes relacionan a la especie Pichia guilliermondii como posible

responsable del deterioro del vino debido a su capacidad de producir en ensayos de

laboratorio cantidades de 4-etilfenol comparables a las producidas por Dekkera/

Brettanomyces bruxellensis (Dias et al., 2003). Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre

con esta última, la producción de compuestos responsables de “off flavours” por parte de P.

guilliermondii podría darse en las etapas iniciales de la fermentación (Barata et al., 2006)

resultando de interés contar con métodos sensibles, específicos y rápidos para su detección

temprana con el fin de tomar a tiempo las medidas correctivas necesarias para evitar el

deterioro de los vinos.

P. guilliermondii es una especie ampliamente extendida en la región Norpatagónica,

aislándose con frecuencia de uvas, mostos y equipos de bodegas. En este contexto, el

objetivo del trabajo fue confirmar la identidad taxonómica de 22 aislamientos de levaduras

obtenidos de vinificaciones regionales y asignados a la especie P. guilliermondii por

métodos convencionales, analizar su diversidad intraespecífica y su potencialidad como

contaminantes. Adicionalmente se evaluó la sensibilidad de estos aislamientos frente a

levaduras productoras de toxinas killer de colección y autóctonas de la región. La

explotación de compuestos antimicrobianos naturales inocuos para el hombre, como las

toxinas killers, para el control de levaduras contaminantes en bodega aparece como una

herramienta interesante para la elaboración de vinos sanos, de alta calidad y reproducible.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Levaduras 22 aislamientos de levaduras de la especie P. guilliermondii por métodos convencionales y obtenidos de vinificaciones regionales, 40 aislamientos de levaduras killer (indígenas y de referencia) y cepas controles de D. bruxellensis y Candida Boidinii. 2. Identificación: la confirmación taxonómica de los aislamientos de P. guilliermondii se realizó por ITS1-5.8SADNr-ITS2 PCR/RFLP (Esteve-Zarzoso et al. 1999) y por secuenciación del dominio D1/D2 del gen del ARNr 26S y de la región ITS1-5.8S-ITS2.

La discriminación a nivel de cepa se realizó mediante el método de RAPD-PCR. La amplificación por PCR se realizó de acuerdo al protocolo propuesto por Mitrakul et al., 1999 con los cebadores OPA 1,2,3,7,8,9,10,11,15 y16 (Operon Technology primers). 3.-PRODUCCION DE COMPUESTOS FENOLICOS VOLATILES: Se realizaron micro-fermentaciones con mosto de uvas de la variedad Syrah (22,5 Brix; 238,7 g/L de azucares reductores totales; pH 3,82; acidez total 4,75 g/L; ácido málico 2,45 g/L; amonio 109,3 mg/L) adicionado con ácido p-cumárico (100 mg/L) y esterilizado por filtración. Cada tubo con 9 mL de mosto estéril fue inoculado con 1 mL de un pie de cuba (inóculo) de cada aislamiento de P. guilliermondii se incubó a 26ºC durante 30 días. La identificación y cuantificación de compuestos fenólicos cuales se realizó por cromatografía gaseosa HS-SPME-GC. 4.-SENSIBILIDAD A TOXINAS KILLER DE P. guilliermondii.

Se evaluó la sensibilidad de los aislamientos de P. guilliermondii a 10 cepas killer de referencia y a 30 aislamientos indígenas pertenecientes a la colección de cultivos del laboratorio, por el método de inhibición de crecimiento en YEPD-MD (Sangorrín et al, 2002).

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5.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las comparaciones entre medias se realizaron por Análisis de la Varianza (ANOVA) y Test de Tukey de diferencia significativa honesta (HSD), utilizando un α: 0.05. La normalidad en la distribución de los datos se evaluó utilizando el Test de Lilliefors y la homocedasticidad de las varianzas con el Test de Cochran, Hartley y Barlett.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1 -Identificación molecular de aislamientos de P. guilliermondii

Como resultados de la identificación molecular se obtuvo para todos aislamientos, un producto de amplificación de 600 pares de bases (pb) de ADN. Los patrones de restricción del amplificado fueron de 300+260 pb con la enzima Cfo I, de 400+115+90 pb con la enzima Hae III y de 320+300 pb con la enzima Hinf I. La secuencia de nucleótidos algunos aislamientos representativos confirmo que los aislamientos pertenecen la especie P. guilliermondii según la base de datos Genbank disponible en internet.

2 –Diversidad intraespecífica de los aislamientos de P. guilliermondii

Debido a que existen pocos estudios de diversidad de P. guillermondi de RAPD se evaluó la capacidad discriminatoria del método utilizando 10 cebadores diferentes con el fin de seleccionar el más indicado para esta especie. Como resultado de este análisis, sólo algunos de los cebadores evaluados, como el OPA 3, OPA 10 y OPA 16, datos no mostrados, permitieron obtener perfiles adecuados para ser utilizados en la discriminación intraespecífica, debido a la presencia de un gran número de bandas. El uso del cebador OPA 10 permitió detectar 10 perfiles diferentes entre los 23 aislamientos (Figura 1).

Con el cebador OPA 16 se obtuvieron 3 perfiles diferentes dos de los cuales fueron

perfiles únicos (perfiles B’’ y C’’, datos no mostrados). Los aislamientos con estos perfiles también mostraron a perfiles únicos con el OPA 10 (perfiles D y B indicados con una flecha blanca en la figura 1), indicando que se trata de cepas muy diferentes al resto.

3-Evaluación de la capacidad de producir compuestos fenólicos

La producción de los compuestos fenólicos (4-etilfenol, 4-EF; 4-vinilfenol, 4-VF; 4-etilguayacol, 4-EG; y 4-vinilguayacol, 4-VG) analizados al final de las microfermentaciones resulto significativamente diferente entre la cepa D. bruxellensis (control +) y todos los

C D I J E G F G A A A A H B J A E G 8 9 10 11 12 13 14 15 17 M 18 20 21 1 2 3 5 6 4

Figura 1 : Productos obtenidos de la amplificación por PCR utilizando el cebador OPA 10. Los números arábigos en la parte superior indican el aislamiento de P. guilliermondii utilizado y las letras mayúsculas el perfil obtenido. M: Marcador de peso molecular, escala de 100 pb.

3

aislamientos de P. guilliermondii (Tabla 1) para los 3 compuestos detectados (4-EF, 4-EG y 4-VG).

De acuerdo a los valores obtenidos, D. bruxellensis fue capaz de consumir todo el precursor ácido ferúlico presente en el mosto, transformándolo en el compuesto intermediario 4-VG y produjo elevadas concentraciones de 4-EG, producto de la reducción del intermediario por la enzima vinilfenol reductasa (Suárez et al., 2007). Los aislamientos de P. guilliermondii también lograron consumir el ácido ferúlico naturalmente presente en el mosto, produciendo elevadas concentraciones de 4-VG pero la transformación de este último en 4-EG resultó mínima, con valores por debajo de 2 ug/L en todos los casos.

Al analizar los derivados del ácido p-cumárico se observa una gran producción del intermediario 4-VF (valores mayores a 3000 ug/L) para todos los aislamientos, excepto para la cepa de D. bruxellensis (Tabla1). Esto podría estar relacionado con diferencias en las velocidades de reacción de las dos enzimas involucradas. Probablemente las velocidades de la cinamato decarboxilasa y la vinilfenol reductasa son muy similares para la cepa D. bruxellensis, mientras que para el caso de los demás aislamientos analizados, la vinilfenol reductasa presenta velocidades inferiores y por lo tanto en el producto final se encuentran elevadas concentraciones del intermediario 4-VF.

Aun cuando los valores de 4-etilfenol fueron obtenidos a partir de mosto adicionado con una cantidad elevada de ácido p-cumárico, y por lo tanto no resulta representativo de lo que se podría obtener en una fermentación vínica normal, los mismos permiten obtener información acerca de cuales son los aislamientos que presentan una mayor actividad cinamato decarboxilasa y vinilfenol reductasa en condiciones de saturación y por lo tanto potencialmente más peligrosos en la industria.

No se observó relación entre los diferentes perfiles moleculares encontrados utilizando el método de RAPD-PCR y la producción de compuestos fenólicos volátiles. Martorell et al. (2006) en cambio, ha reportado recientemente una asociación entre determinados perfiles moleculares de mtADN-RFLP y la producción de altas concentraciones de 4-etilfenol en cepas de esta misma especie.

4 -Ensayo de sensibilidad de P. guilliermondii a toxinas killer indígenas Con el objetivo de encontrar levaduras killer capaces de ser utilizadas como

herramienta efectiva e inocua para el biocontrol de P. guilliermondii se evaluó la sensibilidad de los 23 aislamientos a las levaduras killer de referencia e indígenas de distinto origen. La cepa de referencia Kluyveromyces lactis var. drosophilarum NCYC 575 fue capaz de inhibir el crecimiento de todos los aislamientos de P. guilliermondii (Tabla 1). Entre los aislamientos killer indígenas, las especies P. kluyveri, P. anomala, T. delbrueckii y M. pulcherrima fueron capaces de inhibir el desarrollo de los algún aislamiento de P. guilliermondii. En particular, los aislamientos de P. anomala presentaron actividad killer frente a más del 75% de los aislamientos. Estos aislamientos killer, originalmente recuperados de mostos de fermentación, resultan interesantes como posible herramienta de biocontrol debido a su alta eficacia y a que ya se encontrarían adaptados a las condiciones regionales de vinificación.

5.-Uso combinado del RAPD y el biotipo killer para discriminar cepas.

Los perfiles de sensibilidad a toxinas killer han sido ampliamente utilizados como herramienta para la caracterización de cepas de levaduras de diferentes orígenes (Buzzini & Martini, 2001; Sangorrín et al, 2007). Aunque la capacidad de discriminación de este método es baja, puede aumentar si se aumenta el número de cepas killer de referencia en el panel o se utiliza conjuntamente con algún otro método de diferenciación (Corte et al., 2005; Lopes et al., 2006b; Buzzini et al., 2007).

De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, si se utilizan de manera combinada los perfiles de sensibilidad de los aislamientos a las 10 cepas killer de referencia y los perfiles moleculares obtenidos por RAPD con el cebador OPA 10, es posible identificar claramente al aislamiento nº5, quien mostró los niveles más altos de 4-EF y 4-VG (Tabla 1).

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Tabla 1: Producción de compuestos fenólicos volátiles por los aislamientos de P. guilliermondii y las cepas control y perfiles combinados del biotipo killer y de RAPD.

Compuestos fenólicos

4-vinilguayacol 4- etilguayacol 4-vinilfenol 4-etilfenol Denominación

# M s.d M s.d M s.d M s.d

RAPD Opa10

Sensibilidad killer

PERFIL*

Perfil combinado

RAPD/Killer

9 T1 23 671,28 ±23,00 2,18 ±0,32 >3000 --- 61,79 ±26,27 C 10 I 9 T1 25 601,30 ±40,41 0,74 ±0,27 >3000 --- 96,76 ±14,65 D 10 II 9 T1 27 374,87 ±129,50 0,17 ±0,09 >3000 --- 57,15 ±37,96 I 10 III 9 T1 29 502,69 ±9,36 0,45 ±0,13 >3000 --- 64,49 ±7,60 J 10 IV 9 T1 30 585,40 ±77,28 0,62 ±0,20 >3000 --- 146,59 ±95,70 E 10

NAT 1- 34 699,78 ±7,19 0,42 ±0,11 >3000 --- 143,56 ±4,92 E 10 V T0 BC "A" 706,79 ±220,20 0,48 ±0,00 >3000 --- 25,66 ±2,55 G 4,5,6,9,10 VI T0 BC "B" 481,49 ±19,60 0,46 ±0,05 >3000 --- 68,78 ±34,90 F 5,10 VII NAT 1- 22 568,68 ±33,68 0,45 ±0,05 >3000 --- 44,07 ±2,99 G 10 VIII NAT 1- 23 528,72 ±169,35 0,30 ±0,16 >3000 --- 35,29 ±21,41 A 10 NAT 1- 26 688,64 ±11,34 0,70 ±0,21 >3000 --- 65,14 ±8,53 A 10 NAT 1- 29 637,93 ±61,36 0,65 ±0,16 >3000 --- 61,95 ±8,50 A 10 NAT 1- 31 556,79 ±69,38 0,27 ±0,06 >3000 --- 105,01 ±87,17 A 10 NAT 1- 32 535,46 ±54,09 0,33 ±0,11 >3000 --- 62,93 ±6,83 A 10 NAT 1- 35 710,71 ±19,22 0,41 ±0,19 >3000 --- 82,36 ±5,61 A 10

IV

NAT 1- 27 558,43 ±6,89 0,39 ±0,01 >3000 --- 73,48 ±59,36 A 1,5,10 X NAT 1 -33 685,30 ±43,76 0,50 ±0,19 >3000 --- 135,50 ±13,34 E 10 XI (V1) a35 661,31 ±84,91 0,32 ±0,09 >3000 --- 63,04 ±3,38 H 1,5,8,9,10 XII (V2) m2 771,29 ±241,87 0,80 ±0,75 >3000 --- 57,76 ±6,29 B 8,10 XIII

(V3) m19 628,19 ±174,14 0,30 ±0,03 >3000 --- 51,27 ±7,62 J 1,5,8,9,10 XIV (V5) mp10 4 874,99 ±25,74 1,56 ±0,42 >3000 --- 196,95 ±36,94 A 1,5,8,9,10 XV (V7) mp108 759,96 ±122,44 1,09 ±0,92 >3000 --- 128,25 ±39,73 E 1,5,8,9,10 XVI

T52 637,74 ±126,94 0,47 ±0,04 >3000 --- 34,87 ±2,77 G 1,5,6,7,8,10 XVII D. bruxelensis n/d --- 534,08 ±110,43 591,88 ±176,25 722,40 ±388,29 C. boidini 243,33 ±42,91 0,19 ±0,09 468,81 ±4,08 <10 ---

En letras azules ser indica el perfil combinado del asilamiento nº 5, el cual produjo mayor cantidad de 4-etilfenol y 4-vinilguayacol. M= media, s.d.=desvío estándar, n/d = no detectable, (*) los números indican los tipos de levaduras killer de referencia. (#) origen del aislamiento; Superficie uva= a: Merlot, m: Malbec, T: Pinot Gris ; Diferentes etapas de fermentación: mp= Mosto Malbec y

NAT1, 9T1, T0BC= Mostos Cabernet Sauvignon

CONCLUSIONES • Los aislamientos de la especie P. guilliermondii presentan la capacidad de producir

compuestos fenólicos de tipo 4-etilfenol, 4-vinilfenol, 4-etilguayacol y 4-vinilguayacol en microvinificaciones.

• Los niveles de 4-etilfenol detectados en cultivos de P. guilliermondii en mosto estéril adicionado con ácido p-cumárico son menores que los alcanzados con la especie D. bruxellensis. No obstante, P. guilliermondii produce cantidades significativamente mayores del intermediario 4-vinilfenol con respecto a D. bruxellensis.

• Existe un comportamiento diferencial en la producción de estos compuestos por las diferentes cepas de P. guilliermondii.

• Utilizando el método RAPD-PCR se evidenció una baja variabilidad genética entre aislamientos de P. guilliermondii indígenas.

• La utilización en forma combinada del la técnica de RAPD con el cebador OPA 10 junto con el ensayo de sensibilidad a 10 levaduras killer de referencia, permite contar con una opción válida para discriminar diferentes cepas de levaduras de la especie P. guilliermondii, e incluso detectar aquellas capaces de producir las mayores concentraciones de 4-etilfenol.

• Aislamientos killer indígenas de la especie P. anomala, podrían ser tenidos cuenta como una alternativa interesante para el control de P. guilliermondii en vinos.

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