(SAR) de novas benziltioureias derivadas do isotiocianato de benzila

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Departamento de Medicamentos

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Marcela Jaqueline Braga de Paiva

ESTUDOS DE SÍNTESE E RELAÇÃO

ESTRUTURA-ATIVIDADE (SAR) DE NOVAS

BENZILTIOUREIAS DERIVADAS DO

ISOTIOCIANATO DE BENZILA (BITC) COM

ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO

Aedes aegypti

Rio de Janeiro

2011

Faculdade de Farmácia

ii


ESTUDOS DE SÍNTESE E RELAÇÃO ESTRUTURA-

ATIVIDADE (SAR) DE NOVAS BENZILTIOUREIAS

DERIVADAS DO ISOTIOCIANATO DE BENZILA (BITC)

COM ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO

Aedes aegypti

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como um dos requisitos parciais necessários à obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues (FF – UFRJ)

Co-orientador: Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral (FF – UFRJ)

Rio de Janeiro

2011

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

P149e Paiva, Marcela Jaqueline Braga de.

Estudos de Síntese e Relação Estrutura-Atividade (SAR) de

Novas Benziltioureias Derivadas do Isotiocianato de Benzila

(BITC) com Atividade Larvicida frente a Aedes aegypti / Marcela

Jaqueline Braga de Paiva. Orientador: Carlos Rangel

Rodrigues; co-orientador: Lucio Mendes Cabral. Rio de Janeiro:

UFRJ, Faculdade de Farmácia, 2011.

xx, 128f.: il.; 30 cm

Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) –

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de

Farmácia, Rio de Janeiro, 2011.

Inclui bibliografia.

1. Aedes aegypti. 2. BITC 3. Tioureias. 4.SAR. I. Rodrigues,

Carlos Rangel II. Cabral, Lucio Mendes

CDD 615.19

iv


ESTUDOS DE SÍNTESE E RELAÇÃO ESTRUTURA-

ATIVIDADE (SAR) DE NOVAS BENZILTIOUREIAS

DERIVADAS DO ISOTIOCIANATO DE BENZILA (BITC) COM

ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO

Aedes aegypti

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como um dos requisitos parciais necessários à obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Aprovada em 27 de setembro de 2011.

_____________________________________________

Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues – FF - UFRJ

_____________________________________________

Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral – FF – UFRJ

_____________________________________________

Profa. Dra. Estela Maris Freitas Muri – FF - UFF

_____________________________________________

Profa. Dra. Luiza Rosaria Sousa Dias – FF - UFF

_____________________________________________

Profa. Dra. Valéria Pereira de Sousa – FF - UFRJ

v

Aos meus anjos protetores, encarnados

e desencarnados, dedico esse trabalho.

vi

“Concedei-me, Senhor, a serenidade necessária para aceitar o que não posso

modificar, a coragem para modificar o que posso, e a sabedoria para distinguir

um do outro, vivendo um dia de cada vez, desfrutando um momento de cada

vez, aceitando as dificuldades como um caminho para alcançar a paz...”

Reinhold Niebuhr

vii

AGRADECIMENTOS

A Deus, a Jesus e a toda a espiritualidade amiga, que me levantaram nas

quedas e que me sustentaram durante toda a minha vida e que, nos períodos em que

mais precisei, me carregaram no colo amorosamente, agradeço infinitamente.

A minha mãe, meu pai, meus irmãos e sobrinhos, pelo ombro amigo e pelo

colo nas horas mais difíceis, registro aqui minha gratidão, que muitas vezes não

verbalizei.

Ao meu marido que, mesmo achando que tudo era muito fácil, nunca deixou

de estar ao meu lado quando o desânimo e a descrença vinham me visitar, agradeço

de coração. Sua simplicidade fez acreditar que as coisas não eram tão difíceis assim.

Aos meus orientadores, Carlos Rangel e Lucio Cabral, pela paciência e

compreensão e por não deixarem de acreditar na capacidade que, muitas vezes, eu

não sabia que existia em mim, serei eternamente grata.

Aos meus amigos queridos, Gil Viana e Lívia Rubatino, por toda ajuda e pelo

tempo dispendido ao meu lado, ajudando-me, dando-me forças e, até mesmo, me

carregando nos braços, sempre dizendo: “Vamos lá, você consegue”. Amo vocês

amigos, e não conheço palavras capazes de expressar todo o meu amor e gratidão.

Aos queridos companheiros do LabModMol, Uiaran, Ilídio e Ana Carolina por

tudo o que fizeram por mim e pelas minhas tioureias. Sem a ajuda de vocês, esse

trabalho não teria sido possível. Muito, muito obrigada.

À querida professora e, muitas vezes, orientadora, Lucia Sequeira, por sua

boa vontade ao esclarecer minhas dezenas de dúvidas, pelo carinho e pelas palavras

de apoio e coragem, deixo aqui registrada minha gratidão.

À professora Glória Braz, e à Larissa Rezende, do Laboratório de Vetores de

Doenças, por todo o auxílio, pela presteza e por possibilitarem a realização de grande

parte desse trabalho, meus sinceros agradecimentos.

À professora Gisela Dellamora, por sua compreensão, atenção e

benevolência de sempre: muito obrigada.

viii

Ao meu chefe e amigo, Luiz Eduardo Ghetti, por acreditar em mim e na minha

capacidade, serei sempre grata.

Aos colaboradores da Secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de

Farmácia, Thiago e Marcelo, pela presteza, sorriso e boa vontade de sempre, deixo

meu sincero agradecimento.

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, pela camaradagem

e pela ajuda sempre que foi necessário. Valeu, galera!

À bibliotecária Flor, pela Ficha Catalográfica.

A todos os meus amigos e familiares, que nunca me abandonaram, mesmo

quando nem eu mais acreditava em mim, minha profunda gratidão.

A todos aqueles que, seja em oração, gestos, olhares, palavras e

pensamentos, estiveram ao meu lado: muito, muito, muito obrigada.

ix

RESUMO

PAIVA, Marcela Jaqueline Braga. Estudos de síntese e relação estrutura-atividade

(SAR) de novas benziltioureias derivadas do isotiocianato de benzila (BITC) com

atividade larvicida frente ao Aedes aegypti. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação

(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

Aedes aegypti é o vetor de transmissão de doenças negligenciadas

como Febre Amarela, Febre do Chikungunya e Dengue. Considerando-se que ainda

não foram desenvolvidos medicamentos eficientes para o combate à Dengue; que se

faz necessário intensificarem-se as ações de prevenção e combate ao vetor; que a

resistência dos insetos aos inseticidas aumenta a cada dia e que o combate se torna

mais efetivo quando realizado na fase larvar do inseto, o presente trabalho visa a

demonstrar a atividade do BITC e de suas tioureias derivadas frente a larvas de

Aedes aegypti. Foram utilizadas larvas de 3º estádio (L3) obtidas a partir de ovos de

fêmeas sadias de uma criação cíclica. Foi avaliada a estabilidade do BITC frente a

diferentes excipientes, que poderiam compor uma futura formulação inseticida de

BITC ou benziltioureia. Além disso, as moléculas foram estudadas quanto à relação

estrutura-atividade. Foram obtidos parâmetros estruturais e estereoeletrônicos e os

mesmos correlacionados com a atividade. O efeito dos substituintes no anel fenila da

substituição R1 das N-benzil,N’-feniltioureias na atividade também foi avaliado. Os

resultados demonstraram que as tioureias, embora possuam maior estabilidade

química que o BITC são menos ativas. As benziltioureias mais ativas foram as

moléculas 24 (N-benzil,N’-(2,6-dimetilfenil)tioureia) e 27 (N-benzil,N’-(α-naftil) tioureia),

ambas com R1 = aromático dissubstituído. As análises de SAR e modelagem

x

molecular demonstraram não haver correlação clara e direta com os valores de HBD,

HBA, momento dipolo molecular e energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO

com a atividade larvicida. Por outro lado, os valores de pKa, clogP, distribuição das

densidades de HOMO e de LUMO, presença de substituintes nas posições 2, 4 e 6 do

anel fenila da substituição R1 das N-benzil,N’-feniltioureias parecem estar

relacionados à maior atividade larvicida, mostrando que valores de pKa e clogP em

torno de 15 e 3, respectivamente, densidade de HOMO sobre o anel aromático,

restrição conformacional orto,orto, presença de substituinte em para doador de

elétrons com baixa capacidade de formar ligações hidrogênio levariam a uma

benziltioureia mais atival, que poderia ser o composto 24b (N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-

metóxifenil)tioureia), ainda não sintetizado.

Palavras-chave: Aedes aegypti, BITC, tioureias, SAR.

xi

ABSTRACT

PAIVA, Marcela Jaqueline Braga. Estudos de síntese e relação estrutura-atividade

(SAR) de novas benziltioureias derivadas do isotiocianato de benzila (BITC) com

atividade larvicida frente ao Aedes aegypti. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação

(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

Aedes aegypti is the transmission vector of neglected diseases like

Yellow Fever, Chikungunya Fever and Dengue. Considering that are no effective

drugs to combat Dengue; that is necessary to intensify the prevention and vector

control; that the insects resistance to insecticides increases every day and that the

fight becomes more effective when performed in the larval stage of the insect, this

work studies the activity of benzyl isothiocyanate (BITC) and its thiourea derivatives

against Aedes aegypti larvae. Third instar larvae (L3) obtained from healthy eggs from

Aedes aegypti females of a breeding cycle were used. The BITC stability against

different excipients, which might constitute a future formulation for BITC or

benzilthiourea insecticide was evalueted. In addition, the molecules were studied on

their structure-activity relationship. The structural and stereoelectronic parameters

obtained were correlated with the activity. The effect of substituents of phenyl ring of

the R1 substitution of the N-benzyl,N'-phenylthioureas on activity was also evaluated.

The results showed that the thioureas, although have greater chemical stability that

BITC, are less active. The molecules 24 (N-benzyl,N’-(2,6-dimethylphenyl)thiourea)

and 27 (N-benzyl,N’-(α-naphthyl)thiourea), were the most active benzyllthiourea, both

with R1 = aromatic ring disubstituted. The SAR analysis and molecular modeling

showed no clear and direct correlation between the values of HBD, HBA, molecular

xii

dipole moment and energy of the frontier orbitals HOMO and LUMO and the larvicidal

activity. On the other hand, the pKa and clogP values, the distribution of densities of

HOMO and LUMO, the presence of substituents in positions 2, 4 and 6 of phenyl ring

of de substitution of the R1 substitution of N-benzyl,N'-phenylthioureas seem to be

related to higher larvicidal activity, indicating that pKa and clogP values next to 15 and

3, respectively, HOMO density on the aromatic ring, ortho,ortho conformational

restriction and presence of para substituent electron donor with low ability to form

hydrogen bonds would lead to an more active benzylthiourea, that could be the 24b

(N-benzyl, N'-(2,6-dimethyl ,4-methoxyphenyl)thiourea), not synthesized yet.

Keywords: Aedes aegypti, BITC, thiourea, SAR.

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mapa de distribuição das doenças tropicais negligenciadas (DTN) no mundo............................................................................................................. 22

Figura 2. Comportamento do mercado farmacêutico mundial frente às doenças......... 24

Figura 3. Estádios evolutivos do Aedes aegypti – fase aquática................................... 26

Figura 4. Distribuição global do vírus Chikungunya em 2007........................................ 31

Figura 5. Distribuição mundial de países ou áreas de risco de transmissão de Dengue, 2008................................................................................................. 34

Figura 6. Classificação das áreas de vulnerabilidade à Dengue no Brasil, 2010/2011. 34

Figura 7. Áreas de vulnerabilidade à Dengue em bairros do município do Rio de Janeiro............................................................................................................ 35

Figura 8. Taxa de incidência de Dengue. Brasil e grandes regiões, 1990-2010.......... 38

Figura 9. Mortes confirmadas por Dengue de 1990 a 2010.......................................... 38

Figura 10. Inseticidas reguladores do crescimento do inseto (IGR)................................ 41

Figura 11. Estruturas químicas de alguns inseticidas organoclorados............................ 44

Figura 12. Estruturas químicas de alguns inseticidas organofosforados......................... 45

Figura 13. Estruturas químicas de alguns inseticidas carbamatos.................................. 46

Figura 14. Piretrinas naturais........................................................................................... 47

Figura 15. Estruturas químicas das diferentes gerações de inseticidas piretróides........ 49

Figura 16. Hidrólise do glicosinolato de benzila catalisada pela mirosinase,produzindo BITC............................................................................................. 56

Figura 17. Molécula de ureia........................................................................................... 56

Figura 18. Formas tautoméricas das tioureias................................................................. 57

Figura 19. Estrutura geral das tioureias e padrões de substituição................................. 58

Figura 20. Obtenção de tioureia a partir de isotiocianato................................................ 59

xiv

Figura 21. Ilustração do afunilamento de candidatos a um novo fármaco na fase de P&D................................................................................................................ 60

Figura 22. Representação de uma molécula utilizando princípios de modelagem molecular........................................................................................................ 62

Figura 23. Posição de substituição das benziltioureias estudadas.................................. 74

Figura 24. Método de obtenção das benziltioureias estudadas....................................... 78

Figura 25. Estrutura geral das benziltioureias estudadas................................................ 78

Figura 26. Soluções utilizadas na avaliação da atividade larvicida do BITC................... 89

Figura 27. Atividade larvicida do BITC............................................................................ 90

Figura 28. Modelos gráficos para a molécula de BITC.................................................... 100

Figura 29. Conformações de menor energia das benziltioureias estudadas................... 101

Figura 30. Conformação mais estável das benziltioureias mais ativas........................... 102

Figura 31. Mapas de potencial eletrostático molecular (MEP) das benziltioureias estudadas............................................................................... 103

Figura 32. Densidades de HOMO das benziltioureias estudadas codificadas sobre uma superfície de van der Waals................................................................... 105

Figura 33. Densidades de LUMO das benziltioureias estudadas, geradas em uma superfície de densidade eletrônica constante de 0,002 e/ua3........................ 107

Figura 34. Conformações de menor energia das benziltioureias propostas.................... 110

Figura 35. Mapas de potencial eletrostático molecular (MEP) das benziltioureias propostas........................................................................................................ 111

Figura 36. Densidades de HOMO das benziltioureias propostas codificadas sobre uma superfície de van der Waals................................................................... 112

Figura 37. Densidades de LUMO das benziltioureias propostas, geradas em uma superfície de densidade eletrônica constante de 0,002 e/ua3........................ 113

xv

ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1. Histórico da Febre Amarela no Brasil de 1685 a 1998.................................. 29

Quadro 2. Atividades biológicas das tioureias e derivados............................................ 58

Quadro 3. Benziltioureias com R1 alifático..................................................................... 79

Quadro 4. Benziltioureias com R1 saturado alicíclico ou heterocíclico.......................... 79

Quadro 5. Benziltioureias com R1 aromático não-substituído........................................ 80

Quadro 6. Benziltioureias com R1 aromático orto-substituído........................................ 80

Quadro 7. Benziltioureias com R1 aromático meta-substituído...................................... 80

Quadro 8. Benziltioureias com R1 aromático para-substituído....................................... 81

Quadro 9. Benziltioureias com R1 aromático dissubstituído........................................... 81

Quadro 10. Diferenças entre o protocolo OMS e a metodologia utilizada....................... 83

ÍNDICE DE ESPECTROS DE RMN 1H

Espectro 1. BITC............................................................................................................ 87

Espectro 2. Polyquart H® em DMSO.............................................................................. 87

Espectro 3. Polyquart H® + BITC.................................................................................... 88

xvi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Excipientes testados com o BITC................................................................. 86

Tabela 2. Comparação entre atividade larvicida das benziltioureias e suas propriedades físico-químicas........................................................................ 95

Tabela 3. Comparação entre atividade larvicida das benziltioureias e suas propriedades eletrônicas moleculares teóricas............................................. 96

Tabela 4. Propriedades moleculares teóricas das benziltioureias propostas............... 109

Tabela 5. Teste larvicida para a benziltioureia 24a'...................................................... 115

ÍNDICE DE EQUAÇÕES

Equação1. Energia total do sistema................................................................................ 63

Equação2. Coeficiente de Partição................................................................................. 71

Equação3. Fórmula de Abbot.......................................................................................... 84

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

AChE - Acetilcolinesterase

AHJ - Análogo do Hormônio Juvenil

AM1 - Modelo de Austin 1 (Austin Model 1)

AMBER - Modelo assistido de construção e refinamento energético (Assisted Model Building and Energy Refinement)

BHC - Benzeno Hexacloro

BITC - Isotiocianato de Benzila (Benzyl Isotiocyanate)

BPU - Benzoil Fenil Ureias (Benzoyl Phenyl Urheas)

Bs - Bacillus sphaericus

Bti - Bacillus thuringiensis var israelensis

CADD - Design de Fármacos Auxiliado por Computador (Computer-Aided Drug Design)

CCF - Cromatografia em Camada Fina

CDC - Centros Americanos de Controle e Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and Prevention)

CHIKV - Vírus Chikungunya

CL50 - Concentração Letal para 50% da população

CL99 - Concentração Letal para 99% da população

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

clogP - logP calculado (Calculated logP)

DDT - Dicloro-Difenil-Tricloroetano

DENV - Virus Dengue

DTN - Doenças Tropicais Negligenciadas

ELISA - Teste ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

FAO - Organização Mundial de Alimentos e Agricultura (Food and Agriculture Organization)

FDA - Agência Americana de Alimentos e Drogas (Food and Drugs Agency)

FHD - Febre Hemorrágica da Dengue

GABA - Ácido Gama Amino Butírico (Gamma Amino Butyric Acid)

GCDPPH - Grupo de Colaboração para o Desenvolvimento de Pesticidas para Saúde Pública (Global Colaboration for Development of Pesticides for Public Health)

GSH - Glutation reduzido

HBA - Aceptor de Ligação Hidrogênio (Hydrogen Bond Acceptor)

HBD - Doador de Ligação Hidrogênio (Hydrogen Bond Donnor)

HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus)

HOMO - Orbital Molecular Ocupado de Maior Energia (Highest Occupied Molecular Orbital)

xviii

IDH - Índice de Desenvolvimento Humano

IGR - Regulador de Crescimento do Inseto (Insect Growth Regulator)

L3 - Larva de 3º estádio

LUMO - Orbital molecular não-ocupado (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)

MEP - Potencial Eletrostático Molecular (Molecular Eletrostatic Potential)

MM - Mecânica Molecular

MNDO - Negligência modificada da sobreposição diferencial (Modified Neglect of Differential Overlap)

MoReNAa - Rede Nacional de Monitoramento da Resistência do Aedes aegypti a Inseticidas

MW - Massa Molecular (Molecular Weight)

NAS - Academia nacional de ciências (National Academy of Sciences – USA)

OMS - Organização Mundial de Saúde

OPAS - Organização Pan-Americana de Saúde

P&D - Pesquisa e Desenvolvimento

PEAa - Programa de Erradicação do Aedes aegypti

PhRMA - Pesquisadores e fabricantes farmacêuticos da América (Pharmaceutical Research and Manufaturers of America)

PIACD - Plano de Intensificação das Ações de Controle da Dengue

pKa - - log Ka (Parâmetro para Grau de Ionização)

PM3 - Método Paramétrico 3 (Parametric Method 3)

PNCD - Programa Nacional de Controle da Dengue

PNH - Primatas Não Humanos

QSAR - Relação Quantitativa Estrutura-Atividade (Quantitative Structure-Activity Relationship)

QSPR - Relação Quantitativa Estrutura-Propriedade (Quantitative Structure-Property Relationship)

SAR - Relação Estrutura-Atividade (Structure-Activity Relationship)

SCF - Campo auto-consistente (Self-Consistent Field)

STO - Orbitais tipo Slater (Slater Type Orbitals)

TMS - Tetrametilsilano

WDI - Índice Mundial de Drogas (World Drug Index)

WHO - Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)

WHOPES - Esquema de avaliação de pesticidas da Organização Mundial de Saúde (WHO Pesticide Evaluation Shemme)

YFV - Vírus da Febre Amarela (Yellow Fever Virus)

xix

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 22

1.1 DOENÇAS NEGLIGENCIADAS 22

1.2 ARBOVIROSES E Aedes aegypti 24

1.2.1 Febre Amarela 28

1.2.2 Febre do Chikungunya 31

1.2.3 Dengue 32

1.3 CONTROLE DE VETORES 39

1.3.1 Controle Biológico 40

1.3.2 Controle Químico 42

1.3.2.1 Organoclorados 42

1.3.2.2 Organofosforados 44

1.3.2.3 Carbamatos 45

1.3.2.4 Piretróides 46

1.4 RESISTÊNCIA A INSETICIDAS 50

1.4.1 Redução na Taxa de Penetração 50

1.4.2 Resistência Metabólica 51

1.4.3 Alteração do Sítio-Alvo 51

1.5 ESTRATÉGIAS BRASILEIRAS DE COMBATE À DENGUE 52

1.6 GLICOSINOLATOS E ISOTIOCIANATOS 55

1.7 TIOUREIAS 56

1.7.1 Método de Obtenção de Tioureias 59

1.8 RELAÇÕES ESTRUTURA-ATIVIDADE 59

1.9 MÉTODOS DE CÁLCULO DE MODELAGEM MOLECULAR 61

1.9.1 Mecânica Molecular 62

1.9.2 Mecânica Quântica 64

1.9.2.1 Métodos Quânticos ab initio 64

xx

1.9.2.1.1 Função de base 65

1.9.2.2 Métodos Quânticos Semi-Empíricos 67

1.9.3 Descritores Moleculares 68

1.9.3.1 Energia dos Orbitais de Fronteira – HOMO e LUMO 68

1.9.3.2 Densidade dos Orbitais de Fronteira 69

1.9.3.3 Momento Dipolo Molecular 69

1.9.3.4 Parâmetros Energéticos 69

1.9.3.5 Modelos Gráficos 70

1.9.3.5.1 Mapa de Potencial Eletrostático Molecular (MEP) 70

1.9.3.5.2 Mapa de Densidade Eletrônica do LUMO 71

1.9.3.5.3 Mapa de Densidade Eletrônica do HOMO 71

1.9.4 Parâmetros Farmacocinéticos in silico 71

1.9.4.1 Coeficiente de Partição 71

2 JUSTIFICATIVA 73

3 OBJETIVOS 74

3.1 OBJETIVO GERAL 74

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 74

4 MATERIAL E MÉTODOS 75

4.1 MATERIAL 75

4.2 MÉTODOS 76

4.2.1 Avaliação da Estabilidade do BITC 76

4.2.2 Síntese das Benziltioureias 77

4.2.3 Tioureias utilizadas neste trabalho 78

4.2.4 Avaliação da Atividade Larvicida do BITC e das Benziltioureias Estudadas 82

xxi

4.2.5 Análise dos Dados 84

4.2.6 Estudos de SAR e Modelagem Molecular 84

4.2.7 Síntese das Benziltioureias sugeridas por SAR 85

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 86

5.1 ESTABILIDADE DO BITC FRENTE A DIFERENTES EXCIPIENTES 86

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVICIDA DO BITC 89

5.3 ESTUDOS DE SAR E MODELAGEM MOLECULAR 93

5.4 IDEALIZAÇÃO DAS NOVAS BENZILTIOUREIAS A SEREM SINTETIZADAS 108

5.5 SÍNTESE DAS NOVAS BENZILTIOUREIAS 113

5.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LARVICIDA DA NOVA BENZILTIOUREIA 115

6 CONCLUSÕES 116

7 REFERÊNCIAS 117

22

1 INTRODUÇÃO

1.1 DOENÇAS NEGLIGENCIADAS

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as doenças negligenciadas

são “um conjunto de doenças associadas à situação de pobreza, às precárias

condições de vida e às iniquidades em saúde”. Pode-se dizer que doenças

negligenciadas são doenças que prevalecem em condições de pobreza, mas também

são importantes para que o quadro de desigualdade seja mantido, visto que atrasam

o desenvolvimento dos países (DECIT/MS, 2010).

Os principais países com os mais baixos índices de desenvolvimento humano

(IDH) e maior prevalência de doenças tropicais negligenciadas (DTN) estão

localizados em regiões tropicais e subtropicais do mundo (Figura 1). O Brasil possui o

70o índice de desenvolvimento humano (IDH) do mundo. Nove das dez doenças

tropicais negligenciadas estabelecidas pela OMS estão presentes no Brasil

(LINDOSO e LINDOSO, 2009).

Figura 1 – Mapa de distribuição das doenças tropicais negligenciadas (DTN) no mundo. Fonte: Adaptado de LINDOSO e LINDOSO, 2009

Figura 1 – Mapa de distribuição das doenças tropicais negligenciadas (DTN) no mundo. Fonte: Adaptado de LINDOSO e LINDOSO, 2009

5 DTN 6 DTN 7 DTN

23

Leishmaniose, tuberculose, dengue e hanseníase estão presentes na maioria

dos estados do território brasileiro. Mais de 90% dos casos de malária ocorrem na

região norte do país, enquanto a filariose linfática e a oncocercose ocorrem em surtos

em determinadas regiões. As regiões norte e nordeste do Brasil possuem o menor

IDH e as maiores taxas de DTN. Malária e tuberculose podem ser citadas como

doenças negligenciadas, enquanto dengue, doença de Chagas, esquistossomose,

hanseníase, leishmaniose, doença do sono e oncocercose são exemplos de doenças

conhecidas como “extremamente negligenciadas”. De acordo com dados da OMS,

mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais doenças

negligenciadas, número este que representa cerca de um sexto da população mundial

(MENDONÇA, SOUZA e DUTRA, 2009; LINDOSO e LINDOSO, 2009).

Apesar do financiamento oferecido às pesquisas relacionadas às doenças

negligenciadas, nem todo o conhecimento produzido é revertido em avanços

terapêuticos, tais como novos métodos diagnósticos, fármacos e vacinas. Uma razão

para esse quadro é o baixo interesse da indústria farmacêutica no assunto, que pode

ser justificado pelo baixo potencial de retorno lucrativo para a indústria, haja vista que

a população atingida é, principalmente, de baixa renda e vive nos países em

desenvolvimento. Estes países, que representam 80% da população mundial,

respondem por apenas 20% do mercado de medicamentos. Menos de 1% dos mais

de 1300 novos medicamentos desenvolvidos nos últimos vinte e cinco anos foram

destinados a essas doenças.

Cerca de 90% dos recursos para pesquisa e desenvolvimento no setor

farmacêutico são destinados a medicamentos contra doenças que atingem 10% da

população mundial, como hipertensão e diabetes (Figura 2). Para a população dos

países em desenvolvimento, esse desequilíbrio existente entre suas necessidades e a

disponibilidade de medicamentos é muito prejudicial. A doença do sono, por exemplo,

atinge quinhentas mil pessoas e ameaça outras sessenta milhões na África. Apesar

disso, até pouco tempo atrás, os pacientes tinham como única alternativa de cura um

tratamento à base de arsênico que, além de doloroso, matava uma a cada vinte

pessoas que se submetiam a ele. Já a dengue atinge cerca de cinquenta milhões de

pessoas em mais de cem países. A malária, para a qual não há cura 100% eficaz,

infecta mais de trezentos milhões e mata um milhão de pessoas a cada ano

(MENDONÇA, SOUZA e DUTRA, 2009; LINDOSO e LINDOSO, 2009).

24

Figura 2 – Comportamento do mercado farmacêutico mundial frente às doenças

Fonte: www.dndi.org.br. Acessado em 27/06/2011

1.2 ARBOVIROSES E Aedes aegypti

O clima tropical do Brasil favorece a disseminação das chamadas arboviroses,

doenças transmitidas por picadas, secreções ou contato com insetos, principalmente

aqueles da família Culicidae, os mais importantes hematófagos com grande

adaptabilidade biológica, fato que permite sua existência na Terra há mais de 30

milhões de anos (NEVES, 2005).

As arboviroses representam um grande número de doenças infecciosas

emergentes e ressurgentes em humanos e animais. Os arbovírus, vírus transmitidos

por esses insetos, podem ser considerados incomuns pelo fato de se replicarem em

diferentes hospedeiros, como vertebrados e artrópodes. Essa característica peculiar

leva a uma infecção vitalícia persistente nos artrópodes e a uma infecção aguda,

usualmente de curta duração, nos vertebrados. Os 3 estágios determinantes para a

eficiência de um artrópode como vetor para um arbovírus são: necessidade de

ingestão de quantidade suficiente de sangue virêmico para infectar as células

intestinais; nas células intestinais, replicação suficiente dos vírus para atingirem o

sistema circulatório e, por último, a infecção dos outros tecidos do inseto. O

mesentério do mosquito é a maior barreira à transmissão do patógeno, sendo o

ambiente de interação viral e replicação antes da disseminação para outros órgãos e

Tecidos, como as glândulas salivares e ovários, entre outros (TCHANKOUO-

NGUETCHEU et al., 2010).

25

Aedes aegypti é uma espécie do reino Animalia, filo Arthropoda, classe Insecta,

ordem Diptera, subordem Nematocera, família Culicidae, subfamília Culicinae, gênero

Aedes, subgênero Stegomyia. Menor que os mosquitos comumente conhecidos, o

Aedes aegypti é preto com pequenos riscos brancos no dorso, na cabeça e nas

pernas. Suas asas são translúcidas e o ruído que produzem é praticamente inaudível

ao ser humano (ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e

GLASSER, 2002).

Uma fêmea pode dar origem a 1.500 mosquitos durante a sua vida. Os ovos

são distribuídos por diversos criadouros – estratégia que garante a dispersão e

preservação da espécie, sendo depositados pelas fêmeas alguns milímetros acima do

nível d’água, ficando aderidos às paredes internas dos criadouros (ARAÚJO,

ARAÚJO-JORGE e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

Inicialmente, os ovos de Aedes aegypti possuem cor branca e, com o passar

do tempo, escurecem devido ao contato com o oxigênio. O ovo do Aedes aegypti

mede aproximadamente 0,4 mm de comprimento e é de difícil observação. Os ovos

adquirem resistência ao ressecamento muito rapidamente, em apenas 15 horas após

a postura. A partir de então, podem resistir a longos períodos de dessecação – até

450 dias. Esta resistência representa uma grande vantagem para o mosquito, visto

que permite que os ovos sobrevivam por muitos meses em ambientes secos, até que

o próximo período chuvoso e quente propicie a eclosão. A resistência à dessecação

permite também que os ovos sejam transportados a grandes distâncias, em

recipientes secos (ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e

GLASSER, 2002).

Após a oviposição, inicia-se o período de incubação. Em condições favoráveis

de temperatura e umidade, esse período dura de 2 a 3 dias, quando ocorrerá a

eclosão. O desenvolvimento embrionário ocorre geralmente após a deposição dos

ovos, sendo influenciado principalmente pela temperatura e umidade, sendo

concluído em 48 horas. A diapausa na fase do ovo caracteriza-se pela suspensão

temporária da eclosão após o término do desenvolvimento embrionário. Para

interromper a diapausa, é necessário o contato do ovo com a água ou sua submersão

nela. Com o aumento das chuvas e da temperatura no verão, criadouros são

reabastecidos com água, possibilitando o processo de eclosão, originando as larvas,

26

que passam por 4 estádios1 (L1 a L4) até atingirem a fase de pupa (figura 3). Essas

larvas têm grande mobilidade e passam a maior parte desse período alimentando-se

de substâncias orgânicas existentes na água, tais com bactérias, fungos e

protozoários, através da filtração, que constitui a forma mais comum de alimentação,

podendo uma só larva filtrar até 2 litros de água por dia. Por não selecionarem

alimento, durante esse período, é que se encontra a chave para a atuação dos

larvicidas, que são ingeridos pelas larvas como alimento (ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE

e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

Figura 3 - Estádios evolutivos do Aedes aegypti – fase aquática

Fonte: EMBRAPA

As larvas de Aedes aegypti não toleram grandes concentrações de substâncias

orgânicas na água e não se adaptam a viver na água em movimento. Mesmo as

espécies encontradas em rios e riachos vivem em locais de água quase parada.

Embora aquáticas, as larvas respiram oxigênio do ar, necessitando atingir a superfície

da água e ligar-se através de um sifão respiratório. As fases de larva e pupa têm

desenvolvimento rápido, devido à variação no volume de líquido dos criadouros,

causada pela evaporação e pelas chuvas (ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE e

MEIRELLES, 2011).

O ciclo de vida do Aedes aegypti varia de acordo com a temperatura,

disponibilidade de alimentos e quantidade de larvas existentes no mesmo criadouro,

sendo a competição de larvas por alimento um obstáculo ao amadurecimento do

inseto para a fase adulta. A pupa não se alimenta, motivo pelo qual raramente é

1 Estádio: Intervalo entre duas mudas, consecutivas, da larva dos insetos (Dicionário Michaelis, 2009)

27

afetada pela ação de larvicidas. A duração da fase pupal é de 2 dias, em média. Em

condições ambientais favoráveis, após a eclosão do ovo, o desenvolvimento do

mosquito até a forma adulta pode levar um período de 10 dias (ARAÚJO, ARAÚJO-

JORGE e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

Machos e fêmeas do Aedes aegypti alimentam-se de substâncias açucaradas,

como néctar e seiva e, dentro de 1 a 3 dias de nascidos, os agora adultos copulam e

somente a fêmea busca sua primeira refeição sanguínea – hematofagia - para a

oviposição. O sangue é o alimento necessário à maturação dos ovos. Geralmente, a

hematofagia é mais voraz a partir do segundo ou terceiro dia depois da emergência

da pupa e da cópula com o macho. Essas fêmeas, em busca do alimento capaz de

maturar seus ovos, sofrem dispersão espontânea de trinta a cinquenta metros, o que

limita seu percurso a, no máximo, duas casas diferentes e vizinhas, onde picam os

humanos nas regiões dos pés, tornozelos e pernas, uma vez que têm o hábito de voar

à altura máxima de meio metro do solo. Uma vez infectada por um Flavivirus ou

Alphavirus, a fêmea do Aedes aegypti permanece infectada e infectante pelo resto de

sua vida, mesmo após repetidos repastos em humanos, copulando uma única vez,

assegurando sua fecundidade até o fim de seu ciclo de vida, que leva em torno de

quarenta e cinco dias. Os vírus multiplicam-se no intestino médio dessas fêmeas e

infectam outros tecidos, chegando, finalmente, às glândulas salivares. Cerca de sete

dias após ingerir o sangue infectado pelos vírus, a fêmea do Aedes aegypti passa a

transmitir a doença, ratificando que esta permanece infectada até sua morte

(ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE e MEIRELLES, 2011; DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

O Aedes aegypti foi trazido da África (Aedes = odioso; aegypti = egípcio) para a

América durante a colonização e a escravidão, disseminou-se para toda a faixa

tropical e, em função de seu modo de reprodução peculiar, é hoje considerado

cosmopolita. A partir de 1967, tornou-se ainda mais conhecido, em vista do seu alto

potencial na transmissão de Dengue e Febre Amarela (BRAGA e VALLE, 2007).

Hoje, a espécie Aedes aegypti apresenta-se distribuída mundialmente, sendo

encontrada, geralmente, entre as latitudes 35° Norte e 35° Sul (isotermas de inverno

de 10°C em latitudes norte e sul). Segundo Githeko e colaboradores (2000), projeções

de elevação de 2ºC da temperatura no planeta para o fim do século XXI

provavelmente aumentarão a distribuição mundial do Aedes aegypti. Sua distribuição

é também restrita à altitude. Embora não seja comumente encontrado em regiões de

28

altitude superior a 1000 metros, exemplares já foram detectados, na Índia e na

Colômbia, a mais de 2000 metros acima do nível do mar (BRAGA e VALLE, 2007).

O Aedes aegypti foi responsabilizado pela transmissão da Febre Amarela em

1881, por Carlos J. Finlay. Os primeiros registros de A. aegypti no Brasil datam de

1898 (Lutz) e 1899 (Ribas). Em 1906, as primeiras evidências de que o mosquito

também era o vetor de Dengue foram publicadas por Brancroft, o que foi confirmado

no mesmo ano por Agramonte e em 1931 por Simmons (BRAGA e VALLE, 2007).

Presente principalmente na América Central, América do Sul, Ásia e África, o

Aedes aegypti é sabidamente o vetor de transmissão de vírus do gênero Flavivirus,

agentes etiológicos de doenças como Dengue e Febre Amarela (SÁ et al., 2009), e de

vírus do gênero Alphavirus, agentes etiológicos da febre do Chikungunya (SVS/MS -

Nota Técnica 162/2010).

1.2.1 Febre Amarela

A Febre Amarela, transmitida pelo Aedes aegypti e por outras espécies do

gênero Aedes, é causada pelos vírus do gênero Flavivírus, família Flaviviridae. Esses

agentes consistem em vírus RNA de fita simples e polaridade positiva, conhecidos

como Vírus da Febre Amarela (YFV, do inglês Yellow Fever Virus) (VASCONCELOS,

2010).

A Febre Amarela apresenta-se sob duas formas epidemiologicamente distintas:

Febre Amarela silvestre e Febre Amarela urbana, sendo as diferenças entre as duas

formas relativas à localização geográfica, espécie vetorial e tipo de hospedeiro. A

Febre Amarela silvestre é uma infecção acidental, resultante da introdução do homem

no ciclo enzoótico natural, constituindo uma grave ameaça às populações rurais e

risco permanente à introdução do vírus nas grandes cidades e pequenas localidades

infestadas pelo Aedes aegypti. Na forma silvestre, os primatas não humanos são os

principais hospedeiros do vírus, principalmente os macacos dos gêneros Cebus

(macaco prego), Alouatta (guariba), Ateles (macaco aranha) e Callithrix (sagui)

(AGÊNCIA FIOCRUZ DE NOTÍCIAS, 2010).

A Febre Amarela urbana foi considerada erradicada no Brasil desde 1942, no

entanto, a Febre Amarela silvestre não é erradicável, já que possui uma circulação

29

natural entre primatas das florestas tropicais (AGÊNCIA FIOCRUZ DE NOTÍCIAS,

2010).

Um breve resumo de mais de 300 anos de curso (1685 a 1998) da história da

Febre Amarela e do percurso dos vetores envolvidos com essa doença no Brasil,

encontra-se descrito no Quadro 1.

Quadro 1 – Histórico da Febre Amarela no Brasil de 1685 a 1998

ANO FATO

1685 Primeira epidemia de Febre Amarela no Brasil (Recife/PE).

1686 Epidemia em Salvador/BA (900 óbitos).

1691 Primeira campanha sanitária oficial no Brasil (Recife /PE).

1849Reaparecimento da Febre Amarela em Salvador (2800 óbitos) e surgimento no estado do Rio de Janeiro (4160 óbitos).

1881 Carlos Finlay comprova que o Aedes aegypti é transmissor da Febre Amarela.

1901 Emilia Ribas inicia em Sorocaba/SP a primeira campanha contra a Febre Amarela.

1903 Oswaldo Cruz cria o Serviço de Profilaxia da Febre Amarela.

1909 Erradicada a Febre Amarela da capital federal (Rio de Janeiro/RJ).

1928Nova epidemia de Febre Amarela no Rio de Janeiro (738 casos). Professor Clementino Fraga organiza campanha para combate ao mosquito na fase larvar.

1931 Adoção de técnica de combate às larvas de Aedes aegypti com petróleo.

1937 Surgimento da vacina anti-amarílica.

1947 Adotado o uso do diclo-difenil-tricloroetano (DDT) no combate ao Aedes aegypti.

1958 A XV Conferência Sanitária Panamericana declara o Aedes aegypti erradicado do Brasil.

1972 Epidemia de Febre Amarela silvestre em Goiás (71 casos e 44 óbitos).

1978/84 Registrada a presença do Aedes aegypti na maioria dos estados brasileiros.

1993 Epidemia de Febre Amarela silvestre no Maranhão (12 óbitos).

1996 Surto de Febre Amarela silvestre no Amazonas (12 óbitos).

1997 Confirmada a presença do vetor em todos os estados brasileiros (2719 municípios).

1998 Surto de Febre Amarela silvestre no Pará (9 óbitos).

Fonte: Manual de Vigilância Epidemiológica em Febre Amarela. Ministério da Saúde, Brasília, 1999

Os principais sintomas da Febre Amarela aparecem, geralmente, de três a seis

dias após a picada do Aedes aegypti (período de incubação) e consistem em febre

alta, mal-estar, cefaleia, dor muscular, cansaço, calafrios, vômito e diarreia. Em cerca

de 15% dos casos podem ser observados sintomas graves como icterícia,

hemorragias, comprometimentos renais, hepáticos, pulmonares e cardíacos, podendo

levar à morte. Cerca de 90% dos indivíduos infectados pelo vírus da Febre Amarela

30

são assintomáticos ou apresentam sintomas leves da doença, com duração de cerca

de dois dias. A letalidade da doença varia entre 5% a 50% (AGÊNCIA FIOCRUZ DE

NOTÍCIAS, 2010).

A partir de 2008, quando se observou a re-emergência do vírus da Febre

Amarela nas regiões Centro Oeste, Sudeste e Sul do Brasil, o Sistema Nacional de

Vigilância e Controle da Febre Amarela iniciou o monitoramento dos casos humanos

suspeitos e as epizootias de primatas não humanos (PNH), no período que antecede

o período sazonal de transmissão do vírus no Brasil, nos meses de dezembro a maio.

A ocorrência de casos humanos de Febre Amarela foi registrada em dezembro de

2008 e se estendeu até o final de abril, com o último registro de caso humano na

região afetada dos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul. Após esse período,

mais três casos humanos confirmaram-se em regiões consideradas endêmicas para a

Febre Amarela nos estados de Minas Gerais e Mato Grosso, sendo, provavelmente,

áreas silvestres, rurais ou de floresta (SVS/MS/BRASIL, 2009).

Há uma extensa área geográfica considerada de risco para Febre Amarela

silvestre, onde a vacinação é adotada como procedimento de rotina para a população

residente, a partir de nove meses de idade. Sem periodicidade definida, e

eventualmente, o vírus da Febre Amarela surge em novas áreas geográficas,

podendo invadir áreas onde não tem sido documentado durante anos, caracterizando

assim uma emergência de saúde pública de importância nacional em Febre Amarela

(SVS/MS/BRASIL, 2009).

Os fatores associados à emergência e dinâmica da transmissão da Febre

Amarela nos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul nos anos de 2008 e 2009

são: a grande população humana suscetível; a elevada prevalência de vetores e

hospedeiros (primatas não humanos); condições climáticas favoráveis, sobretudo o

excesso de chuvas no verão; a emergência de uma nova linhagem viral e a circulação

de pessoas ou macacos infectados em fase virêmica (VASCONCELOS, 2010).

31

1.2.2 Febre do Chikungunya

A Febre do Chikungunya, causada pelo vírus CHIKV, gênero Alphavirus,

família Togaviridae, é uma arbovirose emergente e tem o Aedes aegypti como

principal vetor, onde o vírus é endêmico, na África e na Ásia, além de outra espécie

do gênero Aedes (Aedes albopictus). (SVS/MS - Nota Técnica 162/2010). A doença

recebeu esse nome a partir da língua Kimakonde da Tanzânia e Moçambique, na qual

a palavra chikungunya significa “aquela que contorce ou dobra”, uma alusão aos

sintomas da doença (THIBOUTOT et al., 2010).

O vírus circula na África, Ásia e em algumas ilhas do Oceano Pacífico (Figura

4). Apesar de não haver relatos de circulação do CHIKV nas Américas, o risco de sua

introdução é alto, corroborado pela presença do Aedes aegypti e pelo intenso fluxo de

viagens internacionais, associados à susceptibilidade da população (SVS/MS - Nota

Técnica 162/2010).

Figura 4 – Distribuição global do Vírus Chikungunya em 2007Fonte: http://www.mosquitaire.com/cms/website.php?id=/en/tigermosquitos/chikungunya.htm

Acessado em 27/06/2011

A Febre do Chikungunya é usualmente caracterizada, além de febre, por

artralgia e mialgia, com tempo de incubação relativamente curto, requerendo somente

2 a 6 dias, com os sintomas surgindo 4 a 7 dias após a infecção. É uma das seis

principais doenças endêmicas transmitidas por vetor na Índia (KUMAR et al., 2010).

Países com atividade endêmica do CHIKV

32

Muitos viajantes foram contaminados pelo CHIKV após visitarem áreas com

populações ativamente infectadas. Tais casos foram documentados em países da

Europa, Austrália, Ásia e Estados Unidos. Os Estados Unidos já registraram pelo

menos 12 casos de CHIVK associados a viagens, enquanto a França reporta 850

casos e o Reino Unido, 93. Além disso, viajantes infectados pelo CHIKV foram

também diagnosticados na Austrália, Bélgica, Canadá, República Tcheca, Guiana

Francesa, Alemanha, Hong Kong, Itália, Japão, Kênia, Malásia, Martinica, Noruega,

Suíça e Sri Lanka (THIBOUTOT et al., 2010).

No Brasil, no ano de 2010, foram diagnosticados 3 casos de viajantes

infectados pelo CHIKV. Em junho de 2010, a Organização Pan-Americana da Saúde

(OPAS) e o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), realizaram

uma reunião no Peru para elaborarem um “Guia de Preparação e Resposta para a

Introdução do Vírus Chikungunya nas Américas”. Logo após essa reunião, a

Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde do Brasil (SVS/MS),

realizou uma série de atividades, visando implantar a vigilância do vírus Chikungunya

no país. Dentre elas, reuniões com especialistas das áreas de epidemiologia,

entomologia, controle de vetores, laboratório, atenção ao paciente e comunicação

social do Ministério da Saúde, Fiocruz, Instituto Evandro Chagas, universidades e

OPAS, objetivando preparar as diretrizes do Brasil da vigilância e resposta a uma

possível entrada do vírus Chikungunya no país; tradução para o português do guia

elaborado pela OPAS; implantação de capacidade para realização do diagnóstico

laboratorial no Instituto Evandro Chagas, entre outras (SVS/MS - Nota Técnica

162/2010).

1.2.3 Dengue

Pertencentes à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, os vírus da Dengue

(DENV) apresentam-se como agentes esféricos, de 40 a 50 nm de diâmetro,

envolvidos por envelope lipoproteico, com material genético consistindo em uma fita

positiva de RNA (GUEDES et al., 2004). O vírus da Dengue mantém-se na natureza

pela multiplicação em mosquitos hematófagos do gênero Aedes, principalmente a

espécie Aedes aegypti (FIOCRUZ, 2011a).

33

Os quatro sorotipos, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, podem causar

desde a forma clássica da Dengue até formas mais graves (FIOCRUZ, 2011a).

Há relatos de existência da Dengue desde meados do século XIX e início do

século XX no Brasil (FIOCRUZ, 2011a).

A circulação dos vírus da Dengue foi comprovada laboratorialmente no ano de

1982, a partir do isolamento dos sorotipos DENV-1 e DENV-4, no município de Boa

Vista, Roraima. Após isso, não houve novas notificações de casos por 4 anos. No ano

de 1986, o DENV-1 foi isolado no Estado do Rio de Janeiro, após a disseminação de

uma grande epidemia e dispersão do sorotipo DENV-1 para diversas regiões do

Brasil. Com a introdução do sorotipo DENV-2, observada no estado do Rio de

Janeiro, foi confirmado o primeiro caso de Dengue hemorrágico por esse sorotipo,

com o aparecimento concomitante de formas graves da doença também em outras

regiões. No início de 2001, isolou-se o sorotipo DENV-3 no município fluminense de

Nova Iguaçu. Em 2010, o sorotipo DENV-4 foi isolado após a detecção de casos em

dois estados da região norte do Brasil (Roraima e Amazonas), sendo isolado em outro

estado da região, o Pará, já em janeiro de 2011 (FIOCRUZ, 2011a).

Atualmente, a Dengue é mundialmente considerada a mais importante doença

transmitida por mosquito. Nos últimos 50 anos, a incidência aumentou 30 vezes.

Estima-se que 2,5 bilhões de pessoas vivem em áreas onde o vírus da Dengue pode

ser transmitido. Mais de 50 milhões de infecções ocorrem anualmente sendo cerca de

500 mil o número de casos de Dengue hemorrágica e 22 mil o número de mortes

(GALLI e CHIAVARALOTTI NETO, 2008).

Até 1970, somente nove países apresentaram casos de Dengue hemorrágica.

Desde então, esse número aumentou quatro vezes e seu crescimento é contínuo,

segundo dados da OMS (Figura 5). Entre 1986 e 1987, a Dengue atingiu os estados

do Rio de Janeiro, Ceará, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Minas Gerais e São Paulo e,

em todos os casos, o vetor foi o Aedes aegypti. Em 1997 e 1998, houve um aumento

significativo no número de casos e, nos dias de hoje, a Dengue já é considerada uma

epidemia, tendo como agravante as formas hemorrágicas e letais da doença (GALLI e

CHIAVARALOTTI NETO, 2008; WHO, 2010).

34

Figura 5 – Distribuição mundial de países ou áreas de risco de transmissão de Dengue, 2008

Fonte: WHO 2010

Os estados brasileiros e os bairros do município do Rio de Janeiro identificados

como principais áreas de risco para o período de 2010/2011 são apresentados nas

figuras 6 e 7.

Figura 6 – Classificação das áreas de vulnerabilidade à Dengue no Brasil, 2010/2011.

Fonte: MS/SVS - NOTA TÉCNICA N.º 118/2010

Países ou áreas com risco de transmissão de dengue

35

Figura 7 - Áreas de vulnerabilidade à Dengue em bairros do município do Rio de Janeiro, 2010/2011.

Fonte: MS/SVS - NOTA TÉCNICA N.º 118/2010

A insuficiência de serviços básicos de saneamento nos grandes centros

urbanos, principalmente, exige que a população mais carente reserve água nos

domicílios, muitas vezes em recipientes sem tampas. Essa situação leva ao aumento

de criadouros potenciais do Aedes aegypti, que apresentam alta produtividade. De

maneira análoga, o serviço irregular de coleta de lixo leva à manutenção de

criadouros em diversas áreas, tornando-as grandes focos de disseminação do vetor e

áreas ideais para a transmissão da Dengue. Por outro lado, há diversos criadouros no

meio ambiente que não são dependentes das condições de saneamento em áreas

com elevado padrão sócio-econômico. Esses criadouros, como piscinas sem

tratamento adequado, vasos de plantas com água e características arquitetônicas,

favorecem igualmente a proliferação do mosquito (NT 118/CGPNCD/DEVEP/SVS/

MS/BRASIL, 2010).

O ciclo de transmissão da Dengue se inicia quando a fêmea do mosquito pica

um indivíduo. Após a picada, inicia-se o ciclo de replicação viral nas células estriadas,

lisas, fibroblastos e linfonodos locais, a seguir ocorre a viremia, com a disseminação

do vírus no organismo do indivíduo. Os primeiros sintomas, como febre, dor de

cabeça e mal-estar, surgem após um período de incubação que pode variar de 2 a 10

36

dias. Uma vez infectado por um dos sorotipos do vírus, o indivíduo adquire imunidade

àquele sorotipo específico, de forma que não existe transmissão da doença sem a

presença do vetor, isto é, através do contato entre indivíduos doentes e pessoas

saudáveis (ARAÚJO, ARAÚJO-JORGE e MEIRELLES, 2011).

Entre os anos de 2000 e 2009, cerca de quatro milhões de casos de Dengue

foram notificados no Brasil, destacando-se os anos de 2002 e 2008, quando houve as

maiores epidemias já registradas (Figuras 8 e 9). A figura 8 apresenta um histórico de

evolução da Dengue de 1990 a 2010 no Brasil e em suas regiões, enquanto a figura 9

mostra os casos em que a doença foi fatal no mesmo período.

Durante a década de 2000, os sorotipos predominantes do vírus da Dengue

alternaram-se, o que resultou em ciclos de alta transmissão para cada sorotipo. O

pico de transmissão de DENV-3 ocorreu em 2002/2003, o DENV-2 em 2008. Em

2009, ressurgiu o DENV1, predominando nos primeiros meses do ano de 2010, nas

regiões Centro-Oeste, Sudeste e Sul do Brasil. Esta situação indica a possibilidade de

ocorrência de novas epidemias causadas pelo sorotipo DENV-1, considerando que

grande parcela da população não teve contato com este sorotipo desde o início da

década. A alternância de circulação dos sorotipos do DENV é um sinal de alerta para

a possibilidade de crescimento da circulação de um determinado sorotipo na próxima

estação de transmissão. Entretanto, deve-se salientar que o mesmo não ocorre para

o DENV-4, visto que praticamente toda a população brasileira encontra-se vulnerável

a este sorotipo (NT 118/CGPNCD/DEVEP /SVS/MS/BRASIL, 2010).

A Dengue, por ser a doença transmitida pelo Aedes aegypti mais difundida no

mundo, tem seu mecanismo de transmissão bastante estudado e compreendido.

Sabe-se que os vírus da Dengue são transmitidos ao ser humano através da picada

de fêmeas do Aedes aegypti (transmissão horizontal). Há muito, discute-se se, uma

vez infectadas, essas fêmeas são capazes de transmitir os vírus à sua progênie

(transmissão transovariana ou vertical) (GUEDES et al., 2004).

Estudos vêm sendo realizados com o objetivo de se esclarecer um dos grandes

mistérios acerca da epidemiologia da Dengue, que é o mecanismo de sobrevivência

dos sorotipos do vírus nos períodos entre uma epidemia e outra, não sendo ainda

totalmente compreendido como o DENV mantém-se na natureza durante a ausência

de hospedeiros vertebrados ou quando as condições climáticas são desfavoráveis à

atividade do Aedes aegypti. Embora vários autores já tenham demonstrado a

37

transmissão transovariana com mosquitos artificialmente infectados com o DENV, faz-

se primordial o estudo do tipo de transmissão em mosquitos naturalmente infectados.

Observa-se uma alta taxa de mortalidade e diminuição da fertilidade em mosquitos

infectados com o sorotipo 2 (DENV-2) (GUEDES et al., 2004).

Estudos realizados em Fortaleza/CE mostram que larvas de Aedes aegypti

provenientes de ovos coletados em diversos bairros da região metropolitana

apresentaram elevada taxa de infecção pelo vírus da Dengue, demonstrando

reatividade para os três sorotipos testados DENV-1, DENV-2 e DENV-3, quando

submetidas ao método de ELISA indireto, sugerindo que, quando os ovos de Aedes

aegypti permanecem no ambiente por longos períodos, as chances de ocorrência de

transmissão vertical aumentam. O trabalho mostra que a presença do vírus nas larvas

é mantida por várias gerações em condições naturais (GUEDES et al., 2004).

Resultados semelhantes foram observados na Índia, onde se relatou uma

elevada taxa de transmissão do sorotipo 3 (DENV-3) de mosquitos coletados no meio

ambiente. Pesquisadores indianos descreveram que, embora a base molecular da

entrada e subsequente replicação do vírus da Dengue nas células do mosquito,

especialmente durante transmissão transovariana, não tenha sido ainda descrita, as

membranas dos ovários dessas fêmeas parecem ser sítios alvos de internalização

dos vírus no interior das células ovarianas desses mosquitos, tendo como base o

modo descrito de invaginação para entrada e subsequente dissolução da membrana

da célula hospedeira por ácido clorídrico (HCl) e proteases, como descrito para

células humanas. A composição proteômica das células ovarianas teria um papel

importante na entrada do vírus e sua subsequente replicação intracelular. No trabalho,

também utilizando larvas de Aedes aegypti coletadas de recipientes domésticos e

peridomésticos de áreas urbanas e rurais indianas, os pesquisadores relatam uma

associação dessas proteínas ovarianas com a transmissão transovariana do DENV.

Porém, na conclusão, os pesquisadores enfatizam a necessidade de se estudar mais

profundamente a exata relação causa-efeito entre a proteína ovariana específica e a

transmissão vertical do vírus (ANGEL, SHARMA e JOSHI, 2008).

38

Figura 8 – Taxa de Incidência de Dengue. Brasil e Grandes Regiões, 1990-2010.

Fonte: http://portal.saude.gov.br. Acessado em 07/04/2011

Figura 9 – Mortes confirmadas por Dengue de 1990 a 2010.

Fonte: http://noticias.r7.com/saude/noticias. Publicado em 01/09/2010. Acessado em 07/04/2011

39

1.3 CONTROLE DE VETORES

O controle de insetos, historicamente iniciado na China, data de mais de 2.000

anos. Esse controle consistia, basicamente, em práticas direcionadas ao

enfrentamento das pragas agrícolas e utilizavam-se principalmente do controle

biológico (BRAGA e VALLE, 2007).

No século XIX, descobriu-se que a transmissão das mais importantes doenças

conhecidas era provocada por certas espécies de insetos e artrópodes. Considerando

que vacinas ou medicamentos efetivos ainda não eram conhecidos ou não estavam

disponíveis, o controle da transmissão era centralizado no combate ao vetor

(DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

Os primeiros programas de controle baseavam-se em medidas físicas e no

controle dos criadouros através da aplicação de produtos conhecidos na época, que

impediam a respiração das larvas por ficarem na superfície dos criadouros aquáticos

(óleo ou de verde de Paris), graças a sua menor densidade, por serem oleosos


Apesar da descoberta de novas vacinas e medicamentos nos dias de hoje, o

controle do vetor continua sendo imprescindível para prevenir tais doenças. O papel

do controle de vetores em Saúde Pública é prevenir a infecção mediante o bloqueio

ou redução da transmissão. Para que essa prevenção seja efetiva, tornam-se

necessárias informações sobre o hospedeiro humano, a doença, o vetor e o

ambiente. Para que o controle dos vetores seja efetivo, este não deve estar

centralizado em apenas um método, devendo dispor de alternativas que se adequem

às diferentes realidades locais, visando possibilitar sua execução de forma integrada

e seletiva. Para atingir esse objetivo, selecionam-se métodos de controle apropriados

e as populações do vetor devem ser mantidas em níveis inócuos à saúde


O controle seletivo do vetor, definido pela Organização Mundial da Saúde, é o

controle integrado operacionalizado, consistindo em vigilância, redução da fonte (ou

manejo ambiental), controle biológico, controle químico com uso de inseticidas e

repelentes, armadilhas e manejo da resistência a inseticidas. No controle integrado do

Aedes aegypti, as medidas preventivas direcionam-se aos criadouros, principalmente.

40

Atualmente, a tecnologia disponível abrange principalmente medidas de controle

biológico e químico, descritos a seguir (DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

1.3.1 Controle Biológico

As medidas de controle biológico de mosquitos consistem no uso de

predadores naturais, como invertebrados aquáticos (Toxorhynchites ou copépodos)

ou peixes (Gambusia affinis), que se alimentam de larvas e pupas, além do uso de

patógenos, como os fungos Lagenedium giganteum e Metharizium anisopliae, e de

parasitas de mosquitos, como os nemátodeos (Romanomermis culicivorax e R.

iyengari), sendo recomendação da OMS o controle das larvas do Aedes aegypti pela

em água potável, principalmente em regiões onde foi detectada resistência do Aedes

aegypti a esses inseticidas. Os peixes são mais utilizados em bebedouros de grandes

animais, fossos de elevadores de obras, fontes ornamentais, piscinas abandonadas e

depósitos de água não potável, tendo como vantagem sua fácil obtenção e

manutenção (DONALÍSIO e GLASSER, 2002).

Nos anos da década de 1970, foram descobertas bactérias efetivas contra

mosquitos e simulídeos. As bactérias Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) e

Bacillus sphaericus (Bs) são específicas para o controle de larvas de culicídeos e

consistem em bacilos entomopatogênicos, cujos cristais encontrados em seus

esporos produzem pró-toxinas; as larvas ingerem esses cristais e suas proteases

digestivas clivam essas pró-toxinas, liberando peptídeos tóxicos que agem sobre seu

epitélio intestinal, provocando diminuição do peristaltismo e, consequentemente,

impossibilitando sua alimentação, o que culmina em sua morte. Produtos à base de

Bti têm sido usados em programas de controle de mosquitos e simulídeos por mais de

20 anos, como alternativa a inseticidas químicos sintéticos em muitos programas de

controle (DONALÍSIO e GLASSER, 2002; BRAGA e VALLE, 2007).

Hormônios miméticos (reguladores de crescimento “sintéticos” – IGR, do inglês

Insect Growth Regulator) atuam no desenvolvimento e na reprodução dos insetos e

têm mostrado bons resultados para controle de larvas de culicídeos. Os IGR mais

utilizados atualmente pertencem ao grupo das benzoil-fenil-ureias (BPU) ou são

análogos do hormônio juvenil natural de insetos (AHJ) (Figura 10) (DONALÍSIO e

GLASSER, 2002; BRAGA e VALLE, 2007).

41

Em geral, os IGR apresentam altos níveis de atividade e eficácia no controle de

várias espécies de insetos, em diferentes habitat. As BPU agem através da inibição

da síntese de quitina nos insetos, interferindo no processo de formação de cutícula a

cada muda do inseto. O diflubenzuron e o triflumuron encontram-se entre os

inibidores da síntese de quitina mais utilizados como larvicidas. Os AHJ são

terpenóides e atuam interferindo no sistema endócrino dos insetos, agindo nos

processos de muda, metamorfose, desenvolvimento ovariano e aquisição da

capacidade reprodutiva, inibindo, dessa forma, a emergência dos adultos. Entre os

produtos pertencentes a essa classe, a OMS recomenda o uso do metoprene e do

piriproxifeno (Figura 10) (DONALÍSIO e GLASSER, 2002; BRAGA e VALLE, 2007).

Benzoil-Fenil-Ureias (BPU)

Diflubenzuron Triflumuron

Análogos do Hormônio Juvenil (AHJ)

Hormônio Juvenil do Inseto

Metoprene Piriproxifeno

Figura 10 – Inseticidas reguladores do crescimento do inseto (IGR)

Fonte: Compendium of Pesticide Common Names

42

O controle genético é outro tipo de controle biológico utilizado. Exemplos de

controle genético são o desenvolvimento em laboratório de machos estéreis, visando

reduzir a fertilidade da população local, e a produção de cepas de Aedes aegypti não

suscetíveis à infecção por vírus, visando substituir as populações locais existentes

(DONALÍSIO e GLASSER, 2002; BRAGA e VALLE, 2007).

1.3.2 Controle Químico

O controle químico consiste na utilização de inseticidas e larvicidas de origem

orgânica ou inorgânica, constituindo-se na metodologia mais adotada para o controle

de vetores em Saúde Pública (BRAGA e VALLE, 2007).

Com o desenvolvimento de inseticidas com ação residual, o século XX

apresentou grande evolução no controle das arboviroses. A década de 1940

representa o início da era moderna dos pesticidas orgânicos, chamada “Revolução

Pesticida” quando o dicloro-difenil-tricloroetano (DDT), um composto organoclorado,

foi usado pela primeira vez como inseticida. Além do organoclorado DDT, outros

inseticidas orgânicos utilizados pertencem aos grupos dos organofosforados,

carbamatos ou piretróides e têm sido usados nos programas de controle das

arboviroses (EMRO/WHO, 2011; BRAGA e VALLE, 2007).

1.3.2.1 Organoclorados

Os inseticidas organoclorados possuem estrutura orgânica contendo átomos

de cloro (Figura 11). Classificam-se em quatro grupos: difenil-alifáticos,

hexaclorociclohexanos, ciclodienos e policloroterpenos (BRAGA e VALLE, 2007).

O DDT (Dicloro-Difenil-Tricloroetano) pertence ao grupo dos difenil-alifáticos e

foi sintetizado em 1874 por Zeidler, tendo sido usado pela primeira vez como

inseticida em 1939, o que deu o Prêmio Nobel de Medicina a Paul Muller em 1948,

pela descoberta de sua utilidade no controle dos vetores de malária e Febre Amarela,

entre outras. Seu mecanismo de ação ainda permanece obscuro, porém sabe-se que

esse inseticida atua nos canais de sódio do vetor, impedindo a transmissão normal

dos impulsos nervosos. Sabe-se que o efeito do DDT é mais pronunciado a baixas

temperaturas (BRAGA e VALLE, 2007).

43

O benzenohexacloro (BHC) é um ciclotrieno e o lindano é representante do

grupo dos hexaclorociclohexanos. Ambos possuem ação análoga ao DDT (BRAGA e

VALLE, 2007).

Os ciclodienos são representados pelo clordano, aldrin e dieldrin, e têm como

característica principal sua persistência e estabilidade no solo, mesmo quando

expostos à luz solar ou ultravioleta, fato que permite seu uso para o controle de larvas

que se alimentam nas raízes dos vegetais. Seu mecanismo de ação é através da

inibição de uma superfamília de receptores de ácido gama-aminobutírico (GABA)

presentes nas junções sinápticas do sistema nervoso central e das sinapses

neuromusculares, impedindo a entrada dos íons cloreto para o interior dos neurônios

dos insetos, provocando emissão de impulsos espontâneos que levam à contração

muscular, convulsões, paralisia e morte dos insetos. Sua toxicidade é mais

pronunciada a temperaturas mais elevadas (BRAGA e VALLE, 2007).

Foram desenvolvidos dois policloroterpenos: o toxafeno e o estrobane cujo

mecanismo de ação é semelhante ao dos ciclodienos, sendo usados mais

comumente na agricultura (BRAGA e VALLE, 2007).

Devido a sua persistência no ambiente e à facilidade de se acumularem em

tecidos humanos e animais, os organoclorados tiveram seu uso descontinuado e

foram proibidos em vários países para o uso em agricultura. O DDT possui baixo

custo, sendo ainda indicado pela Organização Mundial de Saúde no controle de

vetores de malária em países com elevada taxa de transmissão da doença e que não

possuem condições financeiras para implementarem o uso de outro inseticida com

efeito similar (BRAGA e VALLE, 2007).

44

DDT BHC

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Aldrin Lindano Toxafeno

Figura 11 – Estruturas químicas de alguns inseticidas organoclorados


1.3.2.2 Organofosforados

Os inseticidas organofosforados tiveram sua descoberta posterior àquela dos

organoclorados e podem ser classificados em alifáticos (como malathion), derivados

fenílicos (como temephos e fenitrothion) e heterocíclicos (como clorpiriphos) (Figura

12) (BRAGA e VALLE, 2007).

Em saúde pública, esses inseticidas são preferenciais aos organoclorados por

serem biodegradáveis e não terem potencial cumulativo nos tecidos. Essas duas

vantagens, decorrentes de sua instabilidade química, são responsáveis pela principal

desvantagem de seu uso: a necessidade de reaplicação periódica. Outra

desvantagem é sua maior toxicidade aos organismos vertebrados, quando

comparados aos organoclorados (BRAGA e VALLE, 2007).

Os organofosforados têm seu mecanismo de ação através da inibição

irreversível da enzima acetilcolinesterase (AChE), através da ligação covalente da

hidroxila nucleofílica do fragmento de serina do seu sítio ativo com o fósforo do

inseticida, isto é, pela fosforilação do sítio-ativo da enzima. A acetilcolina, quando

presente na fenda sináptica, promove a propagação do impulso nervoso, por induzir a

abertura de canais de sódio na célula pós-sináptica. Ao cessar o estímulo, esse

45

neurotransmissor é removido da fenda sináptica por recaptação ou por degradação

enzimática catalisada pela AChE. Graças a essa inibição, acumula-se acetilcolina nas

sinapses e, consequentemente, a propagação do impulso elétrico se dá

continuamente, o que desencadeia um processo de paralisia que culminará na morte

do inseto. Sua toxicidade se deve ao fato de poderem também inibir a AChE de outros

organismos, incluindo os mamíferos (BRAGA e VALLE, 2007).

O temephos foi registrado na década de 1960 nos Estados Unidos, para uso na

agricultura e no controle de mosquitos, sendo, atualmente, o único larvicida do grupo

dos organofosforados recomendado pela OMS para uso em água potável no controle

generalizado de larvas de mosquitos (BRAGA e VALLE, 2007).

Temephos

Clorpiriphos

Malathion

Fenitrothion

Figura 12 – Estruturas químicas de alguns inseticidas organofosforados


1.3.2.3 Carbamatos

Os inseticidas conhecidos como carbamatos são, na realidade, compostos

derivados do ácido carbâmico (Figura 13).

Foram inicialmente comercializados na década de 1960. O conhecido

“chumbinho”, utilizado como raticida, pertence a esse grupo (Aldicarb). O carbaril é o

mais utilizado como inseticida. Possuem ação letal rápida sobre insetos e curto

potencial residual. Seu mecanismo de ação, assim como os organofosforados, ocorre

através da inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), porém a inibição é

reversível, ocorrendo através da ligação covalente da hidroxila nucleofílica do

46

fragmento do aminoácido serina do seu sítio ativo com o carbono da carbonila do

inseticida, isto é, pela carbamilação do sítio-ativo da enzima. Sua toxicidade se deve

ao fato de poderem também inibir a AChE de outros organismos, incluindo os

mamíferos de pequeno e grande porte, afetando o equilíbrio do meio ambiente

(BRAGA e VALLE, 2007).

Aldicarb (“chumbinho”) Carbaril

Figura 13 – Estruturas químicas de alguns inseticidas carbamatos


1.3.2.4 Piretróides

As piretrinas naturais (Figura 14) são conhecidas devido à sua elevada

atividade inseticida e baixa toxidez para mamíferos, aves e peixes. Por se tratarem de

compostos fotossensíveis e instáveis quando expostos ao ar atmosférico, sua

aplicação no controle de pragas foi inviabilizado, tendo sido iniciada a pesquisa à

busca de análogos sintéticos que apresentassem maior estabilidade frente a esses

dois fatores deletérios. Assim, chegou-se aos piretróides sintéticos. Esses piretróides,

naturais ou sintéticos, são relevantes por apresentarem mecanismo de ação diferente

de outros inseticidas (SANTOS, LOPES e LIMA, 2006).

47

Figura 14 – Piretrinas naturais


Os piretróides sintéticos são estáveis e produzidos a partir do piretro, uma

substância natural, extraída de flores do gênero Chrysanthemum, principalmente a

espécie Chrysanthemum cinerariaefolium, flores de tradição de cultivo milenar nos

países asiáticos, conhecidas como crisântemos (BRAGA e VALLE, 2007).

Mantendo as vantagens do composto natural, atuam como desalojantes de

insetos, são biodegradáveis, ativos em baixas concentrações, não se acumulam nos

tecidos e raramente provocam intoxicações agudas em aves e mamíferos, embora

Cinerina I Cinerina II

Jasmolina IIJasmolina I

Piretrina IIPiretrina I

48

sejam altamente tóxicos para animais aquáticos. O custo elevado de sua produção é

sua desvantagem mais marcante (BRAGA e VALLE, 2007).

O mecanismo de ação dos piretróides é similar ao do organoclorado DDT.

Provavelmente, agem mantendo abertos os canais de sódio das membranas dos

neurônios, estimulando a produção de descargas repetitivas por essas células do

sistema nervoso periférico e central do inseto, levando à paralisia e morte, sendo seu

efeito estimulante sobre os canais de sódio sensivelmente mais pronunciado que o do

DDT. De acordo com o coeficiente de temperatura, isto é, a temperatura em que são

mais ativos, os piretróides podem ser do Tipo 1, quando esse coeficiente é negativo e

são mais ativos com a diminuição da temperatura (como o DDT), ou do Tipo 2, no

qual o coeficiente de temperatura é positivo, ou seja, a mortalidade dos insetos a eles

expostos varia diretamente com o aumento de temperatura (BRAGA e VALLE, 2007).

Há quatro gerações de piretróides (Figura 15). A primeira, representada pela

aletrina, foi lançada em 1949, e sua síntese consistia em mais de 20 reações

químicas. Compostos como a resmetrina e bioaletrina pertencem à segunda geração.

O fenvalerato e a permetrina, descobertos no início dos anos 1970, pertencem à

terceira geração e foram os primeiros piretróides a serem usados na agricultura,

graças à sua fotoestabilidade e elevada atividade inseticida. Atualmente, os

piretróides encontram-se na quarta geração, que tem como característica principal

sua ainda mais elevada efetividade em doses baixas, quando comparados àqueles

das gerações anteriores e fotoestabilidade, ampliando seu leque de uso e diminuindo

sua toxicidade. Dentre os representantes dessa quarta geração podem ser citados a

cipermetrina, ciflutrina, deltametrina, esfenvalerato, fenpropatrina e flucitrinato

(EMRO/WHO, 2011; BRAGA e VALLE, 2007).

49

1ª Geração de Piretróides

Aletrina


Bioaletrina Resmetrina


Fenvalerato Permetrina


Flucitrinato Cipermetrina

Figura 15 – Estruturas de químicas das diferentes gerações de inseticidas piretróides


50

1.4 RESISTÊNCIA A INSETICIDAS

A Organização Mundial de Saúde define resistência a inseticidas como a

habilidade desenvolvida por uma população de insetos para tolerar uma dose de

inseticida que, em condições normais, seria letal. O uso continuado e, muitas vezes,

indiscriminado dos inseticidas provoca o surgimento de populações desses insetos

resistentes, constituindo um problema grave para o controle desses vetores e uma

situação séria na área de Saúde Pública (BRAGA e VALLE, 2007).

Tem-se detectado resistência a todas as classes de inseticidas, já tendo sido

registrados casos de resistência mesmo àqueles usados no controle biológico, como

Bacillus sphaericus e os reguladores do crescimento do inseto (IGR) (BRAGA e

VALLE, 2007).

Registros da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, 2011b) mostram que a

resistência de mosquitos ao DDT foi observada pela primeira vez na Flórida e na

Califórnia em 1949, tendo se disseminado amplamente a partir da década de 1950, a

ponto de já haverem mais de 80 espécies de culicídeos catalogadas como

resistentes, apresentando inclusive resistência simultânea a vários inseticidas.

A resistência a inseticidas pode ser considerada um processo de evolução de

uma população de insetos frente à pressão seletiva que esses agentes exercem

sobre as mesmas. O inseticida não produz a alteração genética necessária à

resistência, porém seu uso continuado e indiscriminado, leva à seleção dos indivíduos

resistentes. Embora haja diversos estudos sobre a resistência, os mecanismos são

inespecíficos e frequentemente conferem resistência cruzada a inseticidas

estruturalmente relacionados. Alguns mecanismos de resistência a inseticidas são

citados a seguir (BRAGA e VALLE, 2007).

1.4.1 Redução na Taxa de Penetração

Propõe-se que a composição protéica do exoesqueleto dos insetos tenha papel

relevante para esse mecanismo que, embora confira baixos níveis de resistência

isoladamente, quando combinado a outros mecanismos de resistência, representa

maior relevância no processo de resistência. Sua base bioquímica não se encontra

claramente definida (BRAGA e VALLE, 2007).

51

1.4.2 Resistência Metabólica

Esse mecanismo é decorrente da potencialização no metabolismo da molécula

de inseticida pelo inseto, gerando metabólitos pouco ou não tóxicos, podendo ser

decorrente de ativação de enzimas de detoxicação tanto de Fase 1 (monooxigenases

e esterases) como de Fase 2 (glutation-S-transferases) envolvidas no metabolismo de

xenobióticos, ou do incremento dos mecanismos reguladores, levando ao aumento da

síntese dessas enzimas. Sabe-se que o metabolismo oxidativo acelerado, catalisado

pelas monooxigenases dependentes do Citocromo P450, é considerado o principal

mecanismo de resistência aos inseticidas, exceto para os ciclodienos. Analisando-se

a estrutura dos principais grupos de inseticidas, observa-se a presença de

grupamentos éster nas moléculas. São esses grupamentos os alvos das esterases. A

etapa final da detoxicação consiste na conjugação do grupamento hidrofílico SH do

glutation reduzido (GSH) com o núcleo eletrofílico dos compostos lipofílicos,

catalisada pela enzima glutation-S-transferase (BRAGA e VALLE, 2007).

1.4.3 Alteração do Sítio-Alvo

A resistência de uma população de insetos a determinado inseticida pode

ocorrer através de uma alteração conformacional do sítio-alvo dessas moléculas,

visando impedir ou dificultar a ligação desse sítio ao inseticida. Dessa forma, uma

alteração conformacional na enzima acetilcolinesterase (AChE), sítio-alvo de

organofosforados e carbamatos, diminuindo sua afinidade à molécula do inseticida,

torna esses insetos resistentes. No caso dos piretróides e de alguns organoclorados,

como o DDT e o BHC, os canais de sódio são os sítios-alvos. A resistência, nesse

caso é resultante de sensibilidade reduzida do canal de sódio a esses compostos.

Esse mecanismo é conhecido como knockdown (ou kdr) e esse tipo de resistência já

foi registrado para várias espécies (MARCOMBE et al., 2009; MARTINS et al., 2009).

Os organoclorados ciclodienos e policloroterpenos têm como sítios-alvos os

receptores de GABA das sinapses neuromusculares e do sistema nervoso central dos

insetos. A resistência, ocasionada pela insensibilização do receptor de GABA a esses

inseticidas, está associada a uma mutação na molécula do receptor (BRAGA e

VALLE, 2007).

52

1.5 ESTRATÉGIAS BRASILEIRAS DE COMBATE À DENGUE

Desde a sua criação, na década de 1980, os programas nacionais de controle

à Dengue propuseram o controle integrado de vetores, com medidas de saneamento,

redução na fonte, educação e participação da comunidade. No entanto, as atividades

de controle foram quase todas centradas em controle químico através da aplicação de

inseticidas para eliminar larvas e adultos (MACORIS et al., 2007).

Em 1996, o Ministério da Saúde do Brasil decidiu rever a estratégia empregada

contra o Aedes aegypti e propôs o Programa de Erradicação do Aedes aegypti

(PEAa). Ao longo do processo de implantação desse programa, observou-se que a

erradicação do mosquito a curto e médio prazos era inviável. A implantação do PEAa

resultou em um fortalecimento das ações de combate ao vetor, ainda com as ações

de prevenção centradas quase que exclusivamente nas atividades de campo de

combate ao Aedes aegypti através do uso de inseticidas. Essa estratégia, comum aos

programas de controle de doenças transmitidas por vetor em todo o mundo, mostrou-

se absolutamente incapaz de responder à complexidade epidemiológica da Dengue.

Em 1999, o Ministério da Saúde cria a Rede Nacional de Monitoramento da

Resistência de Aedes aegypti a inseticidas (MoReNAa), um programa integrado

projetado para monitorar a resistência do Aedes aegypti aos inseticidas utilizados

(MONTELLA et al., 2007).

Diante da tendência de aumento da incidência já verificada e a introdução do

sorotipo DENV-3, prenunciando um elevado risco de epidemias de Dengue e aumento

dos casos de Febre Hemorrágica da Dengue (FHD), o Ministério da Saúde,

juntamente com a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS), elaboraram um

Plano de Intensificação das Ações de Controle da Dengue (PIACD) em 2001 e, diante

da rápida disseminação desse sorotipo no país, o Ministério da Saúde veio a criar, em

julho de 2002, o Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD). Desde então a

luta contra a Dengue tem se intensificado. Em outubro de 2003, o Governo Nacional

constituiu o Comitê Nacional de Mobilização contra a Dengue através da portaria nº

2001, de 17 de outubro de 2003. Depois disso, frequentemente são lançadas notas

técnicas acerca da Dengue no país (PORTAL DA SAÚDE, 2011).

53

A Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos (NAS) considera que

muitos avanços no controle de doenças transmitidas por vetores podem,

parcialmente, ser atribuídos aos pesticidas e inseticidas utilizados em seu combate

(NT 109/CGPNCD/DEVEP/SVS/MS, 2010).

Os inseticidas organofosforados têm sido a principal arma contra o vetor desde

1967, sujeitando as populações do mosquito a uma intensa pressão de seleção

(MONTELLA et al., 2007). Desde 1980, todos os estados brasileiros adotaram, para o

combate às larvas, o organofosforado larvicida temephos em grânulos a 1% para

redução de fontes criadoras do mosquito, como caixas d’água, cisternas, pneus e

depósitos diversos. Depois do surto de Dengue de 1986, o uso dos inseticidas

organofosforados foi intensificado para o combate às larvas e aos insetos adultos.

Fumacês e aerossóis de nuvens frias do organofosforado malathion foram utilizados

de 1985 a 1999. No estado de São Paulo, além do tratamento dos focos de Aedes

aegypti com temephos, em 1985, o tratamento dos resíduos era feito com outro

organofosforado, o fenitrotion. Como adulticida, foi introduzida a cipermetrina em 1989

(MACORIS et al., 2007).

Populações de vetores resistentes disseminaram-se em todo o país. Os

primeiros sinais de resistência incipiente ao temephos foram registrados em 1999, em

populações de mosquitos do estado de São Paulo. Atualmente, sabe-se que a

resistência ao temephos é generalizada na populações de Aedes aegypti em todo o

país. Dados divulgados pela rede obtidos a partir de cidades-sentinela, revelaram a

existência de populações de Aedes aegypti resistentes também ao organofosforado

malathion, usado como adulticida em 1999/2000, quando o seu uso foi interrompido e

substituído pelos piretróides cipermetrina e deltametrina. Três anos mais tarde, já foi

registrada resistência a esses piretróides (LIMA et al., 2011).

O trabalho da rede MoReNAa levou, no ano de 2001, à substituição do temephos

pelo biolarvicida Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) nas localidades onde foram

detectadas populações de larvas de Aedes aegypti resistentes ao temephos. Embora

este biolarvicida seja altamente eficaz contra as larvas do mosquitos vetores e possa

ser usado como alternativa ecológica aos inseticidas químicos sintéticos, existem

muitas limitações ao seu uso (MITTAL, 2003).

Concomitantemente, os organofosforados foram substituídos pelos piretróides no

controle dos vetores adultos em todo o país (MONTELLA et al., 2007).

54

Após a detecção de resistência a todos os inseticidas utilizados pelo PNCD, a

rede vem realizando estudos para caracterizar os mecanismos de resistência no

Brasil (MITTAL, 2003).

Os inseticidas piretróides fotoestáveis respondem por 40% dos inseticidas

utilizados anualmente em nível global para pulverização residual contra vetores da

malária e de 100% dos inseticidas recomendados pela OMS para o tratamento de

mosquiteiros (LIMA et al., 2011).

Em razão do crescente agravamento do processo de resistência de mosquitos

aos inseticidas e em virtude do restrito número de inseticidas para uso em saúde

pública, uma das principais missões do Comitê de Especialistas em Praguicidas

(WHO Pesticide Evaluation Schemme - WHOPES), é o estabelecimento de parcerias

para a busca de novas opções de substâncias que possam ser utilizadas com

segurança em saúde pública. Nesse sentido, foi estabelecido um grupo do qual

participam a Organização Mundial de Saúde (OMS) e a Organização das Nações

Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO), por intermédio da Colaboração Global

para o Desenvolvimento de Pesticidas para Saúde Pública (Global Colaboration for

Development of Pesticides for Public Health - GCDPPH) (NT 109/CGPNCD/

DEVEP/SVS/ MS, 2010).

A preconização dos inseticidas para uso em saúde pública pela OMS obedece

aos princípios de baixa toxicidade, segurança para os aplicadores e população geral e

custos operacionais compatíveis. É importante considerar que todos os inseticidas

que se utilizam em saúde pública são produtos originalmente desenvolvidos para a

agricultura, não havendo nenhum inseticida em uso atualmente que tenha sido

desenvolvido exclusivamente para uso em saúde pública (NT 109/CGPNCD/DEVEP

/SVS/ MS, 2010).

As Diretrizes Nacionais para Prevenção e Controle de Epidemias de Dengue,

documento elaborado pelo SUS em 2009, preconizam a utilização racional de

inseticidas como forma de impactar na população de mosquitos e, desta maneira,

evitar a ocorrência de transmissão de Dengue (NT 109/CGPNCD/DEVEP/SVS/ MS,

2010).

Recentemente, foram introduzidos os inseticidas reguladores do crescimento

dos insetos (IGR). Atualmente o diflubenzuron é o regulador de crescimento em uso

no Brasil pelo PNCD (NT 109/CGPNCD/DEVEP/SVS/ MS, 2010).

55

O maior óbice ao combate ao Aedes aegypti consiste no fato de o controle dos

vetores adultos continuar restrito à utilização dos organofosforados e piretróides, que

já demonstraram ter desenvolvido populações resistentes em vários estados

brasileiros (LIMA et al., 2011; BESERRA et al., 2007; CARVALHO et al, 2004). Nos

organofosforados a oferta restringe-se ao malathion (uso espacial) e o fenitrothion

(uso residual). Esta limitada oferta de adulticidas reforça cada vez mais a orientação

para a restrita e racional utilização destes produtos (NT 109/CGPNCD/DEVEP/SVS/

MS, 2010).

A resistência detectada aos piretróides é considerada um grande problema de

Saúde Pública no Brasil, uma vez que não existem substitutos químicos para os

piretróides (HITOSHI et al., 2009).

1.6 GLICOSINOLATOS E ISOTIOCIANATOS

Os glicosinolatos são substâncias orgânicas aniônicas encontradas em

espécies do reino vegetal, contendo unidades de D-tioglicose e de oximas

sulfonatadas derivadas dos aminoácidos metionina, triptofano e fenilalanina. Os

glicosinolatos são estáveis e hidrossolúveis. Quando hidrolisados pela enzima

mirosinase (EC 3.2.3.1), uma β-tioglicosidase (FAHEY, ZALCMANN e TALALAY,

2001), produzem produtos geralmente tóxicos como sulfatos, tiocianatos, nitrilas e

isotiocianatos além de D-glicose. Esta enzima fica separada fisicamente dos

glicosinolatos no interior do tecido vegetal, criando um sistema de dois componentes,

no qual um deles encontra-se “inativo”, oferecendo às plantas um mecanismo de

defesa contra o ataque de herbívoros e patógenos. As plantas armazenam assim sua

substância de defesa, no caso o glicosinolato, em uma forma não tóxica, protegendo-

se. Quando ocorre dano ao tecido vegetal, causado por insetos que se alimentam de

seu tecido ou por agentes fitopatogênicos, há rompimento celular e enzima e

substrato entram em contato (MORANT et al., 2008).

Dentre os produtos de hidrólise dos glicosinolatos, os isotiocianatos têm sido

relatados como substâncias responsáveis pelos efeitos tóxicos de plantas frente a

insetos, nematóides, fungos, bactérias e mesmo outras plantas (BANGARWA et al.,

56

2011; OLIVEIRA et al., 2011; JANG, HONG e KIM, 2010), possuindo também

potencial antimutagênico (RAMPAL et al, 2010; YU, XU e TENG, 2010).

A hidrólise do glicosinolato de benzila, catalisada pela enzima mirosinase,

produzindo o isotiocianato de benzila (BITC) é esquematizada na Figura16.

Figura 16 - Hidrólise do glicosinolato de benzila catalisada pela mirosinase, produzindo BITC

1.7 TIOUREIAS

A ureia foi descoberta por Hilaire Rouelle em 1773 (Figura 17). Foi o primeiro

composto orgânico sintetizado artificialmente em 1828 por Friedrich Woehler, obtido a

partir do aquecimento do cianeto de potássio. A ureia é uma molécula funcional

comumente encontrada em produtos naturais e frequentemente apresenta uma ampla

gama de atividades biológicas. As ureias substituídas, particularmente, há muito são

utilizadas como pesticidas agrícolas e anticonvulsivantes. A molécula de ureia

assimetricamente substituída é uma característica estrutural comum a muitos

compostos biologicamente ativos, tais como inibidores enzimáticos, com atividade

inibitória da protease do HIV, e pseudopeptídeos. Sulfoniluréias são utilizadas como

hipoglicemiantes orais e herbicidas. Derivados da molécula de ureia são ativos

patenteados para uso como antimicrobianos, antifúngicos e algicidas (SURESHA et

al., 2011).

2HN NH2

O

Figura 17 – Molécula de ureia

MIROSINASE

Glicosinolato de Benzila BITC

57

Nas tioureias, o átomo de oxigênio é substituído pelo enxofre, o que faz com

que as propriedades da ureia e da tioureia difiram significativamente em função das

diferenças de eletronegatividades desses dois átomos. A tioureia consiste em cristais

de massa molecular de 76,12; faixa de fusão 176-178 ºC e é moderadamente solúvel

em água (THE MERCK INDEX, 2001). Trata-se de uma molécula planar com

distância na ligação C=S de 1.60 ± 0.1Å para uma ampla faixa de derivados. Esta

estreita variação indica que a ligação C=S é insensível à natureza do substituinte. A

tioureia ocorre na forma de dois tautômeros: tioureia e isotioureia (Figura 18)

(MERTSCHENK, BECK e BAUER, 2002).

Figura 18 - Formas tautoméricas da tioureia

As tioureias são também conhecidas como tiocarbamidas, sulfoureias ou

sulfocarbamidas e constituem uma importante classe de substâncias com aplicações

em diversos ramos da química em função de sua versatilidade. São intermediários

sintéticos para formação de heterociclos de 5 ou 6 membros (GRIFFIN, WOODS e

KLAYMAN, 1975), vêm sendo extensamente utilizadas como organocatalisadores

(CONNON, 2006), além de apresentarem diversas atividades biológicas

(SCHROEDER,1955), possuindo um grande potencial para aplicação em química

medicinal. São utilizadas comercialmente na indústria farmacêutica, na indústria de

borrachas e na indústria de corantes. Em ratos, a DL50 oral da tioureia é de 1 g/kg de

massa corpórea do animal (MERTSCHENK, BECK e BAUER, 2002).

Há diversos trabalhos na literatura, de diferentes países do mundo, nos quais

diferentes tioureias e derivados têm sido estudados e utilizados e, até mesmo,

patenteados por sua atividade biológica (Quadro 2).

TIOUREIA ISOTIOUREIA

58

Quadro 2 – Atividades biológicas das tioureias e derivados

UTILIZAÇÃO REFERÊNCIAS

Inseticida Patente BASF, 2010; Patente BAYER, 2010; PAREEK et al., 2010

Fungicida e pesticida

SHI e LI, 2010; YE, XIE e ZHANG, 2010; WANG, ZHONG e ZHANG, 2009

Herbicida FU et al., 2010; LI et al., 2010; SOUNG,PARK e SUNG, 2010

Antimicrobiano e antifúngico

LIMBAN et al, 2011; SURESHA et al, 2011; JADHAV et al, 2010; DITU et al, 2010; DOGRUER et al, 2010; MAYEKAR et al, 2010; PATIL et al., 2010; STRUGA et al., 2010

Antimalárico HUTINEC et al., 2011; KRAJACIC et al., 2011

Antiviral (HIV e HCV)

WEITMAN et al., 2011; YANG et al., 2011; CHEN et al., 2010; KANG et al., 2010;VEERASAMY, 2010; ETTARI, PINTO e MICALE, 2009

Inibidor enzimático

MAHATO, BHATTACHARYA e SHANTHI, 2011; GHAZY e MOORE, 2010

AntitumoralNAMMALWAR et al., 2011; THANIGAIMALAI et al, 2010; Patente de BUCHHOLZet al, 2008

Atividade no SNC

GUPTA et al., 2010; PATEL e SEN, 2010; WEI et al., 2010

A estrutura geral das tioureias, bem como os padrões de substituição, são

demonstrados na figura 19.

Figura 19 - Estrutura geral das tioureias e padrões de substituição

R1N NH2

S

H

R1N N

R2

S

H HR1

N NH2

S

R2

R1N N

R3

S

R2 H

R1N N

R3

S

R2 R4

R1N N

R3

S

R2 R4

12

3R1

N NH2

S

H

R1N N

R2

S

H HR1

N NH2

S

R2

R1N N

R3

S

R2 H

R1N N

R3

S

R2 R4

R1N N

R3

S

R2 R4

12

3

Monossubstituída

N,N’-dissubstituída (1,3-dissubstituída) Trissubstituída

N,N-dissubstituída (1,1-dissubstituída)

Tetrassubstituída

TIOUREIA

59

1.7.1 Método de Obtenção de Tioureias

De todos os métodos conhecidos, o mais utilizado para a obtenção de tioureias

consiste na reação de uma amina primária ou secundária com o isotiocianato (Figura

20). Isso se deve ao fato de este método apresentar altos rendimentos e da

possibilidade de se obter uma grande diversidade de tioureias pela substituição dos

radicais R1, R2 e R3.

R1N H

R2

+ R 3 N C S NR1

S

NR3

R2 H

AMINA

1ária ou 2ária

ISOTIOCIANATO TIOUREIA SIMÉTRICA OU ASSIMÉTRICA

Figura 20 - Obtenção de tioureia a partir de isotiocianato

1.8 RELAÇÕES ESTRUTURA-ATIVIDADE - SAR

O objetivo central em estudos de QSAR/QSPR é racionalizar a pesquisa de

compostos bioativos candidatos a fármacos. O estudo da relação quantitativa entre a

estrutura química e a atividade biológica (QSAR), ou entre a estrutura química e

algum tipo de propriedade físico-química (QSPR), é de grande importância no

processo de planejamento e descoberta de novos fármacos. Todo esse processo é

custoso e demanda tempo além de ser altamente arriscado, visto que a probabilidade

de sucesso é inferior a 20% (YU e GITTINS, 2008). Estudos revelam que os custos

excedem cerca de US$ 800 milhões (DIMASI, HANSEN e GRABOWSKI, 2003) e

pode levar entre 10 a 15 anos (PhRMA, 2007) (Figura 21). De acordo com a

Pharmaceutical Research and Manufacturers of America - PhRMA- dentre 5.000-

10.000 entidades químicas candidatas a fármacos, apenas uma passa para fase de

testes pré-clínicos e clínicos e é submetida à aprovação da agência americana

regulatória de drogas e alimentos (Food and Drugs Agency – FDA), para

60

comercialização. QSAR faz parte de um conjunto de ferramentas denominada

Planejamento de fármacos auxiliado por computador (Computer-Aided Drug Design -

CADD) (TANG et al., 2006). QSAR possibilita a construção, visualização,

manipulação e estocagem de modelos moleculares tridimensionais, incluindo também

análise conformacional, cálculos de propriedades estéricas, eletrônicas, físicas entre

outras. Uma vez que a correlação entre estrutura/propriedade e atividade é

encontrada, um grande número de compostos, incluindo aqueles que ainda não foram

sintetizados, podem ser facilmente examinados no computador com o objetivo de

selecionar estruturas com as propriedades desejadas. Desta forma, é possível

selecionar os compostos mais promissores para síntese e ensaios de atividade

biológica. Pode-se dizer que os estudos envolvendo QSAR/QSPR são considerados

ferramentas úteis para acelerar e obter êxito no processo de desenvolvimento de

novas moléculas bioativas candidatas a fármacos, materiais, aditivos e outras

finalidades. Para obter uma correlação significativa, é crucial que descritores

apropriados sejam empregados, quer sejam teóricos, empíricos ou derivados de

dados experimentais. Muitos descritores refletem propriedades moleculares simples

bem como podem fornecer características sobre a natureza físico-química da

atividade/propriedade em estudo (ARROIO, HONÓRIO e SILVA, 2010).

Figura 21 - Ilustração do afunilamento de candidatos a um novo fármaco na fase de P&D.

Adaptado de GELDENHUYS et al., 2006

NOVO FÁRMACO

61

1.9 MÉTODOS DE CÁLCULO DE MODELAGEM MOLECULAR

A modelagem molecular, bem como todas as ferramentas usadas em CADD

para o planejamento de novos fármacos, baseia-se em duas categorias, no

planejamento “direto” e “indireto”. O primeiro leva em consideração as características

tridimensionais do alvo conhecido, obtidas por estudos de raios-X e ressonância

magnética nuclear. Por esse método analisa-se o complexo fármaco-receptor/alvo,

identificando possíveis sítios de ligação e seus principais modos de interação. Isso

permite sugerir modificações específicas no ligante, de tal modo a se obter um maior

grau de afinidade e/ou especificidade com relação ao alvo (JORGENSEN, 2004;

CHAVATTE e FARCE, 2006).

O método indireto é empregado quando o alvo não é estruturalmente

conhecido. Assim informações como atividade biológica, características estruturais e

estéreo-eletrônicas dos compostos ativos e inativos determinam propriedades

específicas de uma molécula que podem influenciar na interação com o receptor

(JORGENSEN, 2004). Esse estudo da Relação Estrutura-Atividade (Structure Activity

Relationship, SAR) permite gerar um modelo que pode ser utilizado para a seleção de

compostos de um banco de dados ou para orientar no processo de planejamento de

novos fármacos (SOUZA, 2007; BARREIRO et al., 1997; LEACH, 1996; COHEN et

al., 1990).

O grande desenvolvimento da modelagem molecular deveu-se em grande

parte ao avanço dos recursos computacionais em termos de hardware (velocidade de

cálculo) e software (programas de modelagem molecular) A maioria dos programas

de modelagem molecular é capaz de realizar os cálculos de otimização geométrica e

estudos de análise conformacional. Um programa de modelagem molecular permite a

representação, visualização, manipulação e determinação de parâmetros geométricos

(comprimento e ângulo de ligação) e eletrônicos (energia dos orbitais de fronteira,

momento de dipolo, potencial de ionização entre outros) de uma molécula isolada,

além de realizar estudos em macromoléculas (proteínas) e complexos fármaco–

receptor (RODRIGUES, 2001).

Existem muitas opções quanto ao método de cálculo a ser aplicado em uma

determinada estratégia de modelagem molecular, a saber: mecânica molecular,

mecânica quântica (métodos semi-empíricos e ab initio). A aplicação de um ou outro

62

método é determinada pelo compromisso entre tempo e precisão dos resultados e

pela complexidade do sistema a ser analisado (BARREIRO et al, 1997).

1.9.1 Mecânica Molecular

Mecânica Molecular (MM) é um método que calcula a estrutura e a energia das

moléculas com base nos movimentos dos núcleos. Os elétrons não são considerados

explicitamente, mas, ao contrário, é assumido que eles encontrarão uma distribuição

ótima, uma vez que as posições dos núcleos são conhecidas. Esta idéia é baseada

na aproximação de Born-Oppenheimer. Esta aproximação estabelece que os núcleos,

por serem mais pesados, movem-se mais lentamente que os elétrons. Desta forma,

os movimentos nucleares, as vibrações e as rotações podem ser estudadas

separadamente, admitindo que os elétrons movem-se rapidamente, ajustando-se aos

movimentos do núcleo. Assim, pode-se admitir que a mecânica molecular trata a

molécula como uma coleção de esferas conectadas por molas, onde as esferas

representam os núcleos e as molas representam as ligações (Figura 22). Dessa

forma, baseia-se na visão clássica da estrutura molecular (RODRIGUES, 2001).

Figura 22 – Representação de uma molécula utilizando princípios de modelagem molecular

(RODRIGUES, 2001)

Esses cálculos adotam um conjunto de forças descritas como funções de

energia potencial tais como comprimento de ligação, ângulo de ligação, ângulo diedro

e interações não ligantes (eletrostáticas e van der Waals). A combinação dessas

funções de potencial é o campo de força. Assim, a energia potencial total (ETOTAL) de

um sistema molecular é descrita simplificadamente pela Equação 1 (Energia Total),

63

que representa o somatório dos termos de energia dos ligantes (ELIGANTES ) e dos não-

ligantes (ENÃO-LIGANTES).

ETOTAL = Es + Ea + Et + EvdW

Es – energia de deformação axial (comprimento da ligação)

Ea – energia de deformação angular (ângulo de ligação)

Et – energia de rotação da ligação (ângulo de torção)

EvdW – energia de van der Waals (estérica)

Equação 1 - Energia total do sistema

O campo de força é usado para calcular a energia e a geometria de uma

molécula, sendo elaborado de forma que contenha uma coleção de diferentes tipos de

átomos, parâmetros (para comprimento (s) e ângulos de ligação (a), ângulo de torsão

(t), interações de van der Waals (vdW) e outros) para calcular a energia de uma

molécula. Cada uma das funções de energia representa a diferença de energia entre

uma molécula real e uma molécula hipotética (ANDREI, 2003; SANT’ANNA, 2002). O

modelo de mecânica molecular assume que qualquer afastamento dos parâmetros

assinalados como ideais resultam em penalidades energéticas para a geometria

molecular, em função de constantes características daquele determinado parâmetro

(SOUZA, 2007).

Dessa maneira, esses parâmetros permanecem razoavelmente constantes

entre estruturas diferentes, considerando que os tipos de ligações e a hibridação dos

átomos envolvidos sejam os mesmos (COHEN et al., 1990). Dessa forma, o método

de mecânica molecular pressupõe que as funções de potencial possam ser

transferidas dentro de um conjunto de moléculas semelhantes.

Métodos de mecânica molecular são mais simples e rápidos que os métodos

de mecânica quântica, sendo capazes de calcular grandes sistemas como as

enzimas, visto que transferem valores conhecidos para outras moléculas, no entanto

os resultados são limitados pela qualidade e abrangência dos parâmetros e pelas

constantes usadas na construção do modelo. Os perfis de energia potencial obtidos

com estes métodos têm significados limitados, visto que normalmente apenas pontos

extremos são usados no procedimento de parametrização (COHEN et al., 1990).

Assim a confiabilidade desses cálculos depende das funções de energia potencial e

da qualidade dos parâmetros utilizados, sendo de grande importância a escolha de

um campo de força adequado para uma investigação (AFONSO, 2008). Comumente

são empregados diferentes campos de forças nos programas computacionais, como:

64

“MM1” (Molecular Mechanics 1), que tratam os hidrocarbonetos mais simples; “MM2”

(Molecular Mechanics 2), para os hidrocarbonetos mais aprimorados, como os cíclicos

e AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement) usados para simulação

de moléculas mais complexas como aminoácidos e proteínas, dentre outras.

1.9.2 Mecânica Quântica

Os métodos de mecânica quântica, por outro lado, permitem maior precisão

nos resultados, além de fornecerem dados sobre a estrutura eletrônica, que não é

considerada na mecânica molecular. Isto implica em um custo computacional (tempo

de computação) e capacidade de memória muito maiores. Os pacotes de programas

de métodos quânticos ab initio (CADPAC, GAMESS, GAUSSIAN, HONDO etc.) e

semi-empíricos (AMPAC, MOPAC etc.) são baseados no formalismo de orbitais

moleculares com diferentes abordagens (BARREIRO et al, 1997).

Os métodos ab initio e semi-empíricos fornecem parâmetros químico-quânticos

moleculares realísticos em um curto período de tempo. Cálculos químico-quânticos

são uma grande fonte de descritores moleculares que podem, em princípio, expressar

muitas propriedades geométricas e eletrônicas das moléculas e suas interações com

o alvo celular (ARROIO, HONÓRIO e SILVA, 2010).

1.9.2.1 Métodos Quânticos ab initio

Os métodos de Química Quântica podem ser aplicados em QSAR pela

derivação direta dos descritores eletrônicos a partir das propriedades eletrônicas e

estruturais geradas. Em geral, o tratamento teórico mais rigoroso não utiliza

parâmetros empíricos, sendo denominado ab initio. Este tipo de método fornece

informação relativamente mais precisa sobre o comportamento eletrônico, mesmo

lento e utilizando muito tempo computacional (ARROIO, HONÓRIO e SILVA, 2010).

O termo ab initio deriva do latim e significa “a partir do princípio”, ou seja, são

cálculos realizados diretamente dos princípios da física quântica, utilizando a equação

de Schrödinger completa, sem aproximações adicionais, para tratar todos os elétrons

de um sistema químico. Os cálculos utilizam os chamados conjuntos de bases

65

atômicas, que requerem parâmetros de constantes físicas como velocidade da luz,

constante de Planck e massa das partículas elementares (AFONSO, 2008; LEACH,

2001).

1.9.2.1.1 Função de base

A função de base mais comum em cálculos de mecânica quântica é composta

de funções atômicas. Na prática, aproximações são necessárias para restringir a

complexidade da função de onda eletrônica e tornar seu cálculo possível

(SANT’ANNA, 2002). Assim, funções de onda muito precisas para os orbitais foram

desenvolvidas por Hartree e, mais tarde, ajustadas a expressões analíticas,

chamadas funções de onda atômica de Slater (conhecidas como STO). Já os

métodos mais modernos utilizam funções de probabilidade Gaussianas (3-21G; 6-31G

entre outros) que, apesar de não descrever as funções de onda atômicas tão bem

quanto as funções de Slater, permitem que os cálculos sejam executados mais

rapidamente (RODRIGUES, 2001). Uma aproximação frequentemente empregada,

considerando a eficiência computacional, é o uso dos mesmos expoentes Gaussianos

para os orbitais s e p, o que restringe a flexibilidade da função de base, porém reduz

significantemente a quantidade de integrais a serem calculadas. Esquemas de

representação que contêm somente as funções necessárias para acomodar todos os

orbitais preenchidos em cada átomo têm sido utilizados nos cálculos ab initio. A

função de base mínima para, por exemplo, os átomos de Hidrogênio e Hélio seria

uma única função tipo s, enquanto que, para os elementos do Lítio ao Neônio, seriam

funções tipo 1s, 2s e 2p. As funções de base STO-3G (em geral, STO-nG) são todas

as funções de base mínima na qual n funções Gaussianas são usadas para

representar cada orbital. No mínimo, três funções Gaussianas são necessárias para

representar cada orbital tipo Slater e a função de base STO-3G é o mínimo absoluto

que deve ser utilizado no cálculo ab initio do orbital molecular. A utilização da função

de base mínima possui deficiências. Existem problemas particulares relacionados a

compostos que contêm átomos que finalizam períodos como o Oxigênio e Flúor. Os

átomos citados utilizam o mesmo número de funções de base que átomos que iniciam

períodos, embora aqueles tenham mais elétrons que estes. A função de base mínima

não consegue descrever aspectos não-esféricos na distribuição eletrônica para

66

elementos do segundo período como o Carbono, por exemplo, cuja anisotropia

somente associa as funções 2px, 2py e 2pz, onde x, y e z não podem ser diferenciados

entre si. Estas deficiências podem ser identificadas se o dobro de uma função for

utilizado como função de base mínima para cada orbital e é descrita como uma base

double zeta. Esta abordagem soluciona o problema da anisotropia já que permite

diferentes combinações lineares para os orbitais px, py e pz. Uma alternativa para a

abordagem double zeta é dobrar o número de funções utilizadas para descrever os

elétrons de valência, mas manter uma única função para os elétrons dos orbitais do

núcleo, já que estes não alteram propriedades químicas e não sofrem grandes

variações de uma molécula para outra. Esta valência dividida (split valence) da base

double zeta é exemplificada pela função de base 6-31G onde: seis funções

Gaussianas são utilizadas para descrever os orbitais do núcleo, três funções

Gaussianas representam a parte contraída e uma função Gaussiana representa a

parte difusa dos elétrons de valência. O simples aumento do número de funções de

base não necessariamente aperfeiçoa o modelo. O uso da valência dividida pode

ajudar a superar os problemas de distribuição da carga, porém não o faz totalmente.

A distribuição da carga do átomo numa molécula é diferente da distribuição da carga

do átomo isolado. A nuvem eletrônica em um átomo de hidrogênio é simétrica, porém,

quando o Hidrogênio encontra-se em uma molécula, os elétrons são atraídos para o

outro núcleo. A distorção corresponde à interação do orbital tipo p com o orbital 1s do

Hidrogênio, gerando o orbital híbrido sp (LEACH, 2001).

A solução mais comumente empregada para o problema é a introdução de

funções de polarização na função de base. Estas funções de polarização têm um

número quântico angular mais elevado que corresponde aos orbitais p para o

hidrogênio e aos orbitais d para os elementos do primeiro e segundo períodos. O uso

das funções de base de polarização é indicado por um asterisco (*). Logo, 6-31G* se

refere à base 6-31G com funções de polarização em átomos pesados (i.e., não

Hidrogênio) (LEACH, 2001).

Apesar dos métodos ab initio resultarem numa predição quantitativa de alta

qualidade para uma grande variedade de sistemas, eles são demorados e de alto

custo computacional. Um recurso comumente empregado é otimizar a geometria com

um conjunto de base mais simples e, em seguida, executar cálculos de “ponto único”

(Single Point) com um conjunto de base mais completo, permitindo determinar a

67

energia e outras propriedades de um sistema molecular, usando uma base de cálculo

mais sofisticada (MAGALHÃES, 2009).

1.9.2.2 Métodos Quânticos Semi-Empíricos

Os métodos semi-empíricos são baseados no mesmo formalismo dos métodos

ab initio, mas parte de seus parâmetros são ajustados a dados experimentais. A

parametrização dos métodos semi-empíricos com dados experimentais aumenta

significativamente a acurácia química e a velocidade dos métodos dos orbitais

moleculares (RODRIGUES, 2001). Esses métodos têm sido desenvolvidos no âmbito

da matemática para a teoria dos orbitais moleculares e são baseados em

simplificações e aproximações que reduzem o tempo do procedimento computacional

(KARELSON, LOBANOV e KATRITZKY, 1996). Nesse tipo de método, os cálculos

são simplificados usando parâmetros para algumas integrais ou ignorando alguns de

seus termos (LEACH, 2001). Estes métodos se baseiam em suposições que

simplificam os cálculos e utilizam certos parâmetros obtidos dos dados experimentais.

Vale ressaltar que a precisão desses métodos está relacionada ao erro associado ao

conjunto de base selecionado e no tratamento da correlação eletrônica (ARROIO,

HONÓRIO e SILVA, 2010). As diversas aproximações semi-empíricas permitem evitar

o cálculo de um grande número de integrais, o que possibilita a aplicação destes

métodos em sistemas com um número maior de átomos. Nestes métodos, os núcleos

são assumidos em sucessivas posições estacionárias, sobre as quais a distribuição

espacial ótima dos elétrons é calculada pela resolução da equação de Schrödinger. O

processo é repetido até que a energia não mais varie dentro de um limite escolhido,

ou seja, até se alcançar um ponto estacionário da superfície de energia

(RODRIGUES, 2001). Os métodos semi-empíricos mais recentes são AM1 (Austin

Model 1) e PM3 (Parametric Method 3) contidos em diversos pacotes de cálculos

teóricos (RODRIGUES, 2001). O AM1 foi projetado para eliminar o problema do

MNDO (Modified Neglect of Differential Overlap), que superestima a repulsão entre

átomos. A estratégia foi utilizar funções Gaussianas de atração e repulsão. Logo, o

processo de parametrização se tornou muito mais complexo e as deficiências

associadas à repulsão do núcleo foram corrigidas (LEACH, 2001). O método AM1 tem

a vantagem de ter tempo computacional relativamente curto quando comparado com

68

os métodos ab initio e dispõe de parametrização para uma grande variedade de

átomos (todos os elementos do segundo período, halogênios, Al, Si, P, S, Sn, Hg e

Pb). Este método promove ainda bons descritores para ânions e sistemas de ligação

de Hidrogênio (KARELSON, LOBANOV e KATRITZKY, 1996).

1.9.3 Descritores Moleculares

Os métodos de Química Quântica e as técnicas de modelagem molecular

permitem a definição de um grande número de propriedades moleculares como a

reatividade, forma e modo de ligação de moléculas completas, fragmentos e

substituintes moleculares. Devido às diversas informações contidas em muitos

descritores moleculares, sua utilização em estudos de QSAR apresenta duas

vantagens principais:

a) os compostos, seus vários fragmentos e substituintes podem ser diretamente

caracterizados baseados em suas estruturas moleculares somente;

b) o mecanismo de ação proposto pode ser diretamente representado em termos da

reatividade dos compostos em estudo (ARROIO, HONÓRIO e SILVA, 2010).

1.9.3.1 Energia dos Orbitais de Fronteira – HOMO e LUMO

As energias do HOMO (highest occupied molecular orbital) e do LUMO (lowest

unoccupied molecular orbital) são muito utilizadas como descritores em estudos de

QSAR. Estes orbitais desempenham um papel importante em reações químicas e no

processo de interação fármaco-receptor. De acordo com a teoria dos orbitais

moleculares de fronteira, a formação de um estado de transição é devido à interação

entre os orbitais de fronteira HOMO e LUMO das espécies reagentes (KARELSON,

LOBANOV e KATRITZKY, 1996). A energia do HOMO mede o caráter elétron-doador

de um composto e a energia do LUMO mede o caráter elétron-receptor. Destas

definições, duas características importantes podem ser observadas: quanto maior a

energia do HOMO, maior a capacidade doadora de elétrons e, quanto menor a

energia do LUMO, menor será a resistência para aceitar elétrons. As energias do

69

HOMO e do LUMO têm sido usadas há algumas décadas como índices de reatividade

química e são comumente correlacionadas com outros índices, tais como afinidade

eletrônica e potencial de ionização (ARROIO, HONÓRIO e SILVA, 2010).

1.9.3.2 Densidade dos Orbitais de Fronteira

A densidade eletrônica dos orbitais de fronteira nos átomos fornece uma forma

útil para a caracterização detalhada das interações doador-aceptor. A maioria das

reações químicas ocorre no local de maior densidade eletrônica nos orbitais de

fronteira, que são definidos de acordo com o tipo de reação: numa reação eletrofílica,

a densidade de HOMO é essencial para a transferência de elétrons, enquanto a

densidade de LUMO representa as áreas mais suscetíveis a ataques nucleofílicos

(MAGALHÃES, 2009).

1.9.3.3 Momento Dipolo Molecular

Outro descritor que também é muito utilizado em estudos da relação estrutura-

atividade é o momento de dipolo, ou momento dipolar. Esta é uma propriedade que

mede a magnitude da carga deslocada quando átomos de eletronegatividades

diferentes são interligados. A direção do momento dipolar de uma molécula é

baseada nas eletronegatividades relativas dos átomos desta molécula e o valor é

obtido pelo vetor resultante dos momentos de dipolo de cada ligação presente na

molécula. A presença de substituintes com eletronegatividades diferentes altera

propriedades moleculares como acidez e basicidade de um composto, de forma que o

momento dipolar está diretamente ligado à reatividade do mesmo (ARROIO,

HONÓRIO e SILVA, 2010).

1.9.3.4 Parâmetros Energéticos

Parâmetros energéticos, como energia eletrônica, energia total e calor de

formação, também são muito utilizados para correlacionar estrutura química e

atividade. A energia eletrônica é determinada mediante a aproximação de Born-

70

Oppenheimer, ou seja, assumindo-se uma posição fixa dos núcleos, a equação de

Schrödinger é resolvida a fim de se encontrar a energia eletrônica da molécula. Este

procedimento é repetido para diversas configurações fixas dos núcleos (através das

interações SCF - Self-Consistent Field). A configuração nuclear que corresponde ao

valor mínimo da energia eletrônica é a geometria de equilíbrio da molécula. A energia

total é frequentemente utilizada para estimar a estabilidade de uma espécie química,

e corresponde à soma da energia de repulsão nuclear com a energia eletrônica.

Assim como a energia total, o calor de formação de uma molécula também é utilizado

para estimar a estabilidade química. A partir da energia total do sistema, calcula-se a

energia de atomização a partir da subtração das energias totais dos átomos em suas

razões estequiométricas. O calor de formação (ΔHƒ) pode ser calculado usando-se as

entalpias de atomização dos átomos e a energia de atomização (ARROIO, HONÓRIO

e SILVA, 2010).

1.9.3.5 Modelos Gráficos

1.9.3.5.1 Mapa de Potencial Eletrostático Molecular (MEP)

O mapa de potencial eletrostático molecular (MEP) é a propriedade mais

importante e mais utilizada atualmente. Este mapa fornece a localização dos

potenciais eletrostáticos na molécula e revela o tamanho molecular total. O tamanho

da superfície revela o tamanho e a forma da molécula, enquanto o potencial negativo

de superfície demonstra em quais regiões há o potencial eletrostático negativo. No

MEP, a cor vermelha representa um potencial negativo (alta densidade eletrônica), a

cor azul representa um potencial positivo (baixa densidade eletrônica) enquanto as

cores laranja, amarelo e verde representam valores intermediários de potencial

eletrostático. Os MEP, entre vários usos, servem para caracterizar várias regiões da

molécula como as regiões ricas e pobres em elétrons e distinguir moléculas com

cargas localizadas das moléculas com cargas deslocalizadas, assim como

caracterizar estados de transição nas reações químicas (HEHRE, 2003).

71

1.9.3.5.2 Mapa de densidade eletrônica do LUMO

Os mapas de orbitais moleculares podem conduzir a modelos informativos. No

mapa de densidade eletrônica do LUMO, o valor absoluto do orbital molecular mais

baixo desocupado é mapeado. Este mapa mostra quais as regiões da molécula são

mais deficientes de elétrons e, portanto, mais sujeitas ao ataque nucleofílico (HEHRE,

2003).

1.9.3.5.3 Mapa de densidade eletrônica do HOMO

Já nos mapas de densidade eletrônica do HOMO, o valor absoluto do orbital

molecular mais alto ocupado é mapeado. Este mapa mostra quais as regiões da

molécula são mais ricas em elétrons e, portanto, mais sujeitas a reações eletrofílicas

(HEHRE, 2003).

1.9.4 Parâmetros Farmacocinéticos In Silico

1.9.4.1 Coeficiente de Partição

O coeficiente de partição de uma determinada espécie química é definido como

sendo a razão entre as concentrações que se estabelecem nas condições de

equilíbrio de uma substância química, quando dissolvida em sistema constituído por

uma fase orgânica e uma fase aquosa, e está associado à mudança de energia livre

provocada pela substância sobre o equilíbrio termodinâmico do sistema. Esta relação

pode ser expressa pela Equação 2:

P = [orgânica]

[aquosa]

Onde,

P: coeficiente de partição do composto analisado

[orgânica]: concentração da substância na fase orgânica

[aquosa]: concentração da substância na fase aquosa

Equação 2 – Coeficiente de Partição

Considerando que o coeficiente de partição é um dos parâmetros físico-

químicos mais amplamente utilizados em estudos de QSAR e que sua determinação

é frequentemente necessária, foi definido o sistema de solventes 1-octanol/tampão

72

fosfato pH 7,4 com este objetivo. As principais vantagens do uso do 1-octanol como

fase orgânica na determinação do coeficiente de partição são: (TAVARES, 2004)

a) ampla capacidade de dissolução frente a diferentes compostos químicos;

b) grupo OH, capaz de agir como doador ou aceptor de elétrons na formação de

ligações hidrogênio;

c) capacidade de dissolver até 2,3 M de água sob condições de equilíbrio, embora

imiscível em água;

d) não há necessidade de quebra das ligações de hidrogênio de moléculas

solvatadas durante sua transferência da fase orgânica para a fase aquosa;

e) coeficientes de partição determinados em 1-octanol/tampão fosfato refletem

apenas as interações hidrofóbicas;

f) não volátil à temperatura ambiente;

g) adequado à medição direta na região do UV, devido a sua absorção ocorrer em

comprimento de onda muito inferior à faixa de absorção da maioria dos

fármacos;

h) estabilidade química;

i) disponibilidade comercial.

Dentre os diversos métodos disponíveis para a determinação de coeficientes

de partição citam-se o método de “shake-flask” que, em princípio, é simples e

fundamenta-se na dissolução de um composto químico em um sistema bifásico

formado por um solvente polar e um solvente apolar. As técnicas de cromatografia em

camada fina (CCF) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) têm sido bastante

utilizadas na determinação dos parâmetros Rf e K’, respectivamente, tendo sido

aplicadas, com sucesso, na obtenção de coeficientes de partição de compostos com

solubilidade consideravelmente maior em uma das fases (TAVARES, 2004).

73

2 JUSTIFICATIVA

Considerando-se:

que ainda não foram desenvolvidos medicamentos antivirais ou vacinas

eficientes para combater a Dengue;

que, para se evitar a disseminação crescente da doença, faz-se necessário

intensificarem-se as ações de prevenção e combate ao vetor, o Aedes aegypti;

que a resistência dos insetos aos inseticidas disponíveis vem aumentando de

forma assustadora por diversos mecanismos e podem ocorrer em vários inseticidas

pelo mesmo grupo de insetos; e

que isotiocianato de benzila (BITC) e seus derivados tioureia demonstram-se

larvicidas eficientes,

justifica-se o presente trabalho pela possibilidade de se compreenderem as

estruturas e grupamentos das moléculas responsáveis pela atividade larvicida do

BITC e de seus derivados tioureia, objetivando-se o aprimoramento dessa atividade,

além de conferir maior estabilidade química a esses compostos, através do uso de

ferramentas de modelagem molecular e síntese de protótipos potencialmente mais

ativos contra as larvas de Aedes aegypti.

74

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo principal do trabalho consistiu no estudo da relação estrutura

química-atividade (SAR) de benziltioureias derivadas do BITC com modificações

estruturais no átomo de nitrogênio N’ (figura 23), dotadas de atividade letal frente a

larvas de terceiro estádio de Aedes aegypti, utilizando metodologias computacionais.

As referidas tioureias foram sintetizadas por Gil Viana em sua dissertação de

mestrado (VIANA, 2009).

N N

S

H

R1

R2

Figura 23 – Posição de substituição das benziltioureias estudadas

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter os parâmetros estruturais e estereoletrônicos como as conformações de

menor energia, mapas de potencial eletrostático molecular, coeficientes de energia de

HOMO e LUMO e momento de dipolo, correlacionando os mesmos com a atividade

larvicida das benziltioureias derivadas do BITC aqui estudadas frente a larvas de

terceiro estádio de Aedes aegypti.

Avaliar a influência dos substituintes nas posições 2, 4 e 6 do anel fenila da

substituição R1 das N-benzil,N’-feniltioureias estudadas em termos de sua atividade

larvicida, em comparação ao BITC, frente a larvas de Aedes aegypti.

Sintetizar e caracterizar os novos protótipos idealizados racionalmente após a

obtenção dos resultados de modelagem molecular.

Determinar a atividade larvicida frente a larvas de Aedes aegypti de todas as

benziltioureias estudadas, incluindo os novos compostos sintetizados.

Avaliar a reatividade do BITC frente a diferentes excipientes de modo a se

preverem possíveis interações em uma formulação de inseticida de ação prolongada.

N’

75

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

Os reagentes e solventes utilizados foram adquiridos das marcas Vetec, Merck

e Aldrich, sendo usados diretamente, sem qualquer necessidade de purificação ou

tratamento prévio. Foi utilizada água destilada em todos os procedimentos em que foi

necessário o uso de água.

Os excipientes testados possuiam grau farmacêutico.

Todos os pontos de fusão (não corrigidos) foram medidos em aparelho

MelTemp II (Laboratory Devices; USA).

Na técnica de cromatografia em camada fina (CCF), foram utilizadas folhas de

alumínio recobertas com gel de sílica com indicador fluorescente (254 nm) como

suporte, corrida em acetato de etila 5% em hexano, para visualização do BITC e

acetato de etila a 50% para visualização das tioureias. Para revelação, foi utilizada luz

ultravioleta (254 nm) e solução 7% (p/v) de ácido fosfomolíbdico em etanol e solução

5% (p/v) de vanilina em H2SO4.

Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) foram

obtidos a 200 MHz ou 400 MHz nos aparelhos Varian Gemini 200 e Bruker 400

respectivamente, utilizando-se o tetrametilsilano (TMS) como referência interna, em

temperatura ambiente. Os valores de deslocamento químico () foram referidos em

parte por milhão (ppm) em relação ao TMS e os valores das constantes de

acoplamento (J) foram referidos em Hertz (Hz). As multiplicidades dos sinais estão

descritas como: s = simpleto; d = dupleto; t = tripleto; q = quarteto; m = multipleto; sl =

sinal largo.

As larvas utilizadas foram obtidas a partir de ovos provenientes de fêmeas

sadias (não contaminadas) de criação cíclica de Aedes aegypti (linhagem

Rockefeller), mantida no Laboratório de Bioquímica de Vetores de Doenças

(IQ/UFRJ), em ambiente climatizado a 28 °C, com 80% de umidade relativa e fotofase

de 12 h (12/12 h de luz e escuro), alimentadas com ração para gatos durante 3 a 4

dias após a eclosão dos ovos, quando atingiram seu terceiro estádio de

desenvolvimento (L3) para a realização dos bioensaios.

76

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Avaliação da Reatividade do BITC

A avaliação da reatividade do BITC foi conduzida seguindo-se o procedimento

experimental usado para a preparação das benziltioureias, substituindo-se, todavia,

as aminas empregadas como substratos da reação por excipientes que poderiam

compor uma futura formulação de inseticida de BITC ou benziltioureia. Estes testes de

compatibilidade realizados com os possíveis excipientes consistiram em deixar o

BITC solubilizado em diclorometano em contato com os mesmos (aproximadamente

1:1 p/p), sob agitação, por períodos de 24, 36 e 48 horas. Depois de decorrido cada

intervalo de tempo, foi realizada cromatografia em camada fina, utilizando placa de

sílica-gel, corrida em acetato de etila 5% em hexano, visualização sob luz UV,

revelação em solução alcoólica a 7% de ácido fosfomolíbdico, e aquecimento em

chama, comparando-se a solução padrão de BITC em diclorometano com a solução

da mistura BITC-excipiente.

Os excipientes testados foram:

Amido de milho

Carboximetilcelulose

Celulose microcristalina

Estearato de magnésio

Etilcelulose

Hidroxipropilmetilcelulose

Lactose

Talco

Foi testado também um polímero poliaminado e polihidroxilado, mais reativo

frente ao grupamento isotiocianato, de forma a se concluir acerca da estabilidade ou

não do BITC para futura formulação como inseticida e aplicação por um período de

tempo prolongado, que idealmente poderia ser de 40 a 60 dias. Para tal, elegeu-se o

Polyquart H®, produzido pela Cognis Inc. um polímero obtido do óleo de coco que

apresenta em sua estrutura grupos NH e OH passíveis de reação com o BITC. Após

diversos testes de solubilidade, conseguiu-se chegar a um procedimento para

avaliação da compatibilidade com o Polyquart H® e BITC. Em balão de 100 mL, foram

77

adicionados 0,6719 g de Polyquart H® e dimetilsulfóxido (DMSO) em quantidade

suficiente para a solubilização. A esse balão foram adicionados 1,5074 g de BITC

previamente dissolvido em diclorometano (CH2Cl2). A mistura reacional ficou sob

agitação à temperatura ambiente por 24 horas, ainda apresentando BITC no meio

reacional, mas com significativa redução de intensidade da mancha, visualizada por

constantes cromatografias em camada fina (CCF) em acetato de etila/hexano 5:95 e

evidenciadas sob luz UV e reveladas em solução alcoólica de ácido fosfomolíbdico a

7% e chama. A mistura reacional foi aquecida a 120°C, temperatura inferior ao ponto

de ebulição dos constituintes, por 7 horas. Por haver necessidade de aumento de

volume da mistura reacional, foram adicionados 10 mL de terc-butanol, uma vez que a

adição de mais DMSO dificultaria o processo de remoção do solvente, considerando

que seu ponto de ebulição é de 189°C. Depois de decorridas 7 horas sob

aquecimento e agitação, todo o BITC foi consumido. Apesar de serem as condições

utilizadas mais drásticas, as mesmas servem como indicativo dos futuros problemas

de processamento que poderão ser observados com a formulação do BITC,

reforçando-se a escolha das tioureias como alvo do presente estudo.

4.2.2 Síntese das Benziltioureias

A metodologia de síntese das 27 benziltioureias utilizadas encontra-se descrita

na dissertação de mestrado de Gil Mendes Viana (VIANA, 2009). As diferentes

aminas utilizadas neste estudo foram adicionadas em excesso aproximado de 20%

em moles, de modo a reagir com o BITC no solvente apropriado (água, hexano,

diclorometano, acetona, etanol ou DMSO), à temperatura ambiente ou sob refluxo, em

função da polaridade e da reatividade das aminas, até o total consumo do BITC

(Figura 24). O consumo do BITC foi determinado por CCF, acetato de etila em hexano

5:95, revelação em solução alcoólica a 7% de ácido fosfomolíbdico e aquecimento em

chama. Ao final da reação, o excesso não reagido das aminas foi removido através de

extração ácido-base ou evaporação, no caso das aminas com baixo ponto de

ebulição. Nos casos onde, mesmo com o excesso de amina, foi possível observar a

presença de BITC não reagido (através de CCF), este foi facilmente removido através

de cromatografia em coluna de sílica de tamanho reduzido (Silica Flash), usando

hexano como eluente, permitindo a obtenção das benziltioureias puras. A fácil

78

separação do isotiocianato de benzila das benziltioureias se deve à enorme diferença

de polaridade entre os dois compostos.

N C S+ H N

R1

R2

N NR1

R2

S

H

BITCAmina

Primária ou Secundária

Benziltioureia

Figura 24 – Método de obtenção das benziltioureias estudadas

4.2.3 Tioureias utilizadas neste trabalho

Viana, em sua dissertação de mestrado, em 2009, sintetizou tioureias pelo

método geral, utilizando o BITC como substrato na reação com diferentes aminas

primárias e secundárias, aromáticas, alifáticas e alicíclicas, de modo a obter as 27

benziltioureias utilizadas na primeira fase desse trabalho (VIANA, 2009).

A estrutura geral das benziltioureias encontra-se na Figura 25, enquanto as

estruturas das benziltioureias estudadas, encontram-se nos quadros de 3 a 9.

N N

S

H

R1

R2

Figura 25 – Estrutura geral das benziltioureias estudadas

Solvente adequado

Temperatura adequada

79

Quadro 3 – Benziltioureias com R1 alifático*

Composto -NR1R2 Nome PF

1 NH2 N-benziltioureia 160 °C

2N

HN-benzil, N’-metiltioureia 67-69 °C

3N

HN-benzil, N’-butiltioureia 42-45 °C

4 N

H

N-benzil, N’-isopropiltioureia 122-123 °C

5* N N-benzil, N’,N’-diisopropiltioureia 80-83 °C

6N

HN-benzil, N’-isobutiltioureia 110-111 °C

7 N

H

OHN-benzil, N’-(2-hidroxietil)tioureia 55-56 °C

8 N

H

( )( )

8

7 N-benzil, N’-oleiltioureia 60-62 °C

9** N

HN, N’-dibenziltioureia 147-148 °C

*A benziltioureia 5 apresenta R2 ≠ H, sendo R1 = R2

** Embora R1=benzila, foi considerado alifático em função do C sp3 não participar da ressonância

Quadro 4 – Benziltioureias com R1 saturado alicíclico ou heterocíclico


10 NHN N-benzil, N’-piperaziniltioureia 132-133 °C

11 N O N-benzil, N’-morfoliniltioureia 87-89 °C

12 N

H

N-benzil, N’-ciclohexiltioureia 90-91 °C

80

Quadro 5 – Benziltioureias com R1 aromático não-substituído


13 NN

H

N-benzil, N’-(2-piridinil)tioureia 166-168 °C

14 N

H

N-benzil, N’-feniltioureia 152-153 °C

Quadro 6 – Benziltioureias com R1 aromático orto-substituído


15 N

H

N-benzil, N’-(2-metilfenil)tioureia 137-138 °C

16 N

H

N-benzil, N’-(2-terc-butilfenil)tioureia 160-162 °C

Quadro 7 – Benziltioureias com R1 aromático meta-substituído


17N

H

OH

N-benzil, N’-(3-hidroxifenil)tioureia 146-148 °C

18

N

H

O

N-benzil, N’-(3-acetilfenil)tioureia 142-145 °C

81

Quadro 8 – Benziltioureias com R1 aromático para-substituído


19 N

H

N-benzil, N’-(4-metilfenil)tioureia 98-100 °C

20N

H

OH

N-benzil, N’-(4-hidroxifenil)tioureia 154-156 °C

21N

H

O

N-benzil, N’-(4-metoxifenil)tioureia 108-109 °C

22N

H

NO2

N-benzil, N’-(4-nitrofenil)tioureia 108-110 °C

23N

H

N

H

ON-benzil, N’-(4-acetamidofenil)tioureia 199-200 °C

Quadro 9 – Benziltioureias com R1 aromático dissubstituído


24 N

H

N-benzil, N’-(2,6-dimetilfenil)tioureia 105-107 °C

25N

H

Cl

Cl

N-benzil, N’-(3,4-diclorofenil)tioureia 160-162 °C

26N

H

O

NO2

N-benzil, N’-(2-nitro,4-metoxifenil)tioureia 110-113 °C

27 N

H

N-benzil, N’-(α-naftil)tioureia 165-166 °C

82

4.2.4 Avaliação da atividade larvicida do BITC e das benziltioureias estudadas

Os bioensaios realizados para a determinação da atividade larvicida do BITC

foram conduzidos no Laboratório de Bioquímica de Vetores de Doenças (IQ/UFRJ),

sob supervisão da Prof.ª Dra. Glória Regina Cardoso Braz. Estes testes larvicidas

foram realizados de acordo com o protocolo estabelecido pela Organização Mundial

da Saúde (WHO, 2005), com algumas modificações. Este protocolo estabelece os

procedimentos a serem adotados em estudos laboratoriais e em pesquisas de campo,

de pequena e larga escalas, com o objetivo de determinar a eficácia e a viabilidade de

substâncias larvicidas.

Os estudos laboratoriais são considerados estudos de primeira fase, onde se

tem como objetivo principal a determinação da potência do material testado. Para a

avaliação dessa atividade biológica, larvas de mosquito, em estágio de

desenvolvimento conhecido, são expostas em água à substância larvicida em várias

concentrações. Após a eclosão dos ovos de Aedes aegypti em água, espera-se um

período de três a quatro dias para que as larvas atinjam seu terceiro estádio de

desenvolvimento. As larvas de terceiro estádio de desenvolvimento (L3) foram

selecionadas, reunidas em grupos de 20 e armazenadas em pequenos copos

plásticos descartáveis (50 mL) com 25 mL de água destilada até o início do ensaio.

Foram usados copos plásticos descartáveis (transparentes) de 300 mL,

contendo 249 mL de água destilada e 1 mL da solução teste em acetona. Utilizou-se a

mesma quantidade de larvas e água destilada, juntamente com 1 mL de acetona,

para os grupos controles negativos.

Após o preparo das soluções contendo a amostra a ser investigada, copos

plásticos descartáveis (transparentes) de 300 mL de capacidade, contendo 224 mL de

água destilada, receberam 1mL destas soluções teste. Depois que todos os copos já

haviam recebido a solução, e inclusive o controle havia recebido 1 mL de acetona,

todos eles foram preenchidos com os grupos de 20 larvas em 25 mL de água

destilada, somando ao final, em cada copo, o volume de 250 mL. Nestes ensaios,

cada solução analisada foi testada em quatro copos (quadriplicata), ou seja, cada um

dos quatro copos recebeu 1 mL da mesma solução.

Os copos teste foram então mantidos à temperatura ambiente por 24 horas.

Após esse período de contato com a amostra, foi feita a contagem do número de

83

larvas mortas por copo. Essas foram consideradas “mortas” quando havia ausência

total de movimentos ou quando apresentaram movimentos limitados ao serem

expostas a um estímulo, como o toque da ponta de uma pipeta. A mortalidade foi

registrada.

Inicialmente, as larvas do mosquito foram expostas a uma ampla faixa de

concentração, para que pudesse ser encontrada a faixa de atividade da substância

testada. Este teste inicial foi feito em duplicata, ou seja, para cada concentração

foram usados dois copos. Após determinada a faixa de concentração em que as

moléculas testadas apresentaram atividade, uma nova faixa de concentração, mais

limitada, foi usada para a determinação dos valores de CL50 e CL99, de maneira que

haja no mínimo quatro concentrações que levem a uma mortalidade entre 10 e 95%.

Em função do trabalho ter sido realizado em conjunto com o Laboratório de

Vetores de Doenças, a metodologia aqui utilizada foi a mesma utilizada na rotina das

pesquisas do grupo. Cabe ressaltar que essa metodologia diferiu somente em alguns

pontos daquela estabelecida pela OMS (WHO, 2005). Enquanto o protocolo mundial

estabelece a utilização de grupos de 25 larvas em recipientes contendo de 100 a 200

mL de água, neste trabalho foram utilizadas 20 larvas por copo, cada um

apresentando o volume de 249 mL de água (Quadro 10). O protocolo estabelece,

também, a realização de quatro ou mais réplicas (quatro ou mais copos) para cada

concentração testada e que o estudo seja repetido mais duas vezes em outros

diferentes dias. Entretanto, na metodologia aqui utilizada foi realizado um teste para

cada molécula, utilizando-se, para uma dada concentração, duas soluções

preparadas de forma independente, sendo cada uma delas testada em quadriplicata.

Quadro 10: Diferenças entre o protocolo OMS e a metodologia utilizada

ParâmetrosOMS

(WHO, 2005)Metodologia

utilizada

Número de larvas por grupo (número de larvas por copo)

25 20

Volume de água por recipiente do teste (copo) 100 a 200 mL 249 mL

Número de réplicas ≥ 4 4

Número de soluções por concentração 1 2

84

4.2.5 Análise dos Dados

A mortalidade observada foi corrigida em relação à mortalidade do controle

negativo segundo a fórmula de Abbott:

Mortalidade (%) = X – Y . 100

X

Onde,

X = % de sobreviventes no controle negativo

Y = % de sobreviventes após exposição à solução-teste

Equação 3 – Fórmula de Abbot

Os dados experimentais foram descartados quando ocorreu a morte de mais

de 20% de larvas no controle negativo, quando foi efetuada nova execução dos

testes. A análise estatística dos dados experimentais para o BITC foi realizada

usando-se o programa StatPlus 2007 (AnalystSoft) para a determinação das

concentrações letais requeridas para matar 50% (CL50) e 99% (CL99) das larvas em

24 horas, através da análise de probitos com 95% de intervalo de confiança.

4.2.6 Estudos de SAR e Modelagem Molecular

As estruturas 3D dos compostos foram construídas e otimizadas no programa

Spartan’06®, versão 1.1.2 da Wavefunction Inc., em ambiente Windows®, numa

estação de trabalho com processador Intel Pentium® 4, operando a 3.2 GHz de

freqüência e 2 Gb de memória RAM. A distribuição das conformações foi efetuada

através do método AM1 empregando análise conformacional sistemática com

incrementos de 30 em 30 graus. O confôrmero de menor energia foi submetido a

“single point calculation” pelo modelo DFT-B3LYP, utilizando a base 6-31G*. A seguir

foram obtidos os valores de momento de dipolo molecular, mapa de potencial

eletrostático molecular (MEP), mapa de densidade eletrônica do HOMO, mapa de

densidade eletrônica do LUMO, distribuição dos orbitais HOMO e LUMO. Todas as

imagens foram capturadas diretamente da tela com o programa SnagIt®, versão 8.2.3

da TechSmith Corporation, sem edição ou correção, com exceção da identificação ou

legenda dos compostos. Os valores de lipofilicidade (cLogP) foram obtidos pelo

modelo de Crippen disponível no programa Spartan’06®. Para obtenção dos valores

de pKa foi utilizado o programa ACD Structure Design, da ACD Labs.

85

4.2.7 Síntese das benziltioureias sugeridas por SAR

Todas as benziltioureias sintetizadas por Vianna em 2009 e descritas nesse

trabalho foram utilizadas para estudos de modelagem molecular. Dos resultados

obtidos, foi sugerida a síntese da benziltioureia que proporcionaria maior atividade

larvicida, substituindo-se a posição para com substituintes de diferentes

características.

Assim, foi sintetizada a N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-bromofenil)tioureia (composto

24a’) a partir da reação do BITC com a 2,6-dimetil,4-bromoanilina, esta obtida a partir

da 2,6-dimetilanilina, de acordo com metodologia sugerida por Rajagopal e

colaboradores (RAJAGOPAL et al., 2004), com exceção apenas de que na

metodologia utilizada não foi utilizado catalisador. Não foi obtido o composto puro,

uma vez que não houve conversão total do material de partida à benziltioureia

correspondente, havendo ainda no meio reacional o composto N-benzil,N’-(2,6-

dimetilfenil)tioureia (composto 24). A separação via CCF não foi efetuada em função

da proximidade dos Rf dos respectivos compostos.

Para sintetizar a N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-nitrofenil)tioureia (composto 24a"),

foi utilizada também a 2,6-dimetilanilina como composto de partida para se obter a

2,6-dimetil,4-nitroanilina. Esta reagiria com o BITC, produzindo o composto 24a". A

síntese da 2,6-dimetil,4-nitroanilina foi executada conforme o método descrito por

Moorthy e Saha (MOORTHY e SAHA, 2009). Porém, em função da reatividade da

amina estar comprometida por sua baixa nucleofilicidade, esta não reagiu com o BITC

para produzir a tioureia esperada, mesmo após o meio reacional permanecer sob

refluxo em tert-butanol por cerca de 30 horas.

Foi proposta a síntese da N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-metoxifenil)tioureia

(composto 24b). Não foi obtido método viável de obtenção da amina precursora, a

2,6-dimetil,4-metoxianilina. O custo de sua obtenção foi levantado, encontrando-se na

ordem de US$ 500.00 / 1g (MaxChemCo, pureza 98%), dificultando a síntese do

composto 24b.

86

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 REATIVIDADE DO BITC FRENTE A DIFERENTES EXCIPIENTES

Os testes de compatibilidade do BITC com os possíveis excipientes de uma

formulação de inseticida de liberação prolongada, listados na tabela 1, demonstraram

que, a partir do simples contato em solvente, não houve reação entre o BITC e os

mesmos.

Tabela 1 – Excipientes testados com o BITC

EXCIPIENTE CATEGORIA FUNCIONALREAÇÃO

COM BITC

Amido de milho diluente, aglutinante, desintegrante NÃO

Carboximetilcelulose agente de revestimento, desintegrante, aglutinante, adsorvente

NÃO

Celulose microcristalina adsorvente, diluente, desintegrante NÃO

Estearato de magnésio lubrificante NÃO

Etilcelulose agente de revestimento, aglutinante NÃO

Hidroxipropilmetilcelulose agente de revestimento, polímero para liberação sustentada

NÃO

Lactose diluente NÃO

Talco lubrificante NÃO

Como descrito no item 4.2.1, a reação com o Polyquart H®, um polímero

poliaminado e polihidroxilado capaz de complexar com o BITC e retardar sua

liberação, ocorreu de forma diversa daquelas para os demais excipientes, verificando-

se reação entre o BITC e o excipiente testado.

Os espectros de RMN 1H a seguir foram obtidos para o BITC (espectro 1), o

Polyquart H® em DMSO (espectro 2) e Polyquart H® + BITC após refluxo (espectro 3).

87

Espectro 1 – RMN 1H [400 MHz, CDCl3, (ppm)]: 7,41-7,29 (m, 5H), 4,70 (s, 2H) BITC

Espectro 2 – RMN 1H [400 MHz, CDCl3, (ppm)]: 3,60 (s), 3,52 (s), 2,52 (s), 1,91 (s), 1,24 (s) Polyquart H® em DMSO

H aromáticos

a

a

BITCa

Polyquart H®

emDMSO

88

Espectro 3 – RMN 1H [400 MHz, CDCl3, (ppm)]: 7,97 (sl), 7,29-7,23 (m), 4,68 (s), 3,50 (s), 3,35 (s), 2,48 (s) – Polyquart H® + BITC após refluxo

A análise dos espectros acima revela que, diferentemente dos espectros

anteriores (1 e 2), no espectro 3 observa-se um deslocamento compatível com a

formação de uma ligação N-H (possivelmente de um carbamato) em = 7,97 ppm

mostrando a possibilidade de ter ocorrido reação entre o BITC e o Polyquart H®,

através de seus grupamentos hidroxila. Tal análise evidencia que aspectos estruturais

dos excipientes devem ser considerados no momento da formulação, principalmente

quando se utilizam excipientes com grupamentos funcionais passíveis de reação com

o BITC, aminas e hidroxilas, que podem comprometer a estabilidade da forma

farmacêutica, como exemplificado pelos grupamentos amina do Polyquart H®, que, ao

reagirem com o BITC, produzem uma ligação covalente, diminuindo a atividade

larvicida do composto de origem.

N-H

H aromáticos

CH2

H2O

DMSO

Polyquart H® + BITC

89

Com isso, descarta-se a utilização de excipientes aminados e polióis como

base para formulação de larvicida de liberação prolongada de BITC.

A compatibilidade deverá ser avaliada de forma mais profunda e significativa a

partir dos testes de estabilidade, após a definição dos excipientes utilizados na forma

farmacêutica escolhida.

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVICIDA DO BITC

Inicialmente foi realizado o estudo da atividade larvicida do BITC (Sigma-

Aldrich; 99,5% pureza). Para avaliação inicial da faixa de concentração onde o BITC

se mostraria ativo contra larvas de Aedes aegypti, foram preparadas as soluções-

-amostra indicadas na Figura 26.

Figura 26: Soluções utilizadas na avaliação da atividade larvicida do BITC

Os resultados obtidos para a atividade larvicida e os corrigidos pela fórmula de

Abbott, o gráfico de dose-resposta utilizado para a determinação dos valores de CL50

e CL99 pela análise de probitos encontram-se na Figura 27.

Solução Estoque G

C = 12,8mg/mL

Solução Estoque H

C = 12,4mg/mL

Solução G1: 0,794mg/mL







Solução H1: 0,826mg/mL







Cada solução foi testada em 4 copos


Solução GH1: 0,810mg/mL







Foi considerado então que, para cada solução, foram

testadas 160 larvas

Média das concentrações das soluções G e H

BITC comercial

Solução Estoque G

C = 12,8mg/mL

Solução Estoque G

C = 12,8mg/mL

Solução Estoque H

C = 12,4mg/mL

Solução Estoque H

C = 12,4mg/mL

Solução Estoque H

C = 12,4mg/mL
























Foi considerado então que, para cada solução, foram

testadas 160 larvas



BITC comercial

90

SOLUÇÃOCONCENTRAÇÃO1

(mg/mL)

CONCENTRAÇÃO FINAL NO COPO2

(ppm)

MORTALIDADE OBSERVADA3

(%)

MORTALIDADE CORRIGIDA4

(%)

GH1 0,810 3,24 91,87 91,8

GH2 0,713 2,85 89,37 89,3

GH3 0,610 2,44 76,25 76,1

GH4 0,518 2,07 70,00 69,8

GH5 0,421 1,68 54,37 54,1

GH6 0,324 1,29 50,62 50,3

GH7 0,226 0,91 24,37 23,9

1Concentração média das soluções G e H em acetona 2Concentração final no copo após transferência de 1 mL da solução até volume final de 250 mL3Percentual de larvas mortas (N=160 larvas) 4Mortalidade percentual corrigida pela fórmula de Abbott (mortalidade no controle negativo = 0,6%)

ANÁLISE DE PROBITOS

Curva Dose x Resposta (BITC)

Figura 27: Atividade larvicida do BITC contra Aedes aegypti

CL50= 1,44 ppmErro padrão= 0,04

CL99= 6,52 ppmErro padrão= 0,60

91

O valor de CL50 obtido para o BITC comercial foi de 1,44 ppm contra os

referenciados na literatura para os inseticidas organofosforados temephos (2,3 ppm) e

fenitrothion (2,1 ppm), como descrito por Macoris e colaboradores (MACORIS et al.,

2007). Dessa forma, observa-se que o BITC é mais ativo que os inseticidas

comumente utilizados no combate ao Aedes aegypti.

A metodologia adotada para a avaliação da atividade inseticida contra larvas de

Aedes aegypti das diferentes tioureias obtidas anteriormente por Viana em 2009 foi a

mesma utilizada no estudo do BITC. Foi realizado um estudo de triagem, no qual

todas as tioureias foram testadas na concentração de 50 ppm (referente à

concentração final em cada copo do teste), de maneira a se detectarem as diferenças

de atividade larvicida das moléculas.

Os resultados de atividade obtidos para o BITC e as benziltioureias estudadas

encontram-se no gráfico abaixo:

Gráfico 1 - Atividade larvicida do BITC e das benziltioureias sintetizadas contra Aedes aegypti

Como se observa no gráfico 1, as tioureias mais ativas contra as larvas de 3º

estádio de Aedes aegypti foram os compostos 21 (N-benzil, N’-(4-metoxifenil)tioureia -

62,5% de atividade), 24 (N-benzil, N’-(2,6-dimetilfenil)tioureia – 97,5% de atividade),

26 (N-benzil, N’-(2-nitro,4-metoxifenil)tioureia - 37,5% de atividade) e 27 (N-benzil, N’-

Percentual de Mortalidade Observado(%)

BITC e número das benziltioureias

92

(α-naftil)tioureia – 85% de atividade). Observa-se que as benziltioureias são bem

menos ativas do que o BITC puro anteriormente testado, mesmo sendo utilizadas na

concentração de 50 ppm (~50 vezes a CL50 do BITC). Porém, a alta reatividade do

BITC, conferida pelo seu grupamento isotiocianato, torna esse composto menos

estável, quando comparado as suas tioureias derivadas. Dessa forma, a vantagem

comparativa desta nova classe se refere à maior estabilidade química das tioureias

quando comparadas ao BITC. Tal fato possibilitaria formular um inseticida de

liberação prolongada com estas novas moléculas, aumentando sua aplicabilidade. O

fato de serem compostos sólidos e não líquidos, como o BITC, representa outra

vantagem adicional comparativa da classe. A princípio, ainda pode-se considerar que

a maior reatividade do BITC o tornaria mais tóxico para humanos que suas tioureias

derivadas, observando-se assim mais uma vantagem comparativa das mesmas

(MASUTOMI et al., 2001). A facilidade de síntese e de purificação dessas tioureias é

função da alta reatividade de seu composto de origem, o BITC, o que também pode

ser avaliado como uma vantagem dessa classe de compostos.

Estudos de toxicidade subaguda do BITC em ratos foram realizados por

Lewerenz e colaboradores em 1992, através da administração oral de 0, 50, 100 e

200 mg de BITC/kg massa corporal/dia durante 4 semanas. Observou-se que o ganho

de massa corporal e o consumo de alimento diminuíram com o aumento das doses de

BITC. O grupo que recebeu as doses mais altas, 200 mg/kg/dia mostrou alterações

hematológicas no nível sérico de colesterol e triglicerídeos. Disfunção renal também

foi observada pela redução no volume de urina, proteinúria e aumento da atividade da

enzima urinária lactato desidrogenase. Efeitos renais também foram observados por

Akagi e colaboradores (AKAGI et al., 2003) e por Masutomi e colaboradores

(MASUTOMI et al., 2001). A exposição dos ratos estudados ao BITC também afetou a

massa de vários órgãos e causou alterações histológicas no ducto colédoco, fígado,

íleo e linfonodos mesentéricos (LEWERENZ et al., 1992), evidenciando-se sua

toxicidade. Quanto às tioureias, há poucos estudos publicados sobre sua toxicidade.

De acordo com estudo realizado por Onderwater e colaboradores (ONDERWATER et

al, 1993), a toxicidade das tioureias em hepatócitos de rato é estrutura-dependente e

se manifesta com uma ligação com a enzima lactato-desidrogenase (LDH) e depleção

93

das sulfidrilas não protéicas intracelulares, principalmente o glutation reduzido (GSH),

seguidas por alquilação de estruras macromoleculares vitais.

5.3 ESTUDOS DE SAR E MODELAGEM MOLECULAR

O estudo das relações estrutura-atividade de um composto-protótipo e seus

análogos auxilia na determinação de quais partes da molécula são responsáveis pela

atividade biológica, ou seja, o grupo farmacóforo. As relações estrutura-atividade

geralmente são elaboradas alterando-se parte da estrutura química do protótipo e

observando-se qual influência na atividade sob os pontos de vista quali e quantitativo.

Pode-se alterar a dimensão e a conformação do esqueleto de carbono, a natureza e o

grau de substituição, ou ainda a estereoquímica (THOMAS, 2003).

A atividade biológica de uma molécula depende de uma conformação única

dentre todas aquelas possíveis de baixa energia. A busca por essa conformação

bioativa é um dos objetivos principais da química medicinal. Somente esta

conformação bioativa ligar-se-á ao ambiente macromolecular específico no sítio ativo

do receptor (HÖLTJE et al., 2003).

A modelagem molecular reúne todo um conjunto de técnicas computacionais

que possibilitam a construção, a visualização, a manipulação e a estocagem de

modelos moleculares tridimensionais, permitindo a análise conformacional, o cálculo

de propriedades estéreo-eletrônicas e a análise de variações estruturais que auxiliam

na interpretação das correlações entre as estruturas químicas de uma série de

compostos com a variação da atividade bilógica, sendo de grande importância no

planejamento de moléculas bioativas. Diante disso, os estudos envolvendo a relação

estrutura-atividade (Structure-Activity Relationship - SAR) de uma série de compostos

são essenciais na avaliação da atividade e na toxicidade seletiva, além de guiar a

síntese de novas moléculas, minimizando o universo de compostos a serem testados

(MAGALHÃES, 2009).

A segunda estratégia, isto é, o uso do método indireto, é necessária quando a

estrutura da macromolécula-alvo não é conhecida. Assim, informações sobre a

atividade e características estruturais e estereoeletrônicas dos compostos ativos e

inativos podem ser utilizadas para determinar propriedades específicas de uma

molécula que podem influenciar na interação com o alvo, tais como calor de

94

formação, potencial eletrostático molecular (Molecular Eletrostatic Potential - MEP),

densidade eletrônica, energia e coeficiente dos orbitais de fronteira HOMO (Highest

Occupied Molecular Orbital) e do LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital),

energia de ionização, ordem de ligação e momento de dipolo (BARREIRO et al.,

1997) grupos hidrofóbicos, grupos aceptores e doadores de ligação hidrogênio. A

partir dessas informações, gera-se um modelo que pode ser utilizado para a seleção

de compostos de bancos de dados ou orientar o processo de planejamento (COHEN

et al., 1990).

Os resultados dos estudos de SAR se encontram listados nas Tabelas 2 e 3.

95

Tabela 2 – Comparação entre atividade larvicida das benziltioureias e suas propriedades físico-químicas

C R1Atividade

(%)MW1 clogP2 pKa3

BITC - 100 149,2 2,27 ND

1 H 10,0 166,2 1,54 16,57

2 CH3 0 180,3 2,06 16,34

3 (CH2)3CH3 5,00 222,4 3,30 16,35

4 CH(CH3)2 32,5 208,3 2,72 16,19

5* [CH(CH3)2]2* 46,0 250,4 3,75 15,33

6 CH2CH(CH3)2 5,00 222,4 3,29 16,42

7 CH2CH2OH 0 210,3 1,55 16,53

8 (CH2)8CHCH(CH2)7CH3 0 416,7 8,83 16,38

9 CH2 fenil 22,5 256,4 3,80 16,11

10** piperazinil** 0 235,4 1,82 15,92

11** morfolinil** 5,00 236,3 2,04 15,80

12 ciclohexil 22,5 248,4 3,61 16,16

13 piridinil 20,0 243,3 3,11 15,29

14 fenil 0 242,4 3,73 15,69

15 2-CH3 fenil 17,5 256,4 4,22 15,70

16 2-CH(CH3)3 fenil 0 298,4 5,43 15,70

17 3-OH fenil 35,0 258,3 3,34 15,93

18 3-COCH3 fenil 15,0 284,4 3,04 15,75

19 4-CH3 fenil 10,0 256,4 4,21 15,78

20 4-OH fenil 0 258,3 3,34 15,86

21 4-OCH3 fenil 62,5 272,4 3,60 15,74

22 4-NO2 fenil 27,5 287,3 3,76 15,19

23 4-NHCOCH3 fenil 7,50 299,4 2,64 15,78

24 2,6-CH3 fenil 97,5 270,4 4,70 15,70

25 3,4-Cl fenil 5,00 311,2 4,84 15,25

26 2-NO2,4-OCH3 fenil 37,5 317,4 3,63 15,34

27 α-naftil 85,0 292,4 4,72 15,69

1 Massa Molecular; 2 Constante de Lipofilicidade ; 3 pKa (= -log Ka)

* Tioureia secundária (N’ dissubstituído) ** N’ faz parte do radical heterocíclico ND- Não determinado

As linhas pontilhadas dividem os compostos de acordo com a natureza dos substituintes conforme Quadros 3-9

96

Tabela 3 – Comparação entre atividade larvicida das benziltioureias e suas propriedades eletrônicas moleculares teóricas

C R1Atividade

(%)MW1 HBD2 HBA3 EHOMO

4

(eV)ELUMO

5

(eV)µ6

(Debye)

BITC - 100 149,2 0 2 -6,80 -1,22 2,92

1 H 10,0 166,2 2 3 -6,01 -0,22 6,78

2 CH3 0 180,3 2 3 -6,05 -0,23 6,84

3 (CH2)3CH3 5,00 222,4 2 3 -6,02 -0,24 6,70

4 CH(CH3)2 32,5 208,3 2 3 -6,01 -0,22 6,71

5* [CH(CH3)2]2* 46,0 250,4 1 3 -5,79 -0,44 6,91

6 CH2CH(CH3)2 5,00 222,4 2 3 -6,02 -0,25 6,76

7 CH2CH2OH 0 210,3 3 4 -6,01 -0,23 5,35

8 (CH2)8CHCH(CH2)7CH3 0 416,7 2 3 -5,89 -0,22 7,44

9 CH2 fenil 22,5 256,4 2 3 -6,02 -0,28 6,93

10** piperazinil** 0 235,4 1 4 -5,77 -0,26 6,08

11** morfolinil** 5,00 236,3 1 4 -5,99 -0,51 6,20

12 ciclohexil 22,5 248,4 2 3 -5,99 -0,22 6,73

13 piridinil 20,0 243,3 2 4 -6,13 -0,99 4,52

14 fenil 0 242,4 2 3 -5,84 -0,82 6,69

15 2-CH3 fenil 17,5 256,4 2 3 -5,80 -0,85 6,86

16 2-CH(CH3)3 fenil 0 298,4 2 3 -5,81 -0,86 6,87

17 3-OH fenil 35,0 258,3 3 4 -5,73 -0,86 6,59

18 3-COCH3 fenil 15,0 284,4 2 4 -5,92 -1,54 9,20

19 4-CH3 fenil 10,0 256,4 2 3 -5,69 -0,79 6,62

20 4-OH fenil 0 258,3 3 4 -5,40 -0,71 8,06

21 4-OCH3 fenil 62,5 272,4 2 4 -5,43 -0,73 7,81

22 4-NO2 fenil 27,5 287,3 2 6 -6,18 -2,60 11,45

23 4-NHCOCH3 fenil 7,50 299,4 3 5 -5,46 -0,84 10,52

24 2,6-CH3 fenil 97,5 270,4 2 3 -5,97 -0,72 6,25

25 3,4-Cl fenil 5,00 311,2 2 3 -6,03 -1,05 7,32

26 2-NO2,4-OCH3 fenil 37,5 317,4 2 7 -5,93 -2,79 4,05

27 α-naftil 85,0 292,4 2 3 -5,38 -1,35 6,581 Massa Molecular; 2 Doador de Ligações Hidrogênio; 3 Aceptor de Ligações Hidrogênio; 4 Energia de HOMO; 5 Energia de LUMO; 6 Momento Dipolo Molecular * Tioureia secundária (N’ dissubstituído) ** N’ faz parte do radical heterocíclico As linhas pontilhadas dividem os compostos de acordo com a natureza dos substituintes conforme Quadros 3-9

97

Os valores de clogP (Tabela 2) representam o caráter lipofílico das

benziltioureias estudadas e variaram de 1,54 a 4,84 (exceto para as benziltioureias 8

e 16, com valores de 8,83 e 5,43, respectivamente, que não apresentaram atividade

larvicida), mostrando que as moléculas são suficientemente lipofílicas para

penetrarem as membranas biológicas das larvas, associados aos valores de massa

molecular, que variaram de 149,2 - para o BITC - a 416,7 - para a maior benziltioureia

analisada, estando em concordância com a Regra-dos-Cinco de Lipinski, que

estabelece como condição valores de clogP < 5 e MW ≤ 500 (LIPINSKI et al., 2001).

Analisando-se os valores de pKa (Tabela 2), observou-se uma variação de

15,19 a 16,57. Os valores elevados de pKa obtidos indicam que os compostos são

dificilmente ionizáveis e, consequentemente, ultrapassam mais facilmente as barreiras

biológicas das larvas.

Analisando-se os dados da tabela 2, observou-se:

a) para as benziltioureias com R1 alifático (Quadro 3), que o maior volume de R1 e

R2 (compostos 4 e 5, atividade 32,5% e 46%, respectivamente) provocou aumento da

atividade em relação ao composto 1, não substituído (atividade 10%); indicando a

possível relação do efeito estérico dos substituintes em relação ao N’ com a atividade

larvicida desses compostos. A baixa atividade ou mesmo sua ausência nos

compostos com cadeias alifáticas mais extensas que a metil indicou que esses grupos

mais volumosos devem estar próximos ao átomo N’, proporcionando interações do

tipo π-π stacking (GRIMME, 2008); considerando os parâmetros de dissociação e

lipofilicidade, pHa e clogP, respectivamente, observa-se que o menor valor de pKa

leva ao composto mais ativo, com clogP igual a 3,75 (tioureia 5 – 46% de atividade).

b) a análise preliminar dos substituintes das benziltioureias com R1 saturado

alicíclico ou heterocíclico (Quadro 4) demonstrou que o átomo N’ deve estar

acessível, apresentando mobilidade conformacional para proporcionar maior interação

com o receptor, como observado pela maior atividade larvicida observada para o

composto 12 (22,5%); a maior atividade relaciona-se ao composto com maior valor de

pKa, mostrando também a possível influência da lipofilicidade (clogP = 3,61) , maior

para essa tioureia, estando na mesma ordem de grandeza daquele calculado para a

tioureia 5, que apresentou 46% de atividade larvicida;

98

c) quando o substituinte R1 é um anel aromático não-substituído (Quadro 5),

observou-se que o substituinte piridina (composto 13) foi 20 vezes mais ativa que o

benzeno (composto 14), possivelmente em função da maior contribuição do par de

elétrons livre do átomo de N no anel piridínico, aumentando a densidade eletrônica no

anel aromático, gerando novos sítios de interação com os prováveis receptores; o

composto mais ativo tendo apresentado também menor valor de pKa;

d) na comparação entre os substituintes R1 aromáticos orto-substituídos (Quadro 6),

pôde-se concluir que a natureza do substituinte na posição orto é crítica para a

atividade larvicida do composto, em função da restrição conformacional tipo π-π

stacking, como observado pela maior atividade do composto 15 (17,5%), não se

observando alteração na atividade em função do pKa, mostrando a maior influência

dos fatores estéricos para explicar a maior atividade do composto com um substituinte

pouco volumoso (metila) na posição orto quando comparada a um substituinte mais

volumoso (tert-butil) na mesma posição;

e) quando foi analisada a substituição do R1 aromático na posição meta (Quadro 7),

observou-se uma atividade cerca de 2 vezes maior para o composto com OH

(composto 17 – 35% de atividade) frente àquele acetilado (composto 18 – 15% de

atividade), indicando que a presença de um grupamento ativador forte na posição

meta do anel aromático, como o grupamento hidroxila, pode ser mais importante para

a atividade larvicida que um substituinte moderadamente desativador, como o

grupamento acetila em função da formação de ligações hidrogênio, apresentando

também maiores valores de pKa e clogP;

f) a substituição do R1 aromático na posição para (Quadro 8) revelou que o

composto mais ativo foi aquele com o grupamento p-OCH3 (composto 21- 62,5% de

atividade), um substituinte moderadamente ativador do anel aromático com baixa

capacidade de formar ligações hidrogênio, em total contraposição à p-OH, outro

substituinte ativador do anel (composto 20 – 0% de atividade) e, curiosamente, um

grupamento fortemente desativador, p-NO2 (composto 22) apresentou a segunda

maior atividade desse grupo (27,5% de atividade), mostrando uma possível alteração

conformacional provocada pelo grupamento NO2. Um substituinte p-acetamidofenila,

um grupamento moderadamente ativador do anel, levou a uma benziltioureia com

atividade de 7,5% (composto 23). Esses dados sugeriram que a presença de

99

substituintes na posição para são importantes para a atividade desse grupo de

benziltioureias, sendo sua natureza relevante, bem como os valores de pKa e clogP

na ordem de 15 e 3, respectivamente. Enquanto a posição orto revela o aspecto da

restrição conformacional, a substituição em para considera aspectos eletrônicos do

substituinte.

g) as benziltioureias mais ativas desse trabalho encontraram-se no grupo daquelas

com R1 aromático dissubstituído (Quadro 9), sendo o composto mais ativo aquele

com substituição orto,orto-dimetil (composto 24 – 97,5% de atividade), indicando que

um impedimento estérico moderado sobre o N’ pode ser importante para a atividade

larvicida desses compostos por reduzir a mobilidade conformacional. O segundo

composto mais ativo desse grupo (composto 27- 85% de atividade), com substituinte

α-naftil (considerado uma substituição orto-meta nas posições 2 e 3 do benzeno),

mostra a possibilidade do efeito eletrônico adicional (π-π stacking), exercendo efeito

sinérgico. A atividade moderada do composto o-NO2,p-OCH3 (composto 26 – 37,5%

de atividade) mostra a presença de um substituinte fortemente desativador na posição

orto e de um substituinte moderadamente ativador no anel na posição para,

reforçando a hipótese da presença de um ativador na posição para ser importante

para a atividade larvicida dessas benziltioureias e da contribuição de um substituinte

na posição orto, em termos conformacionais. A presença dos substituintes fracamente

desativadores no composto 25, Cloro nas posições meta e orto, levou aos compostos

menos ativos desse grupo (5% de atividade), reforçando-se a importância da

substituição na posição orto e valores de pKa na ordem de 15.

Os valores de HBD variaram de 0 a 3 e HBA variaram de 2 a 7 (Tabela 3),

satisfazendo também a Regra-dos-Cinco de Lipinski (HBD < 5 e HBA < 10) (LIPINSKI

et al., 1997). Os dados obtidos para HBD e HBA não parecem ter nenhuma

correlação clara ou direta com a atividade larvicida das benziltioureias estudadas.

A análise total dos momentos de dipolo molecular das benziltioureias (Tabela

3) mostrou uma ampla variação de 4,05 a 11,45 Debye, sem nenhuma correlação

clara ou direta com a atividade larvicida das benziltioureias estudadas.

A análise total das energias de HOMO e LUMO revelou que ambas variaram

amplamente (EHOMO: -6,80 a -5,38 eV, ELUMO: -2,79 a -0,22 eV), também sem

100

nenhuma correlação clara ou direta com a atividade larvicida das benziltioureias

estudadas.

Os modelos gráficos obtidos para o BITC encontram-se na Figura 28.

Configuração de menor energia

MEP Densidade

HOMO

Densidade

LUMO

Figura 28 – Modelos gráficos para a molécula de BITC

A conformação de menor energia para o BITC mostra a ligação N=C=S

paralela à posição assumida pelo anel aromático.

O mapa de potencial eletrostático molecular (MEP) é uma abordagem

alternativa para se compreender a contribuição eletrostática para a ligação entre a

droga e o receptor. Analisando-se o MEP do BITC, observa-se uma distribuição

eletrônica homogênea, com as regiões de maior densidade eletrônica localizadas no

centro do anel aromático e sobre os átomos de Nitrogênio e Enxofre, enquanto as

baixas densidades eletrônicas encontram-se nos átomos de Carbono do anel

aromático e sobre a área de CH2.

O mapa de densidade HOMO revela maiores densidades de HOMO sobre o

anel aromático.

O mapa de densidade de LUMO mostra altas densidades LUMO na região

periférica ao anel aromático.

Vale ressaltar que a densidade de HOMO é essencial para a transferência de

elétrons, enquanto a densidade de LUMO representa áreas mais suscetíveis de

ataques nucleofílicos (GRANT e RICHARDS, 1996). Essa inversão observada nas

densidades de HOMO e LUMO das tioureias em relação ao BITC pode explicar a

maior atividade larvicida do BITC quando comparada a essa classe de compostos.

A Figura 29 mostra as conformações de menor energia das benziltioureias

estudadas. Os valores da atividade larvicida frente ao Aedes aegypti encontram-se

entre parênteses ao lado do número atribuído à benziltioureia (X%), de modo a

facilitar a comparação entre os compostos.

101

Tioureia 1 (10%) Tioureia 2 (0%) Tioureia 3 (5%) Tioureia 4 (32,5%)

Tioureia 5 (46%) Tioureia 6 (5%) Tioureia 7 (0%) Tioureia 8 (0%)

Tioureia 9 (22,5%) Tioureia 10 (0%) Tioureia 11 (5%) Tioureia 12 (22,5%)

Tioureia 13 (20%) Tioureia 14 (0%) Tioureia 15 (17,5%) Tioureia 16 (0%)


Tioureia 21(62,5%) Tioureia 22 (27,5%) Tioureia 23 (7,5%) Tioureia 24 (97,5%)

Tioureia 25 (5%) Tioureia 26 (37,5%) Tioureia 27 (85%)

Figura 29 – Conformações de menor energia das benziltioureias estudadas

102

Essas estruturas (Figura 29) indicam que essas são as conformações mais

estáveis para os referidos compostos e pode-se observar que o anel aromático

originado do BITC assume diferentes conformações em função dos substituintes do

átomo N’, de modo a conferir menores valores de energia e, consequentemente,

tornar a conformação mais estável.

Analisando-se as estruturas da Figura 29, observa-se que a conformação da

benziltioureia que apresentou maior atividade larvicida difere das demais em relação à

posição assumida pelos dois anéis aromáticos que, no caso do composto 24 (mais

ativo), apresentam uma posição relativamente distorcida, ocupando dois diferentes

planos, mostrando o efeito estérico dos grupamentos orto-metila em relação ao átomo

de nitrogênio N’ (Figura 30).

Figura 30 – Conformação mais estável da benziltioureia mais ativa

A Figura 31 mostra os mapas de potencial eletrostático molecular – MEP das

benziltioureias estudadas.

N’

103


Tioureia 5 (46%) 6 (5%) 7 (0%) 8 (0%)

9 (22,5%) Tioureia 10 (0%) Tioureia 11 (5%) Tioureia 12 (22,5%)



Tioureia 21 (62,5%) Tioureia 22 (27,5%) Tioureia 23 (7,5%) Tioureia 24 (97,5%)


Figura 31 – Mapas de Potencial Eletrostático Molecular (MEP) das benziltioureias estudadas

104

Analisando-se os MEP para as diferentes benziltioureias, observou-se que a

região mais negativa (vermelha), representando uma alta densidade eletrônica,

encontra-se na parte superior das moléculas, sobre a ligação tioureia, para a maioria

dos compostos, exceto para as benziltioureias 18 (onde se encontra dividido com a

carbonila), 22 (deslocado para o grupamento p-NO2), 23 (dividida com o grupamento

p-acetamida), 25 (minimizada pelos dois átomos de Cloro em meta e para) e 26

(minimizada pela presença dos grupamentos o-NO2 e m-OCH3). Esse parâmetro não

parece ter correlação com a atividade larvicida. As tioureias mais ativas (21, 24 e 27)

apresentam alta densidade eletrônica sobre a ligação tioureia, porém as

benziltioureias sem nenhuma atividade (0% - 2, 7, 8, 10, 14, 16, 20) também têm o

mesmo perfil.

A figura 32 ilustra as densidades de HOMO benziltioureias estudadas.

105








Figura 32 – Densidades de HOMO das benzilioureias estudadas codificadas sobre uma superfície de van der Waals

106

No mapa da densidade de HOMO, codificada sobre uma superficie de van der

Waals (Figura 32), os valores das densidades de HOMO podem variar de vermelho

(baixo valor de HOMO) a azul (alto valor de HOMO). Para a maioria das benziltioureias

estudadas, pode-se observar a predominância da cor vermelha, isto é, baixo valor de

HOMO, sobre o anel aromático derivado do BITC (anel da esquerda), diferentemente

do observado para o BITC, em que o mapa de densidade HOMO revela maiores

densidades de HOMO sobre o anel aromático.

Diferentemente do BITC, nos compostos de 1 a 12 (exceto o composto 10, que,

provavelmente em função de um segundo átomo de N no anel piperazina desloca a

densidade de HOMO), observa-se a densidade de HOMO concentrada sobre a ligação

tioureia (N=C=S), o que volta a acontecer no composto 22, no qual a presença do

grupamento NO2 substituído em para parece fazer com que essa densidade retorne ao

seu ponto original. Um composto de atividade moderada (46% - composto 5) apresenta

essa alta densidade de HOMO sobre a ligação tioureia.

Nos compostos 13 a 27 (exceto o composto 22, já citado anteriormente),

observa-se o deslocamento da densidade de HOMO para o substituinte aromático do

átomo de nitrogênio N’ e seus grupamentos substituintes nas posições descritas,

mostrando variação da atividade de 0 a 97,5%.

Os dois compostos mais ativos – 24 (97,5% atividade) e 27 (85% atividade) –

apresentam densidade de HOMO nitidamente maior sobre o anel aromático

dissubstituído, o que reproduz as densidades observadas para o BITC.

Avaliando-se os compostos mais ativos, pôde-se concluir que esse

deslocamento da densidade do HOMO para a região do anel aromático substituído é

importante para a atividade larvicida das benziltioureias estudadas contra o Aedes

aegypti em sua fase aquática, representando áreas suscetíveis a interações com

regiões de baixa densidade eletrônica do sítio receptor via interação do tipo π-π

stacking.

A Figura 33 mostra o comportamento das densidades de LUMO nas

benziltioureias estudadas.

107








Figura 33 – Densidades de LUMO das benziltioureias estudadas, gerada numa superfície de densidade eletrônica constante de 0,002 e/ua3

108

O mapa de densidade LUMO descreve áreas deficientes em elétrons que

podem ser suscetíveis à interação com regiões de alta densidade eletrônica do

receptor alvo das benziltioureias. As áreas deficientes em elétrons, ou seja, com baixos

valores de densidade eletrônica ou alto valor de LUMO, são representadas pela

coloração azul

Analisando-se o mapa das densidades de LUMO das benziltioureias

estudadas, observa-se que as áreas mais azuis, isto é, mais deficientes em elétrons,

encontram-se na região central da molécula, o que se observa nitidamente para o

composto mais ativo da classe, a benziltioureia 24 (97,5% de atividade), enquanto o

segundo composto mais ativo, a benziltioureia 27 (85% de atividade) mostra essas

densidades dispersas pelo radical α-naftil.

Esses dados sugerem haver influência das densidades de LUMO na atividade

larvicida das benziltioureias estudadas, uma vez que, da mesma forma que o BITC

(Figura 28), a maior densidade de LUMO encontra-se fora do anel aromático derivado

desse composto, isto é, na região de N’, representando áreas suscetíveis a possíveis

ataques nucleofílicos do receptor.

5.4 IDEALIZAÇÃO DAS NOVAS BENZILTIOUREIAS A SEREM SINTETIZADAS

A partir dos resultados obtidos para atividade larvicida das benziltioureias

estudadas, foram selecionados os compostos mais ativos com substituições simples

no anel aromático de R1 para melhor avaliação de sua estrutura:

a) 21 (N-benzil,N’-(4-metoxifenil)tioureia);

b) 24 (N-benzil,N’-(2,6-dimetilfenil)tioureia); e

c) 26 (N-benzil,N’-(2-nitro,4-metoxifenil)tioureia).

Benziltioureias derivadas das três benziltioureias mais ativas, obtidas a partir

da introdução e retirada de grupamentos doadores e retiradores de elétrons do anel

aromático do substituinte R1, como metoxila (OCH3), cloro (Cl) e nitro (NO2), foram

sugeridas pelos estudos de SAR como potencialmente mais ativas.

109

Os resultados obtidos para as propriedades eletrônicas e físico-químicas das

moléculas estudadas encontram-se na Tabela 4.

Tabela 4 – Propriedades moleculares teóricas das benziltioureias propostas

C R1Atividade

(%)MW1 HBD2 HBA3 EHOMO

4

(eV)ELUMO

5

(eV)µ6

(Debye)clogP7

21 4-OCH3 fenil 62,5 272,4 2 4 -5,43 -0,73 7,81 3,60

21a 4-Cl fenil ND 276,8 2 3 -5,86 -0,93 7,70 4,29

24 2,6-CH3 fenil 97,5 270,4 2 3 -5,97 -0,72 6,25 4,70

24a 2,6-CH3,4-Cl fenil ND 304,8 2 3 -5,99 -0,80 7,68 5,26

24b 2,6-CH3,4-OCH3 fenil ND 300,4 2 4 -5,55 -0,65 5,47 4,58

24c 2,6-Cl fenil ND 311,2 2 3 -6,13 -1,02 5,02 4,84

26 2-NO2,4-OCH3 fenil 37,5 317,4 2 7 -5,93 -2,79 4,05 3,63

26a 2,4-OCH3 fenil ND 302,4 2 5 -5,27 -0,69 9,43 3,48

26b 2-Cl,4-OCH3 fenil ND 306,8 2 4 -5,65 -0,85 3,98 4,16

1 Massa Molecular; 2 Doador de Ligações Hidrogênio; 3 Aceptor de Ligações Hidrogênio; 4 Energia de HOMO; 5

Energia de LUMO; 6 Momento Dipolo Molecular, 7 Lipofilicidade

ND – Não Determinado

A análise dos dados permite concluir que houve, na maioria dos casos, um

aumento na lipofilicidade (clogP) das moléculas propostas em relação ao seu

protótipo, com apenas o composto 24a ultrapassando o valor de clogP de 5. Todos

os demais parâmetros para a aplicação da Regra-dos-Cinco de Lipinski foram

obedecidos, o que se observa pela avaliação de massa molecular (MW), doadores de

ligação hidrogênio (HBD) e aceptores de ligação hidrogênio HBA.

Não houve variação significativa entre os valores de energia dos orbitais de

fronteira HOMO (-6,13 a -5,27 eV) e LUMO (-2,79 a -0,65 eV).

Os momentos de dipolo molecular (µ) sofreram variação de 3,48 a 4,84 Debye.

As conformações de menor energia encontram-se dispostas na Figura 34.

110

Tioureia 21 Tioureia 21a

Tioureia 24 Tioureia 24a Tioureia 24b Tioureia 24c

Tioureia 26 Tioureia 26a Tioureia 26b

Figura 34 – Conformações de menor energia das benziltioureias propostas

Avaliando-se as conformações de menos energia, isto é, as conformações

mais estáveis das tioureias propostas, não foi possível observar nenhuma mudança

drástica na conformação das moléculas mais ativas pela introdução ou retirada de

grupamentos com características eletrônicas diferentes. A exceção foi o composto 26,

no qual as duas substituições propostas (26a e 26b) impossibilitaram a existência da

ligação hidrogênio intramolecular entre o átomo de oxigênio da metoxila e o átomo de

hidrogênio de N’, que pode levar à alteração na atividade larvicida desses derivados.

Na Figura 35 estão dispostos os mapas de potencial eletrostático das

benziltioureias propostas.

111



Tioureia 26 Tioureia 26a Tioureia 26 b

Figura 35 – Mapas de Potencial Eletrostático Molecular (MEP) das benziltioureias propostas

No composto 21a observa-se uma ligeira redução da densidade eletrônica

sobre a ligação tioureia em relação ao composto 21, causada pela substituição de um

grupamento moderadamente ativador (OCH3) por outro fracamente desativador (Cl)

na posição para do anel aromárico de R1.

Em relação à série de derivados da benziltioureia 24, observa-se maior

distribuição dessa densidade eletrônica no composto 24b, o qual apresenta

grupamento metóxi na posição para do anel.

Quanto à série derivada da benziltioureia 26, observa-se o contrário das duas

anteriores, com a concentração da densidade eletrônica maior na região da ligação

tioureia para os compostos 26a e 26 b.

Essas alterações podem provocar alteração na atividade larvicida desses

compostos.

A Figura 36 traz as densidades de HOMO das benziltioureias propostas.

112



Tioureia 26 Tioureia 26a Tioureia 26b

Figura 36 – Densidades de HOMO das benzilioureias propostas codificadas sobre uma superfície de van der Waals

No mapa da densidade de HOMO, observa-se uma uniformidade levemente

maior da densidade HOMO na benziltioureia 21 quando comparada à 21a, ambas

localizadas no anel aromático do substituinte R1, diferentemente do que se observa

para o BITC.

Comparando-se os mapas da série derivada da benziltioureia 24, observa-se

uma drástica deslocalização da densidade eletrônica de HOMO no composto 24c, em

relação ao composto original e aos demais derivados, provocada pela substituição das

metilas por cloro nas posições 2 e 6.

Não se observam alterações significativas quanto à distribuição da densidade

de HOMO na série de derivados da benziltioureia 26.

Essa inversão da localização das densidades de HOMO pode explicar a menor

ativiadade das tioureias, em geral, quando comparadas ao composto original, o BITC.

Na Figura 37, pode-se observar a distribuição das densidades de LUMO nas

benziltioureias propostas.

113



Tioureia 26bTioureia 26 Tioureia 26a

Figura 37 – Densidades de LUMO das benziltioureias propostas, geradas em uma superfície de densidade eletrônica constante de 0,002 e/ua3

As densidades de LUMO dos compostos das séries de derivados das

benziltioureias 21 e 24 encontram-se localizadas no centro da molécula, sobre a

ligação tioureia.

Na benziltioureia 26, essa densidade encontra-se na região do radical orto-

NO2, na ligação hidrogênio intramolecular entre o átomo de oxigênio da metoxila e o

átomo de hidrogênio de N’, distintamente dos dois derivados, onde a densidade se

concentra no centro da molécula, sobre a ligação tioureia.

Em todos os casos, a densidade não está concentrada sobre o anel aromático

derivado do BITC, como ocorre também com essa molécula.

5.5 SÍNTESE DAS NOVAS BENZILTIOUREIAS

Com a conclusão dos estudos de SAR, pode se apontar que a presença de

substituintes no anel aromático do radical R1 é fundamental para a atividade larvicida

dessas benziltioureias. Pode-se dizer que um grupamento aceptor/retirador de

elétrons na posição para do núcleo aromático, presente nas benziltioureias mais

114

ativas, levaria a redução de sua atividade, enquanto a inserção de grupamentos

doadores de elétrons, preferencialmente, com baixa capacidade de formação de

ligações hidrogênio, nesta mesma posição teria efeito inverso. A substituição do

núcleo aromático benzil por outro mais volumoso, o α-naftil, levou a um expressivo

aumento da atividade larvicida desses compostos, quando comparados ao anel não

substituído, mostrando a influência de efeitos estéricos e eletrônicos na atividade

dessa classe de compostos.

As benziltioureias mais ativas, foram utilizadas para estudos de modelagem

molecular (compostos 21, 24 e 26). Foi sugerida a síntese da benziltioureia com maior

atividade larvicida (composto 24), substituindo-se a posição para com substituintes de

diferentes características.

Embora os estudos de SAR sugerissem a síntese da N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-

clorofenil)tioureia (24a), por disponibilidade de método e relativa similaridade entre os

substituintes Cloro e Bromo, foi sintetizada a N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-

bromofenil)tioureia (composto 24a’) (Capítulo 4 - Material e Métodos).

Seguindo a mesma linha de raciocínio da estrutura do composto 24a', foi

proposta a substituição do Bromo, que é um aceptor de elétrons, porém, volumoso,

pelo NO2, que é conhecidamente um forte retirador de elétrons do anel, diminuindo

sua densidade eletrônica. Para sintetizar a N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-nitrofenil)tioureia

(composto 24a"). Foi utilizada também a 2,6-dimetilanilina como composto de partida

para se obter a 2,6-dimetil,4-nitroanilina. Porém, em função da reatividade da amina

estar comprometida por sua baixa nucleofilicidade, causada pela presença de um

grupamento fortemente retirador de elétrons do anel aromático, NO2, e pelo

impedimento estérico à amina, causado pelas duas metilas nas posições 2 e 6 do

anel, esta não reagiu com o BITC para produzir a tioureia esperada (Capítulo 4 -

Material e Métodos).

Buscando observar o efeito de um substiutinte fortemente ativador do anel

aromático, foi proposta a síntese da N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-metoxifenil)tioureia

(composto 24b). A literatura foi avaliada à busca de um método viável de obtenção da

amina precursora, a 2,6-dimetil,4-metoxianilina, porém sem sucesso. O custo de sua

obtenção foi levantado, encontrando-se na ordem de US$ 500.00 / 1g (MaxChemCo,

pureza 98%), não justificando a síntese do composto 24b.

115

5.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LARVICIDA DA NOVA BENZILTIOUREIA

Com a N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-bromofenil)tioureia, composto 24a' na

concentração de 75% em relação ao composto total (25% da tioureia não bromada -

24), conforme descrito no item 4.2.7 (Capítulo 4 - Material e Métodos), foram

realizados os testes seguindo o protocolo utilizado para os demais descritos neste

trabalho.

Devido à dificuldade de purificação causada pela proximidade dos Rf das duas

benziltioureias (N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-bromofenil)tioureia e N-benzil,N’-(2,6-

dimetilfenil)tioureia), qualquer aumento ou diminuição da atividade larvicida seria

função da tioureia bromada. Se houvesse aumento na atividade, utilizaríamos

técnicas mais sofisticadas de separação dos dois compostos.

A atividade larvicida teve como controle positivo a benziltioureia 24 e, como

controle negativo, água e acetona, como nos demais testes.

Os resultados encontram-se na Tabela 5.

Tabela 5 – Teste Larvicida para a Benziltioureia 24a'

Copo Substância[ ]final

(ppm)

Mortalidade Média Corrigida**

(%)

Controle Negativo 1

Acetona (1 mL) NA* 0

Controle Negativo 2

H2O (1 mL) NA* 0

24a'N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-

bromofenil)tioureia50 97,5

Controle Positivo (24)

N-benzil,N’-(2,6-dimetilfenil)tioureia

50 97,5

*NA – Não se aplica **Mortalidade média de 4 copos corrigida pela fórmula de Abbott

Os resultados demonstram não haver alteração da atividade da benziltioureia

de origem (24), mostrando que a inserção do grupamento Bromo na posição 6 (ou

para) não provocou alterações na estrutura eletrônica e espacial capazes de interferir

na atividade larvicida da benziltioureia mais ativa contra Aedes aegypti.

116

6 CONCLUSÕES

Verificou-se que as tioureias possuem maior estabilidade química, são de mais

fácil utilização para uma possível formulação, devido a sua forma sólida, e

potencialmente menos tóxicas que o BITC. Os estudos aqui realizados mostraram

que este apresenta atividade letal expressivamente maior sobre as larvas de terceiro

estádio de Aedes aegypti, porém com menor estabilidade química, em função da alta

reatividade do grupamento isotiocianato.

Estudos de estabilidade e compatibilidade do BITC com alguns excipientes

possibilitaram concluir que os estudos de pré-formulação devem evitar a utilização de

excipientes aminados e polióis, como o Polyquart H® e similares, como base para

formulação de larvicida de liberação prolongada de BITC.

Dentre as benziltioureias estudadas, as que apresentaram maior atividade

larvicida possuem o substituinte R1 aromático dissubstituído, indicando que fatores

como impedimento estérico moderado sobre o N’ e efeito eletrônico de substituintes

no anel aromático de R1 são possíveis determinantes para a atividade larvicida

desses compostos.

Análises de SAR e modelagem molecular mostraram não haver correlação

clara e direta com os valores de HBD, HBA, momento dipolo molecular e energias dos

orbitais de fronteira HOMO e LUMO com a atividade larvicida dos compostos

estudados. Por outro lado, os valores de clogP, pKa da ordem de 3 e 15,

respectivamente, assim como a distribuição das densidades de HOMO e de LUMO na

molécula parecem estar relacionados à atividade larvicida.

Avaliando-se o composto 24a', sintetizado utilizando-se o composto mais ativo

como protótipo, os resultados dos testes larvicidas demonstraram que a inserção do

grupamento Bromo na posição 4 (ou para) não provocou alterações na estrutura

eletrônica e espacial capazes de interferir na atividade larvicida da benziltioureia mais

ativa contra Aedes aegypti. A síntese do composto 24b (N-benzil,N’-(2,6-dimetil,4-

metoxifenil)tioureia) torna-se importante para verificar o efeito ativador do

grupamento metoxila sobre o anel aromático do substituinte R1, de modo a se concluir

sobre a natureza do substituinte ideal para a posição para.

117

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