STEM(Scanning-transmission electron microscopy)

Marcos Farina

Instituto de Ciências Biomédicas-UFRJ

Nesta figura estão mostradas as duas modalidades fundamentais de observação através do MET. Com a lente de difração (INT 1), podemos focalizar o plano da primeira imagem (esquema à esquerda), ou o plano focal posterior da lente objetiva (esquema àdireita), gerando na tela de observação, uma imagem aumentada do objeto ou uma figura de difração, respectivamente. Adaptado de Loretto & Smallman, 1975

“Mass-thickness”

CAMPO ESCURO

Na modalidade varredura as lentes do microscópio são utilizadas para reduzir o tamanho do probe, formando um spot diminuto. O feixe varre a amostra ponto a ponto.

Poderíamos pensar que a resolução seria determinada pelo tamanho do probe, entretanto ela depende tambémdo número de elétrons no feixe e da capacidade do sistema ser capaz de detectar uma determinada estruturacontra um back-ground de ruido.

. Razão sinal/ruído = N/√N

. Razão mínima para detecção de um detalhe contra b.g. estatisticamente variável = 5/1

. Mais aceitável ……………………………………………………………………………. = 10/1

. Para conseguir imagem de boa qualidade comparável à do MET.……………….. = 100/1

. Considerando 100/1 → 104 elétrons por ponto da imagem

. Para um bom display → 1000 pontos em 1000 linhas, ou seja, 106 pontos imagem.

. Portanto 1010 elétrons → carga de 1010x1,6x10-19C = 1,6x10-9C

Se o tamanho do probe é de 1nm (ou seja 10-7cm de diâmetro), a densidade de carga na amostra será≈ (1,6x10-9)/(10-14) = 1,6x105C/cm2

O brilho máximo de um filamento de tungstênio a 100kV é de ≈ 105A/cm2/sr e o máximo ângulo sólido ≈ ¶x10-4sr

→ corrente disponível no probe ≈ 105x¶x10-4A/cm2 = 31,4A/cm2

O tempo para atingir a densidade de carga de 1,6x105C/cm2 com este probe será ≈ 1,6x105/31,4 = 500s (o queequivale a 80 minutos ou 1:20 horas para formar uma imagem !!)

Isto explica a limitação da resolução do microscópio baseado no filamento de tungstênio em ≈ 5nm.

Usando filamento LaB6 o brilho aumenta 10x → resolução vai para ≈ 2nm

Usando Field-emission gun cujo brilho é 103 ou 104x maior → resolução muito melhor ≈ 0,2nm com tempos de varredura por imagem curtos.

STEM a partir de 1971 grande potencial para alta resolução após observação direta de átomos pesados (Crewe et al., Visibility of Single Atoms. Science 168: 1338-1340, 1970). Em 1978 apenas 5 destes microscópiosdemonstravam a mesma habilidade. O requisito mínimo para ver átomos pesados individuais sobre um substratofino de carbono, é uma resolução de ponto ≤4Å. A visibilidade de átomos melhora aproximadamente com o inverso do quadrado do poder de resolução, e eles se tornam relativamente fáceis de serem observados a aproximadamente 2,5Å.

A característica principal do STEM é sua capacidade de trabalhar eficientemente no modo de campo escuro. Neste modo estamos no contexto da resolução de ponto. Neste caso, um objeto pequeno (átomo por exemplo) terá a aparência do próprio probe e o poder de resolução será ≈ FWHM. A outra definição de resolução é a capacidade de resolver imagens de rede cristalina. Neste modo podemos integrar informação de uma regiãolarga da amostra. Microscópios resolvem imagens de rede cristalina com uma resolução melhor do que a resolução de ponto.

O sistema STEM foi desenvolvido como sistema totalmente dedicado; pela modificação de microscópios de varredura pré-existentes; pela conversão de microscópios eletrônicos de transmissão de alta resolução(HRTEM) (com canhão “field-emission”) em STEMs. A adaptação de acessório de varredura a microscópiosconvencionais com filamento de tungstênio apresenta sempre baixa resolução, por exemplo 10 a 25Å. A conversão do HRTEM em STEM envolve:

1) Uso de elementos básicos do HRTEM (lentes eletronicamente estáveis, lentes concentradoras do feixe paraformar um spot, com baixo Cs, sistema de deflexão do feixe, alta estabilidade mecânica, etc.) 2) Possibilidade de operar com voltagens maiores do que os SEMs usuais. 3) Sistema ótico abaixo do plano do objeto, apropriado para detectar a distribuição de espalhamento tanto de elétrons elásticos como inelásticos, pois cada um carrega informações específicas4) A flexibilidade da ótica eletrônica do TEM permite a introdução de diferentes modos de operação no STEM e a possibilidade de otimizar o controle dos parâmetros básicos como spot size e divergênca do feixe5) A introdução do sistema STEM em um TEM provê a base para extender a capacidade deste último como umaferramenta científica.

Varrer um feixe de elétrons finamente focalizado através de uma amostra fina permite informação estrutural com alta resolução com alta eficiência, explorando tanto elétrons de espalhamento elástico como inelástico.

STEM é uma boa alternativa para obter imagens de materiais biológicos, que são susseptiveis ao dano do feixe, e permite guardar a informação de forma a ser processada digitalmente no futuro.

Para amostras finas (T<< livre caminho médio λ), a razão entre o número total de elétrons de espalhamentoelastico e os inelásticos, é aproximadamente proporcional ao número atômico Z.

Há duas razões principais que justificam o STEM como ferramenta analítica quantitativa: (1) os diversos sinaisgerados pela interação de região nanométrica com o probe, podem ser coletados pelos detetores altamenteotimizados; (2) a aquisição sequencial dos sinais leva diretamente ao uso de métodos de processamento digital. Em contraste, imagens por CTEM são difíceis de analizar devido ao efeito de contraste de fase, mesmo quecontenham alta resolução.

STEM foi desenvolvido por Crewe. Contém “field emission source” de alto brilho, consistindo de ponta fina de tungstênio submetida a um campo elétrico intenso. Elétrons da ponta podem “tunelar”para o vácuo resultandonuma fonte de tamanho reduzido. Após serem acelerados, os elétrons do feixe podem ser focalizados pelaslentes condensadoras e pela objetiva num spot sub-nanométrico. O STEM pode ser melhor conceitualizado comoum instrumento para medida de eventos de espalhamento: sinais de uma variedade destes eventos podemser obtidos simultaneamente por detecttores específicos, provendo informações diferentes sobre a amostra.

Uma contribuição do STEM em biologia é a medida de massa molecular (Brian Andrews, R.D. Leapman, Wall, Engel, …). A técnica mass mapping que é baseada no fato de que a intensidade de espalhamento elástico emqualquer pixel, é diretamente proporcional à massa molecular projetada, é normalmente obtida em material processado por congelamento rápido e secagem a vácuo, como no caso de macromoléculas purificadas.

STEM também tem alto potencial microanalítico, que pode chegar à sensibilidade de detecção de um únicoátomo, pela análise das perdas de energia do feixe de elétrons transmitidos após interagir com amostra fina(exemplos: ferritina, átomos de cálcio, detecção de elementos traço contaminantes, aplicações em fisiologiacelular, uso de acessório de crio-transferência recentemente otimizados).

Modos de imageamento por STEM:. O STEM fornece vários tipos específicos de informação, que vão da distribuição da massa em agregadossupramoleculares, às concentrações totais de íons em pequenas organelas. A imagem mais facilmente interpretável em STEM é originada do espalhamento elástico pelos núcleos atômicose é capturada pelo detetor de campo escuro anular (ADF). Pelo fato de que sinal no ADF é integrado sobreuma faixa angular grande, o mecanismo de contraste pode ser considerado incoerente e esta é a razão pelaqual, diferente do CTEM, os efeitos de contraste de fase podem ser desprezados no STEM.Há vantagens em ter dois detetores ADF para permitir algum tipo de contraste devido ao número atômico, pois o espalhamento angular causado por átomos mais pesados é maior do que o causado por átomos mais leves(HAADF…).. Elétrons que passam pela abertura do detector ADF podem entrar em um espectrômetro EELS. O sinal EELS permite obter informação de eventos de espalhamento inelástico nos quais o elétrons do feixe perde energia pelaexcitação de estados eletrônicos no espécime.. O espectro EELS provê muitos tipos de informação sobre o espécime incluindo sua composição química(excitação de eletrons de valência em energias ∆E < 30eV) e composição elementar (excitação de elétronsinternos, ∆E > 30eV).. Uma vantagem importante do STEM é que o canhão field-emission tem dispersão de energia menor do que 0,5 eV, comparado com fonte convencional termoiônica que é maior do que 1 eV.Outra vantagem de EELS, na análise de material biológico, é que apresenta maior sensibilidade para elementosleves quando comparado à microanálise de raios x.

Contraste ZUtilizando o espectrômetro EELS para elimiar a componente elástica do espectro (“zero-loss”) e a componente de elétrons não espalhados, a imagem de elétrons inelásticos totais pode ser obtida. Esta pode ser combinadadigitalmente com a imagem do detetor ADF, para fornecer informação quantitativa sobre o número atômico médiode compostos na amostra, os quais podem estar relacionados com a distribuição de proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos, etc.

Este modo de formação de imagem é chamado de razão, ou contraste Z pois a razão entre o espalhamentoelástico e o inelástico é proporcional ao número atômico Z.

. OBS: EDX dá informação sobre concentração elementar e é complementar à obtida por EELS.

Exemplos de aplicações:

Para amostras muito finas, o sinal no ADF é proporcional à massa projetada. Amostras de gruposmacromoleculares isolados são depositadas sobre filmes extremamente finos de carbono (<3nm) suportados porfilmes de carbono com buracos, depositados por sua vez sobre grade de microscopia eletrônica. A amostra écongelada rápidamente por imersão, transferida a frio para o microscópio, e deixada no interior do microscópiopara remoção de água pelo efeito do vácuo (freeze-drying). Após aquisição digital, da imagem ADF a baixasdoses (< 103 e/nm2) estruturas de interesse são selecionadas digitalmente, a intensidade total na regiãoselecionada é computada, o back-grund devido ao filme suporte de carbono é subtraido, e o resultado écomparado com um padrão de calibração apropriado introduzido na amostra. Virus mosaico do tabaco sãocomumente usados para a calibração.

A sensibilidade do mapeamento de massa por ADF pode ser de até 500Daltons/contagem, enquanto a resoluçãopode se aproximar de 2nm, sendo ótimo na faixa de 10-100nm, o que torna esta técnica ideal para estudar a organização de macromoléculas e agregados macromoleculares.

Caso da cinesina: Imagens STEM de moléculas individuais da proteina motora cinesina revelam a estrutura emtrês domínios esperada a partir de estudos bioquímicos e moleculares, com um peso molecular total de 379±15 kD consistente com a sequência de aminoácidos conhecida. A distribuição de massa pode também ser avaliadaindicando qual das extremidades é geradora de força e qual fica presa à carga transportada pela molécula. Imagens ADF de agregados de cinesina com microtúbulos revelaram a organização de microtúbulos alinhadosligados a intervalos irregulares por pontes que são < 25nm. Estas pontes têm massa de 360±15 kD a qual, juntocom a forma e o tamanho da ponte indica que as mesmas são de moléculas únicas de cinesina. O achado de que a molécula de cinesina pode ligar microtúbulos por ambas extremidades, tem a implicação interessante de que a cinesina pode desempenhar um papel antes desconhecido, no deslocamento de microtúbulos, um processo de extrema importância em mitose e provavelmente na extensão de processos celulares..

Rutherford Scattering

High Angle Annular Dark Field(HAADF) STEM Tomography

Conventional electron tomography utilises BF contrast, due to is biological origins, however for materials specimens BF imagescan be unsuitable due to non monotonic contrast, such as that generated by diffraction or Fresnel fringes. As such alternativecontrast mechanims must be used. One suitable mechanism is Z-contrast imaging, generated by high angle annular dark field(HAADF) scanning transmission electron microscopy (STEM). By using a STEM detector with a large inner radius, a HAADF detector, electrons are collected which are not Bragg scattered. As such HAADF images show little or no diffraction effects, and their intensity is approximately proportional to Z2. This imaging technique proves ideal for tomographic reconstruction as it generates strong contrast that has a fully monotonic relationship with thickness.

The quality of the reconstruction allowsboth the crystallites (yellow) and theexterior cell wall (green) to be to be resolved. Click to view animation of this reconstruction.

Magnetite crystals in bacteria strainMV-1, in this preperation the cell is preserved surrounding the crystals. Thetilt series was acquired from +76 degrees to - 76 degrees. Each crystal is ~60nm long.

1,8 º 2,5 º

123º

123º122º

125º125º

124º

SpecificationsImaging Modes: TEM/STEM

Accel. Voltage: 200KVCs: 1.2mm

PTP Resolution: 0.24nmInformation Limit: 0.14nmSource: Field Emission

Tilt Range: ± 30° (normal holder)Tilt Range: ± 70° (special holder)

Ancillary EquipmentCCD CameraVideo Camera

GatanTM Imaging FilterEnvironmental Cell

Single-Tilt Heating StageDouble-Tilt Heating Stage (800° C)

TechniquesEnergy Filtered Imaging

Environmental Cell MicroscopyEELS

HRTEMZ-contrast Imaging

Tecnai F20

SpecificationsImaging Modes: TEMAccel. Voltage: 400kV

Cs: 1.0mmPTP Resolution: 0.17nm

Source: LaB6Tilt Range: ±25°

Ancillary EquipmentCCD Camera

Top-entry Double-tilt HolderTV Camera

TechniquesHRTEM

JEOL JEM 4000EX

SpecificationsImaging Modes: TEMAccel. Voltage: 100KV

Cs: 2.7mmPTP Resolution: 0.35nm

Source: LaB6Tilt Range: ± 60°

Ancillary EquipmentOmega Filter

Double-Tilt Liquid Nitrogen HolderCCD CameraTechniques

CBEDEnergy Filtered Imaging

EELS

LEO 912-Omega

SpecificationsImaging Modes: TEM/STEM

Accel. Voltage: 200KVCs: 1.2mm

PTP Resolution: 0.25nmFocused Probe: 0.5nm

Source: Schottky Field EmissionTilt Range: ± 25°

Ancillary EquipmentCCD Camera

PEELS DetectorX-Ray Detector

Double-Tilt HolderLorentz Lens

Electrostatic BiprismES VisionTM Acquisition System

TechniquesHRTEM

NanodiffractionElectron Holography

Lorentz ImagingZ-contrast Imaging

Philips CM200-FEG

SpecificationsImaging Modes: TEMAccel. Voltage: 200kV

Cs: 2.0mmPTP Resolution: 0.28nm

Source: LaB6Tilt Range: ± 60°

Ancillary EquipmentSide-Entry Double-Tilt Holder

Eucentric StageDouble-Tilt Cryostage

TV CameraX-Ray Detector

TechniquesCBEDEDX

JEOL JEM 2000FX

SpecificationsImaging Modes: TEM/STEM

Accel. Voltage: 200KVCs: 0.5mm

PTP Resolution: 0.19nmFocused Probe: 0.2nm

Source: Schottky Field EmissionTilt Range: ± 15°

Ancillary EquipmentCCD Camera

Enfina PEELS DetectorX-Ray Detector

Double-Tilt HolderGatan and EDAX Acquisition System

TechniquesEDXEELS

HAADFHRTEM

NanodiffractionZ-contrast Imaging

JEOL JEM-2010F

•LaB6 filament•Operates at voltages up to 200KV•Cs = 2.26 mm •It has a room-temperature, 70-degree, tilt sample holder. •It has two Gatan, 70-degree-tilt, cryotransfer holders and a cryotransfer station. These are necessary for inserting vitrified samples into the microscope and recording data of them. A Gatan Dry Pumping Station is used for pumping out the cryoholders for improved performance. •It has a Gatan Ultrascan 1000 UHS CCD camera that was designed for a 200KV electron source. The camera has a 4 mega-pixel (2k X 2k, 14 micron pixel size), Peltier-cooled, CCD chip and it is equipped with an ultra-high sensitivity phosphor scintillator. The camera is mounted on-axis under the microscope column and it is connected via an optical cable to the computer of the microscope. The microscope will soon also have a Gatan TV rate camera. •A standard film camera that holds 56 sheets of film is also available •It has a cryo package that allows the user to collect data on extremely beam-sensitive, vitrified samples without damaging the sample. The package includes an improved anticontaminator, Low Dose software, and a cryo-protection cycle for the ion getter pump. •It has Gatan Digital Micrograph software for operating the CCD camera and for manipulating the resultant images. •It has two, NEC 20 in. LCD color monitors. These allow the operator to monitor•and control the conditions of the microscope in the numerous windows of the •operating system as well as view the collected digital data. •It has FEI Tomography and Xplore3D tomographic software.•This software allows the researchers to collect three-dimensional•data on samples by taking successive images at various degrees•of tilt and computing a three-dimensional reconstruction from the data. •It has Gatan HREM Autotune software for automatic correction• of imaging parameters with the CCD camera. •It has Tecnai Scripting and Photomontage software.