Schnelle Chromatographie – Trends in der (U)HPLC - bm-at.com Chromatographie–Trends in der (U... · Schnelle Chromatographie – Trends in der (U)HPLC FF DS Business Review 1

Schnelle Chromatographie –Trends in der (U)HPLC

FF DS Business Review

1

Company ConfidentialCompany Confidential

Einfluss Säulenlänge

2

HPLC - Grundsituation - Trennung von zwei Peaks

w½

3

A Bwt0

tR1

tR2

t‘R1

t‘R2

HPLC Parameter I

Totzeit, Durchbruchszeit t0

Totvolumen [mL] V0 = t0 * f

Fluß [mL/min] f

lineare Fließgeschwindigkeit [mm/sec] u Lt

=0

4

Säulenlänge [mm] L

Retentionszeit tR1Nettoretentionszeit ′t R 1

Kapazitätsfaktor - Retentionsfaktork t t

tR

10

0

1=

−

HPLC Parameter II relative Retention, Trennfaktor

α =kk2

1

Bodenzahl pro Säule

N twR

=

16 1

1

2

* oder NtwR

=

554 12

. *½ 1

Bodenzahl pro m

LwtN R 1000**54.5

2

1½

1

=

5

Bodenhöhe, HETP

h LN

=

Asymmetrie

As ba

=

Auflösung

R t tw wR R

=−

+1198 2 1, *

½ 1 ½ 2

Darstellung der Auflösung

6

Auflösung

Auflösung R für Peaks mit ähnlichen k‘-Werten kk k

=+' '1 22

7Seite 7

kkNR+

−=1

)1(41 α

Darstellung der Auflösung

AusgangssituationR ist zu klein

1. MöglichkeitRetentionsfaktor erhöhen:höherer Wasseranteil

2. MöglichkeitBodenzahl erhöhen:

k ↑↑↑↑→→→→ tR ↑↑↑↑, h ↓↓↓↓N = const.

dp ↓↓↓↓→→→→ N ↑↑↑↑, h ↑↑↑↑, tR=

8

Bodenzahl erhöhen:Kleinere Korngröße

3. MöglichkeitSelektivität erhöhen:bessere Phase, pH-Wert,Mobile Phase

→→→→ N ↑↑↑↑, h ↑↑↑↑, tR= const.

α↑α↑α↑α↑→→→→ N , h , tR≈≈≈≈const.

Retention Faktor k

• Stationäre Phase: %C↑ - k↑Å↑ - k↓

• Mobile Phase: %B ↑ - k↓

• pH-Wert: Basen: pH↑ - k↑

9

• pH-Wert: Basen: pH↑ - k↑Säuren: pH↓ - k↑

Einfluss des k-Wertes auf die Auflösung

001

001

001

001

002

002

Auflö

sung

R

10

000

000

000

001

0 2 4 6 8 10 12

Auflö

sung

R

k-Wert

Bodenzahl - Einflussfaktoren

• Partikelgröße: dp ↓ - N↑, P↑

• Säulenlänge: L ↑ - N↑, P↑, tR↑

• Flussrate - Van Deemter Gleichung

11

• Systemkonfiguration

Erhöhung des Flusses

• bei doppeltem Fluss halbe Zeit

• dabei reduziert sich die Bodenzahl i. d. R. nur um 10 - 30%

• Die Auswirkung auf die Auflösung ist aber

12

• Die Auswirkung auf die Auflösung ist aber nur

⇒ sehr effektives Mittel zum Zeitgewinnsehr effektives Mittel zum ZeitgewinnN

Selektivität αααα - Einflussfaktoren

• Stationäre Phase

• pH-Wert

• Mobile Phase

13

- organischer Modifier- Puffer: Art und Konzentration

Notwendige Bodenzahl für versch. α: für R=1,5

3000,0

4000,0

5000,0

6000,0

Bod

enza

hl

14

,0

1000,0

2000,0

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2

Bod

enza

hl

Selektivität α

Zusammenhang Chromatographischer KenngrößenLänge Korngröße N / m Bodenzahl Druck Auflösung (rel) Länge Korngröße N / m Bodenzahl Druck Auflösung (rel)100 10 40000 4000 10 63 100 100 100 100 100 100100 5 80000 8000 40 89 100 50 200 200 400 141100 3 133333 13333 111 115 100 30 333 333 1111 183100 1,5 266667 26667 444 163 100 15 667 667 4444 258

3000

3500

4000

4500

5000

Länge

Korngröße400

500

600

700

Länge

15

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4

Korngröße

N / m

Bodenzahl

Druck

Auflösung (rel)

0

100

200

300

400

1 2 3 4

Korngröße

N / m

Bodenzahl

Auflösung (rel)

Core Competency in Silica Manufacturing

Silica Materials + =Surface Science Markets & Products

! For over 80 years Grace has been at the forefront of silica technology.

! Today Grace is one of the largest silica manufacturers in the world.

1616

SiO2

SI

OSI

CH3

CH3

Cx

SIO

SICH3

CH3

Cx

SI O SICH3

CH3

Cx

+ =Enhance Performance

Preparative

Process

Analytical

Drug Discovery

Drug Production

VisionHT Media Platform

Different Systems, Different Applications, One Media Platform.

See a path to greater productivity with a media platform that delivers performance and speed on any LC system

! Seamless media available in 1.5um to 10um

! High throughput column technologies

17

! High throughput column technologies

! Unique and widely varied phase chemistries

High performance particle technology solves the challenges of modern laboratories

VisionHT High Purity Silica Identical silica particle in 1.5, 3, 5, 10um

Six Phase ChemistriesC18 Polar C18 Basic

C18 High Load

C18 Classic

Apply to six phase Chemistries

Product Line Scope and Definition

18

C18 Classic

SilicaHILIC

UHPLC

Pack in multiple column formats

Rocket Expedite Analytical Prep

Meets the needs of fast LC, standard analytical, and preparative chromatography

Broad Selectivity Options

19

Snyder/Carr/Dolan Coefficients

1.5

2

Snyder Average 94 phases Vision C18HL Vision C18 Vision C18B Vision C18P

Six factors control RP selectivity! Choose Phases based on interactions with key sample components.

Hydrophobicity

Ionic Activity @ pH7

20

-0.5

0

0.5

1

H S r A B C2.8 C7

Most Reversed Phases have the same selectivity. VisionHT Phases are different.

Steric Resistance

H-bonding Base

Ionic Activity @ pH2

H-bonding Acids

Improved Peak Identification

21

Competitive columns need higher organic concentrations to accomplish assays in the same time frames as VisionHT™ series columns. Higher initial organic concentrations can result in some of the more polar impurities being eluted into the void volume.

Unique Approach to Phase Chemistries

! Most Commercial reversed phase columns thoroughly cover silica surface to minimize interaction

! VisionHT Controlled Silica Exposure gives unique mixed-mode Separations

1. Procaine2. Lidocaine3. Tetracaine4. Diphenhydramine

1. GY (238 Da)2. VYV (379 Da)

22

VisionHT Phases Works always !

VisionHT C18 Polar separates highly polar pharmaceuticals, VisionHT C18 Basic resolves complex

peptide mixtures quickly

2. VYV (379 Da)3. Met Enkephalin (YGGFM, 573 Da)4. Leu Enkephalin (YGGFL, 555 Da)5. Angiotensin II (DRVYIHPF, 1045 Da)

Säulenauswahl

Column:Grom-Sil 120 ODS-4 HE, 10 µm, 50 x 4,6 mm

ACN/Wasser = 58/42; 3 mL/min

23

Sationäre Phasen - Eigenschaften?

Charakterisierung von Stationären Phasen:• Basismaterial: Silica, PS/DVB, Zirkoniumdioxid, Hybridmaterialien

• Porengröße: 60, 80, 100, 120, 150, 200, 300 Å

• Oberfläche: 500 bis 50 m2/g

24

• Oberfläche: 500 bis 50 m /g

• Belegung: C30, C18, C8, Phenyl, C4, CN, Diol, Amino, TMSAQ/HE Type, EPS, embedded, shieldedmonomer, dimer / polymer

• Reinheit: Fremdmetalle wie Eisen, Aluminium, …

• Belegungsdichte

Vergleich Fused Core / Total Porös

25

Quelle: http://fortis-technologies.com/UHPLC.html, 20.10.2013

3 u. 5 µm bei hohen Flussraten

26Seite 26

Dr. Stefan Lamotte,

HPLC-Tage 2012

Einfluß der Porengröße

Lorazepam:

27

Naphtalin

Quelle: MZ-Analysentechnik: Halo Prospekt Quelle: Wikipedia

Übersicht Fused Core

Oberfläche Porengröße Dichte Oberfläche V0 tR für k=10

pro Säule für 100 x 4.6 mm bei 1mL/min

m2/g A g/mL m2 mL min

28

m /g A g/mL m mL min

NPS 2 - 2,0 7 0,65 7,15

Fused Core 100 90 0,7 116 0,90 9,90

TPS 320 100 0,5 266 1,20 13,20

Einflußfaktoren Gradient:

Steigung: % / minWird festgelegt über:Start- und Endkonzentrationen, Zeit

29

Gradientenvolumen: mlWird festgelegt über:Flussrate, Zeit

Gradient - Vorgehensweisen

Anpassen von vorhandenen GradientenLineare Anpassung: die Zeit wird im gleichen Verhältnisangepasst, wie sich die Säulenlänge verändert:

halbe Säulenlänge = halbe Gradientenzeiten

Konstantes Gradientenvolumen: die Zeit wird im gleichenVerhältnis angepasst, wie sich die Säulenlänge verändert und gleichzeitig die Flussrate so verändert, dass immer gleichviel

30

gleichzeitig die Flussrate so verändert, dass immer gleichviel Eluent durch die Säule fließt

halbe Säulenlänge = halbe Gradientenzeiten + doppelte Flußrate

Siehe Excelsheet: jmr up/down scaling

Gradient - Vorgehensweisen

Neue GradientenSteigung / Zeiten: Bei unbekannten Substanzen - Screeninggradient

5% - 95% BPro cm Säulenlänge 1 – 2 min

→→→→ 5 cm Säulenlänge = 5 – 10 min Gradientenlänge→→→→ 2 verschiedene Steigungen testen

31

→→→→ 2 verschiedene Steigungen testenGradientenvolumen:

wird über die Flußrate angepaßt→→→→ Standardfluß +50% und –50% testen

Gradientenelution

120

140

GrGr tFV ⋅=

N K = Anzahl der theoretischtrennbaren Komponenten

N K

Gradientenelution: Optimierung über das Gradientenvolumen (VGr)

32

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600

trennbaren KomponentenVGr = Gradientenvolumen

VGr / mL

© Kromidas

Gradientenelution: Optimierung über das Gradientenvolumen (2)

Einige Beispiele für „optimale“ Gradientenvolumina abhängig von der FragestellungVK: Säulenvolumen z.B. für 125 x 4mm = t0 x F ~ 1,0 ml

Übliche Problematik V : 5 < V < 15 d.h. ≈ 6 ml – 19 ml

(...zwischen 2 und 20 Säulenvolumina)

33

Übliche Problematik VGr: 5 < VK < 15 d.h. ≈ 6 ml – 19 ml

Multikomponenten-Mischung VGr: >15 VK d.h. > 20 ml

Spurenbereich VGr: < 5 VK d.h. < 6 ml

Grenze VGr: ≈ 2 VK0 d.h. 2,5 ml

© Kromidas

Gradienten - Test - 2

34

Alternativen zu Acetonitril

Umrechnung der Eluentenzusammensetzung

mit dem Löslichkeitsparameter δAcetonitril δA 23,9 δ = Löslichkeitsparameter

Wasser δW 47,8 φ = Volumenanteil

Methanol δ 29,4

35

Methanol δM 29,4

Mischung δm 35,85

δm = Σi φi δi

Alternativen zu Acetonitril: Methanol

40

50

60

70

80

90

100

Met

hano

l (%

V/V)

36

00

10

20

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Met

hano

l (%

V/V)

Acetonitril (%V/V)

Alternativen zu Acetonitril: THF

40

50

60

70

80

90

100

THF

(%V/

V)

37

00

10

20

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

THF

(%V/

V)

ACN (%V/V)


Säulentestmix:

Uracil

Phenol

N,N-Diethyl-M-Toluamid

Standardeluent:

ACN : Wasser = 58 : 42

Berechnet:

38

N,N-Diethyl-M-Toluamid

Toluol

Berechnet:

MeOH : Wasser = 75 : 25

Angepasst:



Alltima C18, 3 µm;

100 x 2 mm

Standard C18



39



Platinum C18, 3 µm;

100 x 2 mm

Polare C18 Phase



40



Genesis Phenyl, 4 µm;

100 x 2 mm



41


Breyer, M.; Twele, M.; Schmeer, K.; Földi, P.

Einfluss: Säulen ID(Peakfläche / Säuleninnendurchmesser)

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

area

peak area (pentyl benzoate), found

theoretical value of peak area

4000 0

6000 0

Stationäre Phase: GROM Saphir 110 C18 - 5 µm

Säulendimension: 125 mm x 0,05 mm - 4,6 mm ID

Eluent: 20% H2O, 80% ACN (v/v)

42

0

2000000

4000000

6000000

8000000

4,6 mm4 mm3 mm2 mm1 mm800 µm500 µm300 µm200 µm100 µm50 µm

column id

0

2000 0

4, 6 mm4 mm3 mm2 mm1 mm800 µm

Eluent: 20% H2O, 80% ACN (v/v)

Fluß (lin. vel.): 0,80 mm/s,

Temperatur: R, Detektor: 254 nm

Flusszelle: 0,2mm, 50nl

Injektion: 30 nl

Probe: Alkylbenzoate (20-75mg/ml)

Säulenofen / Temperatur

• hohe Temperatur = niederere Viskosität

⇒ geringerer Druck

• oft besserer Stoffaustausch

43

• oft besserer Stoffaustausch

Vorsicht: auch Änderung der Selektivität!

Detektoren für die HPLC

• UV (multi Channel, Fast scan, Diodenarray)• Mass Spectrometer• Light Scattering Detektor• Fluoreszenz Detektor (Laser)

Selektivität, Empfindlichkeit, Verfügbarkeit

44

• Fluoreszenz Detektor (Laser)• NMR • RI-Detektor• Leitfähigkeitsdetektor• ECD - Electro chemischer Detektor• Polarimeter• Radioactivität

How Does ELS Detection Work?

Step 1: Nebulization! Column effluent mixes with gas flow to form a dispersion of

dropletsStep 2: Mobile Phase Evaporation

! Mobile phase evaporates from around sample particle leaving dried particles in solvent vaporStep 3: Detection

! Sample particles pass through laser light in a flow cell. The

45

ELSD detects any compound less volatile than mobile phase

particles scatter light that is collected by a photodiode

Benefits of ELS Detection In Flash Chromatography! Allows purification of non-chromophoric molecules! Allows you to see impurities not seen by UV! Gives a more accurate indication of relative quantities than UV! Give you the freedom to choose UV absorbing solvents

UV

Nonchromophores NOT VISIBLE

Nonionized compounds NOT VISIBLE

! HPLC analysis of 4 compounds

! With equivalent amounts of each

! HPLC analysis of 4 compounds

! With equivalent amounts of each

ELS Detection Detects all of the Components in a Sample

46

Detecting all components eliminates guesswork and wasted time

MS

ELS Detection

Detects all NONVOLATILES

Even NMR misses impurities such as

salts

Detector Detection Limit Sensivity SelectivityUV, single, dual, .. 5 – 10–10 g/mL + +DAD 5 – 10–10 g/mL + +(+)Fluorescenz 10–12 – 10–13 g/mL ++ ++Ri 10–7 – 10–8 g/mL - -Light Scattering 10–8 – 10–9 g/mL + -MS 10–9 – 10–15 g/mL ++ ++(+)

Detektoren für die HPLC

47

MS 10 – 10 g/mL ++ ++(+)NMR + +++ECD 10–12 – 10–13 g/mL ++ ++Conductivity 10–7 – 10–8 g/mL + +Polarimeter 10–7 – 10–8 g/mL - ++Radioactivity 10–10 g/mL + ++

Breyer, M.; Twele, M.; Schmeer, K.; Földi, P.

5

6

7

1

3

5

7

9

1 1

1 3

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 5 5 0 5 54 0

t [m in ]

inte

nsity

[cps

]

a )

b )

8 µ L c e ll

Einfluss: Flow Cell -Radiodetection

48

1

2

3

4

5

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5

t [m in ]

3 µ L c e ll

S ta t io n ä re P h a s e : N u c lo e s il 1 0 0 C 1 8 H D , S ä u le n d im . : 1 2 5 x 1 m m 3 µ m , F lu ß ra te : 3 7 .5 µ L /m in , E lu e n t : A : 1 0 m M N H 4A c p H 3 .0 , B : A C N , F lu ß z e lle : a ) 8 µ L , b ) 3 µ L , P r o b e : D ru g +M e ta b o lite , In je k t io n : 4 0 µ L

Grenzwerte für High Speed und Micro LC

1. Gradientendelayvolumen

= Volumen: Ventil – T-Stück / Mischkammer – Pumpe – Injektor

Dieses Volumen muß in < 1,0 min durchgespült werden !

2. Flow Cell VolumenDieses Volumen muß < 1/20 des Peakvolumens des 1. Peaks sein!

49

Dieses Volumen muß < 1/20 des Peakvolumens des 1. Peaks sein!(Gute Kapillarverbindungen vorausgesetzt)

3. Data sampling rate/ rise timeDer Standardwert des Systems muß um 5 - 10x erhöht werden!( rise time: 0.1 sec)

Einfluss Peakbreite / Bodenzahl

Partikelgröße Bodenzahl tR für k=5 Peakbreite empf. Messzellenvolumnen [µL]für 100 x 4.6

mm bei 1mL/min für k = 5 10x 25x 50xµm min min

TPS 5 10.000 7,20 0,288 29 11,5 5,8TPS 4 12.500 7,20 0,258 26 10,3 5,2TPS 3 16.667 7,20 0,223 22 8,9 4,5TPS 2,7 18.519 7,20 0,212 21 8,5 4,2TPS 2 25.000 7,20 0,182 18 7,3 3,6TPS 1,7 29.412 7,20 0,168 17 6,7 3,4

50

TPS 1,7 29.412 7,20 0,168 17 6,7 3,4TPS 1,5 33.333 7,20 0,158 16 6,3 3,2

Fused Core 5 11.765 5,40 0,199 20 8,0 4,0Fused Core 4 14.706 5,40 0,178 18 7,1 3,6Fused Core 2,7 21.786 5,40 0,146 15 5,9 2,9Fused Core 1,7 34.602 5,40 0,116 12 4,6 2,3Fused Core 1,3 45.249 5,40 0,102 10 4,1 2,0

Einfluss Peakbreite / Bodenzahl

Partikelgröße Bodenzahl tR für k=5 Peakbreite empf. Messzellenvolumnen [µL]für 100 x 2 mm bei 189 µL/min für k = 5 10x 25x 50x

µm min minTPS 5 10.000 7,20 0,288 5 2,2 1,09TPS 4 12.500 7,20 0,258 5 1,9 0,97TPS 3 16.667 7,20 0,223 4 1,7 0,84TPS 2,7 18.519 7,20 0,212 4 1,6 0,80TPS 2 25.000 7,20 0,182 3 1,4 0,69TPS 1,7 29.412 7,20 0,168 3 1,3 0,63

51

TPS 1,5 33.333 7,20 0,158 3 1,2 0,60

Fused Core 5 11.765 5,40 0,199 20 1,5 0,75Fused Core 4 14.706 5,40 0,178 18 1,3 0,67Fused Core 2,7 21.786 5,40 0,146 15 1,1 0,55Fused Core 1,7 34.602 5,40 0,116 12 0,9 0,44Fused Core 1,3 45.249 5,40 0,102 10 0,8 0,38

Data sampling rate / rise time

150000,00

200000,00

250000,00

300000,00

10/sec5/sec2,5/sec1,25/sec

52

0,00

50000,00

100000,00

3,9000 4,0000 4,1000 4,2000 4,3000 4,4000

1,25/sec

Systemvergleich mit Säule: 50 x 4.6 mm

0 min 5% B2 min 5% B8 min 60% B10 min 60% B

A: Wasser mit TFA auf pH 2,5B: ACN

Säule 50 x 4.6 mm, 5 µm

53

10 min 60% B11 min 5% B14 min 5% B

1 mL / min

Systemvergleich mit Säule: 50 x 4.6 mm

20

40

60

80

100

120 04020401 #8 [modified by LabEAHPLC_01] Testmischung UV_VIS_1mAU

min

1,00

min

1,28

min 5,

72 m

in

5,91

min

6,17

min

6,43

min

6,76

min

6,91

min

7,31

min

7,47

min 7,

63 m

in

7,83

min

WVL:230 nm

54

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0-20

0

20

40

60

80

100 04020402 #7 [modified by LabEAHPLC_01] Testmischung (1 : 1 verdünnt mit H/0072/04) UV_VIS_1mAU

min

1,68

min

5,04

min

5,22

min

5,37

min

5,66

min

5,98

min

6,29

min

6,54

min

6,68

min 6,86

min

7,08

min

WVL:230 nm

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0-10 min

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