8/12/2019 Science-1995-Cases-1763-6

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A g g r e s s i v e B e h a v i o r a n d A l t e r e d Amounts o fB r a i n S e r o t o n i n a n d N o r e p i n e p h r i n e i nM i c e L a c k i n g MAOAO l i v i e r C a s e s , I s a b e l l e S e i f , * J o s e p h G r i m s b y , P a t r i c i a G a s p a r ,K e v i n C h e n , S a n d r i n e P o u r n i n , U l r i k e M i l l e r , M i c h e l A g u e t ,C h a r l e s B a b i n e t , J e a n C h e n S h i h , Edward De M a e y e r

D e f i c i e n c y i n monoamine o x i d a s e A ( M A O A ) , an enzyme t h a t d e g r a d e s s e r o t o n i n andn o r e p i n e p h r i n e , h a s r e c e n t l y b e e n shown t o b e a s s o c i a t e d w i t h a g g r e s s i v e b e h a v i o r i nmen o f a D u t c h f a m i l y . A l i n e o f t r a n s g e n i c m i c e was i s o l a t e d i n w h i c h transgene i n t e -g r a t i o n c a u s e d a d e l e t i o n i n t h e gene e n c o d i n g MAOA, p r o v i d i n g an a n i m a l m o d e l o fMAOA d e f i c i e n c y . I n pup b r a i n s , s e r o t o n i n c o n c e n t r a t i o n s were i n c r e a s e d up t o n i n e f o l d ,a n d s e r o t o n i n - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y was p r e s e n t i n c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s . I n pupa n d a d u l t b r a i n s , n o r e p i n e p h r i n e c o n c e n t r a t i o n s were i n c r e a s e d up t o t w o f o l d , a n dc y t o a r c h i t e c t u r a l c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n t h e somatosensory c o r t e x . Pup b e h a v i o r a la l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g t r e m b l i n g , d i f f i c u l t y i n r i g h t i n g , a n d f e a r f u l n e s s were r e v e r s e d b y t h es e r o t o n i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r p a r a c h l o r o p h e n y l a l a n i n e . A d u l t s m a n i f e s t e d a d i s t i n c t b e -h a v i o r a l s y n d r o m e , i n c l u d i n g e n h a n c e d a g g r e s s i o n i n m a l e s .

I n t h e d e b a t e s u r r o u n d i n g a d v a n c e s i ng e n e t i c r e s e a r c h o n a g g r e s s i v e b e h a v i o r 1 ) , t r a n s g e n i c a n i m a l m o d e l s c a r r y i n gs i n g l e g e n e d e f e c t s a r e o f c r i t i c a l i m p o r -t a n c e . We d e s c r i b e t r a n s g e n i c m i c e l a c k -i n g MAOA a s a r e s u l t o f t h e i n t e g r a t i o n o fa n i n t e r f e r o n P ( I F N - , ) t r a n s g e n e i n t ot h e g e n e e n c o d i n g MAOA, a n d r e p o r tt h a t M A O A - d e f i c i e n t m a l e s s h o w i n -c r e a s e d a g g r e s s i v e n e s s . MAOA a n d m o n o -a m i n e o x i d a s e B (MAOB) a r e m i t o c h o n -d r i a l l y l o c a t e d e n z y m e s w i t h o v e r l a p p i n gs u b s t r a t e s p e c i f i c i t i e s a n d t i s s u e d i s t r i b u -t i o n s . T h e y i n a c t i v a t e n e u r o a c t i v e a m i n e ss u c h a s s e r o t o n i n , d o p a m i n e , a n d n o r e p i -n e p h r i n e . MAOA a n d MAOB a r e e n c o d -e d b y s e p a r a t e g e n e s t h a t a r e c l o s e l y l i n k e do n t h e X c h r o m o s o m e , a n d t h e y s h a r e7 0 s i m i l a r i t y i n a m i n o a c i d s e q u e n c e 2 . T h e l o s s o f b o t h MAO g e n e s m a y b ei m p l i c a t e d i n t h e s e v e r e m e n t a l r e t a r d a -t i o n o f s o m e p a t i e n t s w i t h N o r r i e d i s e a s e 3 ) , a n d r e c e n t l y a f a m i l y h a s b e e n d e -s c r i b e d i n w h i c h a p o i n t m u t a t i o n i n t h eg e n e e n c o d i n g MAOA a b o l i s h e s MAOAc a t a l y t i c a c t i v i t y a n d i s a s s o c i a t e d w i t hi m p u l s i v e a g g r e s s i o n 4 ) .We g e n e r a t e d m i c e t r a n s g e n i c f o r I F N - P0 . C a s e s , I . S e i f , E . D e M a e y e r , C e n t r e N a t i o n a l d e l aR e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e C N R S ) , U n i t e d e R e c h e r c h e A s -s o c i e e ( U R A ) 1 3 4 3 , I n s t i t u t C u r i e , 9 1 4 0 5 O r s a y , F r a n c e .J . G r i m s b y , K . C h e n , J . C . S h i h , D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a rP h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y , U n i v e r s i t y o f S o u t h e r nC a l i f o r n i a , L o s A n g e l e s , CA 9 0 0 3 3 , U S A .P . G a s p a r , I n s t i t u t N a t i o n a l d e l a S a n t e e t d e l a R e c h e r -c h e M e d i c a l e , U n i t e 1 0 6 , H o p i t a l d e l a S a l p e t r i e r e , 7 5 6 5 1P a r i s , F r a n c e .S . P o u r n i n a n d C . B a b i n e t , C N R S , URA 3 6 1 , I n s t i t u tP a s t e u r , 7 5 7 2 4 P a r i s , F r a n c e .U . M O l l e r , I n s t i t u t e o f M o l e c u l a r B i o l o g y I U n i v e r s i t y o fZ u r i c h , 8 0 9 3 Z u r i c h , S w i t z e r l a n d .M . A g u e t , G e n e n t e c h , S o u t h S a n F r a n c i s c o , CA 9 4 0 80 ,U S A .T o w h o m c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .

b y i n j e c t i n g a n I F N - 1 m i n i g e n e i n t o o n e -c e l l e m b r y o s o f C 3 H / H e J ( C 3 H ) m i c e . T h em i n i g e n e w a s d e v i s e d t o e v a l u a t e t h e p o -t e n t i a l o f t h e g e n e e n c o d i n g I F N - P f o r a n -t i v i r a l g e n e t h e r a p y . We d e s c r i b e t h e t r a n s -g e n i c l i n e T g ( H 2 - I F N - 3 ) 8 T g 8 ) , w h i c hw a s i n i t i a l l y c h a r a c t e r i z e d b y t h e X - l i n k e dr e c e s s i v e a b n o r m a l b e h a v i o r o f m o u s e p u p s .B y S o u t h e r n ( D N A ) b l o t h y b r i d i z a t i o na n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n P C R ) , as i n g l e m i n i g e n e c o p y w a s f o u n d i n T g 8D NA 5 . T h i s t r a n s g e n e w a s t r a n s m i t t e d

b y X - l i n k e d i n h e r i t a n c e . B y r e v e r s e t r a n -s c r i p t a s e - m e d i a t e d PCR ( R T - P C R ) , I F N - PRNA w a s d e t e c t e d i n t h e t e s t i s a n d s p l e e nb u t n o t i n t h e b r a i n . B e c a u s e t h i s s u g g e s t e dt h a t t h e a b n o r m a l b e h a v i o r o f T g 8 m i c ew a s n o t d u e t o I F N - P , w e e x a m i n e d t h eb e h a v i o r o f t h e F 2 p r o g e n y o f T g 8 f e m a l e sm a t e d t o k n o c k o u t m a l e s l a c k i n g t h e I F N - 1r e c e p t o r 6 ) . F 2 a n d F 3 p u p s h a v i n g t h eI F N - 3 t r a n s g e n e b u t n o I F N - r 3 r e c e p t o r d i s -p l a y e d t h e s a m e a b n o r m a l b e h a v i o r a s T g 8p u p s a n d w e r e u s e d t o r u l e o u t t h e p o s s i b i l -i t y o f I F N - P a f f e c t i n g t h e p h e n o t y p i c f e a -t u r e s o f T g 8 m i c e .B y i n v e r s e PCR 7 ) d o n e o n T g 8 D NAw i t h t r a n s g e n e p r i m e r s , w e o b t a i n e d 2 . 0 k bo f t h e t w o g e n o m i c r e g i o n s f l a n k i n g t h et r a n s g e n e . We t h e n i s o l a t e d t h e j u n c t i o n sb y i n v e r s e PCR d o n e o n C3H D NA w i t hp r i m e r s d e r i v e d f r o m t h e f l a n k i n g r e g i o n s ,a n d i t a p p e a r e d t h a t t r a n s g e n e i n t e g r a t i o nh a d c a u s e d a g e n o m i c d e l e t i o n o f a t l e a s t 1k b . T h e 2 - k b f l a n k i n g s e q u e n c e s a n d 1 - k bd e l e t e d s e q u e n c e s w e r e n o t f o u n d i n t h eG e n B a n k a n d E u r o p e a n M o l e c u l a r B i o l o g yL a b o r a t o r y d a t a b a s e s b u t w e r e m a p p e d t o a3 - m i l l i o n - b a s e p a i r b p ) X - c h r o m o s o m e r e -g i o n c o n t a i n i n g s e v e r a l g e n e s 8 ) , i n c l u d i n gt h e g e n e s e n c o d i n g MAOA a n d MAOB.RT-PCR d o n e o n t o t a l RNA f r o m T g 8s p l e e n o r t e s t e s , w i t h t w o p r i m e r s d e r i v e df r o m r a t MAOA e x o n s 1 a n d 8 9 ) , s h o w e dt h a t t h e MAOA RN o f T g 8 m i c e , i n s t e a do f o c c u r r i n g a s a s i n g l e s p e c i e s a s d i d t h eMAOA RNA o f C3H m i c e , c o n s i s t e d o f a tl e a s t f o u r s m a l l e r s p e c i e s F i g . 1 A ) . PCR o n

F i g . 1 . MAOA RNA o f A 14 5 6 7 8T g 8 m i c e . A ) R e p r e s e n -t a t i o n o f t h e T g 8 g e n e - S A S De n c o d i n g MAOA b e -t w e e n e x o n s 1 a n d 8 t h e .g e n e f o r MAOA p r o b a b l y i - -h a s 1 5 e x o n s ) a n d s t r u c - - - ,' .vt u r e o f t h e f o u r s p e c i e s _o f MAOA RNA d e t e c t e d - - - - - - - - ,b y R T - P C R . T h e s p e c i e sc o n t a i n i n g I F N - P s e - ~ - - - - - - .q u e n c e s a n e x o n o f 1 9 9 - - - -b p ) r e s u l t s f r o m s p l i c i n g B SA S De v e n t s b e t w e e n l e g i t i - A G G A C A T C T C C C A C G T C A A T C T T T C C T C T T G C T T T T C C T C T A G T A n t i s e n s e I F N I T A G o t G A O 0m a t e MAOA s p l i c e s i t e s lAGATGTTAACATTTTGTCTCTATTATTTTGCCTTTAGG MAQAexon 2a n d c r y p t i c I F N - s p l i c e cs i t e s ( S A a n d S D , a c c e p -tor~~ ~nd o o s i e I S O G LA A A K L L S E Y K I N V Lt o r a nd d o no r s i t e s A T T G G A G G C G G C A T C T C A G i n t 1 G A T T G G C T G C T G C C A A A C T A T T G T C A G A A T A C A A A A T T A A T G T C T T Gp r e s e n t i n a n t i s e n s e G T T C T G G A A G C C C G G G A T A G A G T T G G A G G A A G A A C A T A T A C T G T G A G i n t 2 A A T G A G C A T G T T A A A T G GIFN-13 RNA . ( B ) Se- G T A G A T G T T G G T G G A G C T T A T G T G G G A C C A A C C C A G A A C A G A A T C T T A C G C T T G T C T A A G G A G C T A G G C A T A G A GA C C T A T A A A G T G A A T G T C A A T G A G C G T C T A G T T C A A T A T G T C A A G i n t 3 GGGAAAACTTACCCATTCCGTquence o f SA a n d S D , G G T G C A T T T C C A C C T G T G T G G A A C C C C T T G G C A T A T T T G G A T T A C A A C A A C C T G T G G A G G A C A A T G G A T G A T A T Ga n d s e q u e n c e o f MAOA G G A A A A G A G i n t 4 A T C C C T G T T G A T G C A C C A T G G C A A G C A A G A C A T G C T G A G G A A T G G A C A A G A T A A C CA T G A A A G A T C T C A T T G A T A A A A T C T G T T G G A C A A A i n t 5 A A C T G C T C G A G A A T T T G C T T A T C T T T T T G T Gexon 2 a c c e p t o r s p l i c e A A C A T T A A T G T G A C T T C T G A G C C T C A T G A G G T A T C T G C C C T G T G G T T C T T G T G G T A T G T G A G G C A G T G T G G A G G Ts i t e . T h e MAOA ex o n 2 ACCTCTCGGATATTCTCAGTCACCAATGGCGGCCAG i n t 6 G A A C G G A A A T T T G T A G G T G G C T C T G G C C A AA T A A G T G A A C A G A T A A T G G T C C TC C T T G G G G A T A A A G T G A A G C T G A G CT C T C C T G T T A C T T A T A T T G A C C A A A CAa c c e p t o r h a s a s t r o n g G A T G A C A A C A T C A T T A T A G A A A C A C T G A A T C A T G A G C A C T A T G A G i n t 7 T G C A A A T A T G T A A T T A G T G C Cp u t a t i v e b r a n c h s i t e s e - A T C C C A C C G G T T T G A C T G C C A A G A T C C A C T T T A A A C C A G A G C T T C C A C C T G A G A G A A A C C A A c T A A T T C A G C G Tq u e n c e ( T G T T A A C ) , a so p p o s e d t o t h e c r y p t i c a c c e p t o r S A . C C3H MAOA s e q u e n c e s o b t a i n e d b y R T - P C R b e t w e e n exons 1a n d 8 . T h e T g 8 RNA s p l i c e b e t w e e n exons 1 a n d 4 causes a r e a d i n g f r a m e s h i f t , a n d t h e l F N - exon o ft h e h y b r i d RNA s p e c i e s d o e s n o t r e s t o r e t h e n o r m a l r e a d i n g f r a m e . I n t e r n a l i n i t i a t i o n o f t r a n s l a t i o n mayo c c u r a t A C A A T G w i t h i n e x o n 4 .SCIENCE * V O L . 2 6 8 * 2 3 J U N E 1 9 9 5

I I M I I I I I I I I I I I I l l i l i l l l i

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T g 8 D NA i n d i c a t e d t h a t e x o n s 2 a n d 3w e r e m i s s i n g . T h e d e l e t i o n e n c o m p a s s i n gMAOA e x o n s 2 a n d 3 w a s e s t i m a t e d b yS o u t h e r n b l o t a n a l y s i s t o s p a n 1 7 k b .A n y t r u n c a t e d p o l y p e p t i d e t h a t c o u l d b es y n t h e s i z e d f r o m t h e v a r i o u s T g 8 MAOARNA s p e c i e s F i g . 1 C ) w a s e x p e c t e d t o b ed e v o i d o f c a t a l y t i c a c t i v i t y , b e c a u s e MAOe x o n 2 e n c o d e s p a r t o f t h e A i d P u n i t t h a t i sr e q u i r e d t o p o s i t i o n t h e c o f a c t o r FAD 1 0 ) .U s i n g s e r o t o n i n a s a s u b s t r a t e , w e f o u n dt h a t MAOA a c t i v i t y w a s a b o l i s h e d i n t h eb r a i n a n d l i v e r T a b l e 1 . I n c o n t r a s t ,M AO B a c t i v i t y o n p h e n y l e t h y l a m i n e w a sn o t a l t e r e d 1 .A l l T g 8 p u p s d i s p l a y e d t h e s a m e p a t t e r no f a l t e r e d b e h a v i o r , w h i c h v a r i e d w i t h a g e .C h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f t h e s e r o t o n i ns y n t h e s i s i n h i b i t o r p a r a c h l o r o p h e n y l a l a -n i n e ( P C P A ) [ 3 0 0 mg p e r k i l o g r a m o f b o d yw e i g h t p e r d a y , s u b c u t a n e o u s S C ) ] r e -v e r s e d t o n o r m a l a l l t h e b e h a v i o r a l t r a i t s o fT g 8 p u p s , w h e r e a s n o n e o f t h e t r a i t s w e r em o d i f i e d b y t h e c a t e c h o l a m i n e s y n t h e s i si n h i b i t o r a l p h a - m e t h y l p a r a t y r o s i n e 3 0 0m g / k g p e r d a y , S C ) . I n n e w b o r n s , t h e f i r s ts i g n o f a b n o r m a l b e h a v i o r w a s i n t e n s e h e a dn o d d i n g . B e t w e e n d a y s 5 a n d 1 0 , t h e p a t -t e r n i n c l u d e d i t r e m b l i n g u p o n l o c o m o -t i o n a n d s u s p e n s i o n b y t h e t a i l , i i p r o -l o n g e d r i g h t i n g F i g . 2 A ) , i i i m o v i n gb a c k w a r d i n s t e a d o f p i v o t i n g w h e n p l a c e do n a n e w s u r f a c e , a n d i v p r o l o n g e d a n ds t r o n g e r r e a c t i o n s t o p i n c h i n g . T h e s e b e -h a v i o r s c o u l d b e r e p r o d u c e d i n C3H p u p s ,b u t w i t h l e s s i n t e n s i t y , b y d a i l y i n j e c t i o n o ft h e MAOA i n h i b i t o r c l o r g y l i n e 3 0 m g / k gp e r d a y , S C ) . B e t w e e n d a y s 1 1 a n d 1 6 , T g 8m i c e s h o w e d i f r a n t i c r u n n i n g a n d f a l l i n go v e r , j u m p i n g , o r p r o m p t d i g g i n g t o h i d eu n d e r w o o d s h a v i n g s i n r e s p o n s e t o m o d e r -a t e s o u n d a n d m o v e m e n t ; i i s l e e p a c c o m -p a n i e d b y v i o l e n t s h a k i n g a n d j u m p s c a u s -i n g f r e q u e n t d i s p e r s i o n o f l i t t e r m a t e s ; i i iT a b l e 1 . MAOA a c t i v i t y i n t h e b r a i n a n d l i v e r o fT g 8 a n d C3 H m i c e . MAOA a c t i v i t y i n n a n o m o l e sp e r 2 0 m i n p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n ) w as d e t e r -m i n e d b y u s e o f 1 4 C - l a b e l e d s e r o t o n i n 5 - H T ) a ss u b s t r a t e 2 3 ) a n d , w h e n n e c e s s a r y , b y a d d i t i o no f 1 0 - 6 M L - d e p r e n y l d e p ) t o i n h i b i t i n t e r f e r e n c eb y M A O B , w h i c h w a s a b u n d a n t i n l i v e r t i s s u e a sc o m p a r e d w i t h M A O A , MAOB h a s l e s s a f f i n i t y f o r5 - H T a n d g r e a t e r a f f i n i t y f o r L - d e p r e n y l ) . E a c h v a l -u e c o r r e s p o n d s t o one mouse a v e r a g e o f a d u -p l i c a t e d s a m p l e , w i t h l e s s t h a n 10 v a r i a t i o n .S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h o t h e r s e t s o fm i c e o f v a r i o u s a g e s 8 t o 4 0 0 d a y s o l d .

C3 H a t d a y T g 8 a t d a yT i s s u e 1 4 3 0 9 0 1 4 3 0 9 0B r a i n 2 0 . 9 2 2 . 0 1 4 . 0 0 . 1 * 0 . 4 0 . 4L i v e r 7 . 1 5 . 5 3 . 9 2 . 5 1 . 5 1 . 4L i v e r + d e p 3 . 9 2 . 9 1 . 8 0 . 1 0 . 1 0 . 1* T w e n t y - f i v e p e r c e n t a b o v e a b l a n k t h a t h a d no h o m o -g e n a t e .1 7 6 4

p r o p e n s i t y t o b i t e t h e e x p e r i m e n t e r ; i vh u n c h e d p o s t u r e ; a n d v ) b a t a n d b a l l p o s -t u r e s w i t h h i n d l i m b c r o s s i n g u p o n s u s p e n -s i o n b y t h e t a i l 1 2 ) . P o s t u r a l t r a i t s w e r ew e l l r e p r o d u c e d i n 1 2 - d a y - o l d C3H p u p s b ya s i n g l e i n j e c t i o n o f c l o r g y l i n e , w h e r e a s t h eo t h e r b e h a v i o r s , p a r t i c u l a r l y a u d i t o r y s t a r -t l e , w e r e n o t f u l l y o b t a i n e d e v e n w h e n c l o r -g y l i n e w a s a d m i n i s t e r e d f r o m b i r t h 3 0 m g /k g p e r d a y ) .A d u l t m i c e h a d a d i f f e r e n t p a t t e r n o fb e h a v i o r a l a l t e r a t i o n s . M a l e s h o u s e d i ng r o u p s f r o m t h e t i m e o f w e a n i n g s h o w e ds i g n s o f o f f e n s i v e a g g r e s s i v e b e h a v i o r 1 3 ) F i g . 2 B ) , n o t a b l y b i t e w o u n d s o n g e n i t a l sa n d r u m p , w h i c h w e r e m o s t a p p a r e n t f r o mt h e a g e o f 3 m o n t h s a r e a s s c a b b e d o v e r ,w i t h f u r m i s s i n g ; i n 6 - t o 1 2 - w e e k - o l d i n d i -v i d u a l s , w o u n d s w e r e d e t e c t e d b y p a l p a -t i o n ) . We i n v e s t i g a t e d a g g r e s s i o n i n T g 8m a l e s i n t w o d i f f e r e n t r e s i d e n t - i n t r u d e rt e s t s F i g . 2 , C a n d D ) . T g 8 r e s i d e n t m a l e sa t t a c k e d t h e i n t r u d e r f a s t e r t h a n d i d C3Hr e s i d e n t s . I n t h e i n t e r v a l p r e c e d i n g t h e o n -s e t o f a t t a c k , C3H r e s i d e n t s d i s p l a y e d i n -t e n s e s o c i a l i n v e s t i g a t i o n a n d h o m e c a g ec h e c k i n g , w h e r e a s T g 8 r e s i d e n t s a d o p t e d a

s t a t i c , h u n c h e d , f l u f f e d - f u r p o s t u r e a f t e r tf i r s t o l f a c t o r y s t i m u l u s . A l t e r a t i o n s w ea l s o s e e n i n m a t i n g b e h a v i o r . Whe2 - m o n t h - o l d v i r g i n T g 8 m a l e s w e r e t e s ti n d i v i d u a l l y f o r 3 0 m i n w i t h a n o n r e c e p t iv i r g i n C3H f e m a l e , t h e c o u r t s h i p d i f f e rf r o m t h a t o f C3H m a l e s i n t h a t i t wd i s r u p t e d b y e p i s o d e s o f g r a s p i n g [ 1 2 g r a s p i n g e v e n t s ( m e a n + S E M , n = 5 ) ] t hw e r e r e f l e c t e d b y i n c r e a s e d f r e q u e n c y ai n t e n s i t y o f f e m a l e s q u e a k i n g 1 1 3 +v e r s u s 2 8 8 s q u e a k s , P < 0 . 0 0 1 ) . I n tP o r s o l t s s w i m t e s t 1 4 ) , T g 8 a d u l t s , i n s t eo f m o s t l y f l o a t i n g , m a d e p e r s i s t e n t a t t e m pt o e s c a p e , w h i c h c o r r e s p o n d s t o w h a to b s e r v e d w h e n n o r m a l m i c e r e c e i v e MAi n h i b i t o r s a n d o t h e r a n t i d e p r e s s a n t s . F9 - w e e k - o l d m i c e , t h e t i m e s p e n t i m m o b ii n w a t e r , i n a t e s t o f 4 m i n a f t e r 2 m i nh a b i t u a t i o n ) , w a s 2 0 0 + 7 s f o r C3Hm a l e s ( m e a n S E M , n = 1 5 ) , 8 4 1 2 sT g 8 f e m a l e s , 1 5 6 1 2 s f o r C3H m a l e s , a3 7 + 8 s f o r T g 8 m a l e s P < 0 . 0 0 1 ) . I n to p e n f i e l d t e s t a s d e s c r i b e d b y C h e n e t 1 , T g 8 a d u l t s s t a y e d a l o n g e r t i m e i n tc e n t e r , w i t h m u c h h e s i t a t i o n a s t o w h id i r e c t i o n t o t a k e , a n d i t r e m a i n s t o b e d

F i g . 2 . B e h a v i o r a l a l t e r a t i o n s Bo f T g 8 m i c e . A R i g h t i n g r e - 3 0 C3H n = 2 5 ) 1 0 * W o u n d e ds p o n s e . P u p s w e r e s e p a r a t e d 2 T g 8 n = 2 5 )f r o m t h e i r d a m , i s o l a t e d i n a 8 2 5 8b a r e c a g e a t 2 0 0 0 f o r 3 m i n t o | 2 0w a k e t h e m u p , a n d p l a c e d o n _ E 61 5 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0t h e i r b a c k s . T h e g r a p h g i v e s c 4a.04t h e m e a n t i m e f o r t h e p u p s t o 3 1 0 2_t u r n o v e r w i t h a n u p p e r l i m i t o f 21 m i n m e a n o f t h e m e a n o f Z 2 Lf i v e c o n s e c u t i v e t i m e p o i n t s 0 0 u anf o r e a c h p u p S E M ) . T g 8 3 4 5 6 7 8 9 222333345677p u p s t u r n e d o v e r w i t h f o r c e f u lm o v e m e n t s a n d e x c i t a t i o n , C Dw h e r e a s C3 H p u p s a c t e d 1 6 C3 H n 3 0 ) 8 T8 n 2 0c a l m l y . B A g g r e s s i o n b e - 1 4 7t w e e n T g 8 m a l e c a g e m a t e s . 8 1 2 6T h e p l o t r e p r e s e n t s a 1 - d a y E 1 0 _s u r v e y o f s k i n w o u n d s i n 2 - t o 8 047 - m o n t h - o l d m a l e s h o u s e d i n - _g r o u p s f r o m t h e t i m e o f w e a n - E . 0 3Ei n g 1 2 c a g e s ; i n t h e o n e c a g e z 4 2o f u n w o u n d e d 4 - m o n t h - o l d 2 1 -m i c e , t w o i n d i v i d u a l s w e r e 0 0 _ _w o u i d e d 2 w e e k s l a t e r . I n t h e 0 - 1 1 - 2 2 - 3 3 - 4 4 - 5 5 - 1 0 0 - 1 1 - 2 2 - 3w o u n d e d 2 u r w e e k l a t e r . I u n d h e d L a t e n c y t o f i r s t a t t a c k m i n ) L a t e n c y t o f i r s t a t t a c k mc o n t r o l s u r v e y , n o w o u n d e di n d i v i d u a l s w e r e f o u n d among2 - t o 8 - m o n t h - o l d C3 H m a l e s h o u s e d i n g r o u p s f r o m t h e t i m e o f w e a n i n g 1 7 3 m a l e s i n 2 2 c a g e s ) . Sw o u n d s w e r e n o t p r e s e n t i n T g 8 a n d C3 H f e m a l e g r o u p s . C L a t e n c y t o t h e f i r s t a p p e a r a n c e o f b ia t t a c k i n r e s i d e n t - i n t r u d e r t e s t s a f t e r a l o n g p e r i o d o f b r e e d i n g . E a c h 6 - m o n t h - o l d r e s i d e n t w a s g ia s i n g l e 1 0 - m i n e n c o u n t e r i n h i s home c a g e w i t h a 2 - m o n t h - o l d C3 H i n t r u d e r . T h e 3 0 T g 8 r e s i d ea n d 3 0 C3 H r e s i d e n t s w e r e h o u s e d w i t h a f e m a l e f r o m t h e a g e o f 2 m o n t h s a n d r e a r e d s e v e r a l l i tT h e 6 0 i n t r u d e r s were h o u s e d i n g r o u p s o f 1 0 f r o m t h e t i m e o f w e a n i n g ; a t t a c k l a t e n c y ( m e a n + So f T g 8 a n d C3H r e s i d e n t s w a s 7 4 1 0 s a n d 2 3 7 1 8 s , r e s p e c t i v e l y t t e s t ; t 5 8 = 7 . 9 0 , P < 0 . 0 0 0 D ) L a t e n c y t o t h e f i r s t a p p e a r a n c e o f b i t i n g a t t a c k i n r e s i d e n t - i n t r u d e r t e s t s a f t e r a p e r i o d o f i s o l a tT g 8 a n d C3H m a l e s w e r e i n d i v i d u a l l y h o u s e d f o r 5 w e e k s b e g i n n i n g a t w e a n i n g a n d w e r e g i v e n s i3 - m i n e n c o u n t e r s a s h o r t t i m e t o a l l o w f u r t h e r t e s t i n g ) i n t h e i r home c a g e s w i t h 2 - m o n t h - o l d Ci n t r u d e r s . A t t a c k l a t e n c y o f T g 8 a n d C3 H r e s i d e n t s w a s 1 1 0 + 1 2 s a n d 1 7 2 4 s , r e s p e c t i v e l y 0 . 0 0 0 1 ) . On e m o n t h l a t e r , t h e r e s i d e n t s were g i v e n s i n g l e 1 0 - m i n e n c o u n t e r s i n t h e i r home c a g e s2 - m o n t h - o l d B A L B / c J i n t r u d e r s : A t t a c k l a t e n c y o f T g 8 a n d C3H r e s i d e n t s w a s 2 7 + 6 s a n d 2 5 2 +s , r e s p e c t i v e l y P < 0 . 0 0 0 1 ) .

S C I E N C E * V O L . 2 6 8 * 2 3 J U N E 1 9 9 5

R w l ~ w m m i i i i l i i v i i i i 1n a w l m 1 M p l c o

8/12/2019 Science-1995-Cases-1763-6

3/4

t e r m i n e d w h e t h e r t h i s b e h a v i o r c o r r e -s p o n d s t o s e n s o r y o r c o g n i t i v e d e f i c i t s o r t or e d u c e d f e a r . F o r 1 2 - w e e k - o l d m i c e , t h et i m e s p e n t i n t h e c e n t e r o f t h e f i e l d w a s 1 0+ 2 s f o r C3H f e m a l e s ( m e a n S E M , n =1 3 ) , 9 3 3 4 s f o r T g 8 f e m a l e s , 2 0 + 4 s f o rC3H m a l e s , a n d 1 1 8 2 7 s f o r T g 8 m a l e s P < 0 . 0 0 1 ) . I n t h e b e a m - w a l k i n g t e s t , T g 8a d u l t s g r a s p e d t h e e d g e o f t h e b e a m w i t hh i n d l i m b s w h i l e w a l k i n g 1 5 ) , w h e r e a s C3Ha d u l t s w e r e s u r e - f o o t e d i t s h o u l d b e n o t e dt h a t a d u l t T g 8 a n d C3H m i c e a r e b l i n d , a st h e y c a r r y a r e t i n a l d e g e n e r a t i o n g e n e ) .A p a r t i c u l a r b e h a v i o r a l t e s t t o d i s t i n -g u i s h M A O A - d e f i c i e n t a d u l t s f r o m n o r m a la d u l t s c o n s i s t e d i n g i v i n g a n i n j e c t i o n o fL - d e p r e n y l [ 1 5 m g / k g , i n t r a p e r i t o n e a l I P ) ]F i g . 3 . A m o u n t s o f 5 - H T , 5 - H I A A , 2 5 0 0D A , a n d NE i n w h o l e b r a i n s f r o mT g 8 a n d C3 H m i c e . V a l u e s f r o m 2 0 0 0HPLC a s s a y s 2 4 ) a r e e x p r e s s e d i n 0 1 5 0 0p i c o g r a m p e r m i l l i g r a m o f w e t b r a i n Ca n d r e p r e s e n t t h e mean S EM n C 1 0 0 0= 4 , 5 , 7 , 8 , 4 , 4 , a n d 2 . M i c e w e r e _ 5 0 0o f b o t h s e x e s a n d v a r i o u s a g e s e x - :c e p t f o r t h e 3 - m o n t h - o l d m i c e , w h i ch w e r e m a l e s o n l y ) a n d w e r eh o u s e d i n g r o u p s a c c o r d i n g t o s e x 1 6 0 0b e g i n n i n g a t w e a n i n g e x c e p t f o r ct h e 7 - m o n t h - o l d m i c e , w h i c h w e r e X 1 2 0 0b r e e d i n g p a i r s . R n n

o r l a z a b e m i d e 6 0 m g / k g , I P ) 1 6 ) , t w oM AO B i n h i b i t o r s d i f f e r i n g i n s e v e r a l p h a r -m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s . T h e s e t r e a t m e n t sd i d n o t o v e r t l y a f f e c t C3H b e h a v i o r b u tc a u s e d , i n T g 8 a d u l t s , r e s t l e s s n e s s a n d a t -t e n t i o n a l d e f i c i t , w h i c h d i s r u p t e d s o c i a l i n -t e r a c t i o n , f e e d i n g , a n d s e l f - g r o o m i n g , b e -g i n n i n g w i t h i n 2 h o u r s a f t e r i n j e c t i o n a n dl a s t i n g f o r a t l e a s t 3 h o u r s 1 7 ) .I n t h e r o d e n t b r a i n , M AO B a c t i v i t y i sl o w a t b i r t h a n d i n c r e a s e s d u r i n g t h e f i r s tm o n t h p a r t l y d u e t o g l i o g e n e s i s ) , w h e r e a sMAOA a c t i v i t y i s c l o s e t o a d u l t a m o u n t sf r o m t h e f i r s t w e e k o n 1 8 ) . T h i s d e v e l o p -m e n t a l d i f f e r e n c e m a y e x p l a i n w h y t h e p h e -n o t y p e o f T g 8 m o u s e p u p s w a s m o r e s e v e r et h a n t h a t o f a d u l t s , a n d w h y L - d e p r e n y l d i dC C3H c 500

1T8g12284 6 0211400 1m3 ~j~~JJJ4~~j2 ~f

15

12 r

1 8 1 2 28 4 6 9 0 2 1 0 1 8 1 2 2 8 4 6 90210A g e d a y s )

Fig. 4. Abnormal 5 HT immunostaining in 7 - d a y - o l d Tg8 brains. ( A through Coronal sections of C3H-brain. ( D through F) Corresponding sections ofTg8 brain. 5 HT p ol y c l on a l antibodywasused atadilutionof 1:15,000 andwasrevealed byas t r e p t a v i d i n -bi o t i n -p e r o x i d a s e complex and by diaminobenzidine. Inthe locus coeruleus I c ) 1 A ) and D ] , substantia n i g r a ( s n ) , and ventral t e g m e n t a l area ( v t a ) 1 ( B ) and ( E ) ] ,5-HT-like i m m u n o r e a c t i v i t y is present in terminal fibers and medial forebrain bundle (mfb) in C 3 H - andTg8mice but is abnormally present in cell bodies in Tg8 mice [ a r r o w s in ( D ) and ( E ) ] . Four different 5 HTantisera (three polyclonal andonemonoclonal revealed the sames t a i n i n g p a t t e r n . Double immunofluo-rescent staining fo r 5 HTand the catecholamine s y n t h e s i zi n g enzyme t y r o s i n e h y d r o x y l a s e showed thatthese 5 - H T - l i k e immunoreactive cell bodies werec a tec h ol a miner g ic. In the somatosensory cortex 1 ( C )and F ] , clusters of 5-HT-immunoreactive fibers , delineate barrels in layer IV in C 3 H - mice ( C ) , whereasthey formacontinuous band in layer IV in Tg8 mice ( F ) . Scale b a r , 225 p K m .

SCIENCE * VOL. 2 6 8 * 2 3 JUNE 1 9 9 5

n o t a g g r a v a t e t h e b e h a v i o r a l t r a i t s o f 1 2 -d a y - o l d T g 8 m i c e .C o m p a r i s o n o f t h e a m o u n t o f s e r o t o n i n 5 - H T ) , d o p a m i n e ( D A ) , a n d n o r e p i n e p h -r i n e ( N E ) i n T g 8 a n d C3H b r a i n s s h o w e da n i n c r e a s e i n a l l t h r e e a m i n e s i n T g 8b r a i n s F i g . 3 . T h e e l e v a t i o n i n D A w a ss l i g h t , a l t h o u g h t h e D A m e t a b o l i t e d i h y -d r o x y p h e n y l a c e t i c a c i d w a s m a r k e d l y d e -c r e a s e d 3 . 5 t i m e s l e s s a t 3 m o n t h s ) . T h ea m o u n t o f 5 - H T w a s c o n s i d e r a b l y i n c r e a s e di n T g 8 p u p s n i n e f o l d a t d a y 1 a n d s i x f o l d a td a y 1 2 ) a n d r e t u r n e d t o n o r m a l i n o l d e rm i c e , w h e r e a s t h e a m o u n t o f t h e 5 - H Tm e t a b o l i t e 5 - H I A A p r o b a b l y p r o d u c e d b yMAOB) w a s c o n s i d e r a b l y d e c r e a s e d i n T g 8p u p s a n d r e t u r n e d t o n o r m a l i n o l d e r m i c e .T h e M AO B i n h i b i t o r L - d e p r e n y l 1 5 m g /k g , I P ) e l i c i t e d w i t h i n 3 h o u r s a g r e a t e ri n c r e a s e i n 5 - H T i n T g 8 t h a n i n C3Hb r a i n s 2 . 5 - f o l d v e r s u s 1 . 2 - f o l d i n 4 - m o n t h -o l d m a l e s ) a n d c a u s e d t h e n e a r d i s a p p e a r -a n c e o f 5 - H I A A i n T g 8 b r a i n s b u t n o d e -c r e a s e i n 5 - H I A A i n C3H b r a i n s . T h i s s u g -g e s t s t h a t t h e r o l e o f M AO B i n 5 - H T o x i -d a t i o n i n t h e b r a i n i n v i v o i s m o r ei m p o r t a n t t h a n c a n b e p r e d i c t e d f r o m i nv i t r o t e s t s T a b l e 1 .I n 7 - d a y - o l d T g 8 p u p s , t h e d e n s i t y o ff i b e r s s t a i n e d b y 5 - H T i m m u n o c h e m i s t r yw a s e n h a n c e d i n s e v e r a l b r a i n r e g i o n s s u c h a s t h e s t r i a t u m , c e r e b r a l c o r t e x , a n dt h e h i l u s o f t h e d e n t a t e g y r u s ) , a n d 5 - H T -l i k e s t a i n i n g w a s a b n o r m a l l y p r e s e n t i n c a t -e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s o f t h e l o c u s c o e r -u l e u s a n d n i g r a l c o m p l e x A 8 , A 9 , a n dA 1 0 ) F i g . 4 , D a n d E ) . T h e s e n e u r o n ss h o w e d n o i m m u n o r e a c t i v i t y t o t h e 5 - H T -s y n t h e s i z i n g e n z y m e t r y p t o p h a n h y d r o x y -l a s e ( T P H ) , a n d d u r i n g c h r o n i c a d m i n i s t r a -t i o n o f t h e T P H i n h i b i t o r P C P A 3 0 0 m g /k g p e r d a y , S C ) , t h e y d i d n o t r e m a i n i m -m u n o r e a c t i v e t o a n t i b o d y t o 5 - H T . T h u s ,t h e p r e s e n c e o f 5 - H T i m m u n o r e a c t i v i t yp r o b a b l y c o r r e s p o n d s t o 5 - H T u p t a k e 1 9 )a n d t h e l i k e l y a b s e n c e o f MAOB i n t h i sc a t e g o r y o f n e u r o n s 2 0 ) . I n c o n t r a s t , i n1 0 - w e e k - o l d T g 8 m i c e , t h e d i s t r i b u t i o n a n dd e n s i t y o f 5 - H T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d -i e s a n d f i b e r s a p p e a r e d n o r m a l . O n e o f t h ep o s s i b i l i t i e s t o e x p l a i n t h e d i f f e r e n c e b e -t w e e n p u p s a n d a d u l t s i s t h a t 5 - H T m a y b ec a p t u r e d b y M A O B - r i c h c e l l s i n a d u l t s s u c h a s m a t u r e g l i a l c e l l s 2 0 ) .I t i s w e l l d o c u m e n t e d t h a t i n t h e s o -m a t o s e n s o r y c o r t e x o f n o r m a l p u p s , s e r o -t o n e r g i c a f f e r e n t s s h o w a p a t t e r n t h a t c o i n -c i d e s w i t h c y l i n d r i c a l a g g r e g a t e s b a r r e l s o fg r a n u l e c e l l s i n l a y e r I V 2 1 ) . I n s t e a d o f t h i sd i s j u n c t i v e p a t t e r n F i g . 4 C ) , t h e s o m a t o -s e n s o r y c o r t e x o f T g 8 p u p s s h o w e d a c o n -t i n u o u s b a n d o f 5 - H T i m m u n o s t a i n i n g F i g .4 F ) . I n T g 8 p u p s a n d a d u l t s , N i s s l a n dc y t o c h r o m e o x i d a s e c h e m i s t r y r e v e a l e d ac o m p l e t e a b s e n c e o f b a r r e l f i e l d i n t h e s o -m a t o s e n s o r y c o r t e x , w h e r e a s b a r r e l e t t e s

1 7 6 5

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w e r e p r e s e n t i n t h e t r i g e m i n a l a n d t h a l a m i cn u c l e i b r i d g i n g t h e s e n s o r y p e r i p h e r y t o t h ec o r t e x 1 1 . N e o n a t a l a d m i n i s t r a t i o n o fPCPA 3 0 0 m g / k g p e r d a y , S C ) p a r t l y r e -s t o r e d t h e c a p a c i t y t o f o r m c o r t i c a l b a r r e l s .A r o l e f o r s e r o t o n i n i n b a r r e l f i e l d f o r m a t i o nc o u l d b e c o n s i d e r e d b e c a u s e , f o r e x a m p l e ,t h a l a m i c a f f e r e n t s i n t h e b a r r e l s o f n o r m a lp u p s e x p r e s s l a r g e a m o u n t s o f 5 - H T I B r e -c e p t o r s 2 2 ) . T g 8 p u p c o r t i c e s t h a t w e r es t a i n e d f o r t h e 5 - H T 1 8 r e c e p t o r s d i d n o ts h o w t h e b a r r e l p a t t e r n t h a t w a s f o u n d i nC3H c o r t i c e s 1 1 . I t w i l l b e i n t e r e s t i n g t oc h e c k f o r t h e p r e s e n c e o f t h e b a r r e l f i e l d i nt h e p r o g e n y o f T g 8 m i c e m a t e d t o d i v e r s e5 - H T r e c e p t o r k n o c k o u t s .T h i s s t u d y s h o w s t h a t M A O A - d e f i c i e n tm o u s e p u p s h a v e a d r a m a t i c a l l y a l t e r e d s e -r o t o n i n m e t a b o l i s m a n d s e v e r e b e h a v i o r a la l t e r a t i o n s , b o t h p h e n o m e n a b e i n g l i n k e d .T h e b e h a v i o r a l t r a i t s o f a d u l t s m a y b e r e -l a t e d t o p e r s i s t i n g d e f e c t s i n m o n o a m i n em e t a b o l i s m o r t o s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s s u c ha s t h e o n e w e d e m o n s t r a t e d i n t h e c e r e b r a lc o r t e x , a n i s s u e t h a t p h a r m a c o l o g i c a l i n t e r -v e n t i o n s m a y h e l p t o c l a r i f y . T h e f i n d i n gt h a t M A O A - d e f i c i e n t m a l e s w i t h a C 3 H /H e J g e n e t i c b a c k g r o u n d d i s p l a y e n h a n c e da g g r e s s i o n u n d e r s t a n d a r d r e a r i n g c o n d i -t i o n s s u p p o r t s t h e i d e a t h a t t h e p a r t i c u l a r l ya g g r e s s i v e b e h a v i o r o f t h e f e w k n o w n h u -m a n m a l e s l a c k i n g MAOA i s n o t f o s t e r e db y a n u n u s u a l g e n e t i c b a c k g r o u n d o r c o m -p l e x p s y c h o s o c i a l s t r e s s o r s b u t i s a m o r ed i r e c t c o n s e q u e n c e o f MAOA d e f i c i e n c y .

REFERENCES A ND NOTES1 C . C . M a n n , S c i e nc e 2 6 4 , 1 6 8 6 1 9 9 4 ) ; M . B a r i n a g a ,i b i d . , p . 1 6 9 0 ; F . S a u d o u e t a l . , i b i d . 2 6 5 , 1 8 7 5 1 9 9 4 ) ; C . C h e n , D . G . R a i n n i e , R . W . G r e e n e , S .T o n e g a w a , i b i d . 2 6 6 , 2 9 1 1 9 9 4 ) .2 . A . W . J . B a c h e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 5 ,4 9 3 4 1 9 8 8 ) ; Z . - Y . C h e n , J . F . P o w e l l , Y . - P . P . H s u ,X . 0 . B r e a k e f i e l d , I . W . C r a i g , G e n o m i c s 1 4 , 7 5 1 9 9 2 ) .3 . F . A . C o l l i n s e t a l . , Am. J . M e d . G e n e t . 4 2 , 1 2 7 1 9 9 2 ) .4 . H . G . B r u n n e r , M . N e l e n , X . 0 . B r e a k e f i e l d , H . H .R o p e r s , B . A . v a n O o s t , S c i e n c e 2 6 2 , 5 7 8 1 9 9 3 ) .5 . T h e I F N - , 3 m i n i g e n e i s a 1 5 8 8 - b p A c c l - A p a f r a g -m e n t d e r i v e d f r o m p l a s m i d p K b - l F N - P [ I S e i f , E . D eM a e y e r , I . R i v i e r e , J . D e M a e y e r - G u i g n a r d , J . V i r o l .6 5 , 6 6 4 1 9 9 1 ) 1 . T h e T g 8 t r a n s g e n e i s i d e n t i c a l t o t h em i n i g e n e , e x c e p t f o r a 6 4 - b p t e r m i n a l d e l e t i o n i n t h eh e r p e s v i r u s t h y m i d i n e k i n a s e T K ) r e g i o n a n d a 1 4 8 -b p d e l e t i o n i n t h e p r o m o t e r r e g i o n f r o m t h e m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t y g e n e H - 2 K b H 2 ) .6 . U . M O l l e r e t a l . , S c i e n c e 2 6 4 , 1 9 1 8 1 9 9 4 ) .7 . H . O c h m a n , A . S . G e r b e r , D . L . H a r t i , G e n e t i c s 1 2 0 ,6 2 1 1 9 8 8 ) . I n v e r s e PCR w a s d o n e w i t h o u t p r i o r s i z ef r a c t i o n a t i o n a n d i s o l a t i o n o f r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s .8 . T h i s i s a r e g i o n b e t w e e n t h e DXHS32 a n d A - r a f l o c i[ S . D . M . B r o w n e t a l . , Mamm. Genome 4 , S 2 6 9 1 9 9 3 ] .9 . T . K u w a h a r a , S . T a k a m o t o , A . I t o , A g r i c . B i o l . C h e m .5 4 , 2 5 3 1 9 9 0 ) .1 0 . J . G r i m s b y e t a l . , P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U . S . A . 8 8 ,3 6 3 7 1 9 9 1 ) ; R . K . W i e r e n g a e t a l . , J . M o l . B i o l . 1 8 7 ,1 0 1 1 9 8 6 ) .1 1 . 0 . C a s e s e t a l . , u n p u b l i s h e d d a t a .1 2 . I . Q . W h i s h a w , T . S c h a l l e r t , B . K o l b , J . C o m p .P h y s i o l . P s y c h o l . 9 5 , 8 5 1 9 8 1 ) .1 3 . S . C . M a x s o n , i n T e c h n i q u e s f o r t h e G e n e t i c A n a l y s i so f B r a i n a n d B e h a v i o r . F o c u s on t h e M o u s e , D . G o l d -

o w i t z , D . W a h i s t e i n , R . E . W i m e r , E d s . E l s e v i e r , Am -s t e r d a m , 1 9 9 2 ) , p p . 3 4 9 - 3 7 3 .1 4 . R . D . P o r s o l t , A . B e r t i n , M . J a l f r e , A r c h . I n t . P h a r m a -c o d y n . 2 2 9 , 3 2 7 1 9 7 7 ) ; F . B o r s i n i a n d A . M e l i , P s y -c h o p h a r m a c o l o g y 9 4 , 1 4 7 1 9 8 8 ) .1 5 . B . K o l b a n d 1 Q . W h i s h a w , C a n . J . P s y c h o l . 3 7 , 2 1 1 1 9 8 3 ) .1 6 . W . E . H a e f e l y e t a l . , A d v . N e u r o l . 5 3 , 5 0 5 1 9 9 0 ) .1 7 . S . C . G e r s o n a n d R . J . B a l d e s s a r i n i , L i f e S c i . 2 7 ,1 4 3 5 1 9 8 0 ) .1 8 . D . T s a n g , K . P . H o , H . L . W e n , D e v . N e u r o s c i . 8 , 2 4 3 1 9 8 6 ) ; M . S t r o l i n B e n e d e t t i , P . D o s t e r t , K . F . T i p t o n ,D e v . P h a r m a c o l . T h e r . 1 8 , 1 9 1 1 9 9 2 ) ; Y . K o i d e a n dK . K o b a y a s h i , N e u r o c h e m . R e s . 9 , 5 9 5 1 9 8 4 ) .1 9 . W . L i c h t e n s t e i g e r e t a l . , J . N e u r o c h e m . 1 4 , 4 8 9 1 9 6 7 ) ; E . S h a s k a n a n d S . H . S n y d e r , J . P h a r m a c o l .E x p . T h e r . 1 7 5 , 4 0 4 1 9 7 0 ) ; H . W . M . S t e i n b u s c h , A .A . J . V e r h o f s t a d , H . W . J . J o o s t e n , M . G o l d s t e i n , i nC y t o c h e m i c a l M e t h o d s i n N e u r o a n a t o m y , V . C h a n -P a l a y a n d S . L . P a l a y , E d s . L i s s , Ne w Y o r k , 1 9 8 2 ) ,p p . 4 0 7 - 4 2 1 ; J . A . W a l l a c e e t a l . , B r a i n R e s . B u l l . 9 ,1 1 7 1 9 8 2 ) .2 0 . P . L e v i tt , J . E . P i n t a r , X . 0 . B r e a k e f i e l d , P r o c . N a t V .A c a d . S c i . U . S . A . 7 9 , 6 3 8 5 1 9 8 2 ) ; K . N . W e s t l u n d ,R . M . D e n n e y , L . M . K o c h e r s p e r g e r , R . M . R os e , C .W . A b e l l , S c i e n c e 2 3 0, 1 8 1 1 9 8 5 ) . I n t h e n o r m a lb r a i n , m o s t c a t e c h o l a m i n e r g i c n e u r o n s o f t h e l o c u sc o e r u l e u s a n d n i g r a l c o m p l e x a r e r i c h i n MAOA.2 1 . T . W o o l s e y a n d H . V a n d e r L o o s, B r a i n R e s . 1 7 , 2 0 5 1 9 7 0 ) ; R . J . D ' A m a t o e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U . S . A . 8 4 , 4 3 2 2 1 9 8 7 ) ; R . W . R h o a d e s e t a l . , J .C o m p . N e u r o l . 2 9 3 , 1 9 0 1 9 9 0 ) ; M . C . O s t e r h e l d -H a s s e t a l . , D e v . B r a i n R e s . 7 7 , 1 8 9 1 9 9 4 ) .2 2 . C . A . B e n n e t t - C l a r k e e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i .

U . S . A . 9 0 , 1 5 3 1 9 9 3 ) .2 3 . H -F . W u , K . C h e n , J . C . S h i h , M o l . P h a r m a c o l .8 8 8 1 9 9 3 ) .2 4 . F o r h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a( H P L C ) a s s a y s , w h o l e b r a i n was h o m o g e n i z e ds o n i c a t i o n i n 0 . 1 M H C I 0 4 c o n t a i n i n g 0 .N a 2 S 2 0 5 . I n t h e f i r s t a s s a y , t h e HPLC s y s t e m wcomposed o f a 5 - p L m U l t r o s p h e r e c o l u m n ( B em a n , F u l l e r t o n , C A ) a n d a n L C - 2 A e l e c t r o c h e m id e t e c t o r B i o a n a l y t i c a l S y s t e m s , W e s t L a f a y e tI N , a n d t h e m o b i l e p h a s e was a n 8 0 : 2 0 m i x t( p H 2 . 9 ) o f 1 0 0 mM N a 2 H 2 P O 4 a n d m e t h a n o l , w2 . 7 5 mM o c t a n e s u l p h o n a t e , 0 . 1 mM E D T A , a0 . 2 5 mM t r i e t h y l a m i n e . I n t h e s e c o n d a s s a yr e f i n e NE d e t e r m i n a t i o n ) , t h e HPLC s y s t e m waC o u l o c h e m I I E S A w i t h a n H R - 8 0 c a t e c h o l a mc o l u m n E S A , B e df o rd , M A ) , a n d t h e m o b i l e p hwas a n 8 8 : 6 : 6 m i x t u r e ( p H 5 . 2 ) o f 7 5N a 2 H 2 P O 4 , m e t h a n o l , a n d a c e t o n i t r i l e , w i t h 2mM o c t a n e s u l p h o n a t e , 0 . 0 2 mM E D T A , a ndmM t r i e t h y l a m i n e .2 5 . We t h a n k D . H e r v A , J . - P . T a s s i n , J . A d a m ,C o u r t i e r , L . E u se b e , a n d D . H a r a n g e r f o r p a r t i ct i o n ; P . A v n e r f o r t h e D NA b a c k c r o s s p a n e l ; M .P r a d a f o r l a z a b e m i d e ; a n d R . H e n , M . J o u v e t , JC h a n g e u x , I G r e s s e r , L . A b b o t t , E . L a u r e t , V . Vi l l a r d , R . Z a w a t z k y , a n d J . D e M a e y e r - G u i g n a r dd i s c u s s i o n . S u p p o r t e d b y C N R S , t h e A g e n c et i o n a l e d e R e c h e r c h e s s u r l e S i d a , t h e A s s oc i a tp o u r l a R e c h e r c h e s u r l e C a n c e r , a n d N a t i o n a ls t i t u t e o f M e n t a l H e a l t h g r a n t s R O 1 M 3 7 0R 3 7 MH 3 9 0 8 5 , a n d K 0 5 MH 0 0 7 9 6 .2 N o v e m b e r 1 9 9 4 ; a c c e p t e d 6 A p r i l 1 9 9 5

T r a n s c r i p t i o n a l A c t i v a t i o n b y T e t r a c y c l i n e si n M a m m a l i a n C e l l sM a n f r e d G o s s e n , * S a b i n e F r e u n d l i e b , G a b r i e l e B e n d e r ,G e r h a r d M u l l e r , W o l f g a n g H i l l e n , Hermann B u j a r d t

A t r a n s c r i p t i o n a l t r a n s a c t i v a t o r was d e v e l o p e d t h a t f u s e s t h e V P 1 6 a c t i v a t i o n d o m a i n w ia m u t a n t T e t repressor f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . T h i s t r a n s a c t i v a t o r r e q u i r e s c e r t a i n t e tc y c l i n e T c ) d e r i v a t i v e s f o r s p e c i f i c D NA b i n d i n g . T h u s , a d d i t i o n o f d o x y c y c l i n e t o Hec e l l s t h a t c o n s t i t u t i v e l y s y n t h e s i z e d t h e t r a n s a c t i v a t o r a n d t h a t c o n t a i n e d a n a p p r o p r i a ts t a b l y i n t e g r a t e d r e p o r t e r u n i t r a p i d l y i n d u c e d g e n e e x p r e s s i o n m o r e t h a n a t h o u s a n d f o lT h e s p e c i f i c i t y o f t h e T e t r e p r e s s o r - o p e r a t o r - e f f e c t o r i n t e r a c t i o n a n d t h e p h a r m a c o l oi c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f T c ' s m ake t h i s r e g u l a t o r y s y s t e m w e l l s u i t e d f o r t h e c o n t r o l o f g ea c t i v i t i e s i n v i v o , s u c h a s i n t r a n s g e n i c a n i m a l s a n d p o s s i b l y i n g e n e t h e r a p y .

The a b i l i t y t o t i g h t l y c o n t r o l i n d i v i d u a lg e n e a c t i v i t i e s w o u l d g r e a t l y f a c i l i t a t e t h ea n a l y s i s o f g e n e f u n c t i o n , p a r t i c u l a r l y i n s y s -t e m s t h a t a r e n o t a m e n a b l e t o g e n e t i c d i s -s e c t i o n . T h e a c h i e v e m e n t o f t h i s g o a l i nm o r e c o m p l e x e u k a r y o t i c c e l l s h a s b e e n d i f -f i c u l t b e c a u s e o f a l a c k o f t i g h t n e s s o f c o n -t r o l o r t o p l e i o t r o p i c e f f e c t s c a u s e d b y t h ei n d u c i n g p r i n c i p l e f o r e x a m p l e , h e a t s h o c k ,h e a v y m e t a l i o n s , o r s t e r o i d h o r m o n e s ) , o rM . G o s s e n , S . F r e u n d l i e b , G . B e n d e r , H . B u j a r d , Z e n t r u mf O r M o l e k u l a r e B i o l o g i e d e r U n i v e r s i t d t H e i d e l b e r g ,( Z M D H ) I m N e u e n h e i m e r F e l d 2 8 2 , D - 6 9 1 2 0 H e i d e l b e r g ,G e r m a n y .G . M i l l e r a n d W . H i l l e n , I n s t i t u t f O r M i k r o b i o l o g i e u n dB i o c h e m i e , U n i v e r s i t d t E r l a n g e n , S t a u d t s t r a s s e 5 , 9 1 0 5 8E r l a n g e n , G e r m a n y .* T o w h o m c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .t P r e s e n t a d d r e s s : U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a B e r k e l e y , D e -p a r t m e n t o f M o l e c u l a r a n d C e l l B i o l o g y , 4 0 1 B a r k e r H a l l ,B e r k e l e y , CA 9 4 7 2 0 , U S A .

b o t h . S y s t e m s f o u n d e d o n w e l l - d e f i n e d ru l a t o r y e l e m e n t s f r o m e v o l u t i o n a r i l y d i s ts p e c i e s h a v e t h e r e f o r e b e e n e x p e c t e d t ou s e f u l . W i t h t h e u s e o f t h e E . c o l i l a c ta n d t e t r a c y c l i n e t e t r e s i s t a n c e o p e r os e v e r a l t r a n s c r i p t i o n c o n t r o l c i r c u i t s h ab e e n d e v e l o p e d a n d s h o w n t o b e f u n c t i oi n c o m p l e x e u k a r y o t i c c e l l s 1 , 2 . On e st e m 3 ) t a k e s a d v a n t a g e o f t h e h i g h s p ef i c i t y o f t h e T e t r e p r e s s o r T e t R ) - o p e r a tT c i n t e r a c t i o n , t h e p o t e n t c y o f t h e h e rs i m p l e x v i r u s ( H S V ) - V P 1 6 t r a n s c r i p ta c t i v a t i o n d o m a i n , a n d t h e f a v o r a b l e p re r t i e s o f T c s . I n t h i s s y s t e m , t h e T c - ct r o l l e d t r a n s a c t i v a t o r t T A ) a f u s i o nt w e e n T e t R a n d t h e a c t i v a t i n g d o m a i nt h e V P 1 6 p r o t e i n ) c a n s t i m u l a t e t h e e x p rs i o n o f a r e p o r t e r g e n e i n H e L a c e l l s u p1 0 5 - f o l d 3 . B e c a u s e T c p r e v e n t s tTA fb i n d i n g t o t e t o p e r a t o r s p l a c e d u p s t r e a mSCIENCE * V O L . 2 6 8 * 2 3 J U N E 1 9 9 5

l0 11 .l.W 1

1 7 6 6