8/12/2019 Science 1996 Lanske 663 6

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The P T H / P T H r P r e c e p t o r r e s p o n d s t o t w ol i g a n d s , PTH a n d P T H r P . PTH i s s y n t h e -s i z e d b y t h e p a r a t h y r o i d g l a n d s a n d a c t s o nk i d n e y a n d b o n e t o r e g u l a t e c a l c i u m h o -m e o s t a s i s 1 . P T H r P , i n c o n t r a s t , i s s y n -t h e s i z e d i n m u l t i p l e t i s s u e s w i t h s p e c i f i cs p a t i a l a n d t e m p o r a l p r o f i l e s a n d h a s l a r g e l yp a r a c r i n e f u n c t i o n s 2 .C o m p l e m e n t a r y DNA e n c o d i n g t h eP T H / P T H r P r e c e p t o r w a s c l o n e d f r o m b o n ea n d k i d n e y c e l l s . T h e r e c e p t o r b i n d s a n dr e s p o n d s e q u a l l y t o N H 2 - t e r m i n a l f r a g -B . L a n s k e , K . L e e , A . P i r r o , A . - B . A b o u - S a m r a , H . J O p -p n e r , G . V . S e g r e , H . M . K r o n e n b e r g , E n d o c r i n e U n i t ,M a s s a c h u s e t t s G e n e r a l H o s p i t a l a n d H a r v a r d M e d i c a lS c h o o l , B o s t o n , MA 0 2 1 1 4 , U S A .A . C . K a r a p l i s , D e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , S i r M o r t i m e r B .D a v i s - J e w i s h G e n e r a l H o s p i t a l , M c G i l l U n i v e r s i t y , M o n -t r e a l , Q u e b e c H 3 T 1 E 2 , C a n a d a .A . L u z , I n s t i t u t e o f P a t h o l o g y , GSF M O n c h e n , D 8 5 7 5 8N e u h e r b e r g , G e r m a n y .A . V o r t k a m p , D e p a r t m e n t o f G e n e t i c s , H a r v a r d M e d i c a lS c h o o l , B o s t o n , MA 0 2 1 1 5 , U S A .M . K a r p e r i e n a n d L . H . K . D e f i z e , H u b r e c h t L a b o r a t o r i u m ,N e t h e r l a n d s I n s t i t u t e f o r D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y , 3 5 8 4CT U t r e c h t , T h e N e t h e r l a n d s .C . H o , D e p a r t m e n t o f G e n e t i c s a n d H o w a r d H u g h e sM e d i c a l I n s t i t u t e , H a r v a r d M e d i c a l S c h o o l , B o s t o n , MA0 2 1 1 5 , U S A .R . C . M u l l i g a n , W h i t e h e a d I n s t i t u t e f o r B i o m e d i c a l R e -s e a r c h , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 4 2 , a n d M a s s a c h u s e t t s I n -s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 3 9 , U S A .* T o whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .

S

p r o b e d w i t h f l u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i -b o d i e s 1 : 1 0 0 d i l u t i o n ; J a c k s o n I m m u n o R e s e a r c hL a b s ) a n d r h o d a m i n e - p h a l l o i d i n ( 0 . 6 6 , u M ; M o l e c u l a rP r o b e s ) . I m m u n o s t a i n i n g a f t e r m i c r o i n j e c t i o n o f MG -l a b e l e d a n t i b o d i e s 1 m g / m l ) i n t o n e u r o n s w i t h o rw i t h o u t f l u o r e s c e n t d e x t r a n m a r k e r w a s d o n e b y d i -r e c t l y i n c u b a t i n g w i t h f l u o r e s c e n t s e c o n d a r y a n t i -b o d y . I m a g e s w e r e t a k e n w i t h a Z e i s s LSM 4 1 0c o n f o c a l m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h a 63x p l a n -A p o c h r o m a t [ n u m e r i c a l a p e r t u r e ( N A ) = 1 . 4 ] o i l - i m -m e r s i o n l e n s .1 5 . D . G . J a y , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 5 , 5 4 5 4( 1 9 8 8 ) . A l l a n t i b o d i e s w e r e l a b e l e d w i t h MG t o t h esame r a t i o s ( 6 t o 9 d y e s p e r I g G m o l e c u l e ) .1 6 . S l i d i n g a c t i n f i l a m e n t a s s a y w a s d o n e e s s e n t i a l l y a sd e s c r i b e d 1 3 . B r i e f l y , m y o s i n - V ( 2 5 j i g / m l w a s p e r -f u s e d i n t o m o t i l i t y c h a m b e r s a n d a l l o w e d t o a b s o r bo n t o t h e n i t r o c e l l u l o s e c o v e r s l i p s f o r 1 0 m i n . A f t e rr i n s e s w i t h b l o c k i n g b u f f e r t o r e m o v e u n b o u n d m y o -s i n s , M G - l a b e l e d a n t i b o d i e s ( 4 7 . 5 p L g / m l ; m o l a r r a t i om y o s i n - V : l g G = 1 : 7 ) w e r e a d d e d t o t h e c h a m b e r a n di n c u b a t e d f o r 3 0 m i n . A f t e r t h e r e m o v a l o f u n b o u n da n t i b o d i e s , h a l f o f t h e m o t i l i t y c h a m b e r s w e r e m a r k e dw i t h i n k a n d s u b j e c t e d t o l a s e r i r r a d i a t i o n f o r 5 m i n .A f t e r t h e a d d i t i o n a n d e x a m i n a t i o n o f a c t i n f i l a m e n t s( r h o d a m i n e - p h a l l o i d i n F - a c t i n ; 1 2 n M ) i n t h e a b s e n c eo f A T P , s l i d i n g w a s i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f m o t i l i t yb u f f e r c o n t a i n i n g 2 mM A T P . T h e d e n s i t y o f b o u n da c t i n f i l a m e n t s wa s i n d i s t i n g u i s h a b l e b e t w e e n l a s e r -i r r a d i a t e d a n d u n i r r a d i a t e d a r e a s b e f o r e t h e i n i t i a t i o no f m o t i l i t y . A f t e r t h e a d d i t i o n o f A T P , m o s t o f t h e f i l a -m e n t s i n s i d e t h e i r r a d i a t e d a r e a w e r e r e l e a s e d i n t a c t ,a l t h o u g h a f e w e x h i b i t e d B r o w n i a n m o t i o n a n d d e -t a c h e d g r a d u a l l y . M o t i l i t y wa s r e c o r d e d w i t h a N i k onD i a p h o t 3 0 0 m i c r os c o p e e q u i p p e d w i t h e p i f l u o r e s -c e n c e o p t i c s ( P l a n A p o 1 0 O x NA 1 . 4 o i l - i m m e r s i o no b j e c t i v e ) a n d a D a g e - M T I S I T c a m e r a . T i m e - l a p s ei m a g e s w e r e d i g i t i z e d w i t h M e t a M o r p h i m a g e a c q u i -s i t i o n s o f t w a r e ( U n i v e r s a l I m a g es , P A ) a n d t h e n t r a n s -f e r r e d t o a n o p t i c a l l a s e r d i s c r e c o r d e r . M o t i l i t y a s s a y sw e r e d o n e a t 2 4 1 ' C . A y t t r i u m - a l u m i n u m - g a r n e t -N d Y A G - N d ) - p u m p e d d y e l a s e r m o d e l s GCR1 1a n d P D L 2 , S p e c t r a P h y s i c s ) wa s u s e d t o g e n e r a t e a6 2 0 - n m l i g h t a t a n e n e r g y o u t p u t o f 1 8 mJ p e r p u l s e 2 - m m - d i a m e t e r l a s e r s p o t ) .1 7 . C h i c k b r a i n m y o s i n - V w a s p u r i f i e d a n d M g 2 + A T P a s ea s s a y s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d 8 . S a m p l e s c o n -t a i n e d a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 4 . 5 , u g / m l m y o s i n - V ,8 6 0 , g / m l F - a c t i n , a n d 4 3 0 p g / m l c a l m o d u l i n . A l i -q u o t s w e r e i n c u b a t e d f o r 0 o r 7 m i n a t 3 7 C i n A T P a s eb u f f e r . F o r C A L I a s s a y s , m y o s i n - V wa s i n c u b a t e d w i t he i t h e r M G - a n t i - M V o r M G - l g G ( m o l a r r a t i o m y o s i n - V :I g G = 1 : 7 f o r 3 0 m i n a n d t h e n l a s e r - i r r a d i a t e d f o r 5m i n b e f o r e a s s e s s m e n t w i t h A T P a s e a s s a y 1 6 . L a s e ri r r a d i a t i o n o f p u r i f i e d m y o s i n - V i n s o l u t i o n h a d n o e f f e c to n t h e a c t i n - a c t i v a t e d M g 2 + - A T P a s e a c t i v i t y o f m y o -s i n - V ( 2 4 . 7 0 + 0 . 1 0 v e r s u s 2 7 . 1 5 0 . 7 5 w i t h o u t i r r a -d i a t i o n . F u r t h e r , C A L I d i d n o t i n h i b i t m y o s i n - V A T P a s ea c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f M G - a n t i - M V ( 1 6 . 8 0 2 . 0 0v e r s u s 1 6 . 9 5 2 . 9 5 w i t h o u t i r r a d i a t i o n o r M G - l g G( 1 7 . 9 5 + 2 . 9 5 v e r s u s 1 8 . 4 0 1 . 0 0 w i t h o u t i r r a d i a t i o n .R e s u l t s a r e t h e a v e r a g e s SEM f r o m t h r e e i n d e p e n -d e n t a s s a y s . A T P a s e a c t i v i t i e s a r e g i v e n i n A T P m o l e -c u l e s p e r m y o s i n - V h e a d p e r s e c o n d .1 8 . C h i c k D RG c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a t 3 7 C o n t h em i c r o s c o p e s t a g e w i t h a s t a g e i n c u b a t o r . M G - l a b e l e da n t i b o d i e s m i x e d w i t h f l u o r e s c e i n - d e x t r a n 3 m g / m l ;M o l e c u l a r P r o b e s ) w e r e m i c r o i n j e c t e d i n t o n e u r o n s .A f t e r a 3 0 - t o 6 0 - m i n i n c u b a t i o n , h e a l t h y n e u r o n sw e r e s e l e c t e d f o r m i c r o - C A L I e x p e r i m e n t s 1 1 . A s e -l e c t e d a r e a o f t h e g r o w t h c o n e wa s o b s e r v e d f o r 5m i n , s u b j e c t e d t o l a s e r i r r a d i a t i o n f o r 5 m i n , a n d f o l -l o w e d f o r a n a d d i t i o n a l 1 0 - m i n e x a m i n a t i o n w i t h aZ e i s s A x i o v e r t 1 0 m i c r o s c o p e w i t h p h a s e - c o n t r a s to p t i c s . T i m e - l a p s e i m a g e s ( o n e f r a m e e v e r y 1 5 s a n di m a g e e n h a n c e m e n t s w e r e f a c i l i t a t e d b y c u s t o m - w r i t -t e n s o f t w a r e a n d r e c o r d e d o n a n o p t i c a l l a s e r d i s cr e c o r d e r 1 1 . T h e l a s e r b e a m f o r m i c r o - C A L I wa sg e n e r a t e d w i t h a n i t r o g e n - p u m p e d d y e l a s e r ( m o d e lV S L - 3 3 7 , L a s e r S c i e n c e ) a t a n e n e r g y o u t p u t o f 3 0 , u Jp e r p u l s e 1 0 - p u m - d i a m e t e r l a s e r s p o t ) .1 9 . A . M . S y d o r , A . S u , F . - S . W a n g , A . X u , D . G . J a y , J .C e l l B i o l . , i n p r e s s .2 0 . B . B a r y l k o , M . C . W a g n e r , 0 . R e i z e s , J . P . A l b a n e s i ,P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 9 , 4 9 0 ( 1 9 9 2 ) ; M . C .

W a g n e r , B . B a r y l k o , J . P . A l b a n e s i , J . C e l l B i o l . 1 1 9 ,1 6 3 ( 1 9 9 2 ) .2 1 . M . L . S p r i n g e r , B . P a t t e r s o n , J . A . S p u d i c h , D e v e l -o p m e n t 1 2 0 , 2 6 5 1 ( 1 9 9 4 ) .2 2 . B . G o v i n d a n , R . B o w s e r , P . N o v i c k , J . C e l l B i o l . 1 2 8 ,1 0 5 5 ( 1 9 9 5 ) ; G . J u n g a n d J . H a m m e r , i b i d . 1 1 0 ,1 9 5 5 ( 1 9 9 0 ) ; J . A . M e r c e r , P . K . S e p e r a c k , M . C .S t r o b e l , N . G . C o p e l a n d , N . A . J e n k i n s , N a t u r e 3 4 9 ,7 0 9 ( 1 9 9 1 ) ; K . N o v a k a n d M . T i t u s , M o l . B i o l . C e l l 3 ,3 a ( 1 9 9 2 ) ; V . R . S i m o n , T . C . S w a y n e , L . A . P o n , J .C e l l B i o l . 1 3 0 , 3 4 5 ( 1 9 9 5 ) ; M . A . T i t u s , D . W e s s e l s , J .A . S p u d i c h , D . S o l l , M o l . B i o l . C e l l 4 , 2 3 3 ( 1 9 9 3 ) .2 3 . H . M . B u e t t n e r , R . N . P i t t m a n , J . K . I v i n s , D e v . B i o l .

1 6 3 , 4 0 7 ( 1 9 9 4 ) .2 4 . We t h a n k A . X u f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d J . P .A l b a n e s i ( U n i v e r s i t y o f T e x a s S o u t h w e s t e r n M e d i c a lC e n t e r , D a l l a s ) f o r p r o v i d i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e st o m y o s i n - l , 3 M 2 a n d M 3 ) . S u p p o r t e d i n p a r t b yN a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ( N I H ) g r a n t s N S - 2 9 0 0 7a n d N S - 3 4 6 9 9 t o D . G . J . ) a n d D K - 2 5 3 8 7 ( t oM . S . M . ) , t h e L u c i l l e P . M a r k e y C h a r i t a b l e T r u s t a n dK l i n g e n s t e i n f e l l o w s h i p t o D . G . J . ) , a n d t h e Pe wC h a r i t a b l e T r u s t t o J . S . W . ) . F . - S . W . a c k n o w l e d g e sr e c e i p t o f a p o s t d o c t o r a l f e l l o w s h i p f r o m t he N IH .1 5 J a n u a r y 1 9 9 6 ; a c c e p t e d 2 0 Ma y 1 9 9 6

m e n t s o f PTH a n d PTHrP 3 , 4 . T h eP T H / P T H r P r e c e p t o r mRNA i s e x p r e s s e di n t h e PTH t a r g e t o r g a n s , k i d n e y a n d b o n e 5 , 6 , a s w e l l a s i n o r g a n s i n w h i c h P T H r Pi s e x p r e s s e d , s u c h a s e x t r a e m b r y o n i c mem-b r a n e s a n d g r o w t h p l a t e s o f b o n e 7 , 8 .P h y s i o l o g i c s t u d i e s s u g g e s t t h a t o t h e r r e c e p -t o r s f o r PTH a n d P T H r P e x i s t ( 9 - 1 1 ) , o n eo f w h i c h h a s b e e n c l o n e d 1 2 .A t i m p l a n t a t i o n , t h e m u r i n e P T H / P T H r Pr e c e p t o r i s e x p r e s s e d i n p a r i e t a l e n d o d e r mi m m e d i a t e l y a d j a c e n t t o P T H r P - e x p r e s s i n gt r o p h o b l a s t i c c e l l s 7 , 1 3 . T r o p h o b l a s t i cP T H r P i n d u c e s t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p a -r i e t a l e n d o d e r m a n d t h e s u b s e q u e n t s y n t h e s i so f c o m p o n e n t s o f R e i c h e r t ' s m e m b r a n e i nv i t r o 1 3 . N e v e r t h e l e s s , m i c e h o m o z y g o u sf o r a t a r g e t e d d e l e t i o n o f P T H r P a r e n o r m a le a r l y i n d e v e l o p m e n t ( 1 4 ) a n d l a t e r m a n i f e s to n l y a b n o r m a l i t i e s i n e n d o c h o n d r a l b o n e d e -v e l o p m e n t , a n d t h e n d i e a t b i r t h .C h o n d r o c y t e s i n t h e g r o w t h r e g i o n s o fb o n e s o f P T H r P - / - ) m i c e u n d e r g o f e w e rr o u n d s o f p r o l i f e r a t i o n t h a n i n n o r m a l m i c ea n d d i f f e r e n t i a t e p r e m a t u r e l y i n t o h y p e r t r o -p h i c c h o n d r o c y t e s 1 4 , 1 5 . I n c o n t r a s t ,b o n e e x p l a n t s e x p o s e d t o P T H r P N H 2 -t e r m i n a l f r a g m e n t h a v e d e l a y e d d i f f e r e n t i -a t i o n o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s 1 6 .

SCIENCE * V O L . 2 7 3 * 2 AUGUST 1 9 9 6

P T H / P T H r P R e c e p t o r i n E a r l y D e v e l o p m e n t a n dI n d i a n H e d g e h o g - R e g u l a t e d B o n e G r o w t hB e a t e L a n s k e , A n d r e w C . K a r a p l i s , K a e c h o n g L e e , A r n e L u z ,A n d r e a V o r t k a m p , A l i s o n P i r r o , M a r c e l K a r p e r i e n ,L i b e r t H . K . D e f i z e , C h r y s t a l H o , R i c h a r d C . M u l l i g a n ,A b d u l - B a d i A b o u - S a m r a , H a r a l d J u p p n e r , G i n o V . S e g r e ,H e n r y M . K r o n e n b e r g *

T h e P T H / P T H r P r e c e p t o r b i n d s t o t w o l i g a n d s w i t h d i s t i n c t f u n c t i o n s : t h e c a l c i u m -r e g u l a t i n g h o r m o n e , p a r a t h y r o i d h o r m o n e ( P T H ) , a n d t h e p a r a c r i n e f a c t o r , P T H - r e l a t e dp r o t e i n ( P T H r P ) . E a c h l i g a n d , i n t u r n , i s l i k e l y t o a c t i v a t e more t h a n o n e r e c e p t o r . T h ef u n c t i o n s o f t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r w e r e i n v e s t i g a t e d b y d e l e t i o n o f t h e m u r i n e g e n eb y h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n . M o s t P T H / P T H r P r e c e p t o r ( - / - ) m u t a n t m i c e d i e d i nm i d - g e s t a t i o n , a p h e n o t y p e n o t o b s e r v e d i n P T H r P - / - m i c e , p e r h a p s b e c a u s e o f t h ee f f e c t s o f m a t e r n a l P T H r P . M i c e t h a t s u r v i v e d e x h i b i t e d a c c e l e r a t e d d i f f e r e n t i a t i o n o fc h o n d r o c y t e s i n b o n e , a n d t h e i r b o n e s , g r o w n i n e x p l a n t c u l t u r e , w e r e r e s i s t a n t t o t h ee f f e c t s o f P T H r P a n d S o n i c h e d g e h o g . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e P T H / P T H r P r e c e p t o rm e d i a t e s t h e e f f e c t s o f I n d i a n H e d g e h o g a n d P T H r P o n c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n .

4SO w p MMOM N M a

6 6 3

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F i g . 1 . A b n o r m a l i t i e s i n e n - A _ Bd o c h o n d r a l b o n e f o r m a t i o n . A L a t e r a l v i e w o f a n e n t i r es k e l e t o n a f t e r A l i z a r i n r e d S _ _ _ _ is t a i n i n g o f a w i l d - t y p e l e f ta n d a m u t a n t r i g h t P T H / AP T H r P r e c e p t o r e m b r y o a t bd a y 1 8 . 5 o f g e s t a t i o n . A b -n o r m a l i t i e s i n t h e m u t a n t a r ea p p a r e n t t hr o u g ho u t t h ew h o l e s k e l e t o n : f o r e x a m -p l e , r e d u c e d s i z e o f t h e t o - C Dt a l s k e l e t o n , domed s k u l l ,a n d f o r e s h o r t e n e d m a n d i -b l e . A r r o w u p p o i n t s t o t h ea b n o r m a l m i n e r a l i z a t i o n o ft h e s t e r n u m a n d r i b s a n d p bi n d i c a t e s t h e l a c k o f u n m i n -e r a l i z e d c a r t i l a g i n o u s t i s - hs u e ; a r r o w d o w n ) p o i n t s t ot h e s h o r t e n e d l o n g b o n e so f t h e m u ta n t . ( B ) C a u d a lv i e w on t h e b a s e o f t h e s k u l l w i l d t y p e , l e f t ; m u t a n t ,r i g h t . T h e A l i z a r i n r e d S s t a i n r e v e a l s e x c e s s i v e ; Mm i n e r a l i z a t i o n a n d t h e r e -f o r e a s y n c h o n d r o s i s b e - t w e e n t h e b a s i o c c i p i t a l( b o ) , e x o c c i p i t a l e o , a n db a s i s p h e n o i d b s . N a r r o w -i n g o f t h e f o r a m e n magnum f i n a n d m i n e r a l i z e d t y m -p a n i c b u l l a t b a r e a l s o a p -p a r e n t . H i s t o l o g i c a l e v a l u a -t i o n a t t h e l e v e l o f t h e f i f t hr i b o f a w i l d t y p e ( C ) a n dm u t a n t ( D ) a t d a y 1 8 . 5 o fg e s t a t i o n . T h e q u i e s c e n th y a l i n e c a r t i l a g e h c i n t h ew i l d t y p e i s s u r r o u n d e d b yp e r i c h o n d r i u m p c , w h e r e -a s t h e m u t a n t c a r t i l a g e i s c o m p o s e d o f h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s h y , s u r r o u n d e d b y p e r i c h o n d r i a lb o n e ( p b ) . E x a m i n a t i o n o f t h e g r o w t h p l a t e o f t h e p r o x i m a l t i b i a b y l i g h t m i c r o s c o p y r e v e a l e d m a r k e da n o m a l i e s i n t h e h o m o z y g o u s F c o m p a r e d w i t h t h e n o r m a l l i t t e r m a t e E , i n c l u d i n g a m a r k e dr e d u c t i o n i n t h e z o n e o f p r o l i f e r a t i n g c a r t i l a g e p a n d i r r e g u l a r a n d s h o r t e r c o l u m n s o f p r o l i f e r a t i n gc h o n d r o c y t e s .T a b l e 1 . S u r v i v a l o f h o m o z y g o u s o f f s p r i n g - / - i n d i f f e r e n t g e n e t i c b a c k g r o u n d s . H e t e r o z y g o u s m i c eo f t h e r e s p e c t i v e s t r a i n w e r e i n t e r b r e d t o o b t a i n m i c e h o m o z y g o u s f o r t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r g e n ed e l e t i o n . C e s a r e a n s e c t i o n a t t h e i n d i c a t e d d a y o f g e s t a t i o n was c a r r i e d o u t , a n d g e n o t y p i n g o f t h ee m b r y o s wa s p e r f o r m e d w i t h S o u t h e r n D N A ) b l o t a n a l y s i s . F r o m t h e f i r s t 1 0 l i t t e r s o f e a c h g r o u p , a l le m b r y o s w e r e a n a l y z e d t o c o n f i r m t h e e x p e c t e d p a t t e r n o f M e n d e l i a n i n h e r i t a n c e f o r w i l d - t y p e a n dh e t e r o z y g o u s m i c e . B e c a u s e s u r v i v a l o f w i l d - t y p e a n d h e t e r o z y g o u s a n i m a l s wa s s i m i l a r , we l i m i t e d o u rs t u d i e s t o t h e h o m o z y g o u s m u t a n t s . N o n i n f o r m a t i v e ( N o n - i n f . ) c a s e s r e p r e s e n t d e g e n e r a t e d e m b r y o st h a t y i e l d e d i n s u f f i c i e n t D NA f o r a n a l y s i s .

G e n e t i c D a y s o f N o . i n T o t a l A l i v e D e a d N o n - i n f .b a c k g r o u n d g e s t a t i o n l i t t e r n o . o f ( - ) - - ) ( )e m b r y o s C 5 7 B U 6 - 1 2 9 / S v J E 9 . 5 1 9 1 5 3 3 3 2 2 3 2 1 2 8C 5 7 B U 6 - 1 2 9 / S v J E 1 2 . 5 1 0 9 3 9 ( 1 0 ) 5 5 1 1 1 2C 5 7 B L / 6 - 1 2 9 / S v J E 1 4 . 5 1 0 6 9 3 4 8 ( 1 2 ) 4 6C 5 7 B L U 6 - 1 2 9 / S v J E 1 8 . 5 2 0 1 2 4 4 3 4 3 1 0 8C57BU6 ( 2 n d E 1 8 . 5 2 2 1 6 8 4 2 4 2 0 0b a c k c r o s s )M F - 1 ( 3 r d E 1 8 . 5 4 0 3 7 1 9 2 1 9 4 6 2b a c k c r o s s )B l a c k S w i s s 1 s t E 1 8 . 5 5 6 4 3 4 5 1 ( 1 2 ) 2 5 6 9 2b a c k c r o s s )

T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a tPTHrP d e l a y s c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n ,t h e r e b y a l l o w i n g m o r e c h o n d r o c y t e p r o l i f -e r a t i o n . T h e a c c o m p a n y i n g r e s e a r c h a r t i -c l e ( 1 6 ) d e m o n s t r a t e s t h a t I n d i a n h e d g e -h o g ( I h h ) , m a d e b y p r e h y p e r t r o p h i c a n dh y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s , a l s o d e l a y s t h ed i f f e r e n t i a t i o n o f e a r l y h y p e r t r o p h i c c h o n -d r o c y t e s i n a n e g a t i v e f e e d b a c k l o o p . I h hs t i m u l a t e s t h e s y n t h e s i s o f P T H r P i n p e r i -c h o n d r i a l c e l l s n e a r t h e e n d s o f l o n g b o n e s .T h e P T H / P T H r P r e c e p t o r i s e x p r e s s e d i np r e h y p e r t r o p h i c a n d h y p e r t r o p h i c c h o n -d r o c y t e s a n d , t o a l e s s e r e x t e n t , i n p r o l i f -e r a t i n g c h o n d r o c y t e s a n d i s t h u s a c a n d i -d a t e m e d i a t o r o f t h e PTHrP s i g n a l i n t h ef e e d b a c k l o o p t h a t c o n t r o l s t h e r a t e a n ds i t e s o f c h o n d r o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n ( 8 ) . T oe s t a b l i s h t h e p h y s i o l o g i c r o l e o f t h e c l o n e dP T H / P T H r P r e c e p t o r i n t h e g r o w t h p l a t ea n d t o f u r t h e r e x p l o r e t h e r o l e o f PTHrP i ne a r l y d e v e l o p m e n t , w e e x a m i n e d t h e p h e -n o t y p e s o f m i c e h o m o z y g o u s f o r t h e a b l a -t i o n o f t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r g e n e .

G e n e t a r g e t i n g i n e m b r y o n i c s t e m ( E S )c e l l s w a s u s e d t o d e l e t e e x o n s E 2 t h r o u g h T ,w h i c h e n c o d e m o s t o f t h e P T H / P T H r P r e -c e p t o r ( 1 7 , 1 8 . M i c e h e t e r o z y g o u s f o r t h eP T H / P T H r P r e c e p t o r g e n e d e l e t i o n g r e wn o r m a l l y a n d w e r e f e r t i l e . M i c e h o m o z y g o u sf o r t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r g e n e d e l e t i o nw e r e s m a l l e r t h a n n o r m a l f r o m a t l e a s t e m -b r y o n i c d a y 9 . 5 ( E 9 . 5 ) o f f e t a l l i f e ( 1 9 ) . H i s -t o l o g i c e v a l u a t i o n a t E 9 . 5 a n d E 1 2 . 5 r e v e a l e dm o r p h o l o g i c a l l y n o r m a l d e v e l o p m e n t e x c e p tf o r p r o p o r t i o n a l d i m i n u t i o n o f o r g a n s i z e( 1 9 ) . A l t h o u g h t h e n u m b e r o f P T H / P T H r Pr e c e p t o r ( - / - ) f e t u s e s m e t M e n d e l i a n e x -p e c t a t i o n s a t E 9 . 5 , o n l y 1 0 o f t h e l i v i n gf e t u s e s w e r e P T H / P T H r P r e c e p t o r ( - / - ) a tE 1 2 . 5 , a n d a l m o s t a l l t h e s e f e t u s e s h a d d i e db y E 1 4 . 5 ( T a b l e 1 . B e c a u s e t h e o n l y s i t e s o fs y n t h e s i s o f P T H r P a n d t h e P T H / P T H r Pr e c e p t o r b e f o r e E 9 . 5 a r e i n e x t r a e m b r y o n i cm e m b r a n e s , R e i c h e r t ' s m e m b r a n e a n d t h ep a r i e t a l e n d o d e r m w e r e e x a m i n e d 7 , 1 3 ,b u t n o a b n o r m a l i t i e s i n t h e m o r p h o l o g y o fR e i c h e r t ' s m e m b r a n e o r o x - l a m i n i n s t a i n i n gw e r e n o t e d ( 1 9 , 2 0 ) . T h u s , t h e s m a l l s i z e a n de a r l y d e a t h o f t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r ( - /- ) a n i m a l s r e m a i n s u n e x p l a i n e d a n d c o n -t r a s t s w i t h t h e n o r m a l p h e n o t y p e o f P T H r P - / - ) m i c e d u r i n g e a r l y g e s t a t i o n . M a t e r n a lP T H r P - s y n t h e s i z e d i n l a r g e a m o u n t s b ym a t e r n a l c e l l s i n t h e d e c i d u a , l o c a t e d i nt h e i n n e r z o n e d i r e c t l y a d j a c e n t t o t h ee m b r y o ( 2 1 , 2 2 ) - m a y c o m p l e m e n t t h ea b s e n c e o f f e t a l PTHrP i n t h e PTHrP - /- ) m i c e b u t n o t t h e a b s e n c e o f t h e f e t a lP T H / P T H r P r e c e p t o r .T o s e a r c h f o r g e n e t i c b a c k g r o u n d s t h a tm i g h t a l l o w e v a l u a t i o n o f o l d e r f e t u s e s , w eb a c k c r o s s e d h e t e r o z y g o u s m i c e o f C 5 7 B L /6 - 1 2 9 / S v j b a c k g r o u n d i n t o d i f f e r e n t m o u s es t r a i n s . O n l y c r o s s e s w i t h t h e B l a c k S w i s s

SCIENCE * V O L . 2 7 3 * 2 AUGUST 1 9 9 66 4

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s t r a i n ( T a b l e 1 i n c r e a s e d t h e s u r v i v a l o fP T H / P T H r P r e c e p t o r - / - ) e m b r y o s u n t i lb i r t h . A l t h o u g h t h e B l a c k S w i s s b a c k g r o u n dp a r t i a l l y s u p p r e s s e d t h e e a r l y d e a t h p h e n o -t y p e , i n a l l g e n e t i c b a c k g r o u n d s t h e P T H /P T H r P r e c e p t o r - / - ) m i c e w e r e p r o p o r -t i o n a l l y s m a l l e r t h a n n o r m a l . I f a l l o w e d t oc o m p l e t e g e s t a t i o n , a l l P T H / P T H r P r e c e p t o r - / - ) a n i m a l s d i e d w i t h i n a f e w m i n u t e s o fb i r t h . T h e a p p e a r a n c e o f t h e P T H / P T H r Pr e c e p t o r - / - ) a n i m a l s a t E 1 8 . 5 o f g e s t a t i o nw a s s i m i l a r t o t h a t o f t h e P T H r P - / - )m i c e , i n t h a t t h e y e x h i b i t e d a d o m e d s k u l l ,s h o r t s n o u t a n d m a n d i b l e , p r o t r u d i n g t o n g u e ,a n d d i s p r o p o r t i o n a t e l y s h o r t l i m b s F i g . I A )( 1 4 ) . A l i z a r i n R e d S s t a i n i n g ( 2 3 ) o f s k e l e -t o n s o f P T H / P T H r P r e c e p t o r - / - ) m i c er e v e a l e d i n a p p r o p r i a t e l y a c c e l e r a t e d m i n e r a l -i z a t i o n e x c l u s i v e l y o f b o n e s f o r m e d b y e n d o -c h o n d r a l r e p l a c e m e n t F i g . 1 , A a n d B ) .H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s o f 1 8 . 5 - d a y -o l d P T H / P T H r P r e c e p t o r - / - ) f e t u s e s( 2 4 ) r e v e a l e d a p h e n o t y p e s i m i l a r t o t h a to b s e r v e d i n t h e PTHrP - / - ) a n i m a l s , i nt h a t t h e h y a l i n e c a r t i l a g e i n t h e r i b s a d j a -c e n t t o t h e s t e r n u m w a s d i f f e r e n t i a t e d i n t oh y p e r t r o p h i c c a r t i l a g e s u r r o u n d e d b y p r e -m a t u r e l y m i n e r a l i z e d o s t e o i d m a t r i x a n d a c -t i v e o s t e o b l a s t s F i g . 1 , C a n d D ) ( 1 4 ) . T h eg r o w t h p l a t e o f t h e p r o x i m a l t i b i a , l i k et h a t o f t h e PTHrP - / - ) f e t u s e s , r e v e a l e di r r e g u l a r a n d m a r k e d l y s h o r t c o l u m n s o fp r o l i f e r a t i n g c h o n d r o c y t e s ( F i g . 1 , E a n dF ) . T h e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e p h e n o -t y p e s o f PTHrP - / - ) a n d P T H / P T H r Pr e c e p t o r - / - ) m i c e s u g g e s t t h a t t h eP T H / P T H r P r e c e p t o r m e d i a t e s t h e a c t i o n so f PTHrP o n c h o n d r o c y t e s . T h i s h y p o t h -e s i s i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e p r e s e n t a -t i o n o f h u m a n s w i t h J a n s e n o s t e o c h o n d r o -d y s t r o p h y . T h e s e p a t i e n t s , w i t h a c t i v a t i n gp o i n t m u t a t i o n s o f t h e P T H / P T H r P r e c e p -t o r , e x h i b i t g r o w t h p l a t e a b n o r m a l i t i e ss i m i l a r t o t h o s e s e e n i n t h e m u r i n e g r o w t hp l a t e e x p l a n t s e x p o s e d t o e x c e s s PTHrP( 2 5 ) . O u r r e s u l t s s u p p o r t t h e h y p o t h e s i st h a t t h i s p a t h o l o g y r e f l e c t s i n a p p r o p r i a t eP T H r P - l i k e , b u t l i g a n d - i n d e p e n d e n t , a c t i -v a t i o n o f t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r .I n t h e a c c o m p a n y i n g r e s e a r c h a r t i c l e( 1 6 ) , I h h a n d P T H r P a r e s h o w n t o p a r t i c i -p a t e i n a f e e d b a c k l o o p t h a t c o n t r o l s t h e p a c eo f d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e c h i c k e n a n d m u r i n eg r o w t h p l a t e s . T o v e r i f y t h a t t h e P T H /P T H r P r e c e p t o r , w h i c h i s e x p r e s s e d i n a r e -g i o n t h a t o v e r l a p s t h a t o f I h h e x p r e s s i o n F i g .2 , A t o D ) 1 6 , m e d i a t e s t h e a c t i o n s o fP T H r P i n t h i s f e e d b a c k l o o p , w e t r e a t e d l o w -e r l i m b e x p l a n t s f r o m P T H / P T H r P r e c e p t o r - / - ) E 1 6 . 5 f e t a l m i c e w i t h P T H r P , w i t hp a r t i a l l y p u r i f i e d S o n i c h e l g e h o g ( S h h ) ( t h ea c t i o n s o f w h i c h r e s e m b l e t h o s e o f I h h o n t h eg r o w t h p l a t e , o r w i t h c o n t r o l m e d i a ( 2 6 ) .T r e a t m e n t w i t h c o n t r o l m e d i a s h o w e d t h a tc h o n d r o c y t e s i n P T H / P T H r P r e c e p t o r ( - /

- ) l i m b s b e c a m e h y p e r t r o p h i c m o r e r a p i d l yi n c u l t u r e a n d e x p r e s s e d m o r e t y p e X c o l l a g -e n m R N A t h a n t h o s e i n n o r m a l l i m b s F i g .3 , A a n d D ) , c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i st h a t t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r r e g u l a t e s t h er a t e o f h y p e r t r o p h i c c o n v e r s i o n . W h e r e a s i nn o r m a l l i m b s , a d d i t i o n o f e i t h e r P T H r P o rS h h r e s u l t e d i n e x p a n s i o n o f t h e l e s s d i f f e r -e n t i a t e d c h o n d r o c y t e p o p u l a t i o n a n d s u p -p r e s s i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n i n t o h y p e r t r o p h i c ,t y p e X c o l l a g e n - p r o d u c i n g c h o n d r o c y t e s F i g . 3 , B a n d C ) , n e i t h e r P T H r P n o r S h hh a d a n y e f f e c t o n l i m b s f r o m P T H / P T H r PF i g . 2 . l h h m R N A e x p r e s - As i o n i n t h e h u m e r u s o f E l 8 . 5mouse e m b r y o s . I n b o t hw i l d - t y p e A , b r i g h t f i e l d ; B ,d a r k f i e l d a n d m u t a n t P T H /P T H r P r e c e p t o r - / - ) f e t u s -e s ( C , b r i g h t f i e l d ; D , d a r kf i e l d , l h h m R N A i s e x -p r e s s e d i n p r e h y p e r t r o p h i ca n d h y p e r t r o p h i c c h o n d r o -c y t e s , i n a m a n n e r s i m i l a r t oi t s e x p r e s s i o n i n c h i c k e nl i m b s 1 6 . T h i s p a t t e r n o fe x p r e s s i o n i s u n c h a n g e d i nt h e P T H / P T H r P r e c e p t o r - I - ) e m b r y o s , a l t h o u g h Ct h e c e l l s e x p r e s s i n g l h h a r e n e ar e r t he a r t i c u l a r e n d o f 9 ,t h e b o n e i n m u t a n t t h a n i n

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g l l 4 m *f o u n d i n c e l l s m u c h c l o s e r t o t h e a r t i c u l a rs u r f a c e t h a n n o r m a l . We c o n c l u d e t h a t I h h ,p r o d u c e d b y d i f f e r e n t i a t i n g c h o n d r o c y t e s ,d e l a y s t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f g r o w t h p l a t ec h o n d r o c y t e s b y s t i m u l a t i n g t h e s y n t h e s i so f p e r i c h o n d r i a l P T H r P , w h i c h t h e n a c t s o nt h e P T H / P T H r P r e c e p t o r o n c h o n d r o c y t e s .

R E F E R EN C E S AN D NOTES1 . J . P o t t s J r . e t a l . , i n E n d o c r i n o l o g y , L . D e G r o o t , E d .( S a u n d e r s , P h i l a d e l p h i a , 1 9 9 5 ) , v o l . 2 , p p . 9 2 0 - 9 6 6 .2 . A . E . B r o a d u s a n d A . F . S t e w a r t , i n T h e P a r a t h y r o i d s .B a s i c a n d C l i n i c a l C o n c e p t s , J . P . B i l e z i k i a n , M . A .L e v i n e , R . M a r c u s , E d s . ( R a v e n , New Y o r k , 1 9 9 4 ) ,p p . 2 5 9 - 2 9 4 .3 . H . J u p p n e r e t a l . , S c i e n c e 2 5 4 , 1 0 2 4 ( 1 9 9 1 ) .4 . A . B . A b o u - S a m r a e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U . S . A . 8 9 , 2 7 3 2 ( 1 9 9 2 ) .5 . P . U r e n a e t a l . , E n d o c r i n o l o g y 1 3 3 , 6 1 7 ( 1 9 9 3 ) .6 . J . T i a n , M . S m o r g o r z e w s k i , L . K e d e s , S . G . M a s s r y ,A m . J . N e p h r o l . 1 3 , 2 1 0 ( 1 9 9 3 ) .7 . M . K a r p e r i e n e t a l . , M e c h . D e v . 4 7 , 2 9 ( 1 9 9 4 ) .8 . K . L e e , J . D . D e e d s , G . V . S e g r e , E n d o c r i n o l o g y 1 3 6 ,4 5 3 ( 1 9 9 5 ) .9 . J . J . O r l o f f e t a l , A m . J . P h y s i o l . 2 6 2 , E 5 9 9 ( 1 9 9 2 ) .1 0 . N . I n o m a t a , M . A k i y a m a , N . K u b o t a , H . J u p p n e r ,E n d o c r i n o l o g y 1 3 6 , 4 7 3 2 ( 1 9 9 5 ) .

1 1 . S . F u k a y a m a , A . H . T a s h j i a n J r . , J . N . D a v i s , J . C .C h i s h o l m , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 2 , 1 0 1 8 2 1 9 9 5 .1 2 . T . B . U s d i n , C . G r u b e r , T . I B o n n e r , J . B i o l . C h e m .2 7 0 , 1 5 4 5 5 ( 1 9 9 5 ) .1 3 . A . v a n d e S t o l p e e t a l . , J . C e l l B i o l . 1 2 0 , 2 3 5 ( 1 9 9 3 ) .1 4 . A . C . K a r a p l i s e t a l . , G e n e s D e v . 8 , 2 7 7 ( 1 9 9 4 ) .1 5 . N . A m i z u k a , H . W a r s h a w s k y , J . E . H e n d e r s o n , D .G o l t z m a n , A . C . K a r a p l i s , J . C e l l B i o l . 1 2 6 , 1 6 1 1( 1 9 9 4 ) .1 6 . A . V o r t k a m p , K . L e e , B . L a n s k e , G . V . S e g r e , H . M .K r o n e n b e r g , C . T a b i n , S c i e n c e 2 7 3 , X X X ( 1 9 9 6 ) .1 7 . M . R . C a p e c c h i , i b i d . 2 4 4 , 1 2 8 8 ( 1 9 8 9 ) .1 8 . Tw o g e n o m i c c l o n e s ( X - 8 a n d X - 1 5 ) w e r e i s o l a t e df r o m a X - D A S H I 1 2 9 / S v J mouse l i v e r g e n o m i c l i b r a r y 1 X 1 0 7 p l a q u e - f o r m i n g u n i t s p e r m i l l i l i t e r w i t h t h ec o d i n g s e q u e n c e o f t h e r a t P T H / P T H r P r e c e p t o r a s ap r o b e 4 , 2 7 ) . F o r c o n s t r u c t i o n o f t h e t a r g e t i n g v e c t o r ,a 4 . 5 - k b Ba m H I f r a g m e n t c o n t a i n i n g e x o n E l o f t h eP T H / P T H r P r e c e p t o r g e n e wa s u s e d a s t h e 5 ' f l a n k -i n g r e g i o n a n d s u b c l o n e d b y b l u n t e n d l i g a t i o n i n t o as i m i l a r l y t r e a t e d X h o s i t e i n t h e p P N T p l a s m i d 1 4 . A5 . 6 - k b E c o R I f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e 3 ' u n t r a n s l a t e dr e g i o n o f t h e P T H / P T H r P r e c e p t o r g e n e , c l o n e d i n t ot h e E c o R I p o l y l i n k e r s i t e o f p P N T , wa s u s e d a s t h e 3 'f l a n k i n g r e g i o n . T h e r e s u l t i n g t a r g e t i n g v e c t o r wa s l i n -e a n z e d a t t h e u n i q u e N o t s i t e i n t h e p P N T b a c k b o n ef o r e l e c t r o p o r a t i o n o f E S c e l l s . D o u b l e s e l e c t i o n wa sc a r r i e d o u t , a n d r e s i s t a n t E S c l o n e s w e r e a n a l y z e d b yS o u t h e m ( D N A ) b l o t a n a l y s e s w i t h a n e x t e r n a l i n t r o n i c0 . 9 - k b S a c l - X h o f r a g m e n t a t t h e 5 ' e n d o f t h e g e n e .P o s i t i v e c l o n e s ( 1 2 ) w e r e i n j e c t e d i n t o r e c i p i e n tb l a s t o c y s t s t o g e n e r a t e c h i m e r a s a s d e s c r i b e d 2 8 .P r o g e n y o f t w o i n d e p e n d e n t c l o n e s y i e l d e d t h e i d e n -t i c a l p h e n o t y p e . A l l a n i m a l e x p e r m e n t a t i o n f o l l o w e di n s t i t u t i o n a l g u i d e l i n e s .1 9 . B . L a n s k e e t a l . , d a t a n o t s h o w n .2 0 . T w e n t y - f i v e e m b r y o s f r o m E 6 . 5 t o E 9 . 5 w e r e e x a m -i n e d h i s t o l o g i c a l l y a n d h a d n o r m a l a p p e a r i n gR e i c h e r t ' s m e m b r a n e . F i v e E 9 . 5 e m b r y o s w e r e e x -a m i n e d b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n f o r P T H / P T H r P r e c e p -t o r mRNA 2 9 . T h e h y b r i d i z a t i o n s i g n a l wa s s t r o n g i nf o u r e m b r y o s b u t wa s c o m p l e t e l y a b s e n t f r o m o n e , ap r e s u m e d P T H / P T H r P ( - / - ) f e t u s . I m m u n o h i s t o -c h e m i c a l s t a i n i n g wa s c a r r i e d o u t on p a r a f f i n s e c t i o n sb y s t a n d a r d t e c h n i q u e s . H y b r i d i z a t i o n was d o n e w i t ha r a b b i t a n t i b o d y t o a - l a m i n i n d i l u t i o n , 1 / 3 0 0 ; G i b c o ) .T o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y , we u s e d a s e c o n d a n t i -b o d y s p e c i f i c f o r t h e f i r s t o n e ( s w i n e a n t i b o d y t o r a b b i ti m m u n o g l o b u l i n G c o m p l e x ; D A K O ) . V i s u a l i z a t i o n o ft h i s c o m p l e x wa s o b t a i n e d b y h y b r i d i z a t i o n w i t h t h eA B C o m p l e x ( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ; D A K O ) .2 1 . M . K a r p e r i e n , P . L a n s e r , S . W . d e L a a t , J . B o o n s t r a ,L . H . K . D e f i z e , I n t . J . D e v . B i o l . , i n p r e s s .

2 2 . F . B e c k , J . T u c c i , P . V . S e n i o r , J . R e p r o d . F e r t i l . 9 9 ,3 4 3 ( 1 9 9 3 ) .2 3 . M . M c L e o d , T e r a t o l o g y 2 2 , 2 9 9 ( 1 9 8 0 ) .2 4 . F r e s h t i s s u e s w e r e o b t a i n e d b y c e s a r e a n s e c t i o n sf r o m f e t u s e s d e r i v e d f r o m h e t e r o z y g o u s i n t e r b r e e d -i n g a t d a y 1 8 . 5 o f g e s t a t i o n . F e t u s e s w e r e f i x e d i n10 f o r m a l i n - p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e P B S ) p H7 . 2 ) a n d s u b s e q u e n t l y d e c a l c i f i e d i n n e u t r a l 40E D T A . V a r i o u s p a r t s o f t h e s k e l e t o n w e r e e m b e d d e di n p a r a f f i n , a n d 5 - t o 1 0 - p u m - t h i c k s e c t i o n s w e r es t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n .2 5 . E . S c h i p a n i , K . K r u s e , H . J O p p n e r , S c i e n c e 2 6 8 , 9 8( 1 9 9 5 ) .2 6 . H i n d l i m b s o f E l 6 . 5 f e t u s e s w e r e s e v e r e d a t m i d -f e m u r , s t r i p p e d o f s k i n , a n d t he n p l ac e d o n a f i l t e rp a p e r ( p o r e s i z e , 0 . 8 , u r m o n a w i r e m e s h i n a F a l c o no r g a n c u l t u r e d i s h , a n d 1 m l o f B G J b m e d i u m ( G i b c oB R L ) w a s a d d e d . T h e h i n d l i m b s , w h i c h l a y a t t h ea i r - f l u i d i n t e r f a c e , w e r e c u l t u r e d a t 3 7 C i n a h u m i d i -f i e d a t m o s p h e r e o f 95 a i r - 5 C 0 2 w i t h d a i l y c h a n g -e s o f m e d i u m . T h e h i n d l i m b s w e r e t r e a t e d w i t h e i t h e r1 0 - 7 M h u m a n P T H r P ( 1 - 3 4 ) , r e c o m b i n a n t m u r i n eS h h 5 , u g / m l ) 1 6 , o r v e h i c l e B G J b m e d i u m - 0 . 1

b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) a l o n e f r o m d a y 2 f o r 4 d a y s .T h e s a m p l e s w e re n e v e r e x p o s e d t o s e r u m . A t t h et e r m i n a t i o n o f c u l t u r e , t h e h i n d l i m b s w e r e f i x e d i n10 f o r m a l i n - P B S , p a r a f f i n - e m b e d d e d , a n d c u t i ns e r i a l s e c t i o n s .2 7 . X . F . K o n g e t a l . , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun.2 0 0 , 1 2 9 0 1 9 9 4 ) .2 8 . A . B r a d l e y , i n T e r a t o c a r c i n o m a s a n d E m b r y o n i cS t e m C e l l s : A P r a c t i c a l A p p r o a c h , E . R o b e r t s o n , E d .( I R L , W a s h i n g t o n , D C , 1 9 8 7 ) , p p . 1 1 3 - 1 5 2 .2 9 . C o m p l e m e n t a r y 3 5 S - l a b e l e d R NA p r o b e s w e r e t r a n -s c r i b e d f r o m t h e r a t P T H / P T H r P r e c e p t o r cDNA 4a n d f r o m t h e h u m a n l h h cDNA ( 1 6 ) . I n s i t u h y b r i d i z a -t i o n w a s d o n e a s d e sc r ib e d 8 .3 0 . We t h a n k C . T a b i n f o r v a l u a b l e c o l l a b o r a t i o n a n d h e l p -f u l r e a d i n g o f t h e m a n u s c r i p t , T . D o e t s c h m a n n f o rr e a g e n t s , E . S a m s o n f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e w i t hh i s t o l o g y , a n d M . M a n n s t a d t f o r h e l p a n d t e c h n i c a le x p e r t i s e . S u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t hg r a n t s DK 4 7 0 3 8 a n d D K 4 7 2 3 7 . B . L . w a s s u p p o r t e di n p a r t b y a f e l l o w s h i p o f t h e M a x - K a d e F o u n d a t i o n .1 0 A p r i l 1 9 9 6 ; a c c e p t e d 2 0 J u n e 1 9 9 6

E m e r g e n c e o f P r e f e r r e d S t r u c t u r e s i n aS i m p l e M o d e l o f P r o t e i n F o l d i n gHao L i , R o b e r t H e l l i n g , * Chao T a n g , t N e d W i n g r e e n

P r o t e i n s t r u c t u r e s i n n a t u r e o f t e n e x h i b i t a h i g h d e g r e e o f r e g u l a r i t y f o r e x a m p l e , sec-o n d a r y s t r u c t u r e a n d t e r t i a r y s y m m e t r i e s ) t h a t i s a b s e n t f r o m r a n d o m compact c o n f o r -m a t i o n s . W i t h t h e us e o f a s i m p l e l a t t i c e m o d e l o f p r o t e i n f o l d i n g , i t was d e m o n s t r a t e dt h a t s t r u c t u r a l r e g u l a r i t i e s are r e l a t e d t o h i g h d e s i g n a b i l i t y a n d e v o l u t i o n a r y s t a b i l i t y .T h e d e s i g n a b i l i t y o f e a c h compact s t r u c t u r e i s m e a s u r e d b y t h e n u m b e r o f sequencest h a t c a n d e s i g n t h e s t r u c t u r e - t h a t i s , seq uenc e s t h a t p o s s e s s t h e s t r u c t u r e a s t h e i rn o n d e g e n e r a t e g r o u n d s t a t e . Compact s t r u c t u r e s d i f f e r m a r k e d l y i n t e r m s o f t h e i r d e -s i g n a b i l i t y ; h i g h l y d e s i g n a b l e s t r u c t u r e s emerg e w i t h a n u m b e r o f a s s o c i a t e d s equence smuch l a r g e r t h a n t h e average. T h e s e h i g h l y d e s i g n a b l e s t r u c t u r e s p o s s e s s p r o t e i n l i k es e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d even t e r t i a r y s y m m e t r i e s . I n a d d i t i o n , t h e y are t h e r m o d y n a m -i c a l l y m o r e s t a b l e t h a n o t h e r s t r u c t u r e s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t p r o t e i n s t r u c t u r e s ares e l e c t e d i n n a t u r e b e c a u s e t h e y are r e a d i l y d e s i g n e d a n d s t a b l e a g a i n s t m u t a ti o n s, a n dt h a t s u c h a s e l e c t i o n s i m u l t a n e o u s l y l e a d s t o t h e r m o d y n a m i c s t a b i l i t y .

N a t u r a l p r o t e i n s f o l d i n t o s p e c i f i c c o m p a c ts t r u c t u r e s d e s p i t e t h e h u g e n u m b e r o f p o s -s i b l e c o n f i g u r a t i o n s 1 . F o r m o s t s i n g l e -d o m a i n p r o t e i n s , t h e i n f o r m a t i o n c o d e d i nt h e a m i n o a c i d s e q u e n c e i s s u f f i c i e n t t od e t e r m i n e t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l ( 3 D ) f o l d -e d s t r u c t u r e , w h i c h i s t h e m i n i m u m f r e e -e n e r g y s t r u c t u r e 2 . P r o t e i n s e q u e n c e sm u s t u n d e r g o s e l e c t i o n s o t h a t t h e y f o l di n t o u n i q u e 3D s t r u c t u r e s . B e c a u s e f o l d i n gm a p s s e q u e n c e s t o s t r u c t u r e s , i t i s r e l e v a n tt o a s k w h e t h e r s e l e c t i o n p r i n c i p l e s a l s o a p -p l y t o s t r u c t u r e s t h a t h a v e e v o l v e d i n n a -t u r e . P r o t e i n s t r u c t u r e s o f t e n e x h i b i t a h i g hd e g r e e o f r e g u l a r i t y - f o r e x a m p l e , s e c o n d -a r y s t r u c t u r e s s u c h a s o t h e l i c e s a n d I s h e e t sa n d t e r t i a r y s y m m e t r i e s - t h a t i s a b s e n tNE C R e s e a r c h I n s t i t u t e , 4 I n d e p e n d e n c e W a y , P r i n c e -t o n , N J 0 8 5 4 0 , U S A .* P r e s e n t a d d r e s s : S e c o n d I n s t i t u t e f o r T h e o r e t i c a l P h y s -i c s , D E S Y / U n i v e r s i t y o f H a m b u r g , H a m b u r g , G e r m a n y .t T o whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d . E - m a i l :t a n g @ r e s e a r c h . n j . n e c . c o m

f r o m r a n d o m c o m p a c t s t r u c t u r e s . W h a t i st h e o r i g i n o f t h e s e r e g u l a r i t i e s ? D o e s n a t u r es e l e c t s p e c i a l s t r u c t u r e s f o r d e s i g n ? W h a ta r e t h e u n d e r l y i n g p r i n c i p l e s t h a t g o v e r nt h e s e l e c t i o n o f s t r u c t u r e s ?H e r e w e d e s c r i b e r e s u l t s f r o m a s i m p l em o d e l o f p r o t e i n f o l d i n g t h a t s u g g e s t s o m ea n s w e r s t o t h e s e q u e s t i o n s . We f o c u s o n t h ep r o p e r t i e s o f e a c h i n d i v i d u a l c o m p a c t s t r u c -t u r e b y d e t e r m i n i n g t h e s e q u e n c e s t h a th a v e t h e g i v e n s t r u c t u r e a s t h e i r n o n d e g e n -e r a t e g r o u n d s t a t e . We s h o w t h a t t h e n u m -b e r o f s e q u e n c e s ( N S ) a s s o c i a t e d w i t h ag i v e n s t r u c t u r e ( S ) d i f f e r s f r o m s t r u c t u r e t os t r u c t u r e a n d t h a t p r e f e r r e d s t r u c t u r e se m e r g e w i t h N s v a l u e s m u c h l a r g e r t h a nt h e a v e r a g e . T h e s e p r e f e r r e d s t r u c t u r e s a r e p r o t e i n l i k e , w i t h s e c o n d a r y s t r u c t u r e s a n ds y m m e t r i e s , a n d a r e t h e r m o d y n a m i c a l l ym o r e s t a b l e t h a n o t h e r s t r u c t u r e s .O u r r e s u l t s a r e d e r i v e d f r o m a m i n i m a lm o d e l o f p r o t e i n f o l d i n g , w h i c h w e b e l i e v ec a p t u r e s t h e e s s e n t i a l c o m p o n e n t s o f t h eS C I E N C E * V O L . 2 7 3 * 2 AUGUST 1 9 9 66 6