Scienze forensi Genetica forense

Balistica forense

Tossicologia forense

Entomologia forense

Botanica forense

Antropologia forense

Genetica Forense: è l'applicazione di tecniche e metodologie molecolari nel contesto legale della genetica , solitamente volta all'identificazione personale.

Casi criminali: indagato/vittima-traccia

Test di paternità: paternità controversa

Immigrazione: relazioni familiari

Mass disaster

Soggetti scomparsi Identificazione

Identificazioni storiche

Applicazioni genetica forense

1900 1920 1984 1987 1989 1992 1995 2000

1915 1960 1986 1988 1991 1993 1997 2004

Scoperta deiprimi polimorfismigenetici, i gruppisanguigni AB0, daparte di Landsteiner

Primi test, basatisugli anticorpi, peri gruppi sanguigniAB0

Locard enuncia ilprincipio secondo ilquale “ogni contattoLascia una traccia”

(1920s-1950s)Scoperta ed uso dialtri gruppi sanguignie proteine del siero

Sviluppo del multilocusDNA fingerprinting da da parte di Jeffreys, seguitadal single-locus-profiling (SLP)

Scoperta ed uso deipolimorfismi degli enzimidei globuli rossi

Primo utilizzo del DNAin criminalistica

Ammissione delDNA nelle corti

Introduzione della PCRin genetica forense

Ammissione del DNAnelle corti italiane(caso Balzorano)

Caratterizzazione deiprimi STRs umanipolimorfi

Descrizione del primoY-STR

Sviluppo dei primi kitcommerciali per ilprofilo di STRs

Primo utilizzo delDNA per l’identificazionedi vittime in disastri di massa (Waco, Texas)

Fondazione del UK DNA Database(profili STR)

Analisi di profilida singole cellule(singolo capello)

EPOCA DEGLISNPs?e

A. Jeffreys e il DNA fingerprinting

METODICA FINGERPRINTING

• Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus “core”minisatellite marcata con radioattivo per l’ibridazione.

• Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X

CHI E’ IL COLPEVOLE?C 1 2 3

C 1 2 3 4

C 1 2 3C 1 2 3 C 1 2 3 C 1 2 3

FINGERPRINTING20ANNI FA

OGGI

Il primo caso criminale risolto mediante DNA typing: il signor Colin Pitchfork

1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK)

1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona

Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo

A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo.

1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due

delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente

che egli era innocente.

Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si

organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting

dei 5000 individui corrispondeva a quello dell’assassino.

1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, gli

aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro.

Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA

risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

Breve storia della genetica forense

1985: MINISATELLITI, inizia l’era del DNA typing

IL SOPRALLUOGO GIUDIZIARIO

Il sopralluogo è la riproduzione e registrazione dello scenario

Nel 1919 Salvatore Ottolenghi, fondatore della Polizia Scientifica parla del sopralluogo come di un “portrait

parlé”, “ritratto parlato”

Sopralluogo Autopsia

Ricostruzione di causa e modalità degli eventi

RICERCA DELLA TRACCIA

“Crime Scene Investigation Linee Guida. Departments of Justice USA: a Reference for Law Enforcement Training “

Evidenzia protocolli ancor più restrittivi:

I. Designare aree separate per i rifiuti prodotti nel corso dell’investigazione sulla scena;

II. Stabilire area/aree come ubicazione per le apparecchiature: III. Nominare un responsabile per la rimozione dei rifiuti: utilizzare PPE

(equipaggiamento protettivo personale) specifico; IV. Eliminare il PPF nei contenitori specifici per il rischio biologico; V. Utilizzare attrezzature/equipaggiamento pulite o monouso: VI. Gettare attrezzature/equipaggiamento mononuso nei contenitori per il rischio

biologico o nel contenitore specifico dopo l’uso; VII. - Pulire lo strumentario riusabile prima della repertazione di ciascuna nuova

traccia

LA CATENA

DI CUSTODIA

analisi

campioni residui

I s tituto di M edic ina L egale dell'Univers it̂ degli Studi di M ilano

Labor ator io di E matologia e G ene tica for ens e

Via L . Mangiagalli, 37 20133 Milano

tel.: 02.5835-5699 Ğ5703 Ğ5717 fax: 02.5835-5724

_________________________

SCHEDA DI REGISTRAZIONE REPERTI

n. progressivo _______________________

ESTERNI

Cognome / Nome _____________________________________________

data arrivo / repertazione ________________________________________

provenienza __________________________________________________

tipo di plico (plastica, carta, ecc.) _________________________________

consegnato da ________________________________________________

verbale di consegna r si (v. allegato) r no

sigillato r aperto r chiuso con punti metallici r sigillo non integro r

rimozione sigilli/punti metallici r si r no _______________________

____________________________________________________________

descrizione reperti

______________________________ _____________________________

______________________________ _____________________________

______________________________ _____________________________

______________________________ _____________________________

______________________________ _____________________________

______________________________ _____________________________

altri reperti conservati altrove r si r no dove _____________________

____________________________________________________________

sigillo apposto _________________________ N. ___________________

frigo -80¡C r -20¡C r +4¡C r

collocazione __________________________________________________

trasporto

Repertazione dei campioni

Evitare di toccare la zone dove c’è una traccia con mani nude

Evitare di tossire o starnutire nelle vicinanze della traccia

Ogni traccia deve essere collezionata separatamente

Macchie di sangue, di sperma, devono essere essiccate direttamente all’aria prima di essere sigillate

Usare buste di carta non di plastica

Repertazione dei campioni

Repertare l’oggetto macchiato direttamente

Rimuovere la macchia su un cotton fioc inumidito o grattarlo a secco

Conservazione e trasporto dei campioni

Le tracce biologiche si conservano meglio se essiccate e poste in ambiente freddo; condizioni che riducono il tasso di crescita batterica e la degradazione del DNA.

I campioni devono essere sigillati e trasportati con cura

I campioni vanno conservati a +4°C (breve tempo), a – 20°C (lungo tempo) oppure a – 80 °C.

LA RICERCA DELLE

TRACCE: METODI FISICI

RICERCA DI TRACCEDI LIQ. SEMINALE

CrimescopeLa crimescope è una lampada con lunghezza d'onda variabile (400-670nm). Sfruttando il diverso assorbimento della luce, si riescono a distinguere tracce di materiale organico.

LA RICERCA DELLE TRACCE:

METODI CHIMICI – IL LUMINOL (PER IL

SANGUE

LA RICERCA DELLE TRACCE:METODI CHIMICI – IL LUMINOL (PER IL SANGUE)

Il luminol è un reagente chimico che permette di individuare tracce di sangue.

Negli anni 90 l’FBI propone la creazione di un database nazionale per lo scambio di informazioni tra laboratori a livello federale, statale e locale.•Alla fine del 2003 conteneva già oltre 1 milione e mezzo di profili genotipici.•In pochi anni si è passati dall’uso degli RFLP agli STR

Il CODIS è composto da due indici:CONVICTED OFFENDER INDEX (contiene i profili di soggetti colpevoli di crimini a sfondo sessuale o crimini violentiFORENSIC INDEX (contiene i profili genetici estrapolati da campioni biologicirinvenuti sulla scena del crimine

All’interno del CODIS i profili non sono associati ad altri dati personali del soggetto

Codis: Combined DNA Index System

Le caratteristiche del CODIS sono:• Gli STR del CODIS sono adottati da tutti i laboratori di genetica forense•Gli alleli degli STR possono essere analizzati rapidamente mediante kit commerciali•I dati sono digitalizzati per essere inseriti nel database•Grazie all’adozione degli STR i laboratori di genetica forense contribuiscono a fornire dati statistici sulle popolazioni nazionali

IL CODIS ha 3 livelli gerarchici: Locale (LDIS- local DNA index system)Statale(SDIS- state DNA index system)Nazionale(NDIS- national DNA index system)Lo scambio e la comparazione di profili genetici, a vari livelli, consentono di correlare fatti delittuosi avvenuti in tempi e luoghi differenti.

In ambito Europeo a partire dal 1995 l�’Inghilterra è stata la prima a dotarsi di una banca dati del DNA fino ad arrivare al 2003 , anno in cui sono state attivate le banche dati di Ungheria e Lettonia.

L�’Italia fino a poco tempo fa non disponeva di una banca dati nazionale criminalistica del DNA, già presente in tutti i paesi Europei.

Prevaleva il timore , diffuso nell�’ opinione pubblica , della possibilità che dalla banca dati potessero proliferare informazioni personali originariamente non previste.

Sono sorti anche problemi di ordine etico: le regioni usate in ambito forense non risultano in alcun caso interessate da alterazioni che siano alla base di patologie . Qualora venga verificata scientificamente tale eventualità si dovrebbe non considerare più’ utile quel locus per la costituzione della banca dati .

Il gruppo di lavoro di biosicurezza e biotecnologie Italiano ha redatto un elaborato che si articola in due punti cardine…

In Italia…

Art. 13 Cost:

La libertà personale è inviolabile. Non è ammessa alcuna forma di

detenzione, di ispezione o perquisizione personale né qualsiasi

altra restrizione della libertà personale se non per atto motivato

dell’autorità giudiziaria e nei soli casi e modi previsti dalla legge.

[…]

È punita ogni violenza fisica e morale sulle persone comunque

sottoposte a restrizioni di libertà.

Articolo 224 bisCodice di Procedura Penale “Provvedimenti del giudice per le perizie che richiedono il compimento di atti idonei ad incidere sulla libertà personale”

I. “1. Quando si procede per delitto non colposo, consumato o tentato, per il quale la legge stabilisce la pena dell’ergastolo o della reclusione superiore nel massimo a tre anni e negli altri casi espressamente previsti dalla legge, se per l’esecuzione della perizia è necessario compiere atti idonei ad incidere sulla libertà personale, quali il prelievo di capelli, di peli o di mucosa del cavo orale su persone viventi ai fini della determinazione del profilo del DNA o accertamenti medici, e non vi è il consenso della persona da sottoporre all’esame del perito, il giudice, anche d’ufficio, ne dispone con ordinanza motivata l’esecuzione coattiva, se essa risulta assolutamente indispensabile per la prova dei fatti.”

II. Direttive del Consiglio dell’Unione Europea in materia di � ‘Raccolta di campioni biologici’ �di ‘�Scambio dei risultati’: definiscono i principi fondamentali per la raccolta dei campioni biologici finalizzata alla realizzazione delle banche dati e agli standard che devono essere seguiti per la gestione e la trattazione dei dati. Standardizzazione dei protocolli per lo scambio dei risultati e l’’impiego degli stessi marcatori genetici.

Laboratori delle Forze di Polizia e istituzioni pubbliche o private devono essere accreditati secondo le norme UNI CEI EN ISO/IEC 17025 per lo standard di QUALITA’.

...

Chi sono gli interessati L’archivio dovrà essere predisposto per la raccolta e il raffronto dei profili del Dna di cinque categorie di persone: coloro ai quali sia applicata la misura della custodia cautelare in carcere o degli arresti domiciliari; chi viene arrestato in flagranza di reato o sottoposto a fermo di indiziato di delitto; i detenuti e gli internati per sentenza irrevocabile per un delitto non colposo; coloro ai quali è applicata una misura alternativa al carcere sempre per sentenza irrevocabile per un delitto non colposo; quelli che scontano una misura di sicurezza detentiva in via provvisoria o definitiva. Chiaro l’obiettivo: a regime il sistema permetterà di confrontare le tracce biologiche sulla scena di un reato con i profili dei pregiudicati. Come d’altronde avviene già in gran parte dei Paesi europei.

Il prelievo e il ruolo del Laboratorio centrale I condannati, identificati attraverso l’Afis (il sistema automatizzato per l’identificazione delle impronte digitali del casellario centrale d’identità del Viminale, collocato alla Direzione centrale anticrimine della Polizia), saranno sottoposti al prelievo di due campioni di mucosa orale che sarà effettuato da agenti penitenziari appositamente addestrati o dalle forze di polizia (in caso di arresti domiciliari o in flagranza). Il compito di accettare, catalogare e conservare i campioni biologici assicurandone la tracciabilità è assegnato invece a un Laboratorio centrale ad ho di circa 1.800 metri quadrati, collocato al ministero della Giustizia presso la Direzione generale dei detenuti del Dap e dotato di strutture robotizzate.

Le cautele per la privacy Il risultato è una miniera di dati sensibilissimi, accessibile per questo - secondo la bozza di decreto del presidente della Repubblica - soltanto da «operatori abilitati e designati incaricati del trattamento dei dati personali ai sensi dell’articolo 28 del decreto legislativo 196/2003» (il Codice della privacy), secondo profili di autorizzazione predefiniti, in possesso di credenziali di autenticazione «previo superamento di una procedura informatica di autenticazione forte». Profili e procedure rimandati a un successivo decreto del ministero dell’Interno, di concerto con la Giustizia e sentito il Garante per la protezione dei dati personali, da adottare entro trenta giorni dalla data di entrata in vigore del regolamento.

Lo scambio dati con l’esteroIl punto di contatto nazionale per lo scambio dati per le finalità di collaborazione internazionale di

polizia è individuato nel Servizio per la cooperazione internazionale di polizia nella Direzione centrale della polizia criminale del Dipartimento della pubblica sicurezza. Responsabile della banca dati è invece il direttore del Servizio per il sistema informativo interforze della stessa Direzione centrale: è lui che ne assicura la funzionalità e che garantisce l’esecuzione di tutte le misure tecniche e di sicurezza, nel rispetto del Codice della privacy.

Il marcatore ideale per studi di mappatura genetica deve essere:

altamente polimorfico;

analizzabile con una tecnica semplice e a basso costo;

analizzabile su un materiale biologico facilmente reperibile;

SVILUPPO DEI MARCATORI GENETICI NELL’UOMO

Tipo di marcatore n° loci Caratteristiche

Gruppi sanguigni 20 necessità di sangue fresco, talora dominanza

1910-1960

Varianti proteiche 30 necessità di sangue fresco, saggi specialistici,

1960-1975 polimorfismo limitato, spesso solo 2 alleli

RFLP >105 2 alleli (eterozigosità massima 0.5), necessità di

1975- grande quantità di DNA, procedimento lungo e

costoso

VNTR (minisatelliti) >104 molti alleli, altamente informativi,

1985- limitati alle regioni telomeriche

STR (microsatelliti) >105 molti alleli, altamente informativi

1989- distribuiti in tutto il genoma

SNP >106 meno informativi dei microsatelliti

ma se ne possono esaminare

contemporaneamente migliaia

Come li si studia amplificazione tramite

PCR del tratto che comprende le repeats e

analisi dei prodotti di amplificazione su gel di

poliacrilammide (permette la separazione di

frammenti di DNA che differiscono anche di un

solo nucleotide) o su sequenziatore automatico

(elettroforesi capillare)

I microsatelliti, STRs, offrono sostanziali vantaggi:

•sono facilmente amplificabili tramite PCR utilizzando brevi sequenze nucleotidiche (primers) che riconoscono in maniera specifica le regioni fiancheggianti il polimorfismo di interesse;

•possono essere tipizzati con un alto grado di specificità in tempi relativamente brevi;la loro moderata variabilità permette una corretta tipizzazione degli alleli mediante confronto con un marcatore di peso molecolare noto (ladder);

•il ristretto range molecolare dei loci STRs, ossia l’intervallo di lunghezza tra l’allele a più basso peso molecolare e quello a più alto peso molecolare, in genere inferiore a 100 paia di basi, consente un’amplificazione omogenea di ciascuno dei due alleli;

•le ridotte dimensioni molecolari delle relative regioni polimorfe permettono l’amplificazione del DNA anche nei casi in cui questo risulti degradato;

•Elevata eterozigosità (corrisponde alla quota dei loci di un individuo che sono polimorfi);

•Facilità ad amplificarsi in multiplex.

•Da svariati anni sono in commercio kit che permettono l’amplificazione simultanea di numerosi marcatori: oggi esistono kit commerciali, affidabili e validati che consentono di amplificare 24 STRs, comprendenti sia i marker CODIS (Combined DNA Index System) che i marcatori dell’European Standard Set (ESS).

I microsatelliti in ambito forense

«Il microsatellite ideale»(nella genetica forense)

1) Microsatellite con elevata eterozigosità2) Microsatellite con range allelico contenuto3) Microsatellite amplificabile in corti prodotti PCR 4) Microsatellite i cui alleli siano ben separabili su gel5) Microsatellite che presenti un ridotto fenomeno di stuttering6) Microsatellite con tasso di mutazione contenuto7) Microsatellite situato su autosomi

Molte di queste caratteristiche si escludono vicendevolmente:Qual è un ragionevole compromesso?

Tetranucleotide repeats selezionati

STR utilizzati in ambito forense

CODIS• D8S1179 • D21S11• D7S820• CSF1PO• D3S1358• THO1• D13S317• D16S539• VWA• TPOX• D18S51• Amelogenina• D5S818• FGA

ESS•D1S1656•D2S441•D3S1358•FGA•D8S1179•TH01•vWa•D10S1248•D12S391•D18S51•D21S11•D22S1045

http://www.fbi.gov

I microsatelliti in ambito forense

Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense.

I kit commerciali sviluppati da Applied Biosystems (a sinistra) e Promega (sotto) permettono di amplificare i 13 STR «core» del CODIS più alcuni altri STR.

I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense ( maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc.) CS7 PowerPlex®,

The PowerPlex® Fusion System 24 loci, including all CODIS and ESS loci: D3S1358,

D1S1656, D2S441, D10S1248, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, CSF1PO, TH01, vWA, D21S11, D7S820, D5S818, TPOX, D8S1179, D12S391, D19S433, D22S1045, and FGA

plus Penta E, Penta D, DYS391 and Amelogenin.

CS7 PowerPlex®, I loci CS7 includono F13A01, F13B, FESFPS, LPL e Penta C. The most variable locus in our data set is SE33 with 52 observed alleles.

Autosomi PowerPlex® Fusion System

Y-STRs

PowerPlex® Y23 System

Comprende sei ulteriori STR del cromosoma Y oltre a quelli del kit Applied Biosystems Yfiler®: DYS481, DYS533, DYS549, DYS570 , DYS576 e DYS643.

L’analisi del cromosoma Y assume un ruolo di primaria importanza:

nei casi di paternità “deficitari”: qualora non sia disponibile il padre è possibile fare degli accertamenti indiretti attraverso i fratelli del padre o altri soggetti imparentati in linea paterna;

nei casi di mixing biologici che coinvolgono più di due soggetti maschili: in questi casi l’analisi può stabilire il numero di tali soggetti;

nei casi di violenza sessuale: in tali casi infatti, può essere particolarmente difficile discriminare la componente genetica derivante dalla vittima (cellule mucosali) rispetto a quella derivante dal colpevole (spermatozoi). Il cromosoma Y è l’unico materiale genetico posseduto esclusivamente dall’individuo di sesso maschile (colui che ha compiuto il reato in questo specifico caso) e non è quindi soggetto alle contaminazioni da parte del DNA della vittima. Chiaramente, per quanto detto prima, è possibile anche rilevare l’eventualità in cui più di un individuo abbia partecipato alla violenza;

nei casi di identificazione di persone scomparse, mediante la comparazione con il profilo ottenuto da parenti di linea paterna.

Markers del cromosoma Y

Il cromosoma Y ha il più basso livello di polimorfismi tra i diversi cromosomi umani (International SNP Map Working Group 2001). In particolare il cromosoma Y mostra una variazione di sequenza ogni circa 10.000 nucleotidi, mentre gli altri cromosomi in media mostrano una variazione di più di un nucleotide ogni 1000.

Per quanto riguarda l’esclusione, se l’aplotipo ottenuto dall’analisi del cromosoma Y di un sospettato non coincide con quello del colpevole la diagnosi di esclusione è certa (analogamente nei casi di STRs autosomici).

Il discorso invece cambia radicalmente quando si tratti di effettuare una conferma sulla base dell’aplotipo del cromosoma Y. Il problema chiave, come osservato, è la condivisione dello stesso aplogruppo (aplotipo) da parte di tutti i discendenti per linea paterna. Chiaramente, stabilire l’identità biologica di una persona esclusivamente sulla base dei risultati forniti dall’analisi dell’aplotipo del cromosoma Y è impresa piuttosto avventata (lo stesso aplotipo può essere condiviso da tutti i parenti in linea paterna) e suscettibile di errori di false attribuzioni. La tipizzazione del cromosoma Y non è un sistema identificativo e, sebbene particolarmente dirimente in particolari condizioni, questa dovrebbe, ove possibile, essere sempre accompagnata dall’analisi del DNA autosomico. Il suo utilizzo appare quindi un elemento di prova addizionale, piuttosto che una valida alternativa.

X-strs

Investigator® Argus X-12 QS Kit

X-STR: poco utilizzati – test di paternità su

femmine come prodotti di concepimento di

reati sessuali o incesti - verifica di

consanguineità tra sorelle. Individui femminili

con lo stesso padre biologico presentano uno

stesso cromosoma X ereditato dal padre se gli

alleli sono diversi (in assenza di mutazioni)

allora le figlie hanno padri diversi.

Linkage groups

Linkage group

1 (Xp22) DXS8378 – DS10135 – DXS10148

2 (Xp11) DXS7132 – DXS10074 – DXS10079

3 (Xp26) HPRTB – DXS10101 – DXS10103

4 (Xp28) DXS7423 – DXS10134 – DXS10146

L’Amelogenina è una proteina della matrice extracellulare espressa negli ameloblasti durante lo sviluppo dentale e coinvolta nel processo di produzione dello smalto.

Il gene è localizzato sui cromosomi sessuali(X, Y) ed è presente in due forme: AmelX e AmelY.

Tutti gli individui di sesso femminile presentano due copie del gene AmelX, mentre tutti gli individui di sesso maschile presentano una copia del gene AmelX e una copia del gene AmelY.

I geni AmelX e AmelY sono lunghi, rispettivamente, 7.35 e 8.11 kb. Entrambi sono costituiti da 6 esoni e 5 introni. Una parte del primo esone del gene AmelY è più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX. E’ possibile, quindi, distinguere il DNA di un individuo di sesso maschile e quello di un individuo di sesso femminile dalla

lunghezza di questo frammento.

Determinazione del sesso

L’amplificato del soggetto di sesso maschile presenterà

due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY), mentre

quello del soggetto di sesso femminile presenterà due

bande sovrapposte di 106bp (AmelX).

F F M

106112

F F M

106112

Un vantaggio introdotto negli ultimi anni nella tecnica del DNAfingerprinting è che i picchi degli elettroferogrammi vengono convertitiin un formato numerico che si presta bene alla creazione di una bancadati di profili genetici di individui già incriminati.

Analisi della traccia

Analisi di genere e specie

Estrazione DNA

Amplificazione e Quantificazione Purificazione

(MINELUTE Purification Kit (Qiagen)

Analisi del marcatori genetici: autosomi, cromosoma x, cromosoma Y, mt-DNA

Interpretazione dati,calcolo biostatistico

Presentazioni risultati e conclusioni

Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus.

Generare un profilo STR:

2. Amplificazione mediante PCR multiplex

Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione:

Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili

Devono essere valutate e minimizzate le possibili interazioni tra primers, anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3’)

Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli primers è sempre necessaria quando si mette a punto una nuova multiplex, così come una titolazione dei vari componenti della PCR.

PRESENZA DI INIBITORI: I reperti biologici possono essere mescolati con inibitori della PCR di tipo organico ed inorganico che non sempre vengono eliminati efficacemente negli step di purificazione del DNA.

Ulteriore purificazione, BSA, diluzione

CONTAMINAZIONE IN LABORATORIO O IN FASE DI REPERTAZIONE:

a causa della sua elevata sensibilità, la PCR presenta un forte problema legato alla contaminazione, in misura tanto maggiore quanto più il DNA in esame è scarso e/o degradato.

Utilizzazione di guanti monouso e mascherine (in lab e in repertazione)

Strumentazione e spazi pre- e post- PCR separati;

Utilizzazione di puntali monouso con filtro

Irradiazione con UV dell’area dedicata alla preparazione della PCR

Creazione di un database di profili genetici del personale del laboratorio

Generare un profilo STR:

2. Amplificazione mediante PCR multiplexProblemi in ambito forense

Generare un profilo STR:

3. Sequenziamento mediante elettroforesi capillare

Generare un profilo STR:

3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare:

Prodotto PCR fluorescente viene denaturato con formammide e posto nel campionatore

Si applica voltaggio elettrico Il prodotto PCR viene elettroiniettato nel capillare

Quando il frammento arriva in corrispondenza di una finestra nel capillare, una sorgente laser eccita il fluorocromo legato al prodotto PCR

DetectorWindow

Il DNA migra nel polimero contenuto nel capillare; tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento

Il fluorocromo eccitato dal laser emette luce nel visibile, in un determinato intervallo di lunghezze d’onda e con una intensità che è proporzionale alla quantità di molecole di fluorocromo eccitate.

La luce emessa viene filtrata per determinati range di lunghezza d’onda e convertita in un segnale elettrico che viene misurato in RFUs (Relative Fluorescence Units).

I segnali elettrici vengono tradotti nei tipici picchi colorati degli elettroferogrammi.

Generare un profilo STR:

3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare (segue)

CCD Panel (with virtual filters)

Argon ion LASER (488 nm)

ColorSeparationFluorescence

ABI Prism spectrograph

Processing with GeneScan/Genotyper software

Sample Interpretation

Sample Detection

Capillary(filled with

polymer solution)

D3 vWA FGA

D8 D21 D18

D5 D13 D7

Am

RAW DATA

PROCESSED DATA

•Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore

•Blue

•Green

•Yellow

•Red

•Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare e ad un ladder allelico

ALLELIC LADDER

Il Ladder è l’insieme degli alleli di un locus rilevati nella popolazione generale. Assegna ad un determinato allele un nome univoco.

Test di parentela e paternità

L’analisi del DNA può essere usata per studi sulla parentela di individui diversi. La maggior parte di questi studi riguarda:

1. Test di paternità

2. Studi per determinare se determinati individui (viventi o deceduti) siano imparentati.

3. Analisi volte a risolvere casi di persone scomparse.

4. Analisi volte ad identificare cadaveri nei disastri di massa

5. Analisi di supporto ad investigazioni criminali (…il parente dell’assassino…)

6. Predizione dell’origine etnica di un DNA (estendendo il concetto di parentela a quello di «coancestry»)

Test di parentela e paternità

Test di paternità

In tutti i casi, i test di parentela si basano su un concetto semplice:

Individui imparentati condividono alleli in una maggiore proporzione (spesso misurabile) rispetto ad individui presi

a caso dalla popolazione.

Sono, in altre parole, più simili geneticamente

ESCLUSIONE,

NON ESCLUSIONE,

… ?

1

2

3

ESCLUSIONE

1

2

3

ESCLUSIONE

1

2

3

NON ESCLUSIONE

1

2

3

1

2

3

APPROCCIO

STATISTICO

PRESENTAZIONERISULTATI

NON FACILE

Test di paternità

Due possibili risultati:

(1) Compatibilità:Tutti* gli “alleli obbligati paterni” del figlio sono presenti

nel padre putativo

(2) Esclusione:Più* “alleli obbligati paterni” del figlio non sono presenti nel

genotipo del padre putativo* Attenzione ad alleli nulli e mutazioni!!!

Test di paternità

Allele obbligato paterno

L’allele (i) che il padre DEVE avere

In base alle leggi dell’ereditarietà (1° legge Mendel ), considerando un locus autosomico e assumendo che “la

madre sia certa”, se si conosce il genotipo di madre e figlio, è possibile dedurre (nella maggior parte dei casi) l’allele di

origine paterna. Oppure (nei casi meno fortunati) due alleli di cui uno sia di origine paterna.

Questo allele (o alleli) deve essere presente nel padre putativo (allele obbligato) pena esclusione della paternità.

Laddove ci fossero una o due incompatibilità si impone il calcolo biostatistico perché potrebbe trattarsi del raro ricorrere di mutazioni.Per tre incompatibilità la regola empirica prevede l’esclusione della paternità.

Test di paternità

In caso di esclusione, il test può considerarsi concluso

In caso di compatibilità, è necessario quantificare il “peso” dell’osservazione.

P.I. = Indice di paternità (per un locus)

C.P.I = Indice di paternità combinato (considerando più loci).

Test di paternità

Indice di paternità

L’ indice di paternità si calcola attraverso il rapporto di due probabilità:

(1)Numeratore: probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele(i) obbligato essendo il vero padre. Il trio in analisi è un vero trio

(2)Denominatore: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l’allele(i) obbligato essendo il vero padre. Il trio in analisi è un falso trio

Queste due probabilità discendono rispettivamente dalle leggi di Mendel e dalle leggi della genetica di popolazioni, il loro rapporto esprime una verosimiglianza (Likelihood Ratio, LR)

Test di paternità

Indice di paternità:

Esercitarsi nel calcolo!

Esempio (semplice): Madre AB, Figlio AC, Padre AC(1) Individuare l’allele/i paterno obbligato/i

(allele C in questo esempio)(2) Numeratore: Probabilità che il padre

trasmetta l’allele obbligato = ½ (Mendel!!)(3) Denominatore: Probabilità che un individuo

a caso della popolazione trasmetta l’allele obbligato = Frequenza dell’allele nella popolazione (Hardy-Weinberg!!) necessità di utilizzare database di frequenze alleliche. Se l’allele C ha frequenza nella popolazione (ad esempio) pC = 0,1, allora (in questo esempio):

P.I. = 0,5/0,1 = 5

Test di paternità

Indice di paternità

Figlio

Madre

Padre presunto

Test di paternità

Indice di paternità

Un solo locus non è generalmente sufficiente per ottenere una informazione che abbia un peso rilevante circa la compatibilità osservata.

Si considerano più loci

C.P.I = Indice di paternità combinato

Si ottiene come prodotto dei singoli P.I.

Un valore di CPI > 100 viene in genere considerato sufficientemente alto da far ritenere il padre putativo il vero padre.

CPI = 100 significa: « E’ 100 volte più probabile ottenere i risultati osservati (i profili genetici dei tre soggetti del trio) se il padre putativo (piuttosto che un

uomo preso a caso dalla popolazione) è il vero padre

Con i loci microsatelliti attualmente in uso in genetica forense, in caso di compatibilità si ottengono valori di CPI >> 100

> 99,9999%

Probabilità di paternità

Test di paternità

Test di paternità in presenza di mutazioni

In caso di esclusione si osserva generalmente non compatibilità per più loci.

Ma come considerare una situazione in cui solo uno (o “pochi”) dei loci analizzati non sono compatibili?

Bisogna tener conto delle possibili mutazioni

Tasso di mutazione?

Come si tiene conto delle mutazioni?

“two exclusion rule”e

CPI in presenza di mutazioni

Test di paternità

Test di paternità in assenza di madre

In caso di assenza della madre è sempre possibile determinare quale/i siano gli alleli obbligati paterni.

In caso di non paternità, sarà molto frequente ottenere un giudizio di esclusione

In caso di paternità, si avranno meno informazioni per dare un peso alla compatibilità osservata

Si può utilizzare anche in questo caso il CPI

Utilizzi Dna fingerprintingCaptured December 13, 2003

Questo uomo è realmente

Sadaam Hussein?

Uday and Qusay Hussein

Killed July 22, 2003

Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Box 23.1, p. 534

Random Match probability (RMP): stima della frequenza con la quale quel particolare profilo ricorre nella popolazione, quindi la probabilità che, prendendo a caso una persona dalla popolazione, essa abbia quel determinato profilo genetico.

Identificazione personale

Identificazione personale

Likelihood ratio (LR) o rapporto di verosimiglianza

RMP= frequenza del profilo genetico all’interno della popolazione

1<LR<10 peso limitato10<LR<100 peso moderato100<LR<1000 peso importanteLR>1000 peso molto influente

Utilizzando i kit da 15 STRs, valori di LR>1017 avvalorando l’ipotesi dell’accusa

1. DNA degradato2. DNA scarso3. Campioni misti

Situazioni molto comuni nelle indagini forensi di tipo investigativo

Quali strategie (tecniche e computazionali) possono essere utilizzate per risolvere casi in cui sono coinvolti campioni di questo tipo?

TR. “FRESCA”

“INDAGATO”

TR. MISTA

TR. SCARSA

TRACCIA CON

DNA DEGRADATO

NESSUN RISULTATO

ANALISI E INTERPRETAZIONE

?

?

Reperti difficili:

L’esposizione all’ambiente (acqua,batteri e funghi, UV, nucleasi) determina la progressiva degradazione del DNA.

In presenza di DNA degradato, il vantaggio dell’utilizzazione di marcatori «corti» quali gli STRs è evidente.

Se il DNA è fortemente degradato, potrebbero presentarsi dei problemi di amplificazione utilizzando le multiplex STRs, principalmente a carico dei microsatelliti in ampliconi più grandi.

1. DNA degradato

Progressiva diminuzione dell’amplificato

LARGE

SMALL

Degradazione

Quando il campione biologico è esposto a condizioni

ambientali avverse, si degrada:

caldo, umido, luce solare, tempo

La degradazione rompe il DNA in punti random

Reperti difficili:

In situazioni di forte degradazione, si può ricorrere a markers/strategie alternative rispetto agli STR convenzionali

In questi casi si possono utilizzare:

-SNPs (ampliconi < 100 basi)

-mtDNA (l’elevato numero di copie rispetto al nucleare aumenta la probabilità che i primer si appaino ad un segmento di DNA «intatto»)

-«Mini-STRs» (STR con primer ridisegnati in modo da ottenere ampliconi più piccoli di quelli utilizzati normalmente)

-Altre possibilità valutate: aree protette da nucleosomi, riparazione del DNA

1. DNA degradato

Ba

se

pa

irs

Differenti Markers

RFLP (minisat multi-locus

50

100

500

1000

D1S80

STRs

miniSTRs

SNPs

Mini STR

AmpFℓSTR® MiniFiler ™ PCR Amplification

AmpFlSTR® MiniFiler™ . The primers amplify the STR loci D13S317, D7S820, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO, FGA, and the gender marker Amelogenin.

Convalidato secondo le norme / Nazionali FBI e le linee guida SWGDAM.

Reperti difficili:

Si parla di «low template» DNA (LT-DNA) quando la quantità di DNA disponibile per l’analisi è inferiore a 100-200 pg (il contenuto in DNA di 20-40 cellule diploidi).

Sebbene la PCR sia in grado (con qualche difficoltà) di amplificare un bersaglio a partire da una sola cellula, il problema principale del LT-DNA è quello della sensibilità del metodo. Nel tempo sono stati messi a punto vari sistemi per aumentare il prodotto PCR, ad esempio aumentando il numero di cicli.

Un’alternativa agli STR, in caso di LT_DNA, è l’analisi di mtDNA

Perché?Vantaggi e svantaggi

2. DNA scarso(Low Copy Number ~ Low template; «touch» DNA)

Problemi nell’interpretazione di profili STR

A. Problemi «biologici»

Alleli nulli e fenomeno drop-out

In presenza di una mutazione al 3’ del sito di annealing di uno dei due primers utilizzati per amplificare un STR, la Taq polimerasi non è in grado di sintetizzare il prodotto PCR. La conseguenza può essere quella che solo uno dei due alleli STR vengono amplificati.

Punti da considerare:-Kit differenti per STR multiplex con diversi set di primers -Problemi per il confronto con databases: stringenza della ricerca di match-Problemi nei test di paternità

Dropout allelico

1500

Campione da analizzare

Campione di riferimento

150

?

Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato.Nella figura l’allele 14 al sito D13S317 non si è amplificato:Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14

Da: D. Hobson - LCN Workshop AAFS 2003

IL CASO “BORDERLINE”

ESCLUSIONE O NON ESCLUSIONE?

1ng

IND

AG

AT

O

50 µL PCR

TR

AC

CIA

LC

N

8pg 5 µL PCR

“Drop Out”

“Drop In”Sbilanciamento

LIMITI NELLA TIPIZZAZIONETRAMITE STRs

• Campioni di DNA degradato potrebbero essere difficili da analizzare

• I risultati ottenuti potrebbero essere difficili da interpretare

• Gli STRs sono soggetti ad “artefatti”

• Le tecnologie richieste sono molto costose

Thresholds

Soglia stocastica: 150 RFU (Unità relativa di fluorescenza)(In presenza di LCN può diminuire purché sia validata dal laboratorio secondo gli standard interni)Soglia analitica: 50 RFU

LOQ: è la più bassa concentrazione di analita che può essere determinato con una precisione accettabile

LOD: è il limite di sensibilità del segnale rilevabile. Il limite di detenction è 30-50 RFU

EFFETTI STOCASTICI

Amplificazione sproporzionata di due alleli ad un locus eterozigote

“Allele dropout” e alleli nulli

Falsa omozigosi

Extrapicchi & Off ladder

Stutter

Poliadenilazione

Problemi nell’interpretazione di profili STR

A. Problemi «biologici»

Aggiunta di adenina al 3’ incompleta

La Taq polimerasi in genere aggiunge al 3’ del filamento PCR neosintetizzatoun’adenina. Le multiplex STR sono ottimizzate in modo che questo avvenga regolarmente. Può accedere tuttavia in alcuni casi che si verifichi una adenilazione incompleta dei prodotti PCR, che da luogo, per ciascun allele) a due picchi distanziati di una sola base nell’elettroferogramma.

Punti da considerare:Un picco più corto di una base rispetto al normale potrebbe essere interpretato come una «microvariante»

Incomplete adenylation

D8S1179

-A

+A

-A

+A

Problemi nell’interpretazione di profili STR

A. Problemi «biologici»

Alleli «off ladder»

below ladder between-ladder(microvariante)

Allelic ladder Allelic ladder Allelic ladder

above ladder

Sono alleli che presentano un numero minore (alleli “below ladder”) o maggiore (“above ladder”) di ripetizioni di quante ne siano presenti nei ladder commerciali per multiplex STR. Sono considerati “off ladder” anche gli alleli con una lunghezza dell’amplicone PCR tale da ricadere tra due alleli del ladder (microvarianti o alleli “between ladder”), generalmente dovuti a piccole inserzioni delezioni nell’amplicone.

Microvarianti e alleli off-ladder

Microvarianti: alleli rari che differiscono dalle forme più comuni per una o piùcoppie di basi a causa di inserzioni, delezioni o cambiamenti nucleotidici edifferiscono pochissimo dagli alleli contenenti ripetizioni complete (0.2 bp) .

Off-Ladder: le microvarianti rare, non sono contenute nel ladder allelico, perciò si presentano con una taglia diversa (più di 0.5 bp) da quella degli alleli del ladder

Stutter

Si producono a causa dello “slippage” della polimerasi durante l’amplificazione

Sono caratterizzati da una unità ripetuta in meno (4 Basi)

•Altezza picco stutter/ altezza picco principale*100• La percentuale varia in relazione - al locus-all’allele• In genere inferiore al 10% -15%

Problemi nell’interpretazione di profili STR

A. Problemi «biologici»

Prodotti «stutter».

Come conseguenza dello scivolamento della polimerasi nell’amplificare durante la PCR ripetizioni in tandem (fenomeno analogo a quello che porta alla mutabilità in natura dei microsatelliti) si ottengono alcuni prodotti PCR più corti di un’unità rispetto al numero di ripetizioni dell’allele amplificato.

In genere, il prodotto dello stuttering ha un’altezza inferiore al 20% del picco «reale» (almeno per i loci validati in ambito forense).

Punti da considerare: - differenze tra loci, - differenze per lo stesso locus in esperimenti diversi,- possibili problemi nell’interpretazione di tracce miste.

Formazione degli stutter

Walsh et al (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2807-2812

Slippaggio

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6

Amplificazione normale

Mixture - Contaminazione

Contaminazione: aggiunta di materiale biologico o di DNA durante o dopo la repertazione dei campioni.

Mixture: campione contente DNA appartenente a due o più individui diversi.

Da: D. Hobson - LCN Workshop AAFS 2003

IL CASO “BORDERLINE”

ESCLUSIONE O NON ESCLUSIONE?

1ng

IND

AG

AT

O

50 µL PCR

TR

AC

CIA

LC

N

8pg 5 µL PCR

“Drop Out”

“Drop In”Sbilanciamento

TR. “FRESCA”

“INDAGATO”

TR. MISTA

TR. SCARSA

TRACCIA CON

DNA DEGRADATO

NESSUN RISULTATO

ANALISI E INTERPRETAZIONE

?

?

TRACCE MISTE

Nel caso di violenza con più aggressori

Nel caso di commistione tra fluidibiologici appartenenti a più individui

Valutazione dei profili e dell’altezza deipicchi

D5S818 D13S317

D7S820

D8S1179 D21S11 D18S51

Amel

VWAFGAD3S1358 blue panel

green panel

yellow panelRe

lati

ve

Flu

ore

sce

nce

Un

its

Più alto di una

stutter band

“Stutter” nella

posizione sbagliataImbalance tra X e

Y

4 picchi in un

singolo locus

Sample Mixture ExampleProfiler Plus data

IL TEST DEL DNA

INTEGRA GLI

ELEMENTI A

DISPOSIZIONE DEGLI

INVESTIGATORI

E DEL GIUDICE.

COSA NON PUÒ DIRE

IL TEST DEL DNA

• QUANDO LA TRACCIA È STATA DEPOSTA

• IN QUALI CIRCOSTANZE / MODALITÀ

• IN UNA TRACCIA “MISTA” LA COMPONENTE

MINORE “SPARISCE”

• IN UNA TRACCIA “MISTA” QUALE SIA STATA

DEPOSTA PER PRIMA.

Le alternative agli STR autosomici

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi

Gli SNPs sono utilizzati principalmente quando il DNA da analizzare è fortemente degradato (prodotti PCR più piccoli, quindi maggiore probabilità di successo tecnico).

Trovano tuttavia applicazione anche in:

Predizione circa la popolazione di origine di un reperto biologico (AIMs, ancestry informartive markers)

Predizione di caratteristiche fenotipiche. Ad esempio il fenotipo «capelli rossi» può essere dedotto (in una certa misura) dall’analisi di polimorfismi nel gene «recettore della melanocortina 1» (MC1R).

45 SNPs risultati associati alla variazione del colore dei capellilocalizzati su 12 geni

Branicki et al., (2011). Model-based prediction of human hair color using DNA variants Human Genetics

La selezione degli SNPs si è basata sul contributo di ciascuno di essi sull’accuratezza predittiva, attraverso l’utilizzo di procedure automatizzate come lo STEP-WISE ANALYSIS

MC1R, OCA2 (rs 12193832), HERC2 utilizzati per il loro grande contributo all’effetto fenotipico

Modello predittivo finale Area Under the Curve

Accuracy of hair color prediction

RED OVER 0.9BLACK ALMOST 0.9BLOND OVER 0.8BROWN ALMOST 0.8

AUC CURVE

La statistica di sintesi per valutare l’accuratezza di un modello predittivo è l’aera sottesa alla curva AUC

Da questo studio è emerso che:

La predizione del biondo e del castano è più bassa di quella del rosso e del nero

L’età ed il genere non sono risultati significativi nell’accuratezza della predizione

Ci sono differenze tra studi eseguiti con singolo osservatore e quelli eseguiti con l’utilizzo dello spettrofotometro

La predizione più alta la troviamo nel colore dei capelli ROSSO e NERO con un accuratezza del 90%, per i colori BIONDO e CASTANO l’accuratezza si abbassa all’80%

Conclusioni

Il numero di campioni utilizzato è abbastanza grande da ottenere un modello di ragionevole accuratezza e si auspica che tali risultati possano essere confermati e ed utilizzati in ulteriori studi.

Ci si aspetta che per la predizione del colore dei capelli basata sull’analisi del DNA, i marcatori consigliati in questo lavoro siano utilizzati in future applicazioni pratiche soprattutto per ciò che riguarda il contesto forense. Infatti, grazie a questo modello possiamo ottenere dal genotipo estrapolato da una traccia sulla scena del crimine, informazioni utili soprattutto nei casi in cui non vi è il sospettato.

• Predizione colore degli occhi (almeno 6 SNPs)

• Predizione colore della pelle (almeno 6 SNPs)

• Predizione colore capelli (almeno 45 SNPs)

• Predizione origine geografica (Y e mtDNA)

• Età? (lunghezza dei telomeri)

Marcatori autosomici, del mtDNA e del cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle scienze forensi

Marcatori “uniparentali” nelle scienze forensi

Cromosoma Ysi utilizzano principalmente Y-STR

La variabilità del cromosoma Y viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di misture maschio-femmina (es. violenza sessuale), per ottenere un profilo STR maschio-specifico non contaminato dal DNA della vittima.

Altre applicazioni interessano:- test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (il profilo STR del cromosoma Y sarà identico in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza maschile)- Misture con un numero elevato di maschi possono essere più facilmente interpretabili se si analizza il cromosoma Y.- Maschi deficienti per amelogenina

Problemi principali: Essendo un cromosoma non ricombinante ( a parte le PAR) la variabilità si accumula solo per mutazione.Minore informazione e impossibilità di ottenere probabilità di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell’intero aplotipo nella popolazione)

RM- YSTR

Analysis of Y-chromosomal short tandem repeat (Y-STR) loci provides an extremely useful tool in forensic DNA testing. In particular, it allows the unambiguous detection of the male DNA component in mixtures with a high female background, as often found in sexual assault cases. Moreover, due to their haploid nature and uniparental transmission favouring the geographical clustering of haplotypes, Y-STRs can provide intelligence information on the ethnic origin of a stain donor in non-suspect cases. The principal weakness of Y-STR analysis is that, even when a crime sample matches the Y-STR haplotype of a suspect, his patrilineal relatives cannot be excluded as being the donor of the stain. Adding additional markers to the current sets of Y-STRs used in forensic casework can improve the level of paternal lineage differentiation. Since mutation is the only genetic force behind Y-haplotype variation, Y-STRs displaying high mutation rates are best fitted for this purpose. A systematic Y-STR mutation study by Ballantyne et al. identified a set of 13 novel “rapidly mutating” (RM) Y-STR markers with exceptionally high mutation rates (>10−2 per locus per generation) if compared to >170 other Y-STRs including all conventionally used markers, the latter in the order of a few mutations per marker every 1000 generations . RM Y-STRs have been demonstrated not only to improve the resolution of male lineage differentiation, but also to allow close male relative separation with a power unsurpassed by standard Y-STRs .

Marcatori “uniparentali” nelle scienze forensi

mtDNAsi “utilizza” principalmente la sequenza delle regioni ipervariabili

(nel mtDNA umano non ci sono microsatelliti!!)

La variabilità del mtDNA viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di DNA degradato o scarso, a causa dell’elevato numero di copie di mtDNA per cellula.

Al pari del cromosoma Y, il mtDNA viene usato anche nei test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (la sequenza del mtDNA sarà identica in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza femminile).

Problemi principali: Come il cromosoma Y, mtDNA è un sistema non ricombinante e quindi la variabilità si accumula solo per mutazione.

Ne consegue minore informatività («minore» variabilità) e impossibilità di ottenere probabilità di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell’intero aplotipo nella popolazione per dare un peso alle compatibilità).

Il DNA mitocondriale, per il tipo di genotyping cui è sottoposto (sequenziamento) non si presta facilmente nella risoluzione delle misture.

La presenza frequente di eteroplasmia rappresenta un problema, soprattutto nel confronto di profili genetici provenienti da DNA estratto da tessuti diversi

Presentazione risultati e conclusioni

L’utilizzo di affermazioni come: “ probabilità praticamente accertata…tizio è padre di..l’assassino è…”

E’ da ritenersi assolutamente IMPROPRIO!

L’esperto fornisce solo ed esclusivamente i valori ottenuti dai

vari approcci biostatistici illustrandone il risultato probabilistico.

“Dall’analisi dei loci si evince che la probabilità che Tizio sia il padre biologico di Caio è di 1.3x10⁶ volte, rispetto ad un individuo preso a caso nella popolazione di riferimento.

Tizio è compatibile biologicamente in tutti i loci analizzati stimando una probabilità di compatibilità pari a 99,999924....”.

Indicare il colpevole o attribuire una paternità è esclusivamente

compito del giudice.

Test di parentela

Investigazioni su persone scomparse

Tre categorie di campioni utilizzabili per identificazione di persone scomparse tramite l’analisi di profili genetici:

1) Campioni provenienti dall’individuo scomparso (spazzolino da denti, pettine, vestiti, vecchi reperti medici come biopsie)2) Campioni di parenti che possono essere utlizzati per “ricostruire” il genotipo dell’individuo scomparso (“reverse parentage testing”)3) Campioni provenienti da resti umani non identificati

Si utilizzano e si confrontano: (1) database di profili di DNA di persone scomparse; (2) database di profili di resti umani non identificati; (3) database di profili di parenti di persone scomparse

Test di parentela

Identificazione delle vittime dei disastri di massa (DVI)

Tre categorie di campioni utilizzabili per identificazione di vittime di disastri:

1) Campioni provenienti dall’individuo scomparso (spazzolino da denti, pettine, vestiti, vecchi reperti medici come biopsie)2) Campioni di parenti che possono essere utlizzati per “ricostruire” il genotipo dell’individuo scomparso (“reverse parentage testing”)3) Campioni provenienti dai resti rinvenuti sulla scena del disastro

Problemi:- Complicazioni dovute al numero

di vittime- In alcuni casi frammentazione e

dispersione dei reperti- Spesso DNA fortemente

degradato a causa di incendi

Identificazione delle persone disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del 9/11

Il progetto ha generato

52,000 profili STR

44,000 profili mtDNA

17,000 profili SNPs

850 delle 1594 vittime identificate grazie all’analisi del DNA

L’utilizzo dei micro RNA

Microarrays

qRT-PCR

RNA SEq

L’utilizzo dei micro RNA

… non solo DNA umano

By NA

Il caso dell’albero testimone3 maggio 1992, Phoenix, AZ

Una donna viene ritrovata morta per strangolamento nelle vicinanze di alberi di Cercidium floridum.

Nel camion di un sospetto vengono rinvenuti dei frutti di Cercidium floridum.

La specie in questione presenta una notevole variabilità di sequenza

L’analisi del DNA (mediante analisi RAPD-random amplified polymorphic DNA) permette di stabilire che i frutti appartengono ad uno degli alberi che si trovano sulla scena del delitto

Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli alberi della stessa specie analizzati per confronto

Il sospetto viene incriminato

By NA

La tecnica RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA

By NA

Il gatto palla di neve

3 ottobre 1994, Prince Edward

Island, Canada

Scompare una donna di 32 anni,

successivamente ritrovata morta.

Nella sua macchina abbandonata

vengono ritrovate tracce del suo

sangue assieme ai peli di un gatto

L’ex marito della vittima, tra i

sospettati, vive con un gatto di nome

palla di neve

Il DNA estratto dai peli di palla di

neve presenta un profilo DNA uguale a

quello ottenuto dai peli ritrovati nella

macchina della vittima.

L’ex marito viene incriminato

Per eventuali approfondimenti:

Genetica Forense

Testo consigliato: