LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI MOLEKULAR 

     

 SDS PAGE DENGAN SILVER STAINING DAN ZIMOGRAM 

             

KHAIRUL ANAM P051090031/BTK 

          

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA 

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009 

SDS PAGE DENGAN SILVER STAINING DAN ZIMOGRAM  

 Pendahuluan  

Xilanase merupakan  kelompok  enzim  yang memiliki  kemampuan menghidrolisis  hemiselulosa 

dalam hal  ini  ialah  xilan atau polimer dari  xilosa dan  xilooligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan 

berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β‐xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Subramaniyan 

& Prema 2002; Richana 2002).  

Pemecahan  sempurna  xilan  memerlukan  aktivitas  sinergis  beberapa  enzim  hidrolitik 

(hemiselulase), yaitu endo‐1,4–ß‐xilanase, ß‐xilosidase, α‐glukuronidase, α–L‐ arabinofuranosidase dan 

asetilesterase. Endo‐1,4‐ß‐xilanase dapat memecah kerangka dasar struktur xilan, sehingga merupakan 

enzim kunci dalam proses depolimerisasi xilan (Subramaniyan & Prema 2002). 

Selama dekade  terakhir  ini, potensi bioteknologi dari aplikasi xilan dan xilanase  telah menjadi 

perhatian  utama  dari  para  peneliti  karena  aplikasinya  yang  praktis  dalam  bidang  industri  seperti  : 

memproduksi dan mendaur ulang kertas, meningkatkan digestibilitas makanan ternak, industri makanan 

dan minuman, meningkatkan kualitas roti,  industri tekstil, produksi biopharmaceutika (Beq et al. 2001; 

Richana 2002). 

 SDS‐PAGE 

Salah  satu metode  PAGE  yang  umumnya  digunakan  untuk  analisa  campuran  protein  secara 

kualitatif  adalah  SDS‐PAGE    (Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrilamide  Gel  Electroforesis).    Prinsip 

penggunaan metode  ini  adalah migrasi  komponen  akril  amida  dengan   N.N`  bisakrilamida.  Kisi  –  kisi 

tersebut  berfungsi  sebagai  saringan  molekul  sehingga  konsentrasi  atau  rasio  akrilamid  dengan 

bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode  ini sering 

digunakan  untuk  menentukan  berat  molekul  suatu  protein  disamping  untk  memonitor  pemurnian 

protein (Wilson dan Walker, 2000). SDS‐PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion 

rendah  dan  dapat  menentukan  apakah  suatu  protein  termasuk  monomerik  atau  oligomerik, 

menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer.  

Penggunaan  SDS‐PAGE bertujuan  untuk memberikan muatan negatif pada  protein  yang  akan 

dianalisa. Protein yang  terdenaturasi  sempurna akan mengikat SDS dalam  jumlah yang  setara dengan 

berat molekul  protein  tersebut  (Dunn,1989).   Denaturasi  protein  dilakukan  dengan merebus  sampel 

dalam buffer yang mengandung β‐merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol 

dan SDS (Wilson dan Walker,2000).  Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion 

yang  teikat  sehingga  kompleks  protein‐SDS memiliki  rasio muatan  per  berat molekul  yang  konstan. 

(Hames, 1987).   

Sampel‐sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna dengan bromphenol 

biru  yang  dapat  terionisasi.    Fungsi  pewarna  adalah  untuk  membantu  memonitor  jalannya 

elektroforesis.  Berat  molekul  protein  dapat  diketahui  dengan  membandingkan  Rf  protein  dengan 

protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000). 

 

Zimogram 

Data  pemurnian  enzim  yang  diperoleh melalui  elektroforesis  tidak  selalu menunjukkan  daya 

katalitik enzim sebenarnya karena adanya kontaminan, isoenzim, atau enzim lain dari kelas yang sama.  

Kekurangan  ini  dapat  diatasi  dengan meneliti  aktivitas  enzim  sesudah  elektroforesis  gel.    Zimogram 

merupakan  cara  menganalisaaktivitas  kitinolitik  yang  sederhana,  sensitif,  dapat  dikuantisasi  dan 

fungsional  (Leber  dan  Balkwil,  1997).    Pada  dasarnya  terdapat  2  model  teknik  zimogram.    Model 

pertama menggunakan substrat yang  terikat pada bahan penahan berupa gel, kertas saring,  lembaran 

plastik,  atau  lapisan  substrat  langsung.    Pada model  kedua,  indikator  diikatkan  secara  kuat  pada  gel 

pemisah  dimana  enzim  subjek  dibuat  inaktif  selama  elektroforesis  dan  diaktifkan  kembali  setelah 

elektroforesis.    Substrat  yang digunakan untuk  zimogram harus bersifat  kromogenik,kromoforik,  atau 

hasil reaksi enzim dengannya dapat diwarnai (Peach et al., 1993). 

Zimogram  adalah  salah  satu  teknik  elektroforesis  yang  digunakan  untuk  mengidentifikasi 

aktivitas enzim yang dipisahkan dalam gel poliakrilamida.  Secara keseluruhan, prinsip teknik zimogram 

yang dilakukan  sama,  yaitu penggunaan  substrat  kitinase  yaitu  glikol  kitin  yang disertakan dalam  gel 

pemisah  poliakrilamid,  penggunaan  buffer  renaturasi  agar  protein  melipat  kembali  dan  diberi 

kesempatan untuk menghidrolisis substrat pada kondisi   yang tepat,  inkubasi gel dalam buffer dengan 

pH optimum enzim.   Gel divisualisasi dengan  congo  red dan adanya aktivitas enzim ditunjukkan oleh 

daerah bening dimana substrat telah didegradasi (Kleiner dan Stevenson, 1994). 

Pada percobaan kali ini dilakukan pemisahan dengan SDS PAGE pada hasil fermentasi isolat 234 

P‐16 ataupun isolat 45 I‐3 dengan analisa menggunakan silver staining dan teknik zimogram. 

 

 

Bahan dan Metode 

 Isolat  bakteri  yang  digunakan  adalah  2  bakteri  koleksi  dari  Laboratorium  Fisologi  Molekular 

Bioteknologi,  Pasca  sarjana  IPB  dengan  kode  koleksi  234  P‐16  dan  45  I‐3  yang  diduga  mampu 

memproduksi enzim xylanase.  

Fermentasi dilakukan dengan mengambil beberapa cockborer kultur mikroorganisme pada media padat. 

Kultur tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair yang mengandung 0.5 

g xilan, 10.3 g sukrosa dan 1.0 g ekstrak yeast. Kultur fermentasi diinkubasikan pada suhu kamar selama 

5 hari untuk isolate 234 P‐16 dan 8 hari untuk isolate 45 I‐3 dengan penggoyangan pada kecepatan 150 

rpm. Hasil  fermentasi  dipanen  pada  hari  ke  5  dan  ke  8  karena  pada  hari  tersebut  diketahui  bahwa 

merupakan  hari  dimana  produksi  enzim  xylanase  mencapai  aktivitas  tertingginya  dari  kedua  isolat 

tersebut.  Setelah  waktu  yang  ditetapkan,  kultur  media  di  sentrifugasi  untuk  diambil  larutan 

supernatannya yang merupakan ekstrak enzim kasar. 

Pemekatan  larutan  ekstrak  enzim  kasar  yang  diperoleh  dipekatkan  dengan  metode  pengendapan 

menggunakan larutan aseton pada konsentrasi aseton tertentu. Untuk memperoleh konsentrasi ekstrak 

enzim kasar yang optimal, jumlah aseton yang ditambahkan pada 20 ml enzim ekstrak kasar isolat 45 I‐3 

80 ml  agar  diperoleh  konsentrasi  aseton  80%  (v/v)  sedangkan  untuk  isolat  234  P‐16,  ditambahkan 

aseton sebanyak 90 ml pada 10 ml ekstrak enzim kasar agar diperoleh konsentrasi aseton sebesar 90% 

(v/v).  Campuran  tersebut  kemudian  disimpan  dalam  lemari  pendingin  selama  semalam.  Setelah  itu, 

larutan disentrifugasi pada  kecepatan 10.000  rpm  suhu 4  0C  selama 15 menit. Endapan protein  yang 

terbentuk diambil dan dilarutkan dalam 0,02 M bufer fosfat pH 7,0, dengan volume 1 atau 2 ml. 

SDS PAGE terdiri dari 2 bagian yaitu, 4% gel pengumpul dan 10% gel pemisah. Gel‐gel tersebut dibuat 

dengan mencampurkan beberapa larutan sebagai berikut. 

Tabel 1. Gel pemisah dan gel pengumpul elektroforesi dengan menggunakan SDS PAGE 

Komposisi  Gel Pemisah  Gel Pengumpul Larutan A  3.3 ml  0.67 ml Larutan B  2.5 ml  ‐ Larutan C  ‐  1 ml H2O  4.17 ml  2.3 ml APS 10%  50 ul  50 ul SDS 10%  50 ul  50 ul Temed  5 ul  5 ul  

 

dimana: 

Larutan A dibuat dengan mencampurkan 75 g acrylamide ditambah 2 g bis‐acrylamide  lalu tambahkan 

air hingga 250 ml. tempatkan dalam wadah gelap di suhu 4°C. 

Ammonium Per Sulfate (APS) 10% 

Larutan B atau Gel pemisah protein  (1.4 M  tris HCl pH 8.8) dibuat dengan melarutkan 45.5 g  tris  ke 

dalam 200 ml H2O dan dibuat menjadi pH 8.8  lalu ditambah dengan 1 g SDS  lalu volume dibuat tepat 

menjadi 250 ml.  

Larutan C atau gel pengumpul (1 M tris HCL pH 6.8) dibuat dengan cara melarutkan 15.1 g tris dengan 

200 ml  H2O  lalu  larutan  dibuat menjadi  pH  6.8  kemudian  larutan  ditambah  dengan  1  g  SDS  baru 

ditambahkan H2)O hingga tepat menjadi 250 ml. 

Buffer Reservoir  (buffer elektroda) dibuat dengan melarutkan 28.8 g glysine ditambahkan dengan 6 g 

tris dan disesuaikan pada pH 8.3. kemudian ditambahkan 2 g SDS dan larutan ditepatkan menjadi 2 l. 

Loading buffer sampel dibuat dengan mencampur 2 ml mercaptoetanol dengan 4 ml gliserol, kemudian 

ditambah dengan 0.3 g tris dan 2 ml bromofenol blue (0.1% b/v) dalam 20 ml H2O pH dibuat menjadi 

6.8. setelah itu ditambah dengan 0.92 g SDS. 

Preparasi sampel dilakukan sebelum sampel di elektroforesis. Preparasi dilakukan dengan memanaskan 

campuran larutan sampel dengan larutan loading buffer selama 5 menit pada suhu 100°C. 

Elektroforesis dilakukan dengan menempatkan larutan sampel yang sudah dipreparasi dan juga marker 

ke dalam  sumur SDS PAGE. Elektroforsis dilakukan  selama pada kurang  lebih 4  jam dengan  tegangan 

konstan sebesar 60 volt. Migrasi diamati dengan pewarna biru bromofenol sebagai tanda.  

Silver staining dilakukan dengan cara merendam gel ke dalam larutan fiksasi 50% asam asetat selama 2 

jam hingga semalaman dengan penggoyangan pelan. Setelah difiksasi, gel dibilas dengan dd H2O selama 

10 menit lalu dicuci dengan larutan etanol 20% selama 3 x 20 menit. Gel dibilas kembali dengan dd H2O 

selama  10 menit.  Kemudian  gel  di  sensitize  dengan menggunakan  0.05  g/200 ml Na2S2O3  selama  1 

menit. Gel kembali dibilas dengan dd H2O  selama 3 x 20 menit. Kemudian gel diwarnai dengan 0.1% 

perak nitrat  selama 20 menit, disimpan pada  suhu 4°C. gel dibilas  lagi dengan dd H2O  selama 2 x 20 

menit. Gel kemudian direndam pada larutan pengembang yang terdiri dari 5% Na2CO3 + 0.05% formalin 

+ 0.0004% Na2S2O3. Ketika pewarnaan dengan  larutan pengembang dirasa cukup, gel yang direndam 

diberi larutan stop solution yang berisi 6 ml asam asetat dan 440 ml dd H2O selama 5 menit. Gel dicuci 

dengan dd h2O selama 5 menit. Gel di foto untuk didokumentasi dan di ukur jarak pengembangan pita 

protein sampel maupun marker. 

Zimogram  dilakukan  untuk mengetahui  aktivitas  xylanase  dalam  gel  dengan  cara menambahkan  1% 

(b/v) substrat birchwood xylan ke dalam campuran gel poli akrilamid sebelum polymerase gel  terjadi. 

Setelah  elektroforesis  gel  di  renaturasi  dengan merendam  25%  (b/v)  Triton‐x100  selama  1  jam.  Gel 

kemudian  diinkubasi  dalam  buffer  sitrat  fosfat  pada  pH  dan  suhu  optimum  enzimnya  selama  2  jam. 

Setelah itu diwarnai dengan 0.1% (b/v) pewarna merah kongo selama 30 menit, kemudian dicuci dengan 

NaCl 1M. 

Analisis SDS PAGE pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita‐pita 

protein  yang  terbentuk  pada  gel  pemisah.  jarak migrasi  diukur  dan  dibandingkan  dengan  jarak  yang 

ditempuh  oleh  pewarna  biru  bromofenol.  Sedangkan  untuk  zimogram,  analisa  dilakukan  dengan 

pengamatan terhadap terbentuknya zona bening secara kualitatif pada gel yang melibatkan pewarnaan 

merah Kongo. 

 Hasil dan Pembahasan  Hasil  

Apabila  jarak  migrasi  yang  ditempuh  oleh  pita  marker  dibandingkan  dengan  jarak  migrasi 

penanda pewarna biru bromofenol maka diperoleh nilai rf dari masing‐masing pita yang terbentuk. Dari 

pengamatan diketahui bahwa penanda pada gel pemisah berjarak 6 cm, sehingga diperoleh data sebagai 

berikut.  

 Tabel 2. Jarak migrasi dari marker beserta niali rf dan berat molekul dari masing‐masing pita 

Jarak Marker (cm)  rf  Marker  BM Marker (kDa)  log BM 0.7  0.117  116  2.064 1.7  0.283  66.2  1.820 2.6  0.433  45.0  1.653 3.0  0.500  35.0  1.544 3.4  0.567  25.0  1.397 4.3  0.717  18.4  1.264 4.8  0.800  14.4  1.158 

 Dari data tersebut apabila memasukkan data rf dan log BM dari pita‐pita marker maka diperoleh kurva 

seperti pada gambar 1. Dari kurva log BM vs rf marker diperoleh persamaan regresi, yaitu y = ‐1.333x + 

2.208.  Dari  persamaan  regresi  ini, maka  diperoleh  berat molekul  pita  yang  dihasilkan  oleh  sampel 

seperti yang terlihat pada tabel 3. 

 

                   Gambar 1. Kurva log BM vs rf marker   Tabel 3. Jarak migrasi pita protein dari sampel ekstrak enzim kasar pada produksi enzim xylanase 

Sampel (cm)  rf sampel  log BM  BM (kDa) 5.60  0.93  0.96  9.20 4.30  0.72  1.25  17.89 4.80  0.80  1.14  13.85 5.50  0.92  0.99  9.68 

 Pada pengamatan  zimogram dengan pewarnaan merah Kongo diketahui bahwa  ada pita dari 

eksrak enzim kasar pada SDS PAGE memberikan zona bening. Pengamatan zona bening pada zimogram 

agak  sulit  karena  penampakan  zona  bening  berlangsung  dengan  cepat  sejalan  dengan  lama  nya 

pewarnaan dan pembilasan dengan NaCl 1 M, akan  tetapi pewarnaan  ini bersifat  reversible atau bisa 

dilakukan kembali setelah pembilasan dengn kembali diberi pewarna merah Kongo (Gambar 2). 

             Gambar 2. Pewarnaan merah Kongo pada Zimogram 

Pembahasan  SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate‐Polyacrilamide Gel Electrophoresis) merupakan salah satu 

cara  elektroforesis  dengan  menggunakan  gel  poliakrilamida  yang  dikombinasikan  dengan  SDS.  

Penggunaan  poliakrilamida  mempunyai  keunggulan  dibandingkan  dengan  gel  lainnya,  karena  tidak 

bereaksi  dengan  sampel  dan  tidak membentuk matriks  dengan  sampel,  sehingga  tidak menghambat 

pergerakan  sampel  yang  memungkinkan  pemisahan  protein  secara  sempurna.    Selain  itu,  gel 

poliakrilamida  ini mempunyai  daya  pemisahan  yang  cukup  tinggi.    Penggunaan  SDS  berfungsi  untuk 

mendenaturasi  protein  karena  SDS  bersifat  sebagai  deterjen  yang mengakibat  ikatan  dalam  protein 

terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol.  

Komponen  penting  yang  membentuk  gel  poliakrilamida  adalah  akrilamida,  bis  akrilamida, 

ammonium persulfate dan TEMED (N,N,N’,N’ tetrametilendiamin).   Akrilamida sebagai senyawa utama 

yang menyusun gel adalah merupakan senyawa karsinogenik.  Ammonium persulfate berfungsi sebagai 

inisiator  yang  mengaktifkan  akrilamida  agar  bereaksi  dengan  molekul  akrilamida  yang  lainnya 

membentuk  rantai  polimer  yang  panjang.    TEMED  berfungsi  sebagai  katalisator  reaksi  polimerisasi 

akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein. 

Bis‐akrilamida berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi‐kisi bersama polimer 

akrilamida.    Kisi‐kisi  tersebut  berfungsi  sebagai  saringan  molekul  protein.  Perbandingan  antara 

akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur  sesuai dengan berat molekul protein yang dipisahkan  .  

Semakin  rendah  berat molekul  protein  yang  dipisahkan, maka  semakin  tinggi  konsentrasi  akrilamida 

yang digunakan agar kisi‐kisi yang terbentuk semakin rapat.   

Dalam praktikum ini migrasi protein dengan elektroforesis juga dilakukan pada tegangan 60 volt 

(rendah) dan lama pemisahan kurang lebih 4 jam agar didapatkan molekul protein yang berbeda dapat 

terpisah dengan baik. Penanda migrasi ditentukan dengan pewarna biru bromofenol. 

Pada praktikum ini digunakan 6 protein standar yang telah diketahui berat molekulnya, yaitu β‐

galaktosidase, bovine serum albumin, ovalbumin,  lactate dehidrogenase, REase Bsp98I, β‐lactoglobulin 

dan lysozyme dengan berat molekul secara urut seperti pada tabel 2. Dari elektroforesis diperoleh jarak 

migrasi dari protein‐protein  standar  yang  kemudian dibandingkan dengan  jarak migrasi pewarna biru 

bromofenol maka diperoleh rf. rf yaitu retension factor yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti 

pemisahan protein pada  gel menggunakan prinsip  penghambatan  terhadap  laju migrasi dari protein‐

protein  tersebut  sehingga  pemisahan  karena  perbedaan  berat molekul mengakibatkan  terbentuknya 

pita‐pita pada jarak migrasi yang berbeda satu sama lain dan jarak tersebut di konversi menjadi nilai rf. 

Hubungan antara berat molekul dan nilai rf‐nya dapat dilihat pada gambar 1. Dari hubungan  tersebut 

diperoleh model regresi liniernya, yaitu y= ‐1.333 x + 2.208.  

Dari  analisa  SDS  PAGE  dengan menggunakan  silver  staining, maka  diperoleh molekul  protein 

yang terdapat pada ekstrak enzim kasar dari hasil fermentasi dimana isolat 234 P‐16 menghasilkan satu 

pita pada jarak migrasi 5.6 cm dan isolat 45 I‐3 terdapat 3 pita protein yang masing‐masing berjarak 4.3 

cm,  4.8  cm  dan  5.5  cm,  sehingga  diperoleh  berat molekul  dengan  cara melakukan  intrapolasi  pada 

persamaan  regresi yang diperoleh dari protein  standar yang  telah diketahui berat molekulnya  seperti 

yang terlihat pada tabel 3.  

 Teknik zimogram  ini dapat mendeteksi protein yang masih mempunyai aktifitas katalitik.   Cara 

ini  hampir  sama  dengan  teknik  silver  staining,  yaitu  menggunakan  gel  poliakrilamida  yang 

dikombinasikan dengan SDS.  Perbedaannya terletak pada penambahan substrat pada gel elektroforesis. 

Pada pembuatan gel untuk zimogram, komposisi gel ditambahkan dengan 1% substrat bircwood xylan 

dengan  tujuan  protein  yang  mengandung  enzim  xylanase  akan  mendegradasi  substrat  xylan  yang 

ditambahkan  sehingga  ketika  dilakukan  pewarnaan  merah  Kongo  diperoleh  zona  bening  pada  pita 

protein  yang mengandung  enzim  xylanase  seperti  yang  terlihat  pada  gambar  2.  Baik  isolat  234  P‐16 

ataupun  isolat  45  I‐3  ada  pita  protein  yang memberikan  zona  bening  ketika  diberi  pewarna merah 

Kongo. 

 

Kesimpulan 

Dari percoabaan, diperoleh, 

1. Analisa SDS PAGE dengan dikombinasi silver staining adalah cara untuk mengukur berat molekul 

protein yang dipisahkan dalam gel SDS PAGE. 

2. Analisa SDS PAGE dengan  teknik  zimogram adalah untuk mengetahui  secara kualitatif apakah 

protein yang dipisahkan dengan SDS PAGE mengandung suatu enzim yang bersifat katalitik. 

3. Isolat 234 P‐16 menghasilkan 1 pita protein pada  SDS PAGE dengan  kombinasi  silver  staining 

dengan rf 0.93 dengan BM protein tersebut sebesar 9200 Dalton. 

4. Isolat 45 I‐3 menghasilkan 3 pita protein pada SDS PAGE dengan kombinasi silverstaining dengan 

masing‐masing rf adalah 0.72, 0.80,.0.92 dengan BM protein tersebut secara berurutan sebesar 

17890 Dalton, 13850 Dalton dan 9680 Dalton. 

DAFTAR PUSTAKA 

 

1. Beg QK,  Kapoor M,   Mahajan  L,  Hoondal  GS.  2001. Microbial  xylanases  and  their  industrial 

applications; a review. J. Appl. Micribiol. Biotechnol. 56:326‐338.  

2. Dunn, m.J. 1989. Determination of total Protein Concentration  . di dalam  : Protein Purification 

Methods. Harris, E.L.V. dan S. Angal (eds.). IRL Press, Oxford, England. 

3. Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notess. 2nd edition. Hongkong: 

Springger‐Verag. 

4. Kleiner,  D.E.  dan  W.G.S.  Stevenson.1997.  Quantitative  Zymography:  Detection  of  Picogran 

Quantities of Gelatinases. Anal. Biochem.228 : 325‐329. 

5. Leber ,T.M. dan Balkwil, F.R. 1997. Zymography : A single‐step Staining Method for Quantitative 

of Proteolytic Activity on Substrat Gels. Anal. Biochem. 249:24‐28. 

6. Paech, C., T. Christianson, dan K.H. Maurer. 1993. Zymogram of Protease Made With Developed 

Film  From Nondenaturing Polyacrylamide Gels  after Electrophoresis. Anal. Biochem. 208:249‐

254. 

7. Subramananiyan  S,  Prema  P.  2002.  Biotechnology  of  Microbial,  Xylanase:  Enzymology, 

Molecular Biology, and Application. Critical Rev Biotechhnol 22:33‐64. 

8. Wilson  K.  1994.  Protein  and  enzyme  techniques  In  Practical  Biochemistry,  (ed. Wilson  K  and 

Walker JM), Cambridge University Press. p.161‐226.