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Sécrétion des facteurs de virulence chez les
bactéries A GRAM négatiF
Responsable d’atelier:
BLEVES Sophie
Présentation de:ABBES Imen
M2 Recherche Microbiologie
Novembre 2011
Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion
injectisome
Andreas Diepold, Marlise Amstutz, So¨ ren Abel, Isabel Sorg, Urs Jenal and Guy R Cornelis*
The EMBO Journal (2010) 29, 1928–1940 | & 2010 European Molecular Biology Organization | All Rights Reserved 0261-4189/10
système de sécrétion de type III(T3SS)
Modèle du système de sécrétion de type III chez P.aeruginosa
(Thoma & Finlay, 2003)
Injectisome: véritable seringue moléculaire
Injection directe des protéines effectrices au travers de la membrane des cellules eucaryotes.
Joue un rôle clé dans le processus
infectieux d’un certain nombre d’agents pathogènes à Gram- (Yersinia, Salmonella, Eschirchia)
Différentes familles d’injectisomes mais model structurale est très conservé
Yersinia enterocolitica
Chez l’homme, est principalement responsable de gastro-entérites fébriles
Appartient à la famille des Enterobacteriaceae Bacille à Gram négatif Non capsulé L'expression des caractères phénotypiques dépend de
la température
T3SS de Yersinia enterocolitica
Formation d’Ysc température de 37°C
Effecteurs (Yop) Large répertoire d'activités biochimiques (inhibe la réponse pro-inflamatoire, module le trafic intra-cellulaire,.. )
Nécessite un contact cellulaire
Exportation des effecteurs
Modulation de la fonction des molécules de l'hôte au profit de la bactérie
l'exportation des Yops artificiellement déclenché en absence de contact cellulaire, par chélation Ca2+
Injectisome Ysc de Yersinia enterocolitica
25 protéines appelées Ysc
L'aiguille: tube creux (polymérisation hélicoïdale) YscF
L'anneau de la ME: YscC (sécrétine)
L'anneau la MI est appelé anneau MS: YscJ (lipoprotéine)
YscD: relie les anneaux dans les deux membranes
YscR, S, T, U, V: forme l’appareil d’export à travers la MI
Ysc N ( ATPase) associée à YscK et L (probablement en exerçant un contrôle sur l'activité ATPase) Anneau C: YscQ (lier le complexe ATPase)
Grande similarité avec le flagelle suggérant une relation évolutive
Injectisome Ysc de Yersinia sup.
L'assemblage du flagelle (linéaire et séquentielle)
Le scénario proposé (Kubori et al, 1992; Macnab, 2003) Anneau MS L'anneau C Composants périplasmique Composants OM Composants extracellulaires
(Cornelis, 2006)
l'assemblage de l'injectisome?
Des modèles d’assemblage ont été proposés
(Kimbrough et Miller, 2000)(Sukhan et al, 2001)
MAIS !! L'ordre exact des étapes de l'Assemblage de l’injectisome reste inconnu
Objectif
Etudier le processus d'assemblage de l’injectisome chez Yersinia
(Y.enterocolitica E40)
greffage des protéines fluorescentes sur
différentes parties de la machinerie de l’injectisome chez des mutants de
délétions
RESULTATS
Visualisation de l’injectisome et ses sous-unités
Allèles (wt): yscC, yscD et yscQ (sur le plasmide de virulence de Y.enterocolitica E40)
gènes hybrides codant pour les protéines hybrides fluorescentes: YscC-mCherry, EGFP-YscD et EGFP-YscQ
Délétion complète non-polaire de yscN
complémentée en trans avec un plasmide codant pour l'EGFP-YscN
Localisation des protéines hybrides
La présence des protéines hybrides à la périphérie des cellules n’est pas directement liée à la sécrétion des protéines Yop par T3SS
Spots de fluorescence à la périphérie des
cellules
indépendant de la concentration Ca2+
dans le milieu
Fonctionnalité des protéines de fusion
Souches: YscC-mCherryEGFP-YscNEGFP-YscQ
1-[Wt]2-[YscC–mCherry]3-[EGFP–YscD], 4-[ΔYscN+pBAD–egfp–yscN]5-[EGFP–YscQ]6-[EGFP–YscQ, YscC–mCherry]7-[ΔYscD, control négatif]
Analyse de la sécrétion des protéines Yop dans des conditions de sécrétion permissive (BHI (Brain Heart Infusion), фCa2+)
pleinement fonctionnelles
SouchesEGFP-YscD
Faible niveau des protéines effectrices
Toutes les protéines de fusion ont permis la formation d'aiguilles
Colocalisation de YscQ et YscC
EGFP-YscQ fluorescence verte YscC-mCherry fluorescence rouge
Colocalisation des taches (vertes et rouges)
Les spots fluorescents correspondent à l’assemblage du corps basal
(La Colocalisation des spots a été également observée pour EGFP-YscD et EGFP-YscN avec YscC-mCherry)
Colocalisation de l'aiguille avec les composants du corps basal
Immunofluorescence EGFP-YscQ + Ac contre la sous-unité d'aiguille (yscF)
La majorité des spots de YscF et YscQ colocalisent
l'aiguille est colocalisée avec les composants du corps basalles taches fluorescentes correspondent aux injectisomes fonctionnels
Comment procède l’assemblage de l'injectisome ??
L’insertion de la sécrétine (YscC) dans l’ME nécessite l’assistance de la
pilotine (YscW)(Burghout et al, 2004a; Guilvout et al, 2006)
YscC mCherry + YscWexprimés en trans dans (pMA8, pRS6) chez Y.enterocolitica E40 en absence de pYV (codant pour les composants de T3S)
YscC-mCherry localisée dans la membrane
Confirmation des résultats antérieurs montrant que: YscC exige uniquement la pilotine (YscW) pour
l'assemblage au niveau de l'ME YscW permet la localisation et l’oligomérisation des YscC
Mutants YscC-, YscD- ou YscJ- incapables d’assembler les composants cytosoliques YscN et YscQ
L'établissement des structures transmembranaires formées par YscC, YscD, et YscJ se fait au début de la formation de l’injectisome
Etude de la formation des spots membranaires en absence de différentes
protéines
Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ
L’allèle egfp-yscD (pYV) + délétions non-polaires dans yscC ou yscJ.
ΔYscC Pas de formation de spot d’EGFP-YscD à la membrane bactérienneΔYscJ Pas d‘effet sur l’assemblage
YscC s’insère le premier, suivi par YscD, et enfin YscJ
mauvaise localisation en absence de YscC
un niveau plus faible expression
Confirmation de l’ordre d’assemblage: YscC YscD YscJ
Copurification de YscC et YscD avec YscJ-tag
Copurification de YscC et YscJ avec YscD-tag
Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ
L'insertion de l'anneau de sécrétine dans l'ME est nécessaire pour l'association de YscD et YscJ
YscD fait le lien entre YscC et YscJ1
2
3
Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ
??
Formation de l'anneau C
L'anneau C se forme après l’assemblage des anneaux membranaires (YscC, YscD, YscJ)
Formation de l’anneau C
L'assemblage de l'anneau C requiert en outre ATPase YscN ainsi que les protéines YscK et YscL associées
Formation de l’anneau C
L'assemblage de l'anneau C requiert la présence des protéines structurales des anneaux membranaires (YscCDJ) et du complexe ATPase (YscNKL)
Formation de l’anneau C
L'anneau C s’incorpore uniquement en présence des anneaux membranaires (YscCDJ), et le complexe ATPase (YscNKL)
L'assemblage de l’ATPase YscN ?
L'assemblage de l’ATPase YscN
L’assemblage de l’ATPase exige la présence de la plate-forme YscCDJ de YscK de YscL et YscQ (anneau C)
les composants cytosoliques forment un seul grand complexe
ATPase-anneau C
L'anneau C s’incorpore uniquement en présence des anneaux membranaires (YscCDJ), et le complexe ATPase (YscNKL)
L’assemblage de l’ATPase exige la présence de la plate-forme YscCDJ de YscK de YscL et YscQ (anneau C)
L'activité ATPase de YscN est-elle nécessaire pour l'assemblage du
complexe ATPase-anneau C ?
L'assemblage de l'anneau C nécessite YscN comme une composante
structurelle
YscN(K175E) restaure la formation des spots de l'anneau C Les exigences de YscN pour la formation du complexe ATPase-anneau C est exclusivement structurelle.
YscN(K175E) n'était pas fonctionnel
Rôle de l’activité ATPasique de YscN dans le transport des substrats de
l’injectisome
L’activité ATPase est nécessaire pour la sécrétion: Des sous-unités de l’aiguille Des régulateurs Des protéines effectrices (Yop)
Chronologie de la formation de l’anneau C, de l’aiguille et de la
sécrétion des effecteurs
La cinétique de formation de l'anneau C, l'aiguille et sécrétion des effecteurs
La synthèse de YscQ a été rapidement activée juste après le shift de la température
le délai d'apparition de l'anneau C est similaire à celui de l’apparition de l’aiguilles et la sécrétion des effecteurs
Conclusions et Discussion
L'assemblage de l’injectisome (T3SS) est un processus complexe qui engage plus de 25 protéines différentes
Formation d'une nano-machine traversant les deux membranes bactériennes et se prolongeant hors de la bactérie
Modèle proposé pour le flagelle (Kubori et al, 1997; Macnab, 2003)
Processus d’assemblage mal connu
Même schéma général d'assemblage chez Salmonella entericaL’anneau de l’MI s’assemble d'abord, puis fusionne avec l'anneau de sécrétine dans l'ME (Kimbrough et Miller, 2002)
N'explique pas comment les deux anneaux membranaires se rejoignent
Les étapes ultérieures d'assemblage ??
Construction des souches dans lesquelles un certain nombre des constituants de l’injectisome ont été fusionnés à des protéines fluorescentes
Tous les injectisomes recombinants sont fonctionnels
Conclusions et Discussions
microscopie de fluorescence et de co-immunprecipitation
YscD est le connecteur entre les deux anneaux membranaires
cohérent avec la structure cristalline et des données récentes de modélisation (Spreter et al, 2009)
YscC s’assemble en premier (en présence de YscW) dans la ME, suivi par YscD et enfin YscJ
Différent du rapport précédent (Kimbrough et Miller, 2000) PrgH et PrgK, les homologues de YscD et YscJ de Salmonella , peuvent former un anneau indépendamment de YscC
Différent du rapport (Schuch et Maurelli, 2001): MxiD et MxiJ, les homologues YscC et YscJ de Shigella , interagissent même en absence du connecteur (YscD)
Ces différents modèles suggèrent une évolution convergente dans le processus de formation de ces systèmes d'exportation chez les
procaryotes
Conclusions et Discussions
YscC YscD YscJ
Formation d’un grand complexe cytosolique ATPase-anneau C (YscN, YscK, YscL, YscQ) qui n’exige pas l’activité ATPase de YscC
En parfait accord avec des résultats montrant les interactions entre YscK, yscL, YscN et YscQ (Jackson et Plano, 2000)
Conclusions et Discussions
Après l'assemblage des anneaux de l'ME et de l'MI, les composants cytosoliques peuvent s’assembler sur ces structures.
Modèle d'assemblage de l’injectisome
????
On sait peu sur la stœchiométrie, et la chronologie d’insertion des protéines formant l’appareil d’export à travers la MI, au cours du processus d'assemblage de l’injectisome
Perspectives
