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Juliana Ceballos GiraldoJuan Felipe Giraldo Aristizabal
Tercer semestreUniversidad Pontificia Bolivariana
Introduction
• Congenital is any characteristic present at the moment of birth that was acquired inside the womb. It might be the result of genetic, physical, chemical or infectious factors.
• Neutrophil Defect Syndrome characterized by a severe defect in neutrophils, bone marrow fibrosis, nephromegaly and life-threatening infections.
Introduction
• VPS45 mutation is a mutation that causes Thr224Asn or Glu238Lys modification depending on the ethnicity.
• The mutation of the VPS45 gen causes a defect in the neutrophils that is expressed before the birth what makes this a congenital condition, affecting the innate immunity.
Objective
• The study was performed in 7 kids that had similar symptoms : neutropenia, neutrophil dysfunction, bone marrow fibrosis and renal extramedullary haematopoiesis, in order to describe the mechanism of this new disease.
• The mutation of the VSP45 gen causes multiple defects that affects not only the neutrophil cells but also the fibroblasts.
Materiales y Métodos
Pacientes:
Estudio realizado en 7 niños. 4 familias palestinas y 1 marroquí. Presencia de síntomas anteriormente mencionados. Los padres firmaron consentimiento informado.
Materiales y Métodos
Polimorfismo de nucleótido simple (SNP):
La genotipicación de los SNP se realizó en ADN genómico con el uso del HumanOmniExpress DNA Analysis Bead-Chip.
Los SNPs fueron analizados mediante el uso del software GenomeStudio.
Materiales y Métodos
Secuenciación:
Se utilizó un método de hibridación en solución de captura de exones.
Las variantes del VPS45 fueron examinados por medio de secuenciación didesoxi, con cebadores que cubren el exón 7 y su región intrónica de acompañamiento.
Materiales y Métodos
Estudios celulares
Fibroblastos cultivados de biopsias del antebrazo de niños afectados.
Comparación con fibroblastos de adultos normales.
Materiales y Métodos
Transfección:
Transfección de los fibroblastos de los pacientes y de control con un vector pCMV6 con un plásmido Myc-DDK.
Su eficiencia fue de un 70%
Materiales y Métodos
Función neutrófila:
En neutrófilos aislados de sangre heparinizada se probó la producción de superoxido y H2O2.
También se realizó un análisis de las subunidades de la NADPH-oxidasa y la quimiotaxis.
Materiales y Métodos
Citometría:
Muestras de sangre periférica de pacientes y controles.
Fueron incubadas con anticuerpos anti-CD45 PerCP y anti-CD29 FTC.
Los linfocitos, granulocitos y monocitos fueron separados.
La expresión de ambos marcadores fue medida con citometría de flujo.
Materiales y Métodos
Estudios en el pez cebra:
Se microinyectó morfolinos de genes específicos en los sacos vitelinos de los embriones de pez cebra de la raza Ekkwill.
Los embriones se incubaron a 28°C en medio de embrión E3 por 24 horas post-fertilización.
Se realizó hibridación in situ con ribosondas y tinción con Negro Sudán B.
Fundamentos
Secuenciación:
Se utilizan desoxirribonucleótidos para terminar las cadenas y detener la elongación.
Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.
Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena.
Fundamentos
Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.
Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido.
En el estudio se utilizó para examinar las variaciones del gen VPS45 que causan los defectos.
Fundamentos
Transfección:
Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas para la transferencia.
Fosfato de Calcio, una solución salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar.
Fundamentos
Se forma un precipitado, quedando el DNA en su superficie.
Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar.
En el estudio se utiliza para ingresar a los cultivos de fibroblastos el ADN complementario mediante los vectores pCMV6.
Fundamentos
Citometría:
Se analiza La dispersión y difracción de la luz que ocurre cuando se la hace pasar por una suspensión de células.
Se analiza el tamaño y la complejidad de estas.
Fundamentos
Las células se pueden poner en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados.
En el estudio se utiliza para ver la expresión de los marcadores en la superficie celular en respuesta a los anticuerpos añadidos a las muestras de sangre.
Resultados
Los padres de las cinco familias fueron clínicamente sanosExámenes realizados en padres y hermanos, dieron resultados normales.
Figura 1
Resultados
En el estudio, algunos pacientes presentaron hematopoyesis extramedular.
Figura 1
Resultados
Hipercelularidad.Distorsión del tejido hematopoyético .Prominente fibrosis reticular.Fibrosis en todas las biopsias.
Figura 1
Resultados
Menor proporción de gránulos en los neutrófilos.
Mayor presencia de mitocondrias.
Aparato de Golgi y retículo endoplasmático más desarrollados.Figura 1
Resultados
Resultados
Expresión reducida de VPS45 en sangre y en fibroblastos de pacientes.
reducción de rabenosyn-5 y la sintaxina-16 (STX16)
Figura 2
Motilidad celular reducida en pacientes.
Fibroblastos recubiertos con fibronectina.
Figura 2
Resultados
Resultados
análisis de citometría de flujo para CD45 y β1 integrina La sangre del paciente tiene muchas menos células que son positivas para la integrina β1. Figura 2
Resultados
Presencia de apoptosis aumentada en fibroblastos de los pacientes
Figura 2
Resultados
Los niveles de las proteínas se restauran luego de la trasfección con un plásmido no mutado.
Figura 3
Resultados
Los fibroblastos transfectados tuvieron una motilidad mayor.
Figura 3
Resultados
La transfección con el vector de VPS45 no mutado reduce la apoptosis en un 50%.
Figura 3
Resultados
Figura 4
Conclusions
Progress in laboratory techniques and methods are
of great help in understanding molecular biology’s field and its importance in medicine, is of vital importance in explaining the mechanism by which certain diseases occur, in this case of congenital defect neutrophil syndrome associated with mutations in VPS45.
Conclusions
The use of these techniques are very useful in the clinic, as knowing exactly what is efective or mutated in patients with congenital defects in neutrophils, could eventually be given a better treatment.
Conclusions
The importance of understanding the molecular level of the diseases that have been around us troughout our lives is evident. The ability to achieve that specific level, will in the future recognize new methods of diagnosis and more effective treatments.
Conclusions
It's amazing to understand that the body is
completely perfect and that a minimum burst of normal functions, causes imbalance. For example neutrophil defects associated with VPS45 mutations cause a new immunodeficiency syndrome that involves deterioration in the function of neutrophils.
Discussion
Author Theory Yes or no
Malech HL One component of this system, the neutrophil, plays a particulary prominent role in the defense against bacterial and fungal infections.
Yes
Zucker- Franklin D Congenital neutropenia: and intrisic cell defect demonstrated by electron microscopy of soft agar colonies.
Yes
Discussion
Author Theory Yes or No
Kinchen JM One critical component of the endocytic pathway in neutrophils involves vacuolar sorting (VPS)
Yes
Rahajeng J Common and distinc roles for the binding partners Rabenosyn-5 and VPS45 in the regulation of endocytic trafficking in mammalian cells.
Yes
Mapa
Mapa
GRACIAS