Agrin expresszió primer májtumorban

Doktori értekezés

Dr. Batmunkh Enkhjargal

Semmelweis Egyetem

Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Kiss András, egyetemi docens

Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Tímár József, egyetemi tanár

Dr. Abonyi Margit, egyetemi docens

Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Jeney András, egyetemi tanár

Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Szentirmay Zoltán, egyetemi tanár

Dr. Moldvay Judit, egyetemi docens

Budapest

2007

2

1.TARTALOMJEGYZÉK 1.TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 2 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE....................................................................................... 4 3. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR .................................................................... 6

3.1. Primer májtumorok................................................................................................ 6 3.1.1. Hepatocellularis carcinoma ............................................................................ 6 3.1.2. Cholangiocarcinoma....................................................................................... 9 3.1.3. Hepatocellularis adenoma ............................................................................ 10 3.1.4 Cholangiocellularis adenoma ........................................................................ 10 3.1.5. Fokális Noduláris Hyperplasia ..................................................................... 11

3.2. Az extracelluláris mátrix (ECM) ......................................................................... 12 3.2.1. ECM: szintézis, lebontás, szabályozás ......................................................... 13 3.2.2. Az ECM szerepe a szöveti működés szabályozásában................................. 14 3.2.3. Az ECM és a tumorprogresszió.................................................................... 15 3.2.4. Az ECM összetétele humán májszövetben................................................... 16 3.2.5. Proteoglikánok mint ECM komponensek .................................................... 16

3.2.5.1. A proteoglikánok szerkezete ................................................................. 17 3.2.5.2. A proteoglikánok osztályozása.............................................................. 19 3.2.5.3. Az agrin mint BMHSPG ....................................................................... 24

3.2.5.3.1. Az agrin szerkezete................................................................................. 24 3.2.5.3.2. Az agrin típusai....................................................................................... 25 3.2.5.3.3. Az agrin funkciói .................................................................................... 26

3.3. A proteoglikánok szerepe májbetegségekben...................................................... 29 3.4. A BMHSPG-k szerepe az angiogenesisben ........................................................ 33

4. CÉLKITŰZÉSEK....................................................................................................... 36 5. ANYAG ÉS MÓDSZER............................................................................................ 37

5.1. Beteganyag ......................................................................................................... 37 5.2. Módszerek ........................................................................................................... 38

5.2.1. Fehérjeexpressziós vizsgálatok .................................................................... 38 5.2.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok............................................................ 38 5.2.1.2. Immunfluoreszcens vizsgálat ................................................................ 40 5.2.1.3. Morfometriai elemzés............................................................................ 40 5.2.1.4. Proteoglikán izolálása............................................................................ 41 5.2.1.5. Western blot analízis ............................................................................. 41

5.2.2. mRNS szintű expressziós vizsgálatok .......................................................... 42 5.2.2.1. RNS izolálás .......................................................................................... 42 5.2.2.2. Primertervezés és grádiens PCR............................................................ 43 5.2.2.3. mRNS expresszió vizsgálata real-time RT-PCR módszerrel ................ 45 5.2.2.4. Statisztikai kiértékelés ........................................................................... 46

6. EREDMÉNYEK......................................................................................................... 48 6.1. Agrin fehérje expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel ................. 48

6.1.1. Agrin expresszió ép és cirrhotikus humán májszövetben............................. 48 6.1.2. Agrin expresszió hepatocellularis carcinomában ......................................... 48 6.1.3. Az agrin expressziója más kötőszöveti fehérjékkel kolokálizációban. ........ 50 6.1.4. Agrint termelő sejtek májelváltozásokban ................................................... 51 6.1.5. Az agrin expressziójának vizsgálata a cholangiocarcinomában................... 53 6.1.6. Az agrin expresszió vizsgálata hepatocellularis adenomában...................... 55

3

6.1.7. Az agrin expresszió vizsgálata fokális noduláris hyperplasiában ................ 56 6.2. Az agrin fehérje expresszió vizsgálata Western Blot technikával....................... 57 6.3. Az agrin mRNS kimutatása real time RT-PCR-vel............................................. 58

7. MEGBESZELÉS........................................................................................................ 60 8. KÖVETKEZTETÉSEK.............................................................................................. 66 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................... 68 10. SUMMARY ............................................................................................................. 70 11. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................... 72 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE................................................................. 88 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................. 93

4

2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABC avidin - biotin komplex

AchR acetylcholine receptor

AEC 3-amino-9 ethyl-carbazole

AFP alfa-fetoprotein

ATP adenozin-trifoszfát

BM bazális membrán

BMHSPG bazális membrán heparán szulfát proteoglikán

bFGF basic fibroblast growth faktor, bázikus fibroblaszt növekedési faktor

BSA bovine serum albumin, borjú szérum albumin

CC cholangiocarcinoma

CCA cholangiocelullaris adenoma

CK cytokeratin

CS kondroitinszulfát

CSPG kondroitinszulfát proteoglikán

DAB 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid

DSPG dermatánszulfát proteoglikán

ECL enhanced chemiluminescence, erősített kemilumineszcencia

ECM extracelulláris mátrix

EDTA ethylene -diamine-tetraacetic acid

EGF epidermal growth factor, epidermális növekedési faktor

EHS Engelbreth-Holm-Swarm

GAG glükózaminoglikán

GAPDH glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase, glicerinaldehid-3-foszfát

dehidrogenáz

GBM gromeruláris bazális membrán

HBV hepatitis B vírus

HCA hepatocellularis adenoma

HCC Hepatocellularis carcinoma

HCV Hepatitis C vírus

HE hematoxilin –eozin

HS heparánszulfát

5

HSPG heparánszulfát proteoglikán

HRP horseradish peroxidase, tormaperoxidáz

IR idegrendszer

KSPG keratánszulfát proteoglikán

MuSK Muscle-specific tyrosine kinase, izom specifikus tirozin kináz

MMP matrix metalloproteinase, matrix metalloproteináz

NCAM neural-cell adhesion molecule, idegsejt adhéziós molekula

NEM N-etil- maleimid

NMJ neuromuszkuláris junkció

PBS phosphate-buffered saline, foszfát-pufferolt sóoldat

PCR polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció

PDGF platelet-derived growth faktor, vérlemezke eredetű növekedési faktor

PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid

PG proteoglikán

PTK protein tirozin kináz

RT reverse transcriptase, reverz transzkriptáz

SCG superior cervical ganglion, felső cervikális ganglion

SD standard deviation, standard deviancia

SDS-PAGE sodium-dodecil-szulfát -poliakrilamid gél elektroforézis

SMA smooth muscle actin, simaizom aktin

TBE tris-borát-EDTA

TBS tris-buffered saline, tris-pufferolt sóoldat

TGF transforming growth factor, transzformáló növekedési faktor

TIMP tissue inhibitor of metalloprotease, metalloproteázok szöveti inhibítora

TNF tumor necrosis factor, tumor nekrózis faktor

VEGF vascular endothelial growth factor, vaszkuláris endotél eredetű növekedési faktor

6

3. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR

3.1. Primer májtumorok

3.1.1. Hepatocellularis carcinoma

A daganatok okozta halálozások száma évente világszerte növekszik. Az utóbbi

15 év során a daganatos halálozások száma a férfiak esetében átlagosan 12-, a nők

esetében pedig 9 százalékkal emelkedett az Európai Unióban. A Nemzetközi Rákkutató

Intézet napokban közzétett tanulmánya szerint tavaly 39 európai országban mintegy 3,2

millió új daganatos megbetegedést diagnosztizáltak, ami 300. 000-rel több mint 2004-

ben volt. 2006-ban Európa-szerte 1,7 millióan haltak meg rákos megbetegedés

következtében. (http://www.aerzteblatt.de/v4/news/news.asp). A daganatos elhalálozás 21,6%-

át teszi ki az összes halálozásnak. A hepatocellularis carcinoma (HCC) a világszerte

előforduló rosszindulatú daganatoknak mintegy 4%-át teszi ki, férfiak között a hetedik,

nők között a kilencedik helyen áll gyakoriságban. Világviszonylatban körülbelül

félmillió új beteggel kell számolni évente (Bosch és mtsai, 2004).

Magyarországon a rosszindulatú daganatos megbetegedések halálozási aránya

rendkívül kedvezőtlen, a szív- és keringési rendszer-eredetű halálokok mögött a

második helyet foglalja el, kb. 25%-os gyakorisággal. A nagy európai, illetve

nemzetközi halálozási felmérésekben férfiaknál az első, nőknél pedig a második helyen

állunk (Otto és Kasler, 2005).

Az emésztőrendszer betegségeinek tulajdonítható halálozások gyakorisága a

világon a második legmagasabb mortalitással jellemzi Magyarországot. Szembetűnő

növekedés tapasztalható az elmúlt évtizedekben a krónikus májbetegségek, elsősorban

májzsugor és májrák okozta halálozásban. 100 ezer lakosra számítva 66 haláleset jut,

ami hétszerese az EU átlagnak (www.datanet.hu).

Az ázsiai országokban az európai adatokkal szemben a daganatok okozta halálok

között elsők között említendő a primer májrák. Ezen országok között különös helyet

foglal el Mongólia, ahol a HCC legnagyobb előfordulási aranyát dokumentálták,

100.000 lakosra 99 esetet (www-dep.iarc.fr). Az utóbbi évek adatai szerint itt a primer

7

májrák a malignus tumorok okozta halálozások mintegy 44%-át teszi ki (Oyunsuren és

mtsai, 2006).

Etiológia

A májdaganatok az utóbbi években növekvő számban kerülnek felismerésre.

Ennek oka részben az, hogy a detektálás módszerei érzékenyebbé válnak, elsősorban a

képalkotó eljárások fejlődése következtében. Másrészt viszont az emelkedés oka

összefügghet egyes etológiai tényezők, elsősorban a hepatitis C-vírus (HCV) és a

hepatitis B-vírus (HBV) fertőzés, az ipari mérgekkel és egyéb toxikus anyagokkal való

expozíció nagyobb arányával (Schaff és mtsai, 2004).

A krónikus vírusfertőzések gyakran vezetnek cirrhosishoz, ami önmaga is fontos

kockázati tényező a májrák kialakulásában (Kiss és mtsai, 2002).

A HBV és a HCC kapcsolatát azok a szeroepidemiológiai vizsgálatok vetették fel

először, amelyek igazolták a szoros összefüggést a HBV-infekció és a HCC

előfordulása között Ázsiában. A HCC előfordulása 100-szoros volt HBV- fertőzött

személyekben a HBV negatívakhoz képest (Beasley és mtsai, 1981).

Európában, ahol a HBV nem hiperendémias, mint Ázsiában, a HCV

előfordulását sokkal gyakoribbnak találták HCC-ben, mint a HBV jelenlétet (el Serag,

2001). A HCV-infectiót követően a HCC kifejlődésére kb. 25-30 év elteltével lehet

számítani.

Bármilyen okból eredő krónikus májsejtkárosodás és a kísérő regeneráció

kapcsán a mitózisok a DNS-t fogékonnyá teszik a genetikai alterációkra. Ezért a

krónikus májbetegség más formái is kockázati tényezőt jelentenek májrákra, és e

tekintetben az alkoholos májbetegség, egyéb toxikus tényezők, valamint

anyagcserezavarok, így az α1-antitrypsin hiány, a haemochromatosis és a tyrosinaemia

jön szóba.

Afrikában és Dél-Kínában az Aspergillus flavusból és Aspergillus parasiticusból

származó aflatoxin nagy közegészségügyi probléma (Henry és mtsai, 2002). Ez a

mycotoxin potenciálisan carcinogen, a májrák gyakori előfordulásában ugyancsak

jelentős, mégpedig azáltal, hogy a tumorszuppresszor gén p53 259-es kodonjában

specifikus mutációt indukál (Smela és mtsai, 2001).

8

Hormonális tényezőkre utal a HCC gyakoribb előfordulása férfiakban, valamint

az a tény, hogy a hosszan tartó androgen terápiával is kapcsolatos a tumor előfordulása.

Egyébként orális anticoncipiensek, tórium-dioxid és vinil-klorid-expozíció is kockázati

tényezőnek tekinthető a májdaganatok keletkezésében.

A fent említett oki tényezők közül Mongóliában a vírusfertőzések és az

alkoholfogyasztás szerepe említendő (Oyunsuren és mtsai, 2006).

Pathologia

A HCC makroszkóposan szoliter, multiplex nodularis vagy diffúz formában

mutatkozhat (Schaff és mtsai, 2004). Az esetek közel 70%-ában cirrhosis talaján alakul

ki. A tumor nagyságától függően vérzés, necrosis gyakori. A kisebb méretű HCC-k

tokkal rendelkezhetnek. A progresszió mértékét a tokinfiltráció, a fiókdaganatok

jelenléte és az érinvázió jelzi.

Hisztológiailag trabecularis, acinaris (pseudoglandularis) és szolid (kompakt)

szerkezetű formákat különíthetünk el. Emellett speciális szöveti szerkezetű tumorok is

észlelhetőek, így a világossejtes, óriássejtes, eozinofil sejtes forma. Külön entitás a

fibrolamellaris típusú HCC. Ezen jellegzetes szöveti szerkezetű daganat cirrhosis

mentes májban, fiatalabb életkorban fordul elő, fokális noduláris hyperplasia (FNH)-hoz

hasonló centrális heg és jobb prognózis jellemzi.

A HCC TNM klasszifikációjának elve hasonló az egyéb tumorokéhoz. A T1-T3

kategóriák közötti differenciálást a tumorátmérő, a daganat szoliter vagy multiplex

volta, a lebenyek érintettsége határozza meg.

A HCC klinikai detektálásában a képalkotó módszerek mellett az alfa-

fetoprotein (AFP) meghatározás jelentős, bár bizonyos korlátokkal. Az AFP

hisztológiailag is detektálható, és fontos marker a HCC diagnosztikájában. Újabb

adatok alapján a HCC-k két jól elhatárolható csoportra oszthatók az AFP termelés

alapján (Lee és Thorgeirsson, 2002). Magasabban differenciált daganatokban az AFP

mRNS expressziója alacsonyabb, mint a differenciálatlanokban.

A HCC differenciáltsági fokozatai követik a I-IV beosztást, a magasan

differenciált formától a differenciálatlan formáig, mely egyes szerzők szerint a

prognózissal is összefügg (Nagy és mtsai, 2006).

9

3.1.2. Cholangiocarcinoma

Kiindulhat az epeutak bármely szakaszából, a kis epecapillarisoktól a közös

epevezetékig. A daganat elhelyezkedése alapján megkülönböztetünk intrahepatikus (5-

10%) és extrahepatikus epeúti tumorokat (20-30%), valamint az Altemeier és Klatskin

által leírt ún. hiliaris tumorokat (60-70%) (Klatskin-tumor) (Nakeeb és mtsai, 1996).A

cholangiocarcinomák (CC) több mint 90%-a adenocarcinoma, a sejtek egyszerű

duktularis elrendeződésével és fibrosus stromával.

Epidemiológiájára jellemző, hogy ritkábban fordul elő, mint a HCC és a primer

máj malignus tumorok 5-10%-át képviseli, kivéve a Távol-Keleten, ahol ez az arány

20% is lehet (Vauthey és Blumgart, 1994). Általában idősebbekben észlelhető, mint a

HCC, jellemzően a 6. és 7. évtizedben levő férfiakban (Shaib és el-Serag, 2004).

Az epeútrák kialakulásában különböző kémiai anyagok szerepéről számoltak be.

A tórium-dioxid (thorotrast), mint korábban jól ismert röntgen-kontrasztanyag, bár

ritkán, de oka lehet a CC-nek (Sahani és mtsai, 2003).

Epeúti paraziták szerepe is igazolódott. Távol-Keleten a Clonorchis sinensis,

hátsó-Indiában az Opisthorchis viverrini nevű intrahepaticus parazita szabadgyök-

termelés révén stimulálja a sejtproliferációt (Watanapa és Watanapa, 2002).

Colitis ulcerosában megnő a CC kockázata (10-szeres az átlag népességhez

viszonyítva), főleg azokban a betegekben, akiknek több mint 10 éves a kórlefolyása

(Broome és mtsai, 1996). Primer szklerotizáló cholangitisben is leírták a tumor

gyakoribb előfordulását (Shaib és el Serag, 2004). Az epekő szerepét az extrahepatikus

formák keletkezésében felvetették, de e téren az oki kapcsolat nem bizonyított (Su és

mtsai, 1997).

Makroszkóposan a CC szürkésfehér, tömött, szoliter vagy multiplex göb

formájában mutatkozik. Esetenként mucin termelés, nagyobb daganatokban centrális

necrosis észlelhető (Kopper L, Schaff Zs. 2004).

Az epeúti tumorok szövettana 90%-ban adenocarcinoma. Lehet papillaris, ill.

sclerosus, diffúzan terjedő. A papillaris típus a ritkább, de kevésbé agresszíven

viselkedő forma (Albores-Saavedra és mtsai, 2000). A tumor esetek kb. 35%-a

lokalizálódik a ductus choledochusra (Tompkins és mtsai, 1991).

Immunhisztokémiailag a daganatsejteket a CK7 pozitivitás jellemzi.

10

3.1.3. Hepatocellularis adenoma

A hepatocytákból kiinduló, ritka, jóindulatú daganat. Leggyakrabban fiatal

nőkben fordul elő; számos adat szól az orális fogamzásgátlókkal és az androgén

szteroidokkal való kapcsolat mellett (Trotter és Everson, 2001a). A hepatocellularis

adenoma (HCA) kialakulásának oka lehet a glikogéntárolási betegségek (Biecker és

mtsai, 2003). Általában nem cirrhoticus májban, egyesével alakul ki, ritkán multiplex.

Színe eltér a környezettől, halványabb, a felhalmozott zsír miatt többnyire sárgás,

homogén szerkezetű, de az érgazdagság miatt vérzésekkel tarkított lehet.

Mikroszkóposan szabályos, de az átlagos hepatocytáknál nagyobb sejtekből épül

fel, amelyek két-három sorban helyezkednek el, trabeculákat és/vagy tubulusokat

képezve. A tumorban nincsenek epeutak és portális mezők, vannak viszont

szinuszoidok és az ezeket bélelő Kupffer-sejtek. Néha cytoplasmaticus eperögök, illetve

canalicularis epedugaszok arra utalnak, hogy a májsejtekben megtörténik a bilirubin

konjugációja. Egyes esetekben a daganaton belül kifejezett érhálózat van. Ezek

vékonyabb-vastagabb falúak, bennük gyakoriak a frissebb és régebbi thrombusok. A

HCA nem tartalmaz epeutakat és ebben különbözik a fokális noduláris hyperplasiától

(Grazioli és mtsai, 2001). Biopsziás vizsgálattal többnyire biztonsággal

diagnosztizálható, kivéve a dysplasiával járó eseteket, melyek elkülönítése a magasan

differenciált HCC-től nehéz lehet (Schaff Z és Nagy P, 1997). A HCA legnagyobb

veszélye az esetleges malignus transzformáció lehetősége, mely különösen az

anyagcserezavarok talaján kialakult formákban gyakori.

3.1.4 Cholangiocellularis adenoma

Epeutak hámsejtjeiből indul ki. Szürkésfehér, tömött, szívós, szoliter vagy

multiplex, nem ritkán szubkapszulárisan elhelyezkedő daganat. Változó nagyságú lehet,

de többnyire 1 cm-nél kisebb. Szövettanilag a proliferáló epeutakra jellemző köb- vagy

hengerhámmal bélelt dúctusok láthatók, tömött kötőszövetbe ágyazva. A makroszkópos

képen adenocarcinoma metastasisával vagy cholangiocelluláris carcinomával

téveszthető össze. Ez különösen akkor merül fel, ha az 1 cm körüli tumor multiplex és a

tok alatt helyezkedik el.

11

3.1.5. Fokális Noduláris Hyperplasia

A daganatszerű elváltozások közé tartozik. A fokális noduláris hyperplasia

(FNH) gyakori jóindulatú fokális májelváltozás, az összes primer májtumor 8%-át teszi

ki (Biecker és mtsai, 2003a). A kialakult sejttömeg inkább reaktív elváltozás (a

cirrhosishoz hasonlóan) és nem rendelkezik a daganatok progresszív proliferációs

sajátosságával, valamint a daganatokra jellemző génalterációkkal, beleértve a p53

mutációt is (Schaff és mtsai, 1995). Általában szoliter, ritkábban multiplex; változó

nagyságú lehet, tok nem határolja. Jellegzetessége az igen kifejezett centrális, gyakran

csillag alakú heg a lézió központjában, amely az atípusos vaskos falú kanyargós ereket

tartalmazza. Az éranomáliák következtében a vérzés és ruptura gyakori. Szövettanilag a

hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabeculákat képeznek, köztük portális traktusoknak

megfelelő képleteket láthatók. Az epeút proliferáció igen kifejezett (Hussain és mtsai,

2004). A nőkben gyakrabban fordul elő; orális contraceptivumok szedésével is

összefüggésbe hozzák, ám sokan tagadják ezt a kapcsolatot (Trotter és Everson, 2001).

A májtumor rizikócsoportok szűréséhez és a betegkövetéshez, a kiújulás és a

progresszió megelőzéséhez megfelelően érzékeny és specifikus markerekre van

szükség. Elsődleges fontosságú lenne a betegek kiszűrése minél korábbi stádiumban,

amikor a tumor a helyi kezelésre még jobban reagál. Emellett olyan szisztémás

kezelések kidolgozása is fontos cél, melyek hatékonyan gyógyítanák a betegeket

előrehaladott stádiumban, lehetővé téve ezáltal a máj funkciójának megtartását és

elkerülhetőek lennének a kiterjedt műtétek. A primer májtumorok kutatásának

elsődleges célja, hogy a különböző biológiai viselkedésű daganatok kialakulásának,

progressziójának genetikai hátterét megértsük és erre alapozva új, célzott terápiás

eljárások kerüljenek kidolgozásra.

A májtumorok patogenezisében a vírusfertőzések, illetve más etológiai tényezők

különböző elváltozásokon keresztül vezetnek a máj tumoros elváltozásához. Ez is, mint

általában a tumorgenesis, többlépcsős folyamat eredménye. Különböző

szignáltranszdukciós útvonalak aktivizálásán keresztül a stromának is jelentős szerep jut

a daganat progressziójában. A daganatos szövetté fejlődés egyik alapfeltétele a

12

daganatos stroma kialakítása, így az utóbbi időben egyre inkább előtérbe került az

extracelluláris mátrix kutatása, mely új megvilágításba helyezi a májban zajló

patológiás elváltozásokat, többek közt a fibrogenesis, a cirrhosis valamint a

carcinogenesis mechanizmusát.

3.2. Az extracelluláris mátrix (ECM)

Az ECM elválasztja a különböző szöveti részeket, biztosítja a sejtek

kapcsolódását és meghatározza a szöveti architektúrát. Az ECM, illetve annak egyes

komponensei nemcsak a szövetspecifikus szerkezet kialakításáért felelősek és az

intercelluláris kapcsolatok megteremtésében vesznek részt, hanem újabb megfigyelések

szerint közreműködnek a sejtek proliferációjában, differenciációjában, szövetspecifikus

működésében, életképességének fenntartásában, valamint a biokémiai és a celluláris

szerkezetet szabályozó jelátvitelben. Az ECM-sejt interakció eltérése több kóros állapot,

így a malignus transzformáció és progresszió jellemzője (Liotta, 1982). Az ECM

mennyisége, struktúrája szervenként, szövetenként változó. Hámszövetekben normális

körülmények között az ECM aránya nagyon alacsony, mindössze a sejtek bazális

felszíne alatt végighúzódó bazális laminára korlátozódik, azonban a mesenchymális

eredetű kötő- és támasztószövetekben – a sejtes elemekhez viszonyítva – nagy

mennyiségben van jelen.

Az ECM alkotórészek termelésére számos sejt képes, ezek közül a fibroblasztok,

oszteoblasztok, simaizomsejtek, endothelsejtek érdemelnek említést. Az ECM-et alkotó

fehérjék főbb csoportjai a strukturális fehérjék (elasztin, kollagén), adhéziós

tulajdonságokkal rendelkező fehérjék (fibronektin, tenascin), proteoglikánok és bazális

membrán fehérjék (kollagén IV, laminin, entactin) (Alberts és mtsai, 1989). Az ECM

szinte minden fehérjéje képes a sejtek biológiai viselkedésének a befolyásolására. Főleg

a proteoglikánok alkalmasak növekedési faktorok kötésére, tárolására, aktiválására és

inaktiválására, esetleg ko-receptorként felkínálni a tumorsejtek felszíni receptorai

számára.

13

3.2.1. ECM: szintézis, lebontás, szabályozás

Sokáig az ECM-et csak támasztó szöveti komponensnek tekintették és passzív

szerepet tulajdonítottak neki. Mai ismereteink szerint a stroma igen aktív

kölcsönhatások színtere, jeltovábbító rendszere.

A tumorok csupán növekedésük kezdeti szakaszában (az avaszkuláris fázisban)

épülnek fel csak daganatos sejtekből. A szövetté fejlődés alapfeltétele a daganatos

stroma kialakítása. A daganatos stroma nagymértékben eltér a normál szövet

stromájától. A daganatszövet ezt újonnan szintetizálja vagy termelteti a nem tumoros

mesenhymális eredetű sejtekkel (fibroblasztok, myofibroblasztok, histiocyták, endothel

és gyulladásos sejtek). Egyes kutatók szerint a stroma termelése a tumorsejtek genetikus

kontrollja alatt áll és a tumorprogresszió elősegítése a cél. Bizonyos változások

jellegzetesek lehetnek egy tumortípusra. Számos proteoglikán, illetve a cukorláncok

magas expressziója kedvez a tumorprogressziónak. Ezt az elképzelést támasztja alá az

az eredmény is, hogy a magas metasztázis-hajlamú tumorok más proteoglikán

expresszióval rendelkeznek, mint a nem metasztatizáló típusok (Timár és mtsai, 1995).

A mátrix-szintézis fő stimulátora a transforming growth faktor β1 (TGFβ1),

mely számos mátrixfehérje (fibronektin, I, III, IV típusú kollagén, elasztin) fokozott

termelését indukálja (Cheng és Grande, 2002; Ronnov-Jessen és Petersen, 1993).

Emellett más növekedési faktorok, többek között a tumor necrosis faktor (TNF),

epidermal growth faktor (EGF), basic fibroblast growth faktor (bFGF), platelet-derived

growth faktor (PDGF), valamint az interleukinek is részt vesznek a szintézis

szabályozásában, részben a mátrix fehérjék termelésének stimulálásával, részben az

ezeket termelő sejtek számának növelésével. Vérellátás nélkül a daganatszövet

életképtelen, ezért a tumor növekedése és terjedése szempontjából lényeges növekedési

faktorok a bFGF és a vascular endothelial growth faktor (VEGF), melyek az

endothelsejtek proliferációját, a daganatos érújdonképződést stimulálják. Fontosságukat

támasztja alá, hogy gátlásuk akadályozza a daganatnövekedést (Angelucci és Bologna,

2007).

14

Mivel a tumorprogresszió számos eseménye megköveteli a daganatsejtek és a

környező mátrix kapcsolatát, feltételezhető, hogy az ECM minősége hatással van a

sejtek biológiai viselkedésére. A pontos molekuláris mechanizmus ma még nem ismert.

Az invazív tumorsejtekben számos mátrixbontó enzim expressziója fokozódik.

A proteolitikus enzimek három csoportját különítik el: cisztein/aszpartil proteinázok,

mátrix metalloproteinázok (MMP), szerin proteázok (Metayer és mtsai, 2002).

Előfordul, hogy az invazív fenotípus kialakulásakor nem a mátrixbontó enzimek

expressziója fokozódik, hanem a gátlófehérjék expressziója csökken. Mindhárom fő

mátrixbontó enzimrendszernek megvan az inhibitora. Az MMP-9/2 kollagénáz IV gátlói

például a TIMP1/2 fehérjék (tissue inhibitor of metalloprotease), a katepszinek gátlói a

stefinek, míg a plazminogén aktivátor rendszer gátlói a plazminogén inhibitorok.

A kollagenázok jelentőségét igazolja az a kísérletes adat, mely szerint TIMP-t

tumorsejtekbe transzfektálva azok elvesztik invazív karakterüket (Gallegos és mtsai,

1995).

3.2.2. Az ECM szerepe a szöveti működés szabályozásában

A szöveti kötelékben a sejteket egymástól az ECM választja el. Passzív,

térkitöltő funkcióját is beleértve a szerv alakját, méretét, felépítését szabja meg,

valamint különböző szignálok, növekedési faktorok, enzimek, hormonok tároló és

továbbító helye. Ezek kötését, aktiválását, inaktiválását feltehetően a proteoglikánok

végzik, befolyásolva a sejt-sejt, sejt-mátrix kölcsönhatásokat, valamint a

sejtproliferációt. Napjaikban az ECM aktív szerepét a regenerációs folyamatokban is

egyre inkább hangsúlyozzák. A bazális membrán molekulaszűrőként szerepel. Negatív

töltésű cukorláncai révén szelektíven ereszt át bizonyos molekulákat a vesetubulusokba,

vízmolekulákat kötve befolyásolja a szöveti hidratációt, és szövetspecifikus

génexpresszió-regulátorként serkentő vagy gátló funkciót tölthet be.

A normális ECM fehérjéinek gyakorlatilag mindegyike megtalálható a daganatos ECM-

ben is: a szerkezetet biztosító fehérjék, mint a kollagének és az elasztin; az adhéziós és

antiadhéziós molekulák mint a laminin, fibronektin, vitronektin, entaktin, tenascin,

proteoglikánok (decorin, versican, syndecan), és szinte minden fehérje képes a sejtek

biológiai viselkedésének a befolyásolására. Normális és daganatos sejtek egyaránt

15

rendelkeznek mátrixfehérje receptorokkal, melyek megfelelő ligand jelenlétében jeleket

közvetítenek a sejt számára. Legismertebb receptorcsalád az integrinek családja, ezek

főleg Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)-régiokon keresztül a laminint, fibronektint, kollagént

képesek megkötni.

Az ECM szerepei közé tartozik a mikrokörnyezet megváltoztatása. Egyes ECM

fehérjék, elsősorban a proteoglikánok, nagy vízkötő képességgel rendelkeznek, így

fokozott termelődésük laza mátrixot eredményez, mely a tumorsejtek terjedését segíti

elő (Madri és Marx, 1992). Számos ECM fehérje multidomain szerkezetet mutat. A

tenascin, laminin, trombospondin és az egyes proteoglikánok (pl. az agrin, perlecan)

bizonyos domainjai növekedési faktorokkal mutatnak homológiát. Kísérletileg

igazolták, hogy ezek a domainok képesek a növekedési faktor receptorához kötődni és

stimuláló hatást kiváltani.

Az ECM-mel kapcsolatban lévő növekedési faktorok közül a legismertebbek a heparint

és heparánszulfátot kötők. Ilyenek a TNF és TGF család, melyek fontos szerepet

játszanak a tumorok növekedésében.

3.2.3. Az ECM és a tumorprogresszió

A tumorprogresszió alapvető feltétele a daganatos stroma kialakítása. Ez a

neostroma támasztékot nyújtva lehetővé teszi a tumorsejtek jellemző elrendeződését,

biztosítja a tumorszövet vérellátását, modulálja a biológiailag aktív molekulák

transzportját.

A daganatos stroma kedvezhet a tumor terjedésének és növekedésének, vagy tükrözheti

a környező normál szövet védekezési, valamint elhatárolási törekvéseit, tehát lehet

serkentő vagy gátló (Mueller és Fusenig, 2002).

A tumorsejtek kapcsolódása az ECM molekuláihoz membránreceptorokon

keresztül történik (integrinek), melyek szintézise és sejtfelszíni expressziója jellegzetes

az adott tumorra ill. tumor régióra (Eble és Haier, 2006). A malignusan transzformált

sejtek képesek olyan proteázokat (pl. mátrix metalloproteázok) ill. proteáz aktivátorokat

termelni, melyek a tumorsejtek migrációját, invázióját a mátrix degradálásával teszik

lehetővé. Továbbá a tumorsejtek képesek a gazdaszervezet sejtjeit (fibroblasztok)

16

mátrix molekulák termelésére késztetni és ezáltal a maguk számára megfelelő miliőt

kialakítani.

A tumorsejtek túlélésének, proliferációjának másik lényeges mozzanata a

tumorsejteket tápláló tumorérhálózat létrehozása, amely folyamat elengedhetetlen, ha a

tumor mérete 1-2 mm-nél nagyobbra nő és amikor már nem képes a környező

szövetekből biztosítani az anyagcsere működését. A tumor angiogenesis elősegítésében

a számos tumorszövetből izolált és tumorsejtek által szekretált vascular endothelial

growth faktor / vascular permeability faktor szerepe tűnik kulcsfontosságúnak, amely

növekedési faktorok serkentik az endothelialis sejtek proliferációját és fokozzák a

permeabilitást (Timár és mtsai, 2006).

A daganatsejtek a környező stromával állandó, dinamikus kapcsolatban vannak.

Részben saját létükhöz új, ún. „neostromát” termelnek, vagy erre késztetik a kötőszöveti

sejteket, másfelől növekedésük és terjedésük során a már levő stromát lebontják. A

stroma felől szignálok jutnak el a daganatsejtek felé, melyek azok viselkedését

befolyásolják.

3.2.4. Az ECM összetétele humán májszövetben

A normál májban az ECM makromolekulák dinamikus komplexe, mely a máj

rostos vázát képezi és részben a Disse-térben foglal helyet. Az ECM fehérjék

termelődésének fokozódása vagy lebontásuk csökkenése az ECM felszaporodásához

vezet, mely a Disse-tér lezárásával mechanikusan akadályozza a makromolékulák

szabad cseréjét a hepatocyták és plazmatér között. Újabb ismereteink szerint a

strukturális szerep mellett aktívan részt vesz a szervet alkotó sejtek működésének

szabályozásában és nélkülözhetetlen a hepatocyták differenciált funkcióinak

ellátásához. Az ECM-et alkotó makromolekulák három csoportba sorolhatóak, 1.

kollagének, 2. nem kollagén glikoproteinek és 3. proteoglikánok (PG).

3.2.5. Proteoglikánok mint ECM komponensek

17

3.2.5.1. A proteoglikánok szerkezete

A proteoglikánok olyan ECM komponensek, melyek a sejtfelszínen, de a sejten

belül is előforduló makromolekulák. Jellegzetességük, hogy vázfehérjéikhez savas

karakterű cukorláncok, a glükózaminoglikánok (GAG) kapcsolódnak. A GAG-ok olyan

elágazás nélküli poliszacharidok, amelyekben egy diszacharid egység ismétlődik,

melynek egyik tagja mindig egy amino-cukor (N-acetil-glükózamin vagy N-acetil-

galaktózamin), ami igen gyakran szulfatálódik is. A másik cukor általában egy uronsav

(Gallagher és mtsai, 1986). Mind a szulfát-, mind a karboxil-csoport negatív töltést

hordoz, így a GAG-ok az emlős sejtek által termelt leganionosabb molekulák. Ezáltal

sok kationt képesek kötni, amiket pedig vízmolekulák kísérnek. Jellemző, hogy nagyon

kiterjedt konformációt vesznek fel, miáltal nagy terek kitöltésére képesek. Négy nagy

csoportra bonthatók a GAG-ok az őket felépítő cukorkomponensek alapján: 1)

hialuronan (hialuronsav), 2) chondroitin-szulfát (dermatánszulfát), 3) heparánszulfát, 4)

keratánszulfát (Taylor és Gallo, 2006).

A glikoproteinekre általában 1-60 tömeg% szénhidráttartalom jellemző, míg a

proteoglikánoknak hosszú (átlagosan 80), elágazásmentes szénhidrátláncai a teljes

molekula tömegének 95%-át is kitehetik. Két példa proteoglikánokra: a porcszövet

zömét adó aggrecan több mint 100 GAG lánccal rendelkező fehérjemolekula, míg a

kollagénrostokhoz kapcsolódó decorinnak csak egyetlen GAG lánca van. A

proteoglikán vázát adó fehérjemolekula a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon

szintetizálódik, annak üregébe kerül. A szénhidrát oldalláncok ezt követően a Golgi

apparátusban kapcsolódnak e fehérjéhez. Első lépésként egy tetraszacharid csatoló

(link) alakít ki kovalens kötést egy szerin oldallánccal. Egy fehérje sok szerint

tartalmazhat és nem ismert az a mód, ami meghatározza, hogy ezek közül melyek

kapcsolódjanak a poliszacharid lánccal. (Feltételezhetően a fehérje konformációja

hordozza az információt.) Ezt követően a glikozil-transzferáz enzim a tetraszacharid

lánchoz egyesével újabb monoszacharidokat kapcsol, úgy, hogy az újonnan létrejövő

lánc leginkább ismétlődő diszacharid egységekből fog állni. Még mindig a Golgi

apparátushoz kötött állapotban zajlik le a polimerizált cukormolekulák esetleges további

kovalens módosítása (epimerizáció, szulfatálás). Figyelembevéve a vázfehérjeként

szóba jövő proteinek és a GAG-ok felépítésére rendelkezésre álló cukorkomponensek

18

számát, a lehetséges proteoglikánok száma csaknem végtelen (Silbert és Sugumaran,

2002; Sugahara és Kitagawa, 2002).

A proteoglikánok sokféleségét látva nem meglepő, hogy szerepük nem

korlátozódik a sejtek közötti hidratált közeg létrehozására. A GAG oldalláncok

variálásával pl. eltérő pórusméretű, töltésű géleket alakíthatnak ki, ami megszabja a

proteoglikánon belüli diffúziós folyamatokat. Erre példa a vese glomerulusainak bazális

laminájában található agrin és perlecan (heparánszulfátok közé tartoznak), amely

megszabja, hogy mi juthat a vérből a szűrletbe (Rabenstein, 2002). A proteoglikánok

kémiai jelátviteli folyamatokba is bekapcsolódnak. A fibroblast növekedési faktorok

(FGF) számos sejtféleség osztódását serkentik. Ez a faktor heparán-szulfát

oldalláncokhoz kötődve oligomerizálódik, ami szükséges receptorának aktiválódásához

(Kato és mtsai, 1998). Egy másik növekedési faktor, a TGF-β nem GAG oldallánchoz,

hanem a protein komponenshez kapcsolódik és ez a kötődés meggátolja a faktor

működését (Hildebrand és mtsai, 1994). A proteoglikánokon nem csak növekedési

faktorok, hanem egyéb fehérjék is megkötődnek. Ilyen módon szabályozódik az

aktivitása számos szekretált fehérjének, köztük sok proteolítikus enzimnek (proteáznak)

is.

A GAG-ok és a proteoglikánok hatalmas, rendezett struktúrákat is felépíthetnek

az ECM-ben. Például sok aggrecan molekula kapcsolódhat egyetlen hialuronsav

molekulához, így egy baktérium méretű komplex keletkezik. De a proteoglikánok egyéb

mátrixfehérjékkel is kapcsolódhatnak, pl. kollagénnel a bazális lamina felépítésekor.

Magukhoz a kollagén fibrillumokhoz is kapcsolódik egy proteoglikán, a decorin, ami

nélkülözhetetlen a kollagénrostok kialakulásához. Ezt bizonyítja, hogy a decorinhiányos

egerek bőre törékeny, azaz nyújtással szemben kevéssé ellenálló (Reed és Iozzo, 2002).

Az újabb eredmények szerint proteoglikánok befolyásolják a sejtszaporodást, az

embriogenezist, a morfogenezist, a karcinogenezist, és jelentőségük lehet a betegségek

kialakulásának megértésében (Iozzo, 2005). A daganatokban általában megnövekszik a

proteoglikánok termelése, mennyiségük akár a normális szövetben mértnek 10-20-

szorosa is lehet. Vizsgálataink részletesen érintették a májbetegségekben - elsősorban a

májrákokban - bekövetkező egyes proteoglikánok, elsősorban az agrin minőségi és

mennyiségi változását.

19

3.2.5.2. A proteoglikánok osztályozása

1. táblázat. Proteoglikánok osztályozása.

A) Cukorláncaik alapján (Tímár és mtsai, 1995)

A proteoglikánokat osztályozzák a fehérjevázhoz kapcsolódó cukorlánc alapján.

1. Egyszerű proteoglikánok: a fehérjevázhoz egy vagy több azonos típusú

cukorlánc kapcsolódik. Ilyen módon heparánszulfát proteoglikán (HSPG),

kondroitinszulfát proteoglikán (CSPG) és keratánszulfát proteoglikán (KSPG)

Cukor láncai Intracellularis PG

Sejtfelszíni PG ECM PG

Keratán szulfát Fibromodulin Keratocan Lumican PRELP Osteoadherin Osteoglycin

Chondroitin szulfát/ Dermatán szulfát

Chromogranin-A

i-chain of HLA-DR CD44 Melanoma PG Neurocan NG2 Phosphocan Thrombomodulin

Aggrecan Biglycan Decorin Versican Collagen IX, XII, XIV Embrionalis mesenchyma PG Epiphycan

Egy

szerű

PG

Heparán szulfát Glypican 1,2,3,4,5,6 Syndecan 2,3, 4 Transferrin-receptor

Perlecan Agrin Collagen XVIII

Összetett PG-k

Serglycin Betaglycan Syndecan 1 Amphiglycan

20

különíthető el. Ezektől eltérően a hyaluronsav soha nem kapcsolódik kovalens kötéssel

a fehérjéhez. Az ECM-ben szabadon foglal helyet, vagy a porc esetén speciális

kötőfehérjével óriás CSPG molekulák kapcsolódnak hozzá.

2. Összetett proteoglikánok: a fehérjevázhoz különböző típusú GAG láncok

kapcsolódnak.

B) Szerkezet, funkció és lokalizáció alapján

Az ismeretek gyarapodásával kísérletek történnek arra, hogy a felosztásnál a molekulák

funkcióját, lokalizációját is figyelembe vegyék. Ezt a törekvést tükrözi Gallagher 1989-

es felosztása.

I. Intracelluláris proteoglikánok

A serglycinek felelősek a bazofil és hízósejtek szekretoros granulumainak

metakromáziás festődéséért. Hosszan ismétlődő Ser-Gly dipeptidjei miatt a molekulát

így nevezték el. A kis, kb. 10 kDa méretű fehérjevázhoz HS vagy CS kapcsolódhat. Ez

a cukorkötő régió, melyhez számos cukorlánc kapcsolódhat, rezisztenssé téve a

molekulát proteázokkal szemben. Sajátos vonása a fehérjeváznak, hogy sejttípustól

függően más cukorlánc kapcsolódik hozzá, így a hízósejtben heparin, az NK sejtben CS,

a mucosa hízósejtjeiben CS a kapcsolódó GAG. A molekula feltehető funkciója

proteolitikus enzimek tárolása a granulumokban, azok kötése által. A sejtekből kijutva

szabályozza a bontó enzimek aktiválódását is.

II. Sejtfelszíni proteoglikánok

1. CSPG-k

A sejt-sejt interakciókban játszanak szerepet. A melanoma proteoglikán a melanomák és

neuroektodermalis eredetű tumorok sejtfelszínén található (Nishiyama és mtsai, 1991).

A thrombomodulin a hemosztázisban vesz részt, alvadásgátló aktivitásának jelentős

hányadát a fehérjeváz határozza meg, a CS lánc kapcsolódása esetén azonban a

molekula antikoaguláns kapacitása fokozódik (Sadler, 1997). A TAP-1 az idegrostok

terminális membránján található, szerepe az axonok lokalizálásában van az izomsejtek

felszínén (Arenson és Bissell, 1987). A HNK-1 a gliasejtek és idegsejtek

interakciójának egyik letéteményese. A CD44 fakultatív proteoglikán, eredetileg a

21

lymphocyták felszínén kimutatott fehérje, mely fontos szerepet játszik a lymphocyták

nyirokcsomókba történő recirkulációjában. Epithelialis sejtek felszínén is megtalálható,

CS és HS lánc glikanálhatja. A variációk szövetspecifikusak. Feltételezhetően a

sejtspecifikus felismerésben és adhézióban játszik szerepet (Naor és mtsai, 1997).

2. HSPG-k

Syndecan 1-4, a név a görög syndein - összekötni - szóból származik. A molekula 3 HS

és 1 CS láncot tartalmazhat, transzmembrán domain köti a felszínhez. A HS láncain

keresztül képes kapcsolódni az I, III, V típusú kollagénhez, fibronektinhez,

trombospondinhoz. Az epiteliális sejtek típusos proteoglikánja. Az elmúlt években

számos, az eredetivel homológ molekulát szekvenáltak, melyek vázfehérjéinek mérete

31-90 kD között van (Woods, 2001). A syndecan csoporthoz tartozó syndecan-2-t

(fibroglycan) embrionális tüdő és bőr fibroblasztokon mutatták ki, 125, 90, 60 és 45

kDa fehérjevázzal (Heremans és mtsai, 1988). A 90 és 45 kD fehérjeláncok a

peptidanalízis alapján rokon struktúráknak bizonyultak. Feltehetően ez is

transzmembrán proteoglikán, amelyhez valószínűleg három cukorlánc kapcsolódik. A

fibroglikánnal nagyfokú szekvencia-homológiát találtak a patkány hepatocyták

sejtfelszíni HSPG-jének klónozása során, így feltételezhető, hogy ezek felszínén is

fibroglikán található. A betaglycan a TGBβl III típusú receptora. 110 kD fehérjevázához

HS és CS lánc kapcsolódik. A GAG láncok nem szükségesek a ligandkötési funkcióhoz

(Esko és mtsai, 1987). Feltehetően a növekedési faktor receptorkötődése által kiváltott

fokozott mátrix-szintézis negatív regulációjában van szerepe (Cheifetz és mtsai, 1987).

A vastagbélrák sejtek HSPG-je nagyfokú homológiát mutat a perlecannal (Dodge és

mtsai, 1991). Transzmembrán fehérje, mely hidrofób domaint tartalmaz (Iozzo és mtsai,

1990). Northern blot analízissel hasonló proteoglikán messenger RNS szintű

expresszióját igazolták normál vastagbél szövetben is.

A proteoglikánok különböző módon kapcsolódhatnak a sejtfelszínhez, ennek egyik

lehetséges módja a transzmembrán hidrofób domain segítségével történő kapcsolódás,

egy másik lehetőség a beékelődés a lipid kettősrétegbe a proteoglikánon levő

inozitolfoszfát segítségével, vagy egy specifikus membránreceptorhoz való kötődés a

HS láncon vagy inozitolfoszfáton keresztül.

22

A sejtfelszíni HSPG molekulák szerepét a cukorláncok vagy a vázfehérjék

határozhatják meg. Igen változatos szerepet játszhatnak, megszabják a sejt-sejt, sejt-

ECM interakciókat, enzimeket, növekedési faktorokat, hormonokat képesek kötni,

azokat serkentve, vagy éppen inaktiválva. Bizonyos rendszerekben a fehérjéről leváló

HS láncok a sejtmagba jutva a sejtproliferáció szabályozásában vesznek részt.

Felvetődik a lehetőség, hogy egyes HS láncok információt is hordoznak pl. specifikus,

bázikus FGF és thrombospondin kötő régiót sikerült kimutatni rajtuk.

III. Az ECM proteoglikánjai

1. Térkitöltő CSPG-k az ECM-ben

Az aggrecan a porc proteoglikánja (Doege és mtsai, 1990), a human fibroblaszt

proteoglikán versican, az embrionalis mesenchyma proteoglikán (Kimata és mtsai,

1986) és az agy CSPG-i a legismertebbek. Jellegzetességük, hogy egységekből épülnek

fel, így pl. a versican EGF, lektinszerű, complement regulatory protein (CRP) és hyalin

kötő régiókat tartalmaz. A sejtek adhézióját általában gátolják (Cattaruzza és mtsai,

2002).

2. Kollagén rostokhoz kapcsolódó CSPG-k

A proteoglikán-2/decorin, kb. 40 kD fehérjevázzal rendelkező molekula a kollagén I d

és e csíkjaihoz kapcsolódik, gátolja a kollagénrost képződést. Csak 1 cukorkötő helye

van, DS vagy CS kapcsolódik ehhez. A kötőszövetben csaknem mindenütt megtalálható

(Krusius és Ruoslahti, 1986). A proteoglikán-1/biglycan szintén kis CS- vagy DSPG,

mely DNS szinten nagyfokú szekvenciahomológiát mutat a decorinnal, azonban bi-

zonyíthatóan elkülöníthető gén terméke (Fisher és mtsai, 1989). Nevét azért kapta, mert

két cukorlánc kapcsolódik hozzá. Kollagénhez való kötődését eddig még nem

bizonyították, ugyanakkor erősen kötődik az ECM egyéb komponenseihez. A biglycan

és decorin együtt a rostos kötőszövet proteoglikánjainak a 95%-át teszik ki. A kollagén

IX-ről az utóbbi időben tisztázódott, hogy ez a molekula is proteoglikán, 1 CS lánc

kapcsolódik hozzá (Konomi és mtsai, 1986). A hyalin porcban található rostos hálózat

része, a cukorlánc különösen alkalmassá teszi, hogy egyéb mátrix proteinekhez

kapcsolódjon.

23

3. KSPG-k

A cornea állományának egyik fő alkotórésze egy KSPG, alapvető szerepe van az

optikailag átlátszó, rendezett rosthálózat kialakításában. Keratánszulfát láncot mutattak

ki ezen túlmenően az aggrecanon, az ín és az aorta proteoglikánjai között. A

fibromodulin egy KS proteoglikán, mely jelentős homologiát mutat a decorinnal és a

biglycannal (Chakravarti, 2002). Szintén képes a kollagénhez kötődni.

4. Bazális membrán HSPG-k (BMHSPG)

A perlecan (Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma proteoglikán) a legjobban

tanulmányozott BMHSPG (Gallai és mtsai, 1996). Fehérjeváza kb. 400 kD, ehhez 4

GAG lánc kapcsolódik. Szerkezetében a lineáris struktúrát 7 globuláris régió szakítja

meg, mint gyöngyfüzér. Innen kapta a nevét is. Számos domainje homologiát mutat

egyéb fehérjékkel, így ciszteingazdag régiója a laminin B láncával, egy többhurkos

struktúrája az NCAM-al és egyéb az immunglobulin szupercsaládba tartozó fehérjékkel.

Az endothelsejtek és a humán fibroblaszt nagy HSPG-je feltehetően hasonló struktúrák

(Heremans és mtsai, 1988). A kollagen XVIII a HS láncai miatt a bazális membrán

HSPG-k közé tartozik (Halfter és mtsai, 1998). A BMHSPG-k egyik fontos tagja az

agrin, amelyikről következő fejezetben írok részletesebben.

A BMHSPG-k elsődleges funkciója a molekulaszűrés. Ezen túlmenően az idegrostok

növekedésében a lamininnal alkotott komplexének jelentőségét írták le, úgy tűnik

szoros kapcsolata van az NCAM fehérjével is elősegítve ezáltal az idegrostok

regenerációját (Cole és Burg, 1989). Újabb adatok szerint HS láncaival növekedési

faktorok tárolására képes.

A proteoglikán kutatás felgyorsult üteme a csoportok egyre újabb tagjait deríti fel.

Nyilvánvalóvá vált, hogy méretükben, szerkezetükben és funkcióikban nagyon

heterogén molekulákról van szó. Ismereteink gyarapodásával egyre több adat támasztja

alá, hogy ezen molekulák jelentősége messze nagyobb, mint feltételeztük.

A proteoglikánok fiziológiás körülmények között a következő folyamatokban

játszanak szerepet:

1. A kötőszövet és támasztószövet alkotórészei.

24

2. Negatív töltésük miatt megszabják a szövetek hidratációját; molekulaszűrőként

funkcionálnak.

3. Meghatározóak a sejt-sejt és sejt-ECM kapcsolatokban.

4. Részt vesznek a sejtek szövetté történő szerveződésében.

5. Növekedési faktorok, enzimek, hormonok, citokinek kötése, prezentálása és

semlegesítése révén aktív részesei a sejt- és szövetműködés fiziológiás szabályozásának.

3.2.5.3. Az agrin mint BMHSPG

3.2.5.3.1. Az agrin szerkezete

Agrin, a név görög „agrein”-összegyűjteni (assemble) - szóból származik, ami

azt jelenti, hogy képes acetylcholine receptor (AChR) aggregációra. Az agrin nagy

méretű, erős negatív töltésű multidomain HSPG (Tsen és mtsai, 1995).

Az emberi agrin gén (AGRN) locusa: 1p36.1-1, ami viszonylag közel helyezkedik a

perlecan génhez (1p35-36.1) (Dodge és mtsai, 1991). Az emberi agrin mRNA

hosszában meghaladja a 7 kb-t és több mint 2,000 aminosavból álló, 212 kDa

molekuláris tömegű fehérjét kódol (Rupp és mtsai, 1992).

Szerkezetileg az agrin egy globularis laminin-kötő domaint (NtA), kilenc

follistatin-szerű proteáz inhibitor domaint (FS), két laminin-szerű epidermális

növekedési faktor ismétlődést (LE), két serine/threonine gazdag domaint (S/T), a SEA

module-t (SEA), négy EGF ismétlődést (EG) és három laminin α-lánchoz homológ

laminin globuláris domaint (LG) tartalmaz (1. ábra) (Rupp és mtsai, 1991; Tsim és

mtsai, 1992). Az intenzíven N- és O- glikolizált N-terminális miatt az agrin molekuláris

tömege oldallánccokkal együtt eléri a 600 kDa-t (Tsen és mtsai, 1995). Az

aminocsoportokhoz kapcsolódó szénhidrátok és a GAG az agrin szekvencia egész

hosszában megtalálhatók, de HS-GAG formája főként a fehérje N-terminális szakaszára

korlátózódik. Ezek a régiók ugyancsak részt vesznek az idegsejt adhéziós molekulák

(NCAM) és a heparin kötő növekedési faktorok megkötésében (Cole és Halfter, 1996).

A C-terminálisan helyezkedő, 95-kDa része (ahol az első epidermális

növekedési faktor (EGF)-szerű domain (EG) kezdődik) szerepet játszik az AChR

aggregacióban, valamint tartalmaz α-dystroglycan, heparin, egyes integrin és még nem

25

azonosított „agrin receptor” kötő szakaszokat (Ferns és mtsai, 1993; Gesemann és

mtsai, 1995; Ruegg és mtsai, 1992)

1. ábra. Agrin szerkezete: NtA-N-terminális globularis laminin-kötő domain,

TM- transzmembrán domain, FS-follistatin-szerű proteáz inhibitor domain, LE-

laminin-szerű ismétlődő szekvenciák, S/T-serine/threonine gazdag domain, a

SEA-SEA module, EG-EGF ismétlődés, LG-laminin α-lánchoz homológ

laminin globuláris domain. (Bezakova és Ruegg 2003).

3.2.5.3.2. Az agrin típusai Burger és munkatársai (2000) a patkány agrin két, különböző N-terminálissal

rendelkező izoformáját írták le: az SN-agrint (rövid izoforma, TM agrin) és LN-agrint

(hosszú izoforma, NtA agrin), amelyek a szubcelluláris lokalizációban, a szöveti

eloszlásban és a funkcióban is különböznek egymástól. Az SN-agrin elsősorban az

idegrendszerben (IR) található, míg az LN-agrin a központi IR-en kívül más szervekben

(vese, tüdő, NMJ) is előfordul (Ruegg és Bixby, 1998). Az SN-agrin sejtmembránhoz

kötődve, az LN-agrin az ECM bazális laminájához társultan fordul elő (Bezakova és

Ruegg, 2003). Knockout egerekben az LN-agrin expressziójának csökkenése a

neuromuszkularis junkció működésének csökkenéséhez vezetett (Gautam és mtsai,

1996; Lin és mtsai, 2001). Az LN-agrin a bazális lamina egyik komponenseként, fontos

26

szerepet játszik a neuromuszkuláris junkció (NMJ) jeltovábbításában, míg az SN-agrin

elsősorban az idegsejtek közötti jelátvitelben vesz részt.

Mind a LN-agrin és a SN-agrin izoformák alternatív splicing következtében

különbözhetnek még legalább két további – A/y- és B/z-ként ismert – pozícióban,

melyek a karboxi-terminális laminin-globuláris (LG) LG2, illetve LG3 tartományban

vannak. Az e helyekre való beillesztés olyan fehérje variánsokat hoz létre, melyek 0

vagy 4 aminosavat tartalmazhatnak az A/y pozícióban, és 0, 8, 11 vagy 19 (8+11)

aminosavat a B/z pozícióban. A Lys-Ser-Arg-Lys (Lys =lysin, Ser=serin, Arg=arginin)

A/y helyre történő beillesztése a heparin kötéséhez szükséges, továbbá modulálja az

agrin kötődését az α-dystroglycanhoz, egy erősen glikozilált periferiális membrán

fehérjéhez, mely számos szövetben, így az izomban is expresszálódik. Ezen beillesztés

fiziológiai fontossága az A/y helyen tisztázatlan, mivel látszólag normálisak azok az

egerek, melyekben nem található ez a bizonyos exon (Bezakova és Ruegg, 2003).

Ezzel ellentétben, az aminosav beillesztések a B/z helyen döntőek az agrin-indukált

AChR aggregáció szempontjából. Tenyésztett myotubusok esetében csak a

beillesztéssel (agrin –B/z+) rendelkező izoformok indukálnak AChR aggregációt és ez

az aktivitás nincs jelen, amennyiben hiányzik a beillesztés a B/z helyen (agrin B/z-).

Az AChR aggregációs aktivitást mutató agrin mRNS-t kódoló izoformák a

motoneuronokban expresszálódnak, míg a nem idegi szövetek sejtjei (tüdő, vese és

izom) olyan agrin transzkriptumokat szintetizálnak, melyeknél hiányoznak a

beillesztések az A/y és B/z helyeken. A nem izomszövetek esetében az agrin a

dystroglycan nagy affinitású kötő fehérjéje (Gesemann és mtsai, 1998).

3.2.5.3.3. Az agrin funkciói

AChR aggregáció:

Az agrin legfontosabb és legrészletesebben tanulmányozott funkciója az NMJ-

ben az AChR aggregáció kiváltása. A B/z+ agrin posztszinaptikus differenciálódást

kiváltó képessége bizonyított, ennek molekuláris folyamata azonban csak részlegesen

ismert. Az AChR-aggregáló képességhez az LN-agrinnak rendelkeznie kell karboxi-

terminális 95-kDa domainnal. Érdékes, hogy in vitro a B/z+ agrin LG3 domaint

tartalmazó 21-kDa fragmentje is kiváltja az AChR aggregációt (Gesemann és mtsai,

1995; Yang és mtsai, 2001), de jóval kisebb mértekben, mint a teljes hosszúságú vagy a

27

95-kDA-os fragment. Valószínűsíthető, hogy a B/z+ agrin a LG3-B/z+ domainen

keresztül kapcsolódik a receptorával (receptoraival) (McMahan, 1990), másrészt az

agrin α-dystroglycanhoz kötődve, valamint a muscle-specific receptor tyrosine kinase

(MuSK) aktiválásával részt vesz az AChR aggregálásában (Ruegg és Bixby, 1998). Az

agrin-deficiens egerek az NMJ súlyos funkciózavara következtében közvetlenül születés

után elpusztulnak (Gautam és mtsai, 1996).

Embrionalis szövetekben az agrin a motoneuronokban szintetizálódik, majd

axonalis transzport révén terminálisan szekretálódik, így az NMJ szinaptikus résben a

bazális laminában állandóan jelen van (Magill-Solc és McMahan, 1988). NMJ

kialakulásakor a motoneuronok által expresszált agrin izoformák indukálják a

posztszinaptikus membránban az AChR-ok aggregációját. Ezzel szemben az izomsejtek

által expresszált izoformáknak nincs aggregáló hatásuk (Ruegg és mtsai, 1992).

A strukturális és funkcionális vizsgálatok kimutatták, hogy az agrin különböző

sejtfelszíni és ECM fehérjékhez kötődik, például a lamininhez (Denzer és mtsai, 1997;

Denzer és mtsai, 1998; Kammerer és mtsai, 1999) és az α-dystroglycanhoz (Gesemann

és mtsai, 1998).

A laminin az LN-agrin amino-terminális részén levő NtA véghez kötődik (2.

ábra). Az agrin elsősorban a laminin 2, 4-hez kötődik és ez a két laminin jelen van az

izom bazális laminájában. Az agrin erős kötődése a laminin-4-hez megmagyarázhatja,

hogy miért marad az agrin a sejtes elemek degenerálódása után is a szinaptikus bazális

laminához társultan (Reist és mtsai, 1987). Az agrin karboxi-terminális részén található

az α-dystroglycan kötő rész (Bowe és Fallon, 1995). Az α-dystroglycan a prekurzor

fehérje poszttranszlációs hasítását követően alakul ki, erősen glikolizált perifériás

membránfehérje, a lamininhez, az agrinhoz és a transzmembrán β-dystroglycanhoz

kötődik (Gesemann és mtsai, 1998). Az α- és a β-dystroglycan különböző fehérjékkel

együtt alkotja a dystrophin- glycoprotein complexet. Igy az agrin a bazálmembránt a

cytoskeletonhoz rögzítve jeltovábbításban vehet részt (Bowe és mtsai, 1994; Bowe és

mtsai, 1994; Gee és mtsai, 1994).

28

2.ábra. Az agrin a postsynaptikus differenciálódásban:

(www.cgap.nci.nih.gov/Pathways)

Más kísérletek két további fehérje szerepét támasztják alá az agrin jelátvitelben játszott

szerepében. Az egyik az izom-specifikus tirozin kináz (MuSK) (Jennings és Burden,

1993), a másik cytoplasma membrán fehérje a rapsyn (Frail és mtsai, 1988).

Az agrin neurogenesisben játszott szerepét alátámasztja, hogy magas agrin

expressziós szintet mutattak ki a fejlődő agy ventricularis és subventicularis zónáiban és

a gerincvelőben; ezzel ellentétben a felnőtt agyból hiányzik. Ezen kívül agrin-hiányos

egerek agya sokkal kisebb volt, mint a vad típusé (Serpinskaya és mtsai, 1999).

Az agrin létfontosságú a kolinerg idegsejtek szinaptikus működésének szabályozásában

a felső cervicalis ganglionban (SCG). Az agrin-deficiens embriók a pre- és

postsynaptikus struktúrák szabálytalan illeszkedést és jeltovábbítási hibáit mutatják

(mismatch-et és synaptikus transmission hibát). (Gingras és Ferns, 2001). Az SCG-ben

29

az agrin SN izoformája expresszálódik, és a MuSK-on keresztül hatással van a

synaptogenesisre (Ip és mtsai, 2000).

Az agrin immunreakcióját mutattak ki az agy mikrovaszkulatúrájában, ahol az agrin az

α-dystroglycanhoz és a lamininhoz kötődve stabilizálja a specifikus bazális laminát, ami

a vér-agy gát felépítésében játszik szerepet (Donahue és mtsai, 1999). Az agrin β-

amyloid-hoz is kötődik (Cotman és mtsai, 2000), ami az Alzheimer-es beteg amyloid

plaque-jában felhalmozódik; ennek a kórnak egyik tipikus következménye a vér-agy gát

fokozott permeabilitása (Donahue és mtsai, 1999).

Agrin a glomerularis bazális membránban

Az agrin a vese glomeruláris bazális membránjában (GBM) is kimutatható

(Groffen és mtsai, 1998). Itt részt vesz a töltésszelektív ultrafiltrációs folyamatban.

Az agrin a GBM-ben elsősorban a lamininhoz kötődik. Ez a kötődés a laminin hosszú

kar centrális régiójára lokalizálódik.

A GBM és a sejt felszíne közötti térben az agrin fontos szerepet játszhat a sejt-

matrix adhézióban. Az agrin egyik sejtfelszíni receptora, az α-dystroglycan a vese érett

és fejlődő epitheliumában magas expressziót mutatott (Durbeej és mtsai, 1998). Az érett

glomerulus GBM-ben az α-dystroglycan az agrinhoz hasonlóan expresszálódik (Durbeej

és mtsai, 1998). Így az agrin és az α-dystroglycan kolokalizációja a GBM-ben

támogatja a sejt-mátrix kölcsönhatás funkciót. Ebben a kapcsolatban az agrinnak

kihorgonyzó szerepe lehet a citoszkeleton és BM közötti szerkezeti kölcsönhatás

biztosításában. A citoszkeletonnak a GBM-mel való szoros kölcsönhatása nem csak a

magas helyi vérnyomás fenntartásához nélkülözhetetlen, de a glomerularis filtráció

hemodinamikai változásokhoz történő alkalmazkodásában is szerepet játszik. Az agrin a

transzmembrán jelátvitelben az integrinen keresztül is részt vesz. Az agrin kötődik a

αvβ1-integrinhez (Martin és Sanes, 1997), amelynek fontos szerepe van a sejtek

differenciálódásában.

3.3. A proteoglikánok szerepe májbetegségekben

Az orvostudományban elsődleges kérdésként vetődik fel, mi a jelentősége a

proteoglikánoknak bizonyos kórfolyamatokban. Az elmondottakból nyilvánvaló, hogy a

30

proteoglikánoknak kitüntetett szerepe lehet mindenütt, ahol az ECM felhalmozódása

zajlik, pl. májcirrhosis, májfibrosis, egyéb fibrosisok, sebgyógyulás, keloid képződés,

arteriosclerosis. Ugyancsak fontos az agrin azon folyamatokban, ahol a sejtek

vándorlása történik az ECM-on keresztül, pl. gyulladás, tumorinvázió, metasztatizálás,

valamint ahol a sejtek, szövetek autoregulációja kerül előtérbe, pl. tumorok autonóm

szabályozása, valamint a szervezet védekező funkciói zajlanak, pl. citotoxicitás,

cellularis immunreakciók.

A felsoroltak közül a májra vonatkozó ismereteket szeretném röviden összefoglalni.

A máj proteoglikánjai és változásuk kóros körülmények között

A máj proteoglikánjai

Az ép májban egyéb fehérjékhez képest a proteoglikánok mennyisége elenyésző. A

cukorláncok analízise alapján 65—70%-uk HSPG. A fehérjeváz(ak) méretét, aminosav

és nukleinsav szekvenciáját még nem határozták meg teljes egészében. Feltehetően több

HSPG típus is megtalálható, amelyek vagy a hepatocyták sejtfelszínéhez kötődnek,

vagy az ECM-ben rakódnak le.

Leírtak kicsi, kb. 27 kD-os molekulát, melyhez három vagy négy, egyenként 14 kD

tömegű cukorlánc kapcsolódik (Oldberg és mtsai, 1979). Beszámoltak egy, a

hepatocyták által termelt, az ECM-be lokalizálódó HSPG-ról, melynek mérete 150—

300 kD, 40 kD tömegű fehérjevázzal. Izoláltak egy sejtfelszíni HSPG-t, melynek mérete

200 kD körüli, a fehérjeváz pedig 77 kD (Gallagher, 1989; Lyon és Gallagher, 1991).

Ez a molekula feltehetően homológ a fibroglikánnal. Az ismert proteoglikánok közül a

syndecan expressziója is kimutatható a humán májban. Megtalálhatók ezen kívül a

decorin, a biglycan, a perlecan és a versican is (Kovalszky, I és mtsai, 1997). Ezeket

nagy valószínűséggel nem a hepatocyták, hanem a nonparenchymalis májsejtek (Ito

sejt: decorin, biglycan, perlecan, Kupffer sejt: syndecan, endothelsejt: decorin, perlecan)

termelik.

A proteoglikánok változása májcirrhosisban

A proteoglikánok a kötőszövet és a bazális membrán szerves alkotórészei, így

természetes, hogy mennyiségük a cirrhotikus májban felszaporodik, összetételük

31

megváltozik. Elsősorban a kötőszöveti szeptumoknak megfelelően rakódnak le, döntő

többségük DS-CSPG (Arenson és Bissell, 1987). Előrehaladott cirrhosisban a humán

máj ötször több HS-ot, tízszer több CS-ot és tizenhatszor több DS-ot tartalmaz, mint a

normál máj (Murata és mtsai, 1985). Hasonló nagyságrendű fokozódás a teljes

proteoglikán molekulák esetében nem volt kimutatható, így feltehetően a vázfehérjék

glikanációja is növekszik (Kovalszky és mtsai, 1993). A cukorláncok szulfatáltsága

fokozódik. Az elmúlt években vált ismertté, hogy cirrhosisban a proteoglikánok

fokozott termelését, egyéb mátrixfehérjékhez hasonlóan, a nem-parenchymalis

májsejtek, elsősorban az Ito-sejtek végzik (Senoo, 2004). A fokozott szintézis TGFβl

hatására következik be (Kiss és mtsai, 1998). A perlecan és versican fokozódó

expressziója cirrhosisban szintén a nem parenchymalis sejtekben figyelhető meg

(Kovalszky, I és mtsai, 1997). A syndecan expresszióját humán biliaris cirrhosisban

real-time RT PCR vizsgálattal fokozottnak találták, míg kísérletes széntetraklorid

cirrhosisban nem észleltek érdemi változást (Sebestyen és mtsai, 2000). A

proteoglikánok felszaporodása azonban nemcsak a fokozott szintézis, hanem a

progresszióval párhuzamosan csökkenő lebontás következménye is. A lizoszómális

endohexozaminidázok aktivitása csökken, és különösen nehezítetté válik a DS láncok

degradációja. Részben ez magyarázza a DS mennyiségének kitüntetett emelkedését.

Kérdés, hogy a proteoglikánok mennyiségének és összetételének változása pusztán,

mint a szövetproliferáció egyik részjelensége értékelendő, vagy ennél többről van szó és

ezek a változások hatással vannak a cirrhosis kimenetelére is. Több adat utal arra, hogy

bizonyos proteoglikánok részesei a mátrixképződés szabályozásának. Ismert, hogy a

decorin a kollagén rostokhoz kötődve gátolja azok érését, tehát a kötőszövetképzés

gátlásának irányába hat. A decorin a TGFβl inaktiválására képes, erről a növekedési

faktorról köztudott, hogy a fibrogenezis egyik fő stimulátora (Kovalszky és mtsai,

1998).

Proteoglikánok és májtumor

A témával foglalkozó kutatók kivétel nélkül egyetértenek abban, hogy a

proteoglikánoknak fontos szerepük van a daganatos betegségek progressziójában. Nem

tudjuk, csak feltételezzük, hogy a tumorok indukciójában is szerepük lehet. Elsősorban

leíró adatok állnak rendelkezésre, bemutatva, hogy szinte nincs olyan daganat, melyben

32

a proteoglikánok mennyisége és minősége ne változna meg az eredeti szövethez

viszonyítva. Így van ez a máj esetében is. Kémiai karcinogenezis során az úgynevezett

alterált fókuszokban intenzív GAG festődést mutató anyag jelenik meg a májsejtek

citoplazmájában. A kialakult májrákban ez a felhalmozódás tovább fokozódik. A humán

hepatoma sejtek citoplazmája is alcián kék pozitív és a pozitivitás kondroitináz enzim

emésztést követően eltűnik. Immunhisztokémiával erős HSPG pozitivitás is

megfigyelhető a tumorsejtek citoplazmájában. Kémiai módszerekkel analizálva a májrá-

kokban a kondroitinszulfát kb. hússzoros felhalmozódását találták, a heparánszulfát-

tartalom kb. tízszer nagyobb, mint a normál májban, a GAG-ok egymáshoz viszonyított

aránya is megváltozik.

Nemcsak a májrákok proteoglikán tartalma és összetétele változik meg a normál májhoz

képest, hanem a tumor körüli látszólag ép májszövetben is GAG halmozódik fel

morfológiai és kémiai módszerrel vizsgálva egyaránt (Kovalszky és mtsai, 1990). A

fehérjeváz analízise arra utal, hogy nem a molekulák véletlenszerű felhalmozódásáról,

hanem szelektív eltolódásról van szó, mivel egyes proteoglikánok, mint a syndecan,

expressziója gyakorlatilag eltűnik a májrákból. Ugyanakkor a decorin és egy a bazális

membrán HSPG-nek megfelelő proteoglikán felhalmozódik.

Nem tisztázott még a felhalmozódó proteoglikánok forrása. Nagyon valószínű azonban,

hogy a tumorsejtek részben proteoglikánokat termelnek nagy mennyiségben, részben

pedig olyan faktorokat, melyek a környezet nem tumoros sejtjeit fokozott proteoglikán

szintézisre késztetik. Mi a jelentősége ezeknek a változásoknak? A tumorsejtek felszí-

nén és környezetükben felhalmozódó megváltozott összetételű mátrix, melyben a

CSPG-k dominálnak, a sejtek egymástól való elszakadását segíti elő. Megkönnyíti a tu-

morsejtek invázióját, a mátrix degradációját. Ugyanakkor mintegy körülbástyázza a

daganatot, lehetőséget nyújtva annak fokozott autonómiájára. Ezt a feltételezést

támasztja alá az a tény, hogy a proteoglikánok növekedési faktorokat, cytokineket,

hormonokat képesek kötni, tárolni és semlegesíteni (Ruoslahti és Yamaguchi, 1991). A

bFGF receptora egy syndecannal homológ HSPG (Qiao és mtsai, 2003). A TGFβl III.

típusú receptora, a betaglycan, egy HS/CSPG. A decorin a TGFβl-et semlegesíti.

Hasonló funkció más proteoglikánokról is elképzelhető. Így a megváltozott

proteoglikán-összetétel folytán teljesen más információk jutnak el a tumorsejtekhez,

mint normális proteoglikán-összetétel esetén. Ismert, hogy a TGFβ1 a hepatocyták

33

proliferációját gátolja. Hatásának felfüggesztése proliferációs stimulust jelenthet. A

syndecan az egyik fő letéteményese a sejtek lehorgonyzásának (Saunders és mtsai,

1989), eltűnése a sejtfelszínről elősegíti a sejtek anyatumortól való elszakadását. A

hepatoma sejtek felszínén kimutattak egy HSPG-t, mely bizonyos ingerek hatására

internalizálódik, majd HS lánca a fehérjéről leválva a sejtmagba jut és

proliferációgátlást idéz elő (Fedarko és mtsai, 1989). Amennyiben egy ilyen HSPG

mennyisége csökken, a következmény ismét a proliferáció fokozódása lesz. Újabb

adatok szerint a magban a HS lánc az egyes gének derepressziójában, aktiválásában

fontos szerepet játszó topoizomeráz enzimet gátolja.

Ismert tény, hogy a hepatocyták sejtfelszíni HSPG-jai heparinszerű, tehát antithrombin

aktivitással rendelkeznek. Ezen proteoglikánok arányának csökkenése a

kondroitinszulfát proteoglikánok javára, a HS láncok szulfatáltságának csökkenése,

melyet számos tumor esetén leírtak és magunk májrákok vizsgálata során is

megfigyeltünk, a hemosztázis egyensúlyát az alvadás irányába billentheti el.

Egy daganat biológiai viselkedése természetesen számos, ma még nem minden

részletében ismert, tényezőtől függ. A proteoglikánok megváltozása csak egy ezek

közül, de úgy tűnik, nem jelentéktelen. Jobb megismerésük, észlelt változásaik

modellezése kísérleti rendszerekben remélhetőleg pontosabb választ fog adni arra,

hogyan képesek e fehérjék befolyásolni egy tumor aktuális progresszióját. Nagy a

valószínűsége annak is, hogy a jövőben bizonyos proteoglikánok a daganat-terápia

targetjeiként is számításba jönnek. A fehérjeváz, vagy a cukorláncok szintézisének

gátlásával kísérletes körülmények között már ma is lehet daganat-, illetve

metasztázisgátló hatást elérni.

3.4. A BMHSPG-k szerepe az angiogenesisben

A HSPG-k nélkülözhetetlenek az endothelsejtek strukturális és funkcionális

épségéhez. A HSPG-k a endothelsejtek bazális felszínen vannak jelen, és mátrix-

receptorként viselkednek a különböző bazális membrán fehérjék számára. Továbbá a

BMHSPG-k felelősek a töltésszelektív filtrációs folyamatokért az endotheliumban

(Morita és mtsai, 2005), és gátolják a simaizomsejtek proliferációját, migrációját

34

(Castellot, Jr. és mtsai, 1981). HSPG-k az endothelsejtek luminális felszínen is jelen

vannak, ahol részt vesznek a lipoprotein-lipáz kötődésében és internalizációjában

(Moon és mtsai, 2005). Ezek a luminális HSPG-k ugyancsak fontos szerepet játszanak

az erek felszíni antikoagulatív tulajdonságának a meghatározásában is az intrinsic

véralvadási kaszkád-proteázok, thrombin és proteáz inhibitorok, beleértve az

antithrombin III kötésével. Végül az endothel felszíni HSPG-k számos angiogenikus

növekedési faktor koreceptoraként is működnek, és ezzel az angiogenezis

szabályozásában is részt vesznek.

Mind a makro-, mind a mikrovaszkuláris endothelsejtek termelnek HSPG-ket.

Az endotheliális HSPG-k előfordulhatnak intracellulárisan, ECM-hez vagy

plazmamembránhoz kötődve, valamint szolubilis formában is (Yamamoto és mtsai,

2005). A syndecan-1 a leggyakrabban előforduló HSPG a mikrovaszkuláris

endothelsejtekben. A syndecan-4 is expresszálódik az endothelsejtek felszínén, míg a

perlecan az endothel ECM-ben gyakori. Az endothelsejtek tenyészetének mediumából

28-800 kD molekuláris tömegű, nehezen meghatározható szolubilis HSPG-ket izoláltak

(Kainulainen és mtsai, 1996).

Megfigyelték, hogy mikrovaszkuláris endothelsejtekben 10-15-ször nagyobb

mennyiségben vannak jelen HSPG-k, mint a makrovaszkuláris endothelsejtekben. Az

endothelsejtek felszíni HSPG-inek eltávolítása gátolja a neovaszkularizációt (Cavari és

Vannucchi, 1993).

Az angiogenezis HSPG-függő szabályozása részben összefügg az

angiogenetikus növekedési faktorok kötő kapacitásával és aktivitásuk módosításával.

Például a tisztított perlecan fokozza az FGF-2-függő angiogenezist, míg más HSPG-

knek nincs hatásuk az angiogenezisre (Knox és Whitelock, 2006). A NIH 3T3 sejtek

felszínén túlexpresszálódó syndecan-1 gátolja a FGF-2-indukált sejtproliferációt. Ezzel

ellentétben a syndecan-1 a mátrixhoz kötődve stimulálja az FGF-2-közvetített

sejtnövekedést. Azonban olyan mutáns sejteknél, melyek deficiensek sejtfelszíni HSPG-

re, a szolubilis syndecan és a glypican a heparin/HS-indukált FGF2-receptorkötést

gátolja. Ez azt jelenti, hogy a szolubilis HS eltávolítja a sejtfelszínről az FGF2-t, vagyis

vetélkedik a sejtfelszíni kötött HS-sel.

Ezek az adatok azt sugallják, hogy az angiogenesist negatívan befolyásoló

35

hatások inkább a szolubilis HSPG-k vagy GAG-ok angiogenetikus növekedési faktor-

kötésével magyarázhatók, mintsem a sejthez társult HSPG-k hatásával.

A receptorkötést módosító kapacitáson kívül a HSPG-k hatással lehetnek az

angiogenesisre azáltal, hogy megvédik az angiogenetikus növekedési faktorokat a hőtől

és a proteolitikus bomlástól, valamint növelik diffúziós hatósugarukat (Saksela és mtsai,

1988).

Végül az ECM-ben levő HSPG-k az angiogenetikus növekedési faktorok

rezervoárjaként szolgálhatnak, amelyek így magas helyi koncentrációt elérve az

endothelsejtek hosszú távú stimulálását biztosítják (Mongiat és mtsai, 2001).

Az a megállapítás, hogy az endothelsejtek HSPG-t expresszálnak az

angiogenezis során, nagy jelentőségű. Ennek a mechanizmusnak a szabályozása

különböző szinteken juthat érvényre: a HSPG molekulák típusainak kvantitatív és

kvalitatív differenciált expressziója révén, a GAG oldalláncok összetételének

változatossága révén, illetve a HSPG-k sejtfelszínről történő indukcióján és

mobilizációján keresztül érvényesül. (3. ábra)

3. ábra: HSPG-k és a növekedési faktorok közötti összefüggés az angiogenezisben.

36

4. CÉLKITŰZÉSEK

A fentiekben vázolt adatok alapján vizsgálataink a következő kérdések köré

csoportosulnak:

1. Hogyan változik mennyiségében és lokalizációjában az agrin expressziója a

cirrhotikus májban, összehasonlítva normál májszövettel?

2. Változik-e az agrin expressziója humán hepatocellularis carcinomában (HCC) a

normál májszövethez képest?

3. Kimutatható-e eltérés az agrin mRNS és fehérje expressziójában a HCC-ben és

cholangiocarcinomában (CC)?

4. Kimutatható-e agrin a jóindulatú májtumorokhoz sorolt hepatocellularis adenomában

(HCA) és fokális noduláris hyperplasiában (FNH)?

5. A májdaganatokban észlelt kifejezett neoangigenezist kíséri-e fokozott agrin

expresszió, felvetve ezáltal az agrin lehetséges szerepét neoangiogenezisben?

6. Található-e összefüggés az agrin-expresszió és a tumorok (HCC, CC)

differenciáltsága között?

37

5. ANYAG ÉS MÓDSZER

5.1. Beteganyag A Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében archivált valamint újonnan

gyűjtött humán májmintákat használtuk fel vizsgálatainkhoz. Összességében 104 primer

májtumor (35 HCC, 35 CC, 14 HCA, 20 FNH) és környező normál vagy cirrhotikus

máj, valamint 10 balesetben vagy nem májbetegség miatt elhunyt emberből származó

normál májszövet került feldolgozásra (2.táblázat). A humán vizsgálatokat a betegek

írásos hozzájárulásával és az illetékes etikai bizottságok engedélyének birtokában

végeztük (TUKEB engedély 2/2004). A HCC-t illetően 19 jól differenciált, 11

közepesen differenciált, valamint 5 rosszul differenciált esetet vizsgáltunk. A

csoportosítás az Edmonson-Steiner féle klasszifikáció alapján történt (G1-G3). A 35

eset közül 15 esetben a hepatocellularis carcinoma cirrhosis talaján fejlődött ki. A

vizsgált betegek átlagéletkora 64,8 (42-82), a férfi/nő arány 27/8 volt. A CC-ket

intrahepatikus (n=7), Klatskin tumor (n = 9), valamint extrahepatikus (n = 19)

csoportokra osztottuk.

A sebészileg eltávolított tumormintákat a környező nem tumoros szövetekkel

együtt, valamint a normál máj mintákat 10% neutrális pufferolt formalinban fixáltuk 24

órán keresztül, utána dehidráltuk és paraffinba ágyaztuk. A rutin hisztológia, a

morfológiai elváltozások kimutatása és a tumor grade megítélése hematoxilin-eozinnal

(HE) festett 3-5 µm-os metszeteken történt. Diagnózis céljából a következő festéseket is

elvégeztük: alciánkék-PAS, Shikata-féle orcein, picrosirius-vörös.

Molekuláris biológiai vizsgálatokra a minták egy részet RNA-laterben (Sigma,

St. Louis, MO, USA) (13 HCC, 13 HCC tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC

tumormentes környező májszövet, 10 normál máj) fixáltuk, vagy folyékony nitrogénben

történt fagyasztás után -80°C-on archiváltuk.

38

2. táblázat. A vizsgálatokhoz használt beteganyag.

Vizsgált csoport Eset Kor Nem

CC 35 61,56 12M/23F

Intrahepatikus típus 7 53,14 3M/4F

Klatskin típus 9 61 2M/7F

Extrahepatikus típus 19 64,36 7M/12F

HCC 35 64,83 27M/8F

a. cirrhotikus talajú HCC 15

I b. nem cirrhotikus talajú HCC 20

1. jól differenciált HCC (G1) 19

2.közepesen differenciált HCC (G2) 11

II 3. rosszul differenciált HCC (G3) 5

HCA 14

FNH 20 Normál máj 10 24 6M/4F

Összesen 114

5.2. Módszerek

5.2.1. Fehérjeexpressziós vizsgálatok

5.2.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok A formalinban fixált, paraffinba ágyazott anyagok antigén feltárása a deparaffinálást

követően proteáz emésztéssel (0,01% tripszin, 10 perc, szobahőn) vagy mikrohullámú

feltárással történt. Az agrin antigén-feltárása mikrohullámú sütőben, DAKO

antigénfeltáró oldatban (DAKO Cytomation, Glostrup, Dánia) történt. Ezt követően az

endogén peroxidáz aktivitásának gátlását 3%-os hidrogén peroxiddal (10 perc)

végeztük. Az antitest aspecifikus kötődését ló szérum (Novocastra, New Castle, UK)

inkubálással blokkoltuk (20 perc, szobahőn). 1:100 hígításban használtuk a

monoklonális agrin ellenes antitestet (clone 7E12, MAB 458, Chemicon International

Inc., Temecula, CA, USA), melyet egy glomerulus bazális membránból izolált HSPG

ellen termeltettek Kemeny és msai (1998). Az antitest specifitását munkacsoportunk

tömeg-spektrometriával igazolta (Tatrai és mtsai, 2006). A további antitesteket az alábbi

hígításokban használtuk: monoklonális laminin, (clone: Lam89) 1:500 (Novacastra,

New Castle, UK), monoklonális CD34 (clone QBEnd/10) 1:80 (Novocastra),

monoklonális Ki67 (clone MIB-1) 1:120 (DAKO), monoklonális CK7 (M7018, DAKO)

39

1:600, monoklonális CK19 (RCK108, DAKO) 1:100. Másodlagos antitestként

peroxidáz-jelölt IgG-t (DAKO) és biotinilált IgG-t (Vectastain Elite ABC Kit, Vector

Laboratories, USA) használtunk 1:200 hígításban, 30 percig szobahőn. Biotinilált

másodlagos antitest alkalmazása esetén ezt az avidin-biotin-komplexszel (ABC) történő

inkubálás követte (30 perc szobahőn). Az agrin esetében az immunreakció

érzékenységét biotinilált tiramiddal fokoztuk a Merz és munkatársai (1995) által leírt

módszer szerint (7mM biotinilált tiramid törzsből 1:125+0,033% H2O2, 10 min) (4.

ábra). Ismételt ABC reakció után az immunreakciót 0,05 mg/ml 3-amino-9-ethyl-

carbazol (AEC) (Biogenex HK 129-5K, San Ramon, USA) vagy diaminobenzidin

(DAB) (Genetex, San Antonio, USA) kromogénekkel hívtuk elő.

Háttérfestésként hematoxilint alkalmaztunk és glicerines fedőanyaggal fedtük a

metszeteket.

Pozitív kontrollként humán vesét használtunk, míg negatív kontrollként az elsődleges

ellenanyaggal való inkubálást kihagytuk és az előhívórendszer specifitásának

bizonyítására az elsődleges ellenanyagnak megfelelő nem immunszérumot használtunk

az elsődleges ellenanyagnak megfelelő hígításban.

40

4. ábra. A biotinilált tiramidos immunhisztokémiai reakció vázlata. Az elsődleges,

ill. biotinilált másodlagos antitestet és ABC-t követően a hozzáadott biotinilált tiramid

torma-peroxidáz hatására H2O2 jelenlétében aktiválódik. Az aktivált biotinilált tiramid

hozzákötődik a minta fehérjének tirozin oldalláncaihoz, és ABC-vel újra amplifikálható.

5.2.1.2. Immunfluoreszcens vizsgálat

A fagyasztott metszeteket metanol-aceton módszerrel fixáltuk (15 perc metanol –20°C-

on, 3 másodperc aceton), majd 20 percig blokkoltuk 5% BSA – PBS oldattal (pH:6.5).

A primer antitestek a következőek voltak: poliklonális agrin 2µg/ml (R&D Systems,

Abingdon, UK), poliklonális laminin 1:200 (DAKO), αν-integrin 10µg/ml (clone

P2W7, R&D Systems), poliklonális bFGF 1:50 (R&D Systems), smooth muscle α-actin

(SMA) 1:100 (clone 1A4, DAKO). A primer antitest reakcióját az Alexa Fluor

(Molecular Probes, Eugene, OR, USA) másodlagos antitesttel tettük láthatóvá. Az

előhívást mosási lépések követték, a vizsgálandó mintákat floureszcens fedővel

(DAKO) fedtük és BioRad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal

vizsgáltuk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Pozitív kontrolként humán veseszövetet

használtunk, míg negatív kontrolként primer antitest helyett 5% BSA-val inkubáltuk a

metszeteket.

5.2.1.3. Morfometriai elemzés

Az agrin immunhisztokémiai reakciókat fénymikroszkóp segítségével

fotódokumentáltuk (200X nagyítás, Olympus BX microscope). Tíz, egymást nem fedő

területet értékeltünk. Az agrin immunreakció mennyiségi meghatározására a Leica

QWin software-t (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., Cambridge, UK)

használtuk fel. Az immunpozitív területet kijelölve végeztük el a méréseket. A vörös,

zöld, kék összetevők alapján állítottuk be a küszöbértékeket, amelyeket minden metszet

esetében állandónak fogadtunk el az összevethetőség érdekében.

41

5.2.1.4. Proteoglikán izolálása

A proteoglikán-izolálás azonos mennyiségű fagyasztott mintákból (2 HCC, 2

CC, 1 normál máj) történt Lyon és munkatársai (1994) módszere alapján. A mintákat

10ml homogenizáló pufferben (50 mM/L Tris-HCl, [pH 7.4], 10 mM EDTA, 5mM N-

ethylmaleimid [NEM], 0.5mM phenylmethylsulphonyl fluoride [PMSF], 3.4M NaCl,

5% Gordox) történő homogenizálás után inhibitorokat (5 mM NEM, 0.5 mM PMSF,

0,001%-os tripszin inhibitor, 5%-os Gordox) tartalmazó extraháló pufferrel (4 M

guanidin-HCl, 50 mM Na-acetát, 1% Triton X-100) felszuszpendáltuk és 2 napon át

rázattuk 4°C -on. Majd 4°C -on, 30 percig centrifugáltuk 11000 rpm-el, ezt követően a

felülúszót dializáltuk az extraháló pufferból 7 M-os urea pufferbe (10 mM Tris pH:7.4,

0.5% Triton X-100, 0.5 mM N-etilmaleimid, 0.5 mM PMSF, 0.001% tripszin inhibitor).

Minden alkalommal megmértük a vezetőképességet és összehasonlítottuk az eredeti 7

M-os urea puffer vezetőképességével. Amint az eredeti oldat vezetőképessége

megegyezett a végső oldat vezetőképességével, ioncserélő oszlopkromatográfiát

végeztünk a proteoglikán elválasztás céljából DEAE-cellulóz (diethylaminoethyl

cellulose) oszlopon. Az izolált anyagok tárolása -80°C-on történt. További analízishez a

proteoglikán frakciót abszolút alkohollal kicsaptuk, lecentrifugáltuk (12000 rpm, 4°C,

10 perc), 70% alkohollal mostuk és újra centrifugáltuk. Vákuumban történő beszárítás

után a proteoglikánt 3-15%-os poliakrilamid gradiens gélen futattuk meg. A futtatást

követően Alcian kék 8GX-el és Coomassie Brillant kék oldattal festettük meg a gélt.

5.2.1.5. Western blot analízis

A western blotthoz poliakrilamid gélen elválasztott fehérjéket elektrotranszferrel

nitrocellulóz membránra (Bio Rad, Hercules, CA, USA) blottoltuk. A blottolás 330

mA–rel 90 percig tartó elektrotranszferrel történt. A membránt TBS-ben oldott 5% (v%)

BSA-val blokkoltuk. Az agrin monoklonális antitestet 1:500 hígításban, 5%-os BSA-

ban higítva használtuk. A biotinilált másodlagos antitest és peroxidázzal jelölt ABC

inkubálást követően az előhívást kemilumineszcenciával (ECL, Amersham Biosciences,

UK) végeztük. A kiértékelést képanalizátorral (Kodak, Hemel Hempstead, UK)

végeztük.

42

5.2.2. mRNS szintű expressziós vizsgálatok

5.2.2.1. RNS izolálás RNS izolálás RNA later-ben fixált mintákból

A RNS izolálás RNA-laterben fixált (24 óra), majd –80 C°-on tárolt mintákból

történt. A kiindulási szövet mennyisége egyenként 200 mg volt (13 HCC, 13 HCC

tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC tumormentes környező májszövet, 10

normál máj). Homogenizálás után Trizol reagensben (Sigma, T 9424) inkubáltuk a

mintákat szobahőmérsékleten (15 percig). Steril Eppendorf-csövekbe pipettáztuk át a

folyadékot, majd 0,2 ml kloroform hozzáadása után vortexeltük és centrifugáltuk.

Ezután a felülúszót, amely az RNS-t tartalmazta, kloroformmal tovább tisztítottuk, majd

az RNS-t izopropanollal kicsaptuk, vortexeltük és tíz perc állás után újra centrifugáltuk.

Ezután leöntöttük a felülúszót és 75 %-os etanollal mostuk, majd centrifugáltuk. Roche

RNS tisztító kitből (Roche, Indianapolis, Indiana, USA) származó elúciós pufferben

feloldottuk az RNS-t, DNáz-zal emésztettük, majd a Roche RNS-tisztító kitjével

(Roche) tovább tisztítottuk, végül megmértük az optikai denzitását (O.D.) és az RNS

koncentrációját a kapott folyadéknak. További felhasználásig a tisztított RNS-t -80°C-

on tároltuk. A teljes RNS épségét 2%-os agaróz gélen ellenőriztük.

Reverz transzkripció

Az RNS (1µg 10µl mixben) átírása M-MulV reverz transzkriptázzal (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) történt (10 perc 25ºC-on, 50 perc 42°C-on, és 5

perc 95ºC-on) RNáz inhibitor (Applied Biosystems) jelenlétében, Random Hexamerek

(Applied Biosystems) felhasználásával. Az RT-PCR reakcióhoz használt reakcióelegy

összetételét a 3. táblázat foglalja össze.

43

3. táblázat. Az RT-PCR reakcióhoz használt komponensek

Komponensek

Térfogat

A komponenst gyártó cég

RT Puffer 2 µl Boehringer 145376

Hexamer 0,5 µl Applied Biosystems, CA, USA

dNTP mix 0,5 µl Roche D 8220

20 U/ µl RN-áz gátló 0,5 µl Applied Biosystems, CA, USA

50U/ µl Reverz

Transzkriptáz

1 µl Applied Biosystems, CA, USA

dH2O 4,5 µl Eppendorf 0032006159

RNS templát 1 µg

Összesen 10 µl

5.2.2.2. Primertervezés és grádiens PCR

A kísérletek elvégzéséhez a PubMed adatbázisból rendelkezésre álló

szekvenciák alapján a Primer Expressz 2.00 program (ABI) segítségével megterveztük a

lehetőségek szerinti legideálisabb primereket. A tervezésnél figyelembe vettük, hogy

bizonyos fehérjéknek több transzkripciós variánsa is létezik; ezeknél olyan primereket

használunk, amely valamennyi transzkripciós variáns expressziójának kimutatására

alkalmas.

A PCR-hez megkerestük az optimális primer kötődési hőmérsékletet grádiens PCR-rel.

Ehhez a reakcióhoz MgCl2-at tartalmazó PCR puffert (Roche J 0051), dNTP mixet

(Applied Biosystems, D8220), forward és reverz primert, AmpliTaq Gold enzimet

(Roche, G 0448), desztillált vizet (Eppendorf, 0032006159) és a korábban előállított

cDNS-t használtuk fel. A reakció végtérfogata 25 µl. Az azonos tartalmú PCR csöveket

úgy helyeztük el a készülékben, hogy 50°C és 69,7°C közötti hőmérsékleten történjen

meg a primer kötődés. A reakció paraméterei: 95°C-on 10 perc, 95°C-on 20 másodperc,

60°C-on 60 másodperc, 72°C-on 60 másodperc, és 4°C Ciklusszám: 40. A

grádiens PCR reakcióelegy komponenseit a 4. táblázatban tüntettük fel.

44

4. táblázat. A grádiens PCR reakcióelegy komponensei

Komponensek

Térfogat

A kompnenst gyártó cég

10x PCR puffer MgCl2dal 2,5 µl Roche J 0051

10mM dNTP mix 0,5 µl Applied Biosystems, D8220

25 µM forwar primer 0,5 µl

25 µM forwar primer 0,5 µl

5U/ µl AmpliTaq Gold

Enzim

0,5 µl Roche G0448

dH2O 19,5 µl Eppendorf 0032006159

cDNS 1 µl

Összesen 25 µl

Agaróz gélelektroforézis A grádiens PCR reakciók során kapott PCR termékeket 2%-os agaróz gélben

futtattuk meg (5. ábra). A gélkészítésnél 1 g agarózhoz (GIBCO 15510-019) 50 ml 1x-

es Tris borát EDTA (TBE) puffert adtunk, majd forralással feloldottuk az agarózt és 2,5

µl etídium-bromidot (BIO-RAD 161 0433) adtunk hozzá. Gélöntő formába öntöttük,

szilárdulás után pedig a gélt 1x-es TBE pufferrel feltöltött futtatókádba tettük és a

létrehozott zsebekbe bemértünk 12 µl előre előkészített mintát. Az előkészítés úgy

történt, hogy 10 µl mintához 2 µl futtató puffert adtunk (Novagen 69180). A mintákkal

párhuzamosan a gélre 5 µl DNS létrát (Novagen 70539) vittünk fel. A futtatás 100 V-on

40 mA áramerősség mellett 20-30 percig történt. Ezután a SYNGENE MultiGenius Bio

Imaging rendszerével, a GeneSnap szoftver felhasználásával fotódokumentáltuk a gélt.

Ez alapján azt tapasztaltuk, hogy a primer optimális kötődési hőmérséklete 60°C (5.

ábra). A későbbiekben elvégzett real-time RT PCR reakcióban ezt állítottuk be primer

kötődési hőmérsékletként.

45

5. ábra. A grádiens PCR termékek 2%-os

agaróz gélben futtatva:

1. 50°C 2. 51.4°C

3. 55.5°C 4. 60.8°C

5. 66° 6. 69.7°C

5.2.2.3. mRNS expresszió vizsgálata real-time RT-PCR módszerrel

A real-time PCR reakciókhoz 2 µl cDNS-oldatot használtunk, a méréseket ABI

Prism 7000 készüléken (Applied Biosystems) végeztük. Minden egyes PCR reakciót 25

µl reakcióelegyben, SYBR Green PCR Master Mix (AB4309155, Foster City, USA)

felhasználásával végeztünk. A primer szekvenciák az alábbiak voltak: AGRN

(GI:51459422, 149bp), forward 5’-CATGGCTGTGTTCTTCATGTGTT-3’ 23, reverse

5’-GGTCATTCTGAGACAAGGACGACT-3’ 24; gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz

(GAPDH) (GI:7669491, 141bp) forward 5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’

23, reverse 5’-TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3’ 22). A mérések 96-os plate-eken,

triplikátumokban történtek: 2 percig 95°C-on, majd 40 cikluson keresztül 95°C-on 20

másodperc, 60°C-on 30 másodperc és 72°C-on 30 másodperc. Az adatok elemzéséhez

és a relatív expresszió statisztikai kiértékeléséhez a REST-programot (relative

expression software tool, www.wzw.tum.de/gene-quantification) használtunk, a

génexpressziót minden gén esetében a GAPDH háztartásgénhez mint referenciagénhez

viszonyítottuk. A relatív expressziót az alábbi képlet alapján számítottuk ki:

46

R= a relatív expresszió

E =a PCR reakció hatékonysága (azaz ciklusonként észlelt PCR növekedés szorzója.

CP= crossing point, az a ciklusszám, ahol az RNS mennyisége meghaladja a

detektálhatóság küszöb (treshold) értékét.

t - treshold, küszöbérték: exponenciális fázisban;

Ct – treshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a

szintet – a kiindulási DNS mennyiséggel arányos;

A PCR termékek méretének ellenőrzésére a reakció termékekből 10 µl-t

futtattunk 2%-os agaróz gélen, majd etídium-bromidos festéssel tettük láthatóvá az

amplikonokat (6. ábra).

A B

6. ábra. Az (A) ábrán az agaróz gélen futatott real-time RT-PCR termékek

láthatók. (B) A termékek olvadáspont görbéje látható.

5.2.2.4. Statisztikai kiértékelés

47

A statisztikai kiértékelést a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc. San

Diego, CA, USA) software segítségével végeztük. A csoportok közötti

összehasonlításra a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk. A különbséget p <0,05 esetén

tartottuk szignifikánsnak.

48

6. EREDMÉNYEK

6.1. Agrin fehérje expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel

6.1.1. Agrin expresszió ép és cirrhotikus humán májszövetben A normál májban, illetve tumor melletti ép májszövetekben az agrin a portális

térben, az erek és az epeutak bazális membránjában fordult elő. A májparenchymában a

szinuszoidok mentén nem volt agrin pozitivitás. A reakció a centrális vénák körül sem

mutatott pozitivitást (7.A. ábra). A vizsgált HCC-k 42.8%-a cirrhotikus talajon alakult

ki. A cirrhotikus májszövetben az agrin expresszió a májparenchymában és a

szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető, viszont erős pozitivitás volt látható a

kötőszövetes sövényekben, a portális erek és a felszaporodott epeduktusok bazális

membránjában (7.B. ábra). Jellegzetesen a cirrhotikus nodulusok széli részen duktuláris

reakció volt megfigyelhető, a ductusok körül erős agrinexpresszió volt látható.

7. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A) normál (200x, AEC) és (B)

cirrhotikus májban (400x, AEC). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

6.1.2. Agrin expresszió hepatocellularis carcinomában

A B

49

Az agrin protein expressziót 35 formalinban fixált, paraffinba ágyazott HCC-n

vizsgáltuk. Mindegyik tumor minta tartalmazott ép vagy cirrhotikus peritumorális

májszövetet. A HCC-ben erős agrin expresszió volt megfigyelhető az újonnan

képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában. A tumorsejtek nem

tartalmaztak agrint (8. ábra). A peritumorális ép és cirrhotikus szövet nem mutatott

lényeges eltérést a normál, illetve cirrhotikus májszövethez képest. Az agrin

neovaszkuláris BM lokalizációjának megerősítésére végeztük a CD34, mint endothel

marker expressziójának kimutatását. A vártnak megfelelően a CD34 expressziója

megegyezett az agrin protein expressziójával a HCC-ben (8.D. ábra). Az agrin

expresszió nem mutatott összefüggést a tumor differenciáltsági fokával. Ellentétben az

agrin expressziójával, a laminin az egész tumor stromában kimutatható.

8. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A) cirrhotikus talajú HCC

200x, AEC (B, C) HCC-ben (600x, AEC). (D) CD34 reakció a HCC-ben (600x,

DAB). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

A B

C D

50

6.1.3. Az agrin expressziója más kötőszöveti fehérjékkel kolokálizációban.

Más szövetekhez hasonlóan az agrin a májban a lamininnal együtt fordul elő a

bazális membránokban (9.A. ábra). Az agrin-pozitív bazális membránban a bFGF

fehérje felhalmazódása is látható. (9.B. ábra). Nemcsak a növekedési faktor kötődik az

agrinhoz, de az agrin maga is ligandként szolgál azon sejtfelszíni receptorok számára,

amelyek a bazális membránhoz kötődnek, elsősorban az αν-integrinen keresztül. Az αν-

integrin az endothel és epeúti epithelsejtekben expresszálódik, és kapcsolatban volt az

agrinnal (9.C,D. ábra). Az epeutakban az αν-integrin immunpozitivitást a sejtek

bazolaterális felszínének egész hosszában megfigyeltük (9.D. ábra), ami azt sugallja,

hogy az αν-integrinnek a bazális membrántól független szerepe is van. Az αν-integrint a

daganatsejtek is termelik, de azok az agrint nem koexpresszálják (9.C. ábra). Ennek

ellenére úgy tűnik, hogy az agrin és az αν-integrin valószínűleg kapcsolatban áll

egymással a bazális membránban.

A B C D

51

9. ábra. Az agrin lehetséges molekuláris partnerei. Kettős immunfloureszcens

vizsgálat fagyasztott humán HCC mintákon (A-C) és a cirrhotikus májszövetben (D);

konfokális felvételek. Piros: agrin (R&D System), zöld: a képen látható feliratoknak

megfelelő struktúrákat jelöli, kék: sejtmag. Az összeadott képekben, a legalsó sorban a

sárga szín kolokalizációt/átfedést jelent. Az agrin a bazális membránban a lamininhoz

kötődve immobilizálódik (A); az agrin képes kötni FGF-2 szerű növekedési faktorokat

(B). (C) A tumor vérerekben az endothelsejtek által expresszált αν-integrin (vékony nyíl

a középső soron) receptorként szerepelhet a BM-ban expresszálódó agrin számára

(vastag nyíl a felső soron). (D) A biliaris epithel sejtek a bazolaterális membrán egész

hosszában expresszálják az αν-integrint (bazális felszín: vékony nyíl; laterális felszín:

nyílhegy). Az agrin a bazális felszínen látható. Hosszmértékek: a: 50µm, b:25µm, c, d:

20µm.

6.1.4. Agrint termelő sejtek májelváltozásokban

Szemmel láthatóan az agrin reakció erőssége az artériák és vénák falaiban erősen

korrelál az érfal izomrétegének vastagságával. Az érfal simaizomsejtei teljes átfedést

mutatnak az agrin felhalmozódásával (10. ábra). Ennek alapján úgy tűnik, hogy a

simaizomsejtek szekretálják az agrint a sejteket burkoló bazális membránba, és az is

elképzelhető, hogy az endothelium bazális membránjába is. Noha az epeutakat nem

veszik körül szorosan a simaizom-aktin (SMA) - pozitív sejtek, ennek ellenére az

epeutakat övező bazális membrán erős agrin- immunreakciót mutat. Ezért,

feltételezhető, hogy az epeúti hámsejtek is termelnek az agrint.

52

A tumorok kapillárisainak bazális membránjában az agrint a stróma SMA+

myofibroblasztjai, az endothelsejtek, illetve mindkettő termelheti (11. ábra).

A B

10. ábra. Az agrint termelő sejtek a

májelváltozásokban. Kettős

immunfluoreszcencia fagyasztott

cirrhotikus humán máj mintákon.

Piros: agrin (R&D System), zöld: az

SMA, kék: sejtmag. Az agrin és az

SMA immunreakció átfedést mutat a

vérerek falaiban. Ennek alapján

következtettünk arra, hogy a vérerek

falában az agrint elsősorban az érfal

simaizomsejtjei termelik. Minthogy az

epeutakban nem látható SMA+

reakcíó, így itt feltehetőleg az epeúti

hámsejtek termelik az agrint. Bár: 50.

53

11. ábra. Kettős immunfluoreszcencia humán HCC fagyasztott metszeten. A HCC

stromájában mind az SMA-pozitív mesenchymális sejtek mind a CD31-pozitív

endotheliális sejtek a bazális membránnal határosak. Hosszmérték: 10 µm

6.1.5. Az agrin expressziójának vizsgálata a cholangiocarcinomában

Immunhisztokémiával az agrin protein expressziót 35 formalinban fixált és

paraffinba ágyazott CC-n vizsgáltuk. CC-s mintákból intrahepatikus (n=7), Klatskin

(n=9), és extrahepatikus (n=19) CC-ket vizsgáltunk. Egyes minták a lokalizáció folytán

nem tartalmaztak peritumorális szövetet. Az epeúti rákokat a WHO kritériumok szerint

osztályoztuk jól differenciált (n=5), közepesen differenciált (n=24), valamint rosszul

differenciált (n=6) tumorokra.

Erős agrin expresszió figyelhető meg a tumorsejtekből álló glanduláris és

trabekuláris szövetszerkezetet körülvevő bazális membránban a jól és közepesen

differenciált CC-ákban (12.A, B, E ábra). Ezzel szemben a rosszul differenciált

tumorokban, valamint a környezetbe betörő tumorszöveteknél az agrin expresszió

fragmentálódott, csökkent, sőt el is tűnik (12.C, D ábra). A tumorsejtekben, valamint a

lamininnal ellentétben a tumor stromájában sem volt megfigyelhető agrin expresszió.

A CD34 endothel-marker expressziója megegyezett az agrin expresszióval a

tumor stroma ereiben, viszont nem volt megtalálható a tumorban a glanduláris és

trabekuláris struktúrákat körülvevő bazális membránban (12.F ábra).

54

12. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A, B) közepes diffenciált

(G2), (C, D) rosszul differenciált (G3) és (E) jól differenciált (G1) CC-ben. (A 200x,

B-E 600x, AEC) (F) CD34 immunreakció látható a jól differenciált (G1) CC-ben

(600x, DAB). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

55

Az agrin immunhisztokémiai reakciónak morfometriai elemzése

Az agrin-pozitív területek kvantitatív morfometriai elemzése az összterület

százalékában a következő eredményeket hozta: Normál máj: 0.22 ± 0.029%, HCC: 1.55

± 0.121%, CC: 3.72 ± 0.277%. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy CC-ben

szignifikánsan (p<0,0001) több agrin expresszálódik, mint a HCC-ben. Mind a HCC,

mind a CC szignifikánsan (p<0,0001) több agrint tartalmaz, mint a normál máj (13.A.

ábra). A jól és közepesen differenciált CC-ben az immunpozitív területek aránya

szignifikánsan (p< 0.0001; p< 0.0001) magasabb volt a rosszul differenciált tumorokhoz

viszonyítva. A jól és közepesen differenciált tumorok között nem volt szignifikáns

különbség (13.B. ábra).

13. ábra. Az agrin immunhisztokémiai reakciónak morfometriai elemzése HCC-

ben, CC-ben és normál májban. (A) Normál, CC és HCC csoportok összehasonlítása.

(B) Különböző differenciáltságú CC-k összehasonlítása. A * a csoportok közötti

szignifikáns eltérést jelöli.

6.1.6. Az agrin expresszió vizsgálata hepatocellularis adenomában Tizennégy hepatocellularis adenomában (HCA) vizsgáltuk az agrin fehérje

expressziót immunhisztokémiai módszerrel. Az agrin expressziója a tumorokon belül

eltéréseket mutat. Egyes területeken erős immunpozitivitás látható a szinuszoidoknak

megfelelő képletek mentén (14.A,C. ábra), míg máshol a tumorszövet teljesen negatív

56

(14.A,D. ábra). A CD34 párhuzamos metszeteken az előző kísérletekben

kolokalizációt mutatott az agrinnal, ezért hasonló vizsgálatokat végeztünk az

adenomákban. A HCC-vel szemben az adenomákban az agrin és a CD34 festődés nem

teljesen fedi egymást (14.A,B. ábra). A CD34 egy korábban megjelenő markernak

mutatkozik a „neovaszkularizáció” során.

A B

Agrin CD34

C D

Agrin Agrin

14. ábra. Az agrin (A) és CD34 (B) immunhisztokémiai reakciója párhuzamos metszeteken a HCA-ban. Egyes területeken erős immunopozitivitás látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén (A, C), míg máshol a tumorszövet teljesen negatív (A. D). A: 100x, AEC. B, C, D: 200x, AEC. A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

6.1.7. Az agrin expresszió vizsgálata fokális noduláris hyperplasiában

Az FNH szövettani jellegzetessége az igen kifejezett centrális, gyakran csillag

alakú heg; a hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabeculákat képeznek, köztük portális

57

traktusoknak megfelelő képletek láthatóak. Az epeút proliferáció igen kifejezett.

Közepesen erős agrin expresszió figyelhető a proliferáló epeútak bazális membránjában.

Centrálisan szembetűnő nagyszámú vaskos falú ér, melyek BM-ja is agrin pozitiv. A

szinuszoidok mentén agrin expresszió nem látható.

A B

15. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja a FNH-ban (A 200x, B 600x,

AEC). Az agrin expressziója (nyilak) proliferáló epeutak és az erek BM-jében

figyelhető meg a FNH-ban.

6.2. Az agrin fehérje expresszió vizsgálata Western Blot technikával

Két gramm szövetből izolált proteoglikán azonos hányadát futtatva, mind a HCC-

ben, mind a CC-ben a normál máj proteoglikán tartalmának sokszorosa detektálható. A

16. ábrán láthatóak a Western blottal kimutatott eredmények. Az agrin Western bloton

azt láthatjuk, hogy CC-ben erősebb a reakciók mint HCC-ben; a normál májban

összehasonlítva CC-vel és a HCC-vel nem volt látható az agrin fehérje expresszió.

16. ábra. Agrin fehérje-expresszió detektálása Western blot technikával normál

májban (1), HCC-ben (2) és CC-ben (3).

58

6.3. Az agrin mRNS kimutatása real time RT-PCR-vel Az „Anyagok és módszerek” fejezetnek megfelelően, a real-time-RT PCR-rel

kapott adatokat egy relatív kvantifikációra alkalmas szoftver segítségével értékeltük ki.

Referencia génként a GAPDH-t használtuk.

Az 17. ábrán látható, hogy HCC-ben a normál májhoz képest az agrin mRNS

expressziója fokozott, de nem mutatott szignifikáns változást. A CC mintákban az agrin

szignifikánsan magasabb volt mind a normál májban (10,75-szer), mind a HCC-ben

(3,4-szer). CC-t környező tumormentes szövetekben az agrin mRNS szintje magasabb,

mint a normál májban. A CC-ben, annak tumormentes környezetéhez viszonyítva 2.8-

szoros emelkedést mértünk, bár ez statisztikailag nem volt szignifikáns (17. ábra).

A PCR vizsgálat megerősítette az immunhisztokémiai vizsgálat eredményeit: az

agrin fehérje- és mRNS- expressziója CC-ben szignifikánsan magasabb volt a normál

májhoz és HCC-hez képest, és emelkedést mutatott a környező tumormentes

szövetekhez viszonyítva.

A real-time RT-PCR eredmények számértékeit a 4. táblázatban foglaltuk össze.

*

*

17. ábra. Az agrin expresszió real-time RT-PCR reakció eredmények alapján

kimutatott mennyiségi eltérései különböző csoportokban. Az oszlopok az agrin

mRNS expresszió n-szeres mennyiségi különbséget ábrázolják a vizsgált csoportokban

59

a kontrollnak vett csoportokhoz képest. Minden esetben az aláhúzott csoportot

hasonlítjuk a másik csoporthoz; N: normál máj, HCC: hepatocellularis carcinoma, CC:

cholangiocarcinoma, kHCC: HCC tumormentes környező májszövet, kCC: CC

tumormentes környező májszövet. *- szignifikáns különbséget jelöli.

4. táblázat. Az agrin mRNS expresszió mennyiségi összehasonlítása real-time RT-

PCR reakció alapján.

Csoportok Agrin relatív mRNS expresszió

n-HCC U 2,271

NS, P=0,089

n-CC U 10,755

S, P=0,001

HCC-CC U 3,374

S, P=0,022

n-kHCC U 1,723

NS, P=0,238

kHCC-HCC D 1,003

NS, P=0,85

kCC-CC U 2,807

NS, P=0,0545

n-kCC U 1,838

NS, P=0,29

kHCC-kCC U 1,199

NS P=0,77 N: normál máj, HCC: hepatocellularis carcinoma, CC: cholangiocarcinoma, kHCC:

HCC tumormentes környező májszövet, kCC: CC tumormentes környező májszövet. Az

U – „ upregulált”, D- „ downregulált”, NS-nincs szignifikáns eltérés, S – szignifikáns

eltérés,

60

7. MEGBESZELÉS

A malignusan transzformált sejtek a gazdaszervezeten belül túlélésre, sőt

szaporodásra és invázióra képesek. Ez jelzi, hogy a daganatsejtek mielőtt elpusztítják,

azelőtt leigázzák a gazdaszervezetet, azaz áthangolják különböző sejtjeinek,

sejtvonalainak működését: kikapcsolják a védekező mechanizmusokat, saját

szolgálatukba állítják a gazdaszervezet sejtjeit. Utóbbira példa a daganatnövekedés

egyik domináns mozzanata, a tumormátrix-képződés folyamata, azaz a daganatsejtek

sajátos mikrokörnyezetének kialakulása, mely nem pusztán a tumorsejtek

gazdaszervezeten belüli túlélésének, de kontrollálatlan szaporodásának színtere. Ma már

egyre sokasodnak az irodalomban azok a közlések, amelyek a tumormátrixot – ezen

belül is elsősorban a proteoglikánok depozícióját – terápiás intervenciók célpontjaként

jelölik meg, hangsúlyozván, hogy a gazdaszervezet stromális sejtjeinek áthangolódását

kellene megakadályozni, vagyis gátolni a tumorsejteket túléltető mikrokörnyezet

kialakulását.

A HSPG-k alkalmasak számos szabályozó- illetve növekedési faktor kötésére,

tárolására, képesek azokat aktiválni vagy inaktiválni, prezentálni, ko-receptorként

felkínálni a tumorsejtek felszíni receptorai számára, így minőségbeli és mennyiségbeli

változásaik új, a normálistól eltérő információk közvetítését eredményezhetik. Ilyen

funkcionális változások tisztázásának előfeltétele a daganatos proteoglikán expresszió

és az azt befolyásoló faktorok pontos feltérképezése. A megváltozott proteoglikán

expressziónak mind a daganatok kialakulásában, mind pedig progressziójában szerepe

lehet.

A májbetegségekben a proteoglikánok képződésében és szerkezetében szembetűnő

változás következik be.

A bazális membrán HSPG családjába tartozó proteoglikánok közül egyesekről

már bebizonyították, hogy fontos szerepük van a különböző típusú daganatok

pathogenezisében. E csoport legnagyobb képviselőjéről, a perlecanról már leírták, hogy

részt vesz a tumor terjedésében, a metasztázis-képződésben, valamint a

neoangiogenezisben. A perlecan mRNS szintje jelentősen emelkedett a humán

metasztatizáló melanomában a normál szövethez képest. A kórosan expresszálódott

perlecan a pericelluláris mátrixban lerakódik és megjelenése a melanoma sejtek erős

61

metasztatizáló képességével összefügghet (Marchetti és mtsai, 1993). A perlecan HS

láncairól kiderült, hogy különböző növekedési faktorokkal (pl: bFGF) kölcsönhatásba

lépve stimulálják a tumornövekedést és az érképződést (Aviezer és mtsai, 1994).

Bebizonyították, hogy a perlecannak szerepe van az intrahepatikus CC (Sabit és mtsai,

2001), emlő (Iozzo és mtsai, 1994), petefészek, nyálmirigy (Kimura és mtsai, 2000),

colon (Sharma és mtsai, 1998) valamint a prosztata rák (Jiang és Couchman, 2003)

kialakulásban és terjedésben. Érdékes, hogy a perlecan C-terminális része, az

endorepellin gátolja az angiogenesist (Mongiat és mtsai, 2003).

A BMHSPG-k nemrég felfedezett másik tagjáról, a collagen XVIII-ról

kimutatták, hogy egy fragmense, az endostatin mind in vivo, mind in vitro anti-

angiogenikus hatással bír (Marneros és Olsen, 2005).

Kevesebbet tudunk az agrinnak daganatok kialakulásában és

progressziójában játszott szerepéről. Csupán a glioblastoma multiforméban a

vaszkuláris barrier érésében és differenciálódásában való részvételét írták le (Rascher és

mtsai, 2002).

Mind az agrin, mind a perlecan megtalálható a BM-ban, és mindkettőt kódoló

gén az 1. emberi kromoszoma rövid karján helyezkedik el. Az agrin C-terminális része a

perlecanéhoz hasonló, ezért feltehetőleg a perlecanhoz hasonlóan szerepe lehet

különböző sejtproliferációs folyamatokban.

Számos vizsgálat feltárta a neuronalis agrin szerepét embriógenezis során (Kim és

mtsai, 2007). Felnőttekben a non-neuronális szövetek közül a tüdőben és a vesében levő

agrinnal foglalkoztak (Groffen és mtsai, 1998). Az agrin májban, ill. májbetegségek

során bekövetkező mennyiségi és minőségi változásairól eddig nem jelent meg

közlemény.

Munkacsoportunkkal az agrin expresszióját vizsgáltuk a különböző májbetegségekben,

elsősorban a primer májtumorokban.

A normál májszövet egyik fontos jellemzője, hogy nagyon kevés proteoglikánt

tartalmaz. Ezek többsége sejtfelszíni, illetve transzmembrán HSPG, és elhanyagolható

az ECM proteoglikánok mennyisége. A formalin-fixált, paraffinba ágyazott normál

humán májakon az agrin fehérje komponensét immunhisztokémiával detektáltuk. Az

agrin az epeutak BM-jában, a portális artériák és vénák BM-jában volt erős intenzitással

62

kimutatható, míg a centrális vénában, a nyirokerek BM-jában immunohisztokémiai

módszerrel nem volt detektálható. Az agrin immunhisztokémiai megjelenése a

perlecanétól abban különbözik, hogy a perlecan periszinuszoidális pozitivitást is mutat a

normál májban.

A normál májszövetben látottakat összehasonlítva a májrák körüli, látszólag ép,

cirrhosismentes májszövettel nem volt különbség az agrin immunhisztokémiájában.

Cirrhotikus májban fokozódik az agrin depozíciója a proliferáló epeutakban. A

fibrotikus szeptumokban megfigyelhető reakció (erek, epeutak BM) mellett a

cirrhotikus göbök széli részen bizonyos sejtcsoportok körül megjelenik az agrin

pozitivitás, ami a duktularis reakciónak felelhet meg. Maga a duktularis reakció a

károsult májszövetek regenerációjának részjelensége, amelynek következtében

periportális ill. cirrhotikus nodulusok széli részen levő őssejtek aktiválódnak és

hepatocytákka differenciálódnak (Desmet és mtsai, 1995). Az agrin e nodulusok körüli

megjelenésnek feltehetőleg szerepe lehet az őssejtek differenciálódásában. Egyes

esetekben a cirrhotikus göbök közepén enyhe periszinuszoidális agrin pozitivitás jelenik

meg amely a szinuszoidalis cirrhotikus májkárosodás egyik legsúlyosabb eseménye, ez

vezet végső soron a hepatocyták elégtelen funkciójához .

Kérdés, hogy az agrin mennyiségének és összetételének változása pusztán mint a

szövetproliferáció egyik részjelensége értékelendő, vagy ennél többről van szó és ezek a

változások hatással vannak a cirrhosis kimenetelére is. Több adat utal arra, hogy

bizonyos proteoglikánok részesei a mátrixképződés szabályozásának. Ismert, hogy a

decorin a kollagén rostokhoz kötődve gátolja azok érését, tehát a kötőszövetképzés

gátlásának irányában hat. A decorin a TGFβl inaktiválására képes, mely a növekedési

faktorról köztudott, hogy a fibrogenezis egyik fő stimulátora (Hildebrand és mtsai,

1994; Kovalszky és mtsai, 1998).

Az FNH a máj daganatszerű elváltozásai közé tartozik. Jellemző, hogy a

hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabekulákat képeznek, körülöttük kifejezett epeút-

proliferáció látható. Az agrin itt a proliferált epeutak bazális membránjában található.

Jellegzetes, hogy FNH-ban a nodulusok széli részén a duktularis reakció körül fokozott

agrin pozitivitás látható. A proliferáló epeúti sejtek eredete nem tisztázott, szerepe lehet

benne a differenciálódó őssejteknek.

63

A humán májtumorok esetében az agrin fehérje-expresszió fokozott, de

megjelenése tumor típusától függően váltózó.

A HCA-ban változatos az agrin expresszió. Egyes tumorok erős agrin pozitivitást

mutatnak a tumor-szinuszoidoknak megfelelő képletek és az erek BM-je mentén. Ez a

jelenség a tumoron belül is változó erősségű, a tumorok egyes részei teljesen negatívak.

Ezzel ellentétben az immunhisztokémiai reakció CD34-gyel kiterjedtebb szinuszoidalis

pozitivitást mutat az adenomákban. A CK7 viszont az adenomákon belül teljesen

negatív, ami arra utal, hogy nincsenek bennük epeutak. A fentiekből következik, hogy

az adenomán belüli neovaszkularizációs folyamatnak több lépcsője lehet. Ott, ahol csak

a CD34 pozitivitás mutatható ki, csak az endothelsejtek képeznek érfalat, míg az agrin-

pozitív területeken már fokozottabb strukturális átrendeződés alakulhatott ki.

A HCC-ben intenzív agrin fehérje-expressziót találtunk az újonnan képződött

kapillárisok és az erek bazális membránjában. A HCC-ben nincsenek epeutak, és

vaszkularizáció indul meg a tumor területén. Az így kialakuló erek biztosítják a tumor

tápanyagellátását. Ezen újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában

agrin immunpozitivitás figyelhető meg. Az agrin neovaszkuláris BM lokalizációjának

megerősítésére végzett CD34 és CD31, mint endothel-markerek immunohisztokémiai

reakciója kolokalizációt mutatott az agrinéval a HCC-ben. Az agrin mint HSPG

feltehetően képes kötni különböző növekedési faktorokat, beleértve az FGF-2-t is.

Ennek bizonyítására végeztünk immunfloureszcens vizsgálatot a HCC-n FGF-2- és

agrin-ellenes antitestekkel. Elképzeléseinknek megfelelően az agrin pozitív BM-ben az

FGF-2-t találtunk.

Az agrin-expresszió a tumor differenciáltságával nem mutat összefüggést HCC-ben, bár

a jól differenciált HCC erős trabekuláltságának megfelelően nagyon erezett, ezért

erősen agrin pozitív.

Mindebből az következtethető ki, hogy az agrinnak szerepe van az

angiogenesisben. Feltehetően az agrin HS láncai különböző növekedési faktorokat

(bFGF, VEGF, stb) kötve stimulálják a neovaszkularizációt és a tumornövekedést. Ezen

kívül az agrin azáltal is segítheti a neoangiogenesist, hogy a különböző növekedési

faktorok agrinhoz való kötődése megvédi őket a proteolitikus bomlástól és a hőtől

(Saksela és mtsai, 1988). Lehetséges, hogy az agrin nem csak HS láncaival vesz részt az

angiogenetikus és proliferaciós folyamatokban, hanem közvetlenül vázfehérjéje

64

segítségével is, mivel ezzel kapcsolódni tud az integrinhez és a lamininhoz. Míg a

laminin a HCC stromájában mind az erek BM-jében, mind a kötőszövetben előfordul,

addig az agrin expresszió csak az erek BM-jére korlátozódik.

A CC-ben erős agrin immunreakciót kaptunk. Az agrin immunpozitivitás a

glanduláris szerkezetű tumorsejteket körülvevő BM-ra lokalizálódik. A tumor stromája

az erek BM-je kivételével negatív volt. Az agrin fehérjeexpresszió intenzitása a tumor

differenciáltságtól függően eltért. Magasan és közepesen differenciált tumorban, a

tumorfészkek körüli BM-ben jóval erősebb agrin expresszió volt detektálható, mint

rosszul differenciált tumorokban.

A kevésbé differenciált tumorok egyre kevesebb agrint tartalmaznak, ami arra

utal, hogy az agrin csökkenése a tumor progressziójával és nem a malignus

transzformáció tényével függ össze. Itt az agrin eltünése a bazális membrán

degradálódásával, az intraendothelialis kapcsolatok fellazulásával járhat együtt, és az

endothelsejt migrációjának elindítása, az angiogén stimulus irányában hathat.

A megfigyelt változások feltehetõen maguk után vonják a mikrokörnyezet

módosulását, eltérő szabályozó faktorok kötődését és érvényre jutását a daganatos sejtek

környezetében, elősegítve a daganatok növekedési autonómiájának kialakulását.

Mind a real-time RT-PCR, mind a Western blot, mind pedig az

immunhisztokémiai vizsgálatok arra utalnak, hogy a környező, illetve normál májhoz és

a HCC-hez képest a CC-ben az agrin expresszió jelentősen fokozott.

Az RNS- és fehérje-szintű vizsgálatok igen jól egyeztek egymással, ami arra utal, hogy

a vizsgált mintákban az expresszió elsősorban a transzkripció szintjén szabályozódik.

Mások közlése szerint előfordul, hogy viszonylag magas RNS szint mellett a fehérje

nem íródik át, tehát számítani kell a transzláció szintjén ható szabályozó

mechanizmusokra is (Benjamin és Moroni, 2007).

Még nem tisztázott az agrin fokozott expressziójának a forrása. A CC-ben

valószínű, hogy a tumorsejtek részben agrint termelnek, részben pedig olyan faktorokat,

amelyek a környezet nem tumoros sejtjeit fokozott agrin-szintézisre késztetik. A

fokozott agrin expresszió egyrészt különböző növekedési faktorok kötésével, ko-

receptorként közvetlenül segíti a tumor proliferációját, invázióját, ugyanakkor mintegy

körülbástyázza a daganatot, lehetőséget nyújtva annak fokozott autonómiájára.

65

Összeségében eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy az agrin expresszió

kimutatható normál májban, cirrhotikus májban, HCA-ban, FNH-ban, HCC-ben,

valamint CC-ben. A fokozott agrin expresszió HCC-ben és HCA-ban e fehérjének a

kapillarizációban és a neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető,

hogy CC-ben az agrin a tumor-progresszióban játszik fontos szerepet.

66

8. KÖVETKEZTETÉSEK

1. A normál humán májszövetben az agrin fehérje a portális terek ereinek és

epeútjainak bazális membránjában fordul elő. A szinuszoidok mentén agrin nem

expresszálódik.

2. A cirrhotikus májszövetben az agrin fehérje-expresszió a felszaporodott

kötőszövetben a proliferáló epeutak és az erek bazális membránjában mutatható ki. A

cirrhotikus májban - a normál májhoz hasonlóan - a parenchymában a szinuszoidok

mentén nem volt megfigyelhető agrin pozitivitás.

3. A hepatocellularis carcinomákban (HCC) erős agrin expresszió figyelhető

meg az újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában.

4. Az endothelt jellemző CD34 fehérje expresszió a HCC-ben kolokalizációt

mutatott az agrin expresszióval.

5. A jól és közepesen differenciált cholangiocarcinomákban (CC) erős agrin

expresszió jellemzi a tumorsejtek alkotta glanduláris és trabekuláris struktúrák körüli

bazális membránt, amelyhez nem kapcsolódik CD34 pozitivitás.

6. Ezzel szemben a rosszul differenciált cholangiocarcinomákban, valamint a

környezetet infiltráló tumorszövetben az agrin expresszió csökkent, fragmentálódott, sőt

el is tűnt.

7. Sem a cholangiocarcinoma sejteiben, sem - a lamininnal ellentétben - a tumor

stromájában nem volt megfigyelhető az agrin fehérje-expresszió.

8. Összességében az agrin fehérje-expressziója a HCC-ben fokozottabb, mint a

normál májban, azonban a HCC-nél is magasabb a CC-ben. Az mRNS expresszió

67

vizsgálata hasonló eltérést mutatott és a Western blot analízis megerősítette az

immunhisztokémiai módszerrel detektált fehérje-expressziós eredményeket.

9. Az agrin expressziója a tumorokon belül változatos expressziót mutat a

hepatocellularis adenomákban (HCA). Egyes területeken erős immunopozitivitás

látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén, míg máshol a tumorszövet

teljesen negatív.

10. A fokális noduláris hyperpláziában (FNH) közepesen erős agrin expresszió

figyelhető meg a proliferáló epeútak bazális membránjában. A centrálisan szembetűnő,

nagyszámú vaskos falú ér bazális membránja is agrin pozitív, míg a szinuszoidok fala

negatív.

68

9. ÖSSZEFOGLALÁS

A heparánszulfát-proteoglikánok (HSPG) az ECM fehérjék családjába tartozó

molekulák. Részben fehérje-, részben cukorláncaik részvételével aktív részesei a

sejtműködés szabályozásának. A máj károsodása során a proteoglikánok mennyisége

igen jelentősen változik. Mennyiségi és minőségi változásuk hozzájárul a daganatos

fenotípus kialakításához. Az agrin egy multidomain HSPG, amely különböző szervek

bazális membránjában található. Jelenleg kevés irodalmi adat áll rendelkezésünkre az

agrin karcinogenezisben betöltött szerepéről. Munkánk során célul tűztük ki az agrin

mRNS- és fehérje-expressziójának tanulmányozását egészséges májban és különböző

májbetegségekben, elsősorban primer májrákokban.

Az immunohisztokémiai vizsgálatokat 114 formalinban fixált, paraffinba

ágyazott humán mintán (35 HCC, 35 CC, 14 HCA, 20 FNH, 10 normál máj) végeztük.

Az agrin mRNS-expresszóját 52 sebészetileg eltávolított és RNA laterben fixált mintán

vizsgáltuk (13 HCC, 13 HCC tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC

tumormentes környező májszövet, 10 normál máj). A fenti vizsgálatok megerősítésére

Western blot analízist végeztünk.

A normál humán májban, illetve tumor melletti ép májszövetben az agrint a

portális tér ereiben, az epeutak és a portális erek bazális membrán zónájában

detektáltuk; a szinuszoidokban nem volt kimutatható agrin fehérje expresszió. A

cirrhotikus májszövetben az agrin-expresszió a májparenchymában és a szinuszoidok

mentén nem volt megfigyelhető, viszont erős pozitivitás volt látható a kötőszövetes

sövényekben, a portális erek és a felszaporodott epekanalikulusok bazális

membránjában. A HCC-ben intenzív agrin fehérje expressziót találtunk az újonnan

képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában, amely a tumorok

differenciáltsági fokával nem mutatott összefüggést. Erős agrin-expresszió figyelhető

meg a tumorsejtekből álló glanduláris és trabekuláris szövetszerkezetet körülvevő

bazális membránban a jól és közepesen differenciált CC-kben. Ezzel szemben a rosszul

differenciált CC-ben, valamint a környezetbe betörő tumorszövetben az agrin-

expresszió csökkent, fragmentálódott, sőt el is tűnt. A HCA-ban az agrin expressziója a

tumorokon belül változatos expressziót mutat. Egyes területeken erős immunpozitivitás

látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén, míg máshol a tumorszövet

69

teljesen negatív. A FNH-ban intenzív agrin expresszió figyelhető meg a proliferáló

epeutak bazális membránjában.

A fokozott agrin expresszió HCA-ban és HCC-ben e fehérjének a

kapillarizációban és a neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető,

hogy CC-ben az agrin a tumor-progresszióban játszik fontos szerepet.

70

10. SUMMARY

Heparan sulphate proteoglycans mediate cell adhesion and control the activities

of numerous growth and motility factors. They play a critical role in carcinogenesis and

tumour progression. Agrin is a large, multidomain heparan sulphate proteoglycan which

is associated with basement membranes of several tissues. Recently, the tissue

expression of agrin was described in several organs, including the liver, under

physiological conditions. So far, little is known about its role in malignancies,

especially in primary liver tumours.

Our goal, therefore, was to investigate mRNA and protein expression of agrin in

primary liver tumors (HCC, CC, HCA and FNH) to analyze its involvement in

tumorigenesis.

The mRNA expression was measured on 52 surgically resected, RNA later fixed

samples by real-time PCR method. Agrin immunostaining was carried out on 114

formalin fixed, paraffin-embedded surgical biopsy specimens (35 CC, 35 HCC, 14

HCA, 20 FNH, 10 normal liver). Western blot analysis on representative samples was

also performed.

Immunohistochemistry showed mild positivity around the bile ducts and the

blood vessels within the portal area in normal liver, however, no expression within the

hepatic lobules was found. HCC presented intense expression along the neovascular

basement membrane. CC samples showed increased mRNA expression of agrin in

comparison to both normal liver and HCC. Intense protein expression of agrin was

observed in the tumor-specific basement membrane in well differentiated areas of CCs,

which staining was fragmented, decreased or even disappeared in less differentiated

fields and sites of infiltration. Western blot analysis confirmed the presence of increased

agrin expression.

In HCA, agrin expression was variable within the tumors. In the some fields

agrin showed strong expression along the sinusoids, while elsewhere it was negative. In

FNH intensive agrin expression was detected in the basement membrane of the

proliferated bile ducts, while no agrin expression was observed along the sinusoids.

71

Agrin may play an important role in neoangiogenesis in human HCCs and

HCAs, as part of the newly formed vasculature. In CCs, agrin is also thought to play an

important role in tumour progression.

72

11. IRODALOMJEGYZÉK

Albores-Saavedra,J, L Murakata, J E Krueger, D E Henson, 2000, Noninvasive and

minimally invasive papillary carcinomas of the extrahepatic bile ducts: Cancer, 89: 508-

515.

Angelucci,A, M Bologna, 2007, Targeting vascular cell migration as a strategy for

blocking angiogenesis: the central role of focal adhesion protein tyrosine kinase family:

Curr.Pharm.Des, 13: 2129-2145.

Arenson,DM, D M Bissell, 1987, Glycosaminoglycan, proteoglycan, and hepatic

fibrosis: Gastroenterology, 92: 536-538.

Aviezer,D, D Hecht, M Safran, M Eisinger, G David, A Yayon, 1994, Perlecan, basal

lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding,

mitogenesis, and angiogenesis: Cell, 79: 1005-1013.

Beasley,RP, L Y Hwang, C C Lin, C S Chien, 1981, Hepatocellular carcinoma and

hepatitis B virus. A prospective study of 22 707 men in Taiwan: Lancet, 2: 1129-1133.

Benjamin,D, C Moroni, 2007, mRNA stability and cancer: an emerging link?:

Expert.Opin.Biol.Ther., 7: 1515-1529

Bezakova,G, M A Ruegg, 2003, New insights into the roles of agrin: Nat.Rev.Mol.Cell

Biol., 4: 295-308.

Biecker,E, H P Fischer, H Strunk, T Sauerbruch, 2003, Benign hepatic tumours:

Z.Gastroenterol., 41: 191-200.

Bosch,FX, J Ribes, M Diaz, R Cleries, 2004, Primary liver cancer: worldwide incidence

and trends: Gastroenterology, 127: S5-S16.

73

Bowe,MA, K A Deyst, J D Leszyk, J R Fallon, 1994, Identification and purification of

an agrin receptor from Torpedo postsynaptic membranes: a heteromeric complex related

to the dystroglycans: Neuron, 12: 1173-1180.

Bowe,MA, J R Fallon, 1995, The role of agrin in synapse formation:

Annu.Rev.Neurosci., 18: 443-462.

Broome,U, R Olsson, L Loof, G Bodemar, R Hultcrantz, A Danielsson, H Prytz, H

Sandberg-Gertzen, S Wallerstedt, G Lindberg, 1996, Natural history and prognostic

factors in 305 Swedish patients with primary sclerosing cholangitis: Gut, 38: 610-615.

Burgess,RW, W C Skarnes, J R Sanes, 2000, Agrin isoforms with distinct amino

termini: differential expression, localization, and function: J.Cell Biol., 151: 41-52.

Castellot,JJ, Jr., M L Addonizio, R Rosenberg, M J Karnovsky, 1981, Cultured

endothelial cells produce a heparinlike inhibitor of smooth muscle cell growth: J.Cell

Biol., 90: 372-379.

Cattaruzza,S, M Schiappacassi, A Ljungberg-Rose, P Spessotto, D Perissinotto, M

Morgelin, M T Mucignat, A Colombatti, R Perris, 2002, Distribution of PG-M/versican

variants in human tissues and de novo expression of isoform V3 upon endothelial cell

activation, migration, and neoangiogenesis in vitro: J.Biol.Chem., 277: 47626-47635.

Cavari,S, S Vannucchi, 1993, Glycosaminoglycans exposed on the endothelial cell

surface. Binding of heparin-like molecules derived from serum: FEBS Lett., 323: 155-

158.

Chakravarti,S, 2002, Functions of lumican and fibromodulin: lessons from knockout

mice: Glycoconj.J., 19: 287-293.

74

Cheifetz,S, J A Weatherbee, M L Tsang, J K Anderson, J E Mole, R Lucas, J Massague,

1987, The transforming growth factor-beta system, a complex pattern of cross-reactive

ligands and receptors: Cell, 48: 409-415.

Cheng,J, J P Grande, 2002, Transforming growth factor-beta signal transduction and

progressive renal disease: Exp.Biol.Med.(Maywood.), 227: 943-956.

Cole,GJ, M Burg, 1989, Characterization of a heparan sulfate proteoglycan that

copurifies with the neural cell adhesion molecule: Exp.Cell Res., 182: 44-60.

Cole,GJ, W Halfter, 1996, Agrin: an extracellular matrix heparan sulfate proteoglycan

involved in cell interactions and synaptogenesis. [Review] [86 refs]: Perspectives on

Developmental Neurobiology.3(4):359-71.

Cotman,SL, W Halfter, G J Cole, 2000, Agrin binds to beta-amyloid (Abeta),

accelerates abeta fibril formation, and is localized to Abeta deposits in Alzheimer's

disease brain: Mol.Cell Neurosci., 15: 183-198.

Denzer,AJ, R Brandenberger, M Gesemann, M Chiquet, M A Ruegg, 1997, Agrin binds

to the nerve-muscle basal lamina via laminin: J.Cell Biol., 137: 671-683.

Denzer,AJ, T Schulthess, C Fauser, B Schumacher, R A Kammerer, J Engel, M A

Ruegg, 1998, Electron microscopic structure of agrin and mapping of its binding site in

laminin-1: EMBO J., 17: 335-343.

Desmet,V, T Roskams, P Van Eyken, 1995, Ductular reaction in the liver:

Pathol.Res.Pract., 191: 513-524.

Dodge,GR, I Kovalszky, M L Chu, J R Hassell, O W McBride, H F Yi, R V Iozzo,

1991, Heparan sulfate proteoglycan of human colon: partial molecular cloning, cellular

expression, and mapping of the gene (HSPG2) to the short arm of human chromosome

1: Genomics, 10: 673-680.

75

Doege,K, M Sasaki, Y Yamada, 1990, Rat and human cartilage proteoglycan (aggrecan)

gene structure: Biochem.Soc.Trans., 18: 200-202.

Donahue,JE, T M Berzin, M S Rafii, D J Glass, G D Yancopoulos, J R Fallon, E G

Stopa, 1999, Agrin in Alzheimer's disease: altered solubility and abnormal distribution

within microvasculature and brain parenchyma: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 96: 6468-

6472.

Durbeej,M, M D Henry, M Ferletta, K P Campbell, P Ekblom, 1998, Distribution of

dystroglycan in normal adult mouse tissues: J.Histochem.Cytochem., 46: 449-457.

Eble,JA, J Haier, 2006, Integrins in cancer treatment: Curr.Cancer Drug Targets., 6: 89-

105.

el Serag,HB, 2001, Epidemiology of hepatocellular carcinoma: Clin.Liver Dis., 5: 87-

107, vi.

Esko,JD, J L Weinke, W H Taylor, G Ekborg, L Roden, G Anantharamaiah, A Gawish,

1987, Inhibition of chondroitin and heparan sulfate biosynthesis in Chinese hamster

ovary cell mutants defective in galactosyltransferase I: J.Biol.Chem., 262: 12189-

12195.

Fedarko,NS, M Ishihara, H E Conrad, 1989, Control of cell division in hepatoma cells

by exogenous heparan sulfate proteoglycan: J.Cell Physiol, 139: 287-294.

Ferns,MJ, J T Campanelli, W Hoch, R H Scheller, Z Hall, 1993, The ability of agrin to

cluster AChRs depends on alternative splicing and on cell surface proteoglycans:

Neuron, 11: 491-502.

Fisher,LW, J D Termine, M F Young, 1989, Deduced protein sequence of bone small

proteoglycan I (biglycan) shows homology with proteoglycan II (decorin) and several

nonconnective tissue proteins in a variety of species: J.Biol.Chem., 264: 4571-4576.

76

Frail,DE, L L McLaughlin, J Mudd, J P Merlie, 1988, Identification of the mouse

muscle 43,000-dalton acetylcholine receptor-associated protein (RAPsyn) by cDNA

cloning: J.Biol.Chem., 263: 15602-15607.

Gallagher,JT, 1989, The extended family of proteoglycans: social residents of the

pericellular zone: Curr.Opin.Cell Biol., 1: 1201-1218.

Gallagher,JT, M Lyon, W P Steward, 1986, Structure and function of heparan sulphate

proteoglycans: Biochem.J., 236: 313-325.

Gallai,M, I Kovalszky, T Knittel, K Neubauer, T Armbrust, G Ramadori, 1996,

Expression of extracellular matrix proteoglycans perlecan and decorin in carbon-

tetrachloride-injured rat liver and in isolated liver cells: Am.J.Pathol., 148: 1463-1471.

Gallegos,NC, C Smales, F J Savage, R M Hembry, P B Boulos, 1995, The distribution

of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in colorectal

cancer: Surg.Oncol., 4: 21-29.

Gautam,M, P G Noakes, L Moscoso, F Rupp, R H Scheller, J P Merlie, J R Sanes,

1996, Defective neuromuscular synaptogenesis in agrin-deficient mutant mice: Cell, 85:

525-535.

Gee,SH, F Montanaro, M H Lindenbaum, S Carbonetto, 1994, Dystroglycan-alpha, a

dystrophin-associated glycoprotein, is a functional agrin receptor: Cell, 77: 675-686.

Gesemann,M, A Brancaccio, B Schumacher, M A Ruegg, 1998, Agrin is a high-affinity

binding protein of dystroglycan in non-muscle tissue: J.Biol.Chem., 273: 600-605.

Gesemann,M, A J Denzer, M A Ruegg, 1995b, Acetylcholine receptor-aggregating

activity of agrin isoforms and mapping of the active site: J.Cell Biol., 128: 625-636.

77

Gingras,J, M Ferns, 2001, Expression and localization of agrin during sympathetic

synapse formation in vitro: J.Neurobiol., 48: 228-242.

Grazioli,L, M P Federle, G Brancatelli, T Ichikawa, L Olivetti, A Blachar, 2001,

Hepatic adenomas: imaging and pathologic findings: Radiographics, 21: 877-892.

Groffen,AJ, C A Buskens, T H van Kuppevelt, J H Veerkamp, L A Monnens, L P van

den Heuvel, 1998a, Primary structure and high expression of human agrin in basement

membranes of adult lung and kidney: Eur.J.Biochem., 254: 123-128.

Groffen,AJ, M A Ruegg, H Dijkman, T J van de Velden, C A Buskens, B J van den, K J

Assmann, L A Monnens, J H Veerkamp, L P van den Heuvel, 1998b, Agrin is a major

heparan sulfate proteoglycan in the human glomerular basement membrane: Journal of

Histochemistry & Cytochemistry.46(1):19-27.

Halfter,W, S Dong, B Schurer, G J Cole, 1998, Collagen XVIII is a basement

membrane heparan sulfate proteoglycan: J.Biol.Chem., 273: 25404-25412.

Henry,SH, F X Bosch, J C Bowers, 2002, Aflatoxin, hepatitis and worldwide liver

cancer risks: Adv.Exp.Med.Biol., 504: 229-233.

Heremans,A, J J Cassiman, B H Van den, G David, 1988, Heparan sulfate proteoglycan

from the extracellular matrix of human lung fibroblasts. Isolation, purification, and core

protein characterization: J.Biol.Chem., 263: 4731-4739.

Hildebrand,A, M Romaris, L M Rasmussen, D Heinegard, D R Twardzik, W A Border,

E Ruoslahti, 1994, Interaction of the small interstitial proteoglycans biglycan, decorin

and fibromodulin with transforming growth factor beta: Biochem.J., 302 ( Pt 2): 527-

534.

78

Hussain,SM, T Terkivatan, P E Zondervan, E Lanjouw, S de Rave, J N Ijzermans, R A

de Man, 2004, Focal nodular hyperplasia: findings at state-of-the-art MR imaging, US,

CT, and pathologic analysis: Radiographics, 24: 3-17.

Iozzo,RV, 2005, Basement membrane proteoglycans: from cellar to ceiling:

Nat.Rev.Mol.Cell Biol., 6: 646-656.

Iozzo,RV, I R Cohen, S Grassel, A D Murdoch, 1994, The biology of perlecan: the

multifaceted heparan sulphate proteoglycan of basement membranes and pericellular

matrices: Biochem.J., 302 ( Pt 3): 625-639.

Iozzo,RV, I Kovalszky, N Hacobian, P K Schick, J S Ellingson, G R Dodge, 1990, Fatty

acylation of heparan sulfate proteoglycan from human colon carcinoma cells:

J.Biol.Chem., 265: 19980-19989.

Ip,FC, D G Glass, D R Gies, J Cheung, K O Lai, A K Fu, G D Yancopoulos, N Y Ip,

2000, Cloning and characterization of muscle-specific kinase in chicken: Mol.Cell

Neurosci., 16: 661-673.

Jennings,CG, S J Burden, 1993, Development of the neuromuscular synapse:

Curr.Opin.Neurobiol., 3: 75-81.

Jiang,X, J R Couchman, 2003, Perlecan and tumor angiogenesis:

J.Histochem.Cytochem., 51: 1393-1410.

Kainulainen,V, L Nelimarkka, H Jarvelainen, M Laato, M Jalkanen, K Elenius, 1996,

Suppression of syndecan-1 expression in endothelial cells by tumor necrosis factor-

alpha: J.Biol.Chem., 271: 18759-18766.

Kammerer,RA, T Schulthess, R Landwehr, B Schumacher, A Lustig, P D Yurchenco,

M A Ruegg, J Engel, A J Denzer, 1999, Interaction of agrin with laminin requires a

79

coiled-coil conformation of the agrin-binding site within the laminin gamma1 chain:

EMBO J., 18: 6762-6770.

Kato,M, H Wang, V Kainulainen, M L Fitzgerald, S Ledbetter, D M Ornitz, M

Bernfield, 1998, Physiological degradation converts the soluble syndecan-1 ectodomain

from an inhibitor to a potent activator of FGF-2: Nat.Med., 4: 691-697.

Kemeny,E, H M Fillit, S Damle, R Mahabir, N A Kefalides, J D Gregory, T

Antonovych, S Sabnis, J B Zabriskie, 1988, Monoclonal antibodies to heparan sulfate

proteoglycan: development and application to the study of normal tissue and pathologic

human kidney biopsies: Connect.Tissue Res, 18: 9-25.

Kim,MJ, I H Liu, Y Song, J A Lee, W Halfter, R J Balice-Gordon, E Linney, G J Cole,

2007, Agrin is required for posterior development and motor axon outgrowth and

branching in embryonic zebrafish: Glycobiology, 17: 231-247.

Kimata,K, Y Oike, K Tani, T Shinomura, M Yamagata, M Uritani, S Suzuki, 1986, A

large chondroitin sulfate proteoglycan (PG-M) synthesized before chondrogenesis in the

limb bud of chick embryo: J.Biol.Chem., 261: 13517-13525.

Kimura,S, J Cheng, H Ida, N Hao, Y Fujimori, T Saku, 2000, Perlecan (heparan sulfate

proteoglycan) gene expression reflected in the characteristic histological architecture of

salivary adenoid cystic carcinoma: Virchows Arch., 437: 122-128.

Kiss,A, G Lotz, N P Kaposi, Z Schaff, 2002, [Hepatitis viruses and

hepatocarcinogenesis]: Orv.Hetil., 143: 83-86.

Kiss,A, A Szepesi, G Lotz, P Nagy, Z Schaff, 1998, Expression of transforming growth

factor-alpha in hepatoblastoma: Cancer, 83: 690-697.

Knox,SM, J M Whitelock, 2006, Perlecan: how does one molecule do so many things?:

Cell Mol.Life Sci., 63: 2435-2445.

80

Konomi,H, J M Seyer, Y Ninomiya, B R Olsen, 1986, Peptide-specific antibodies

identify the alpha 2 chain as the proteoglycan subunit of type IX collagen: J.Biol.Chem.,

261: 6742-6746.

Kopper L, Schaff Zs. Patológia tankönyv 2. Medicina, Budapest, 2004: 872-874

Kovalszky,I, A Jeney, K Lapis, 1993, [Proteoglycans (their structure, function and role

in liver diseases)]: Orv.Hetil., 134: 2019-2026.

Kovalszky,I, I, J O Nagy, M Gallai, A Sebestyen, Z Schaff, S Paku, A Jeney, R V

Iozzo, 1997, Altered Proteoglycan Gene Expression in Human Biliary Cirrhosis:

Pathol.Oncol.Res., 3: 51-58.

Kovalszky,I, P Nagy, B Szende, K Lapis, F Szalay, A Jeney, Z Schaff, 1998,

Experimental and human liver fibrogenesis: Scand.J.Gastroenterol.Suppl, 228: 51-55.

Kovalszky,I, G Pogany, G Molnar, A Jeney, K Lapis, S Karacsonyi, A Szecseny, R V

Iozzo, 1990, Altered glycosaminoglycan composition in reactive and neoplastic human

liver: Biochem.Biophys.Res.Commun., 167: 883-890.

Krusius,T, E Ruoslahti, 1986, Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan

core protein deduced from cloned cDNA: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 83: 7683-7687.

Lee,JS, S S Thorgeirsson, 2002, Functional and genomic implications of global gene

expression profiles in cell lines from human hepatocellular cancer: Hepatology, 35:

1134-1143.

Lin,W, R W Burgess, B Dominguez, S L Pfaff, J R Sanes, K F Lee, 2001, Distinct roles

of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse:

Nature, 410: 1057-1064.

Liotta,LA, 1982, Tumor extracellular matrix: Lab Invest, 47: 112-113.

81

Lyon,M, J A Deakin, K Mizuno, T Nakamura, J T Gallagher, 1994, Interaction of

hepatocyte growth factor with heparan sulfate. Elucidation of the major heparan sulfate

structural determinants: J.Biol.Chem., 269: 11216-11223.

Lyon,M, J T Gallagher, 1991, Purification and partial characterization of the major cell-

associated heparan sulphate proteoglycan of rat liver: Biochem.J., 273(Pt 2): 415-422.

Madri,JA, M Marx, 1992, Matrix composition, organization and soluble factors:

modulators of microvascular cell differentiation in vitro: Kidney Int., 41: 560-565.

Magill-Solc,C, U J McMahan, 1988, Motor neurons contain agrin-like molecules: J.Cell

Biol., 107: 1825-1833.

Marchetti,D, D Menter, L Jin, M Nakajima, G L Nicolson, 1993, Nerve growth factor

effects on human and mouse melanoma cell invasion and heparanase production:

Int.J.Cancer, 55: 692-699.

Marneros,AG, B R Olsen, 2005, Physiological role of collagen XVIII and endostatin:

FASEB J., 19: 716-728.

Martin,PT, J R Sanes, 1997, Integrins mediate adhesion to agrin and modulate agrin

signaling: Development, 124: 3909-3917.

McMahan,UJ, 1990, The agrin hypothesis: Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol., 55:

407-418.

Merz,H, R Malisius, S Mannweiler, R Zhou, W Hartmann, K Orscheschek, P

Moubayed, A C Feller, 1995, ImmunoMax. A maximized immunohistochemical

method for the retrieval and enhancement of hidden antigens: Lab Invest, 73: 149-156.

Metayer,S, F Dacheux, J L Dacheux, J L Gatti, 2002, Comparison, characterization, and

identification of proteases and protease inhibitors in epididymal fluids of domestic

82

mammals. Matrix metalloproteinases are major fluid gelatinases: Biol.Reprod., 66:

1219-1229.

Mongiat,M, J Otto, R Oldershaw, F Ferrer, J D Sato, R V Iozzo, 2001, Fibroblast

growth factor-binding protein is a novel partner for perlecan protein core: J.Biol.Chem.,

276: 10263-10271.

Mongiat,M, S M Sweeney, J D San Antonio, J Fu, R V Iozzo, 2003, Endorepellin, a

novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan: J.Biol.Chem.,

278: 4238-4249.

Moon,JJ, M Matsumoto, S Patel, L Lee, J L Guan, S Li, 2005, Role of cell surface

heparan sulfate proteoglycans in endothelial cell migration and mechanotransduction:

J.Cell Physiol, 203: 166-176.

Morita,H, A Yoshimura, K Inui, T Ideura, H Watanabe, L Wang, R Soininen, K

Tryggvason, 2005, Heparan sulfate of perlecan is involved in glomerular filtration:

J.Am.Soc.Nephrol., 16: 1703-1710.

Mueller,MM, N E Fusenig, 2002, Tumor-stroma interactions directing phenotype and

progression of epithelial skin tumor cells: Differentiation, 70: 486-497.

Murata,K, Y Ochiai, K Akashio, 1985, Polydispersity of acidic glycosaminoglycan

components in human liver and the changes at different stages in liver cirrhosis:

Gastroenterology, 89: 1248-1257.

Nagy,P, V Laszlo, Z Schaff, 2006, [Hepatocarcinogenesis in human liver]:

Magy.Onkol., 50: 107-113.

Nakeeb,A, H A Pitt, T A Sohn, J Coleman, R A Abrams, S Piantadosi, R H Hruban, K

D Lillemoe, C J Yeo, J L Cameron, 1996, Cholangiocarcinoma - A spectrum of

intrahepatic, perihilar, and distal tumors: Annals of Surgery, 224: 463-473.

83

Naor,D, R V Sionov, D Ish-Shalom, 1997, CD44: structure, function, and association

with the malignant process: Adv.Cancer Res., 71: 241-319.

Nishiyama,A, K J Dahlin, W B Stallcup, 1991, The expression of NG2 proteoglycan in

the developing rat limb: Development, 111: 933-944.

Oldberg,A, L Kjellen, M Hook, 1979, Cell-surface heparan sulfate. Isolation and

characterization of a proteoglycan from rat liver membranes: J.Biol.Chem., 254: 8505-

8510.

Otto,S, M Kasler, 2005, [Trends in cancer mortality and morbidity in Hungarian and

international statistics. Characteristics and potential outcome of public health screening

programs]: Magy.Onkol., 49: 99-7.

Oyunsuren,T, R Sanduijav, D Davaadorj, D Nansalmaa, 2006, Hepatocellular

carcinoma and its early detection by AFP testing in Mongolia: Asian Pac.J.Cancer

Prev., 7: 460-462.

Qiao,D, K Meyer, C Mundhenke, S A Drew, A Friedl, 2003, Heparan sulfate

proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 signaling in brain endothelial

cells. Specific role for glypican-1 in glioma angiogenesis: J.Biol.Chem., 278: 16045-

16053.

Rabenstein,DL, 2002, Heparin and heparan sulfate: structure and function:

Nat.Prod.Rep., 19: 312-331.

Rascher,G, A Fischmann, S Kroger, F Duffner, E H Grote, H Wolburg, 2002,

Extracellular matrix and the blood-brain barrier in glioblastoma multiforme: spatial

segregation of tenascin and agrin: Acta Neuropathol.(Berl), 104: 85-91.

Reed,CC, R V Iozzo, 2002, The role of decorin in collagen fibrillogenesis and skin

homeostasis: Glycoconj.J., 19: 249-255.

84

Reist,NE, C Magill, U J McMahan, 1987, Agrin-like molecules at synaptic sites in

normal, denervated, and damaged skeletal muscles: J.Cell Biol., 105: 2457-2469.

Ronnov-Jessen,L, O W Petersen, 1993, Induction of alpha-smooth muscle actin by

transforming growth factor-beta 1 in quiescent human breast gland fibroblasts.

Implications for myofibroblast generation in breast neoplasia: Lab Invest, 68: 696-707.

Ruegg,MA, J L Bixby, 1998, Agrin orchestrates synaptic differentiation at the

vertebrate neuromuscular junction: Trends Neurosci., 21: 22-27.

Ruegg,MA, K W Tsim, S E Horton, S Kroger, G Escher, E M Gensch, U J McMahan,

1992, The agrin gene codes for a family of basal lamina proteins that differ in function

and distribution: Neuron, 8: 691-699.

Ruoslahti,E, Y Yamaguchi. Proteoglycans as modulator of growth factor activities. 56,

867-869. 1991.

Rupp,F, T Ozcelik, M Linial, K Peterson, U Francke, R Scheller, 1992, Structure and

chromosomal localization of the mammalian agrin gene: J.Neurosci., 12: 3535-3544.

Rupp,F, D G Payan, C Magill-Solc, D M Cowan, R H Scheller, 1991, Structure and

expression of a rat agrin: Neuron, 6: 811-823.

Sabit,H, K Tsuneyama, T Shimonishi, K Harada, J Cheng, H Ida, T Saku, K Saito, Y

Nakanuma, 2001, Enhanced expression of basement-membrane-type heparan sulfate

proteoglycan in tumor fibro-myxoid stroma of intrahepatic cholangiocarcinoma:

Pathol.Int., 51: 248-256.

Sadler,JE, 1997, Thrombomodulin structure and function: Thromb.Haemost., 78: 392-

395.

85

Sahani,D, S R Prasad, K K Tannabe, P F Hahn, P R Mueller, S Saini, 2003, Thorotrast-

induced cholangiocarcinoma: case report: Abdom.Imaging, 28: 72-74.

Saksela,O, D Moscatelli, A Sommer, D B Rifkin, 1988, Endothelial cell-derived

heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic

degradation: J.Cell Biol., 107: 743-751.

Saunders,S, M Jalkanen, S O'Farrell, M Bernfield, 1989, Molecular cloning of

syndecan, an integral membrane proteoglycan: J.Cell Biol., 108: 1547-1556.

Schaff Z., Nagy P. Pathology techniques and grading systems in the diagnosis of HCC.

111-133. 1997. Churchill Livingstone New York, Liver Cancer.

Schaff,Z, I Sarosi, C C Hsia, A Kiss, E Tabor, 1995, p53 in malignant and benign liver

lesions: Eur.J.Cancer, 31A: 1847-1850.

Schaff,Z, E Szekely, B Jaray, A Kiss, 2004, [Pathology of liver tumors]: Orv.Hetil.,

145: 368-374.

Sebestyen,A, M Gallai, T Knittel, T Ambrust, G Ramadori, I Kovalszky, 2000,

Cytokine regulation of syndecan expression in cells of liver origin: Cytokine, 12: 1557-

1560.

Senoo,H, 2004, Structure and function of hepatic stellate cells: Med.Electron Microsc.,

37: 3-15.

Serpinskaya,AS, G Feng, J R Sanes, A M Craig, 1999, Synapse formation by

hippocampal neurons from agrin-deficient mice: Dev.Biol., 205: 65-78.

Shaib,Y, H B el Serag, 2004, The epidemiology of cholangiocarcinoma: Semin.Liver

Dis., 24: 115-125.

86

Sharma,B, M Handler, I Eichstetter, J M Whitelock, M A Nugent, R V Iozzo, 1998,

Antisense targeting of perlecan blocks tumor growth and angiogenesis in vivo:

J.Clin.Invest, 102: 1599-1608.

Silbert,JE, G Sugumaran, 2002, Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate:

IUBMB.Life, 54: 177-186.

Smela,ME, S S Currier, E A Bailey, J M Essigmann, 2001, The chemistry and biology

of aflatoxin B(1): from mutational spectrometry to carcinogenesis: Carcinogenesis, 22:

535-545.

Su,CH, Y M Shyr, W Y Lui, F K P'Eng, 1997, Hepatolithiasis associated with

cholangiocarcinoma: Br.J.Surg., 84: 969-973.

Sugahara,K, H Kitagawa, 2002, Heparin and heparan sulfate biosynthesis: IUBMB.Life,

54: 163-175.

Tatrai,P, J Dudas, E Batmunkh, M Mathe, A Zalatnai, Z Schaff, G Ramadori, I

Kovalszky, 2006, Agrin, a novel basement membrane component in human and rat

liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma: Lab Invest, 86: 1149-1160.

Taylor,KR, R L Gallo, 2006, Glycosaminoglycans and their proteoglycans: host-

associated molecular patterns for initiation and modulation of inflammation: FASEB J.,

20: 9-22.

Timar,J, C Diczhazi, A Ladanyi, E Raso, W Hornebeck, L Robert, K Lapis, 1995a,

Interaction of tumour cells with elastin and the metastatic phenotype: Ciba

Found.Symp., 192: 321-335.

Timar,J, A Jeney, I Kovalszky, I, L Kopper, 1995b, Role of Proteoglycans in Tumor

Progression: Pathol.Oncol.Res., 1: 85-93.

87

Timar,J, S Paku, J Tovari, B Dome, 2006, [Rationale of antiangiogenic therapy]:

Magy.Onkol., 50: 141-151.

Tompkins,RK, B M Aizen, K D Saunders, J J Roslyn, W P Longmire, Jr., 1991,

Carcinoma of the ductus choledochus: Am.J.Surg., 161: 235-238.

Trotter,JF, G T Everson, 2001, Benign focal lesions of the liver: Clin.Liver Dis., 5: 17-

42, v.

Tsen,G, W Halfter, S Kroger, G J Cole, 1995, Agrin is a heparan sulfate proteoglycan:

J.Biol.Chem., 270: 3392-3399.

Tsim,KW, M A Ruegg, G Escher, S Kroger, U J McMahan, 1992, cDNA that encodes

active agrin: Neuron, 8: 677-689.

Vauthey,JN, L H Blumgart, 1994, Recent advances in the management of

cholangiocarcinomas: Semin.Liver Dis., 14: 109-114.

Watanapa,P, W B Watanapa, 2002, Liver fluke-associated cholangiocarcinoma:

Br.J.Surg., 89: 962-970.

Woods,A, 2001, Syndecans: transmembrane modulators of adhesion and matrix

assembly: J.Clin.Invest, 107: 935-941.

Yamamoto,C, S Shimada, Y Fujiwara, J B Lee, T Hayashi, T Kaji, 2005, Proteoglycans

released from cultured bovine aortic endothelial cell layers by sodium spirulan are both

perlecan and biglycan: Biol.Pharm.Bull., 28: 32-36.

Yang,JF, G Cao, S Koirala, L V Reddy, C P Ko, 2001, Schwann cells express active

agrin and enhance aggregation of acetylcholine receptors on muscle fibers: J.Neurosci.,

21: 9572-9584.

88

12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke: Batmunkh E., Tátrai P., Szabó E., Lódi C., Holczbauer A., Páska C., Kupcsulik P.,

Kiss A., Schaff Z., Kovalszky I. (2007) Comparison of the expression of agrin, a

basement membrane heparan sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and

hepatocellular carcinoma. Human Pathol, 38: 1508-1515

(IF: 2,810)

Tátrai P., Dudás J., Batmunkh E., Máthé M., Zalatnai A., Schaff Z., Ramadori G.,

Kovalszky L. (2006) Agrin, a novel basement membrane component in human and rat

liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Lab Invest 86: 1149-1160,

(IF: 3.753)

Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények:

Szijártó A.*, Batmunkh E. *, Hahn O., Mihály Z., Kreiss A., Kiss A., Lotz G., Schaff

Z., Váli L., Blázovics A., Geró D., Szabó C., Kupcsulik P. (2007) Effect of PJ-34 Parp-

inhibitor on rat liver microcirculation and antioxidant status. J Surg Res. Sep;142(1):72-

80 ( * megosztott első szerzők)

(IF: 2.038)

Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Szíjártó A., Kupcsulik P., Kovalszky

I., Paku S., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. (2006) Claudin-4 differentiates biliary tract

cancers from hepatocellular carcinomas: Mod. Pathol 19: 460-469

(IF: 3,753)

Szabó E., Lódi C., Korpos E., Batmunkh E., Rottenberger Z., Deák F., Kiss I, Tőkés

AM., Lotz G., László V., Kiss A., Schaff Z., Nagy P. (2007) Expression of Matrilin-2 in

oval cells during rat liver regeneration. Matrix Biol, 26: 554-560

(IF: 3,679)

89

E. Szabó, É. Korpos, E. Batmunkh, G. Lotz, Á. Holczbauer, I. Kovalszky, F. Deák, I.

Kiss, Zs. Schaff, A. Kiss. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular

carcinoma. Pathol Oncol Res. Közlésre elfogadva (2007, augusztus)

(IF: 1,241)

Szijártó A., Hahn O., Batmunkh E., Stangl R., Kiss A., Lotz G., Schaff Z., Váli L.,

Blázovics A., Gerő D.,. Szabó C, Kupcsulik P., Harsányi L. (2007) Short-term alanyl-

glutamine dipeptide pretreatment in liver ischemia-reperfusion model: effects on

microcirculation and antioxidant status in rats. Clinical Nutrition 26, 640-648.

(IF: 2,474)

Megjelent, illetve elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen:

20.448

Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstactok:

Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P,

Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and

cholangiocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the

Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. Abstract: Journal of Hepatology

Supplement No.2 Volume 42, 2005

Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kovalszky I,

Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma.

47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005

Balatonaliga, Hungary. Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43,

2005

Egyéb kutatási témákból lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstactok:

Szabó E., Páska C., Deák F., Kiss I., Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Kiss A.,

Kovalszky I., Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis

90

and hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the

Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. J. of Hepatol 42. S2. 2005

Szabó E, Páska C, Lódi C, Batmunkh E, Holczbauer Á, Korpos É, Deák F, Kiss I, Kiss

A, Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.

47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005

Balatonaliga, Hungary. Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43,

2005

Lódi Cs., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kiss A., Kupcsulik P.,

Illyés Gy, Schaff Zs. High expression of claudin-4 in biliary carcinomas. 20th European

Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005 Virchows Arch 447: 404,

2005.

Lódi C, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Kovalszky I, Paku S, Kiss A, Illyés G,

Schaff Z. High expression of claudin-4 in human biliary cancers. 47th Annual Meeting

of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005 Balatonaliga, Hungary.

Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43, 2005

Egyéb kutatási témákból készült nem idézhető abstractok:

Batmunkh E, Tátrai P, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P,

Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in cholangiocarcinoma. Falk

Symposium October 10-11, 2006, Freiburg, Germany

Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P,

Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and

cholangiocellular carcinoma. Falk Symposium, October 3-4, 2005, Berlin, Germany

Lódi C, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Kiss A, Illyés G, Paku S, Schaff Z,

Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. Falk Symposium,

October 3-4, 2005, Berlin, Germany

91

Tátrai P., Batmunkh E., Dudás J., Egedi K., Ramadori G., Schaff Z., Kovalszky L,

Agrin in the diseased liver: a multifunctional proteoglycan recently found in the liver

may promote bile duct proliferation and tumour angiogenesis FEBS 2005 Congress

Szabó E, Páska C, Lódi C, Batmunkh E, Holczbauer Á, Korpos E, Deák F, Kiss I, Kiss

A, Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.

Falk Symposium, October 3-4, 2005, Berlin, Germany

Lódi C, Szíjártó A, Holczbauer Á, Szabó E, Batmunkh E, Kiss A, Illyés G, Schaff Z,

Kupcsulik P; High expression of claudin-4 in human cholangiocarcinomas. 6th

Congress of the European Hepato-Pancreato-Biliary Association May 25-28, 2005,

Heidelberg, Germany

Szabó E, Páska C, Deák F, Kiss I, Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Kiss A,

Kovalszky I, Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis

and hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the

Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. Abstract: Journal of Hepatology;

Supplement No.2 Volume 42, 2005

Holczbauer Á, Halász J, Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Benyó G, Galántai I, Kiss A,

Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 7th Ph.D. Conference at

Semmelweis University, April 14-15, 2005, Budapest, Hungary

Lódi C, Kiss A, Holczbauer Á, Batmunkh E, Paku S, Illyés G, Kupcsulik P, Schaff Z.

High expression of claudin 4 in human cholangiocellular carcinomas. Falk Symposium

October 16-17, 2004, Freiburg, Germany

Holczbauer Á, Lódi Cs, Batmunkh E, Kiss A, Kupcsulik P, Schaff Zs. Decreased

expression of prepro-nociceptin/OFQ and nociceptin/OFQ receptor in human

hepatocellular carcinoma. 63rd Hungarian Congress of Pathology September 23-25,

2004, Siófok-Balatonszéplak, Hungary

92

Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Holczbauer Á, Kiss A, Illyés G, Paku S, Schaff Z,

Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. 41th Annual Meeting

of the European Association for the Study of the Liver April 26-27, 2006, Vienna,

Austria

Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Holczbauer Á, Paku S, Kupcsulik P, Illyés G, Kiss A,

Schaff Z. Different claudin-4 expression on biliary and hepatocellular carcinomas. 41th

Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 26-27,

2006, Vienna, Austria

93

13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik munkámhoz útmutatásaikkal és

segítségükkel hozzájárultak.

Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Kiss Andrásnak, aki mindig nagy

türelemmel bíztatott a tudományos munkában való elmélyülésre, és aki évek óta

figyelemmel irányítja kísérletes munkámat.

Külön köszönettel tartozom Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, aki lehetővé

tette, hogy munkámat az II. sz. Patológiai Intézetben végezhessem és mindig támogatott

a munkámban.

Hálás vagyok Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár segítségéért és tanácsaiért,

mivel jelen munkám nem jöhetett volna létre korábbi ilyen tárgyú kutatásai nélkül.

Külön köszönet illeti Tátrai Pétert, akinek munkája és segítsége nélkül ez a

munka nem jött volna létre.

Külön köszönöm Szabó Erzsébetnek, PhD társamnak, aki mindig segítségemre

volt. Köszönöm a munkatársaimnak, Dr. Holczbauer Ágnesnek, Dr. Lódi Csabának,

Németh Zsuzsának, Dr. Szász Attila Marcellnak, Dr. Tőkés Anna-Máriának és Dr Páska

Csillának munkámhoz nyújtott segítségüket.

Köszönetet szeretnék mondani Szik Ágnesnek és Pekár Zoltánnénak ez idő alatt

végzett pontos, lelkes és lelkiismeretes munkájukért.

Továbbá köszönettel tartozom az II. sz. Patológiai Intézet minden tagjának, akik

munkám elvégzéséhez segítő, baráti légkört teremtettek.

Köszönetet mondok a Mongol és Magyar Oktatási Minisztériumnak, a Mongol

Nagykövetségnek, akik ösztöndíjat bocsátottak rendelkezésemre.

Végül, de nem utolsó sorban hálás vagyok szüleimnek és páromnak, akik

lehetővé tették számomra azt, hogy eljuthassak idáig, mindig mindenben mellettem

álltak és biztosították a hátteret a terveim megvalósításához.