+

Doç. Dr. Serdar Ceylaner

İntergen Genetik Merkezi

Argekent Bilimsel Araştırma Merkezi

+ Gündem

Eski yöntemlerde yeni gelişmeler (QF-PCR/FISH)

Yeni yöntemlerin eski yöntemlere katkısı (Array-CGH ve

yeni jenerasyon dizi analizi)

Maternal serum DNA analizi

Maternal serum RNA analizi

Yakın gelecek

+ Down sendromu- Çözülemeyen

derdimiz

1/800 sıklıkta

USG ile bulgu vermeme ihtimali var

İkili ve üçlü tarama %15-40 vakayı görmüyor.

USG-İkili-üçlü taramayı beraber bile yapsak % 10 kadar

vakayı kaçırırız.

+ Down sendromu- Çözülemeyen

derdimiz

Onkoloğun hastası ölürse herkes ağlar- doktor elinden geleni

yapmış olur-herkes teşekkür eder. Kanser ölümcül bir

durumdur.

Gebelik bir hastalık olmadığından ve herkesin bir sevinç

yaşamayı beklediği bir durum olduğundan annenin yada

bebeğin ölümü yada her ikisinden birinin kalıcı hastalığı

meydana geldiğinde kıyamet kopar.

+ Amniyosentez ve koryon villus

örneklemesi

Kitaplara göre 1/100-1/400 gebelik kaynı riskine yol açar.

Perinatologların yaptığı işlemlerde ise gebelik kaybı

neredeyse hiç görülmemektedir.

İnvaziv işlemden kaçınma

Maliyet?

+ Eski yöntemlerde yeni gelişmeler

Hızlı tanı yöntemleri sayesinde gebelik tahliyesi için 3 hafta bekleme ihtiyacı azalmıştır.

QF-PCR ve FISH ‘teki gelişmeler kromozom analizi kadar güvenilir sonuç elde edilmesini sağlamaktadır.

Henüz bu yöntemler sadece 5 kromozom ile sınırlıdır ama bu sık görülen hastalıklarda etkinlik yüksek.

En az iki yöntemle tanıyı koyuyorsanız tahliyeyi yapabilirsiniz.

Kromozom analizini Down sendromunun tipini ve dolayısıyla tekrarlama riskini tespit etmek için sürdürün.

+ Eski yöntemlere yeni yöntemlerin

katkısı- Array CGH

Ense kalınlığı artışı ve konjenital anomalilerde kromozomu

normal fetüslerin % 5-15’inde gözle görülemeyen kromozom

bozuklukları vardır.

+ Array CGH

+ Açıklanamayan kromozom

değişiklikleri – Array CGH

+

+

Anne baba kromozomu normal

Fazlalığın nedeni?

+ Yakında

Tüm amniyon veya koryon materyallerinden kromozom

analizi yanında array CGH yapılacak.

PEKİ NE ZAMAN?

Fiyatı 100-200 USD’ye düştüğü zaman

Şu an 2000-2500 TL

+ Eski yöntemlere yeni yöntemlerin

katkısı- Yeni jenerasyon dizi analizi

Yeni jenerasyon dizi analizi yüzlerce genin aynı anada

analizini sağlar.

İnsandaki 21000 genin aynı anda analizini sağlar.

Bir insanın tüm DNA’sının analizini sağlar.

+ Çoklu gen çalışmaları

Uzun QT Paneli (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, CACNA1C, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1 genleri) (12 gen) (Tüm Gen - Dizi Analizi-MISEQ)

Zellweger sendromu, Peroksizom biosentez bozukluğu Paneli (13 gen) (PEX1, PEX2, PEX3, PEX5, PEX6, PEX10, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, HSD17B4 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi)

İlerleyici ailesel intrahepatik kolestaz 1, 2, 3 Paneli (PFIC1, PFIC2, PFIC3) (ATP8B1, ABCB11, ABCB4 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi-MISEQ)

Hipertrofik kardiyomiyopati Paneli (6 gen) (MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL3 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi)

+ İnfantil polikistik böbrek hastalığı

21 haftalık gebe

Gebelikte USG’de infantil tip polikistik böbrek hastalığı

izleniyor.

Aile erken prenatal tanı ve PGT istediği için mutasyon analizi

planlanıyor.

PKHD1 geni 67 ekzon- Fiyat 2350 Euro

Ekzom sekanslama 2000 Euro

Ekzom kararı verildi.

+ Glutarik asidüri tip 2 Homozigot ETFDH: c.1198_1201del (p.His401GlnfsX3)

+ Literatürdeki benzer vaka

ETFDH, 1-BP DEL, 36A

In an infant with the neonatal-onset form of glutaric acidemia IIC with

congenital anomalies (231680), Olsen et al. (2003) found

homozygosity for a 1-bp deletion of 36A in the ETFDH gene, causing a

frameshift beginning with ala12, introducing a stop codon at amino

acid 19. The parents were consanguineous. The child died 1 hour after

birth and showed Potter face, enlarged polycystic kidneys,

symmetrical warty dysplasia of the cerebral cortex, bile duct

hypoplasia, cholestasis, fatty degeneration of the liver, siderosis, lung

hypoplasia, and steatosis of the myocardium. A second child in the

family presented at birth with similar clinical and morphologic

findings. The patient had been previously reported by Lehnert et al.

(1982) and Bohm et al. (1982).

+

İNVAZİV OLMAYAN

PRENATAL TANI

•Maternal kanda fetal hücreler

•Maternal serum DNA

•Maternal seum RNA

+ Anne kanında fetal hücreler

Eski gebeliklerden kalan hücreler

Zenginleştirme ihtiyacı

Zenginleştirme sorunları

+ İŞTE O MUTLU AN

Yeni nesil sekanslama

+ Yeni nesil dizi analizi cihazı

+

+ Sözlük

Maternal Serum Fetal DNA

Cell free DNA – cfDNA

Maternal Plazma Serbest Fetal DNA

Serum + fibrinojen= Plazma

+ Sözlük

Maternal Serum Fetal DNA

NIFTY - Noninvasive Fetal Trisomy Test

NIFT - Noninvasive Fetal Trisomy Test

+ Sözlük DNA’daki parmak izi-DNA fingerprinting

Her insanda diğerlerinden farklı DNA bölgeleri vardır.

SNP: Single nucleotide polymorphism

AAATAGCTC

AAACAGCTC

STR: Short Tandem Repeat

ATACATACATACATACATAC

+ Sözlük

Mutasyon

+ Sözlük

Polimorfizm

+ Sözlük Sekanslama-Dizileme?

AATGAACGATAGCC

Sanger dizileme

Yeni nesil dizileme

+ Yeni nesil sekanslama-dizileme

DNA’daki bir bölgeyi yüzlerce kere okuyor.

Bu sayede düşük orandaki değişiklikleri tespit edebiliyor.

Güvenilir bir oranlama yapabiliyor.

Kapasitesi çok yüksek. Bir insanın bütün DNA’sını

okuyabiliyor. Hatta bir cihaz bir çalışmada 4 insanın bütün

DNA’sını okuyabiliyor.

+ Maternal serumdaki fetal DNA ve

özellikleri

İnsan serumundaki DNA’nın önemli bir kısmı ölen ve

apopitoza uğrayan hücrelerden serbest kalan DNA’dır.

Fetal DNA’nın önemli bir kısmı plasenta kaynaklıdır.

Küçük fragmanlar halindedir.

Serumdaki DNA’nın % 5-10’u fetal kaynaklıdır.

Yarılanma ömrü 16 dk’dır.

+ Masively paralel sequencing

+ MANTIK Massively Paralel Sequencing

Deep Sequencing

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

G

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

+ Massively Paralel Sequencing

Deep Sequencing

+ MANTIK (oransal olarak 1,5 kat)

21. Kromozom 1. bölge 6299 tane

21. Kromozom 2. bölge 6065 tane

…..

21. Kromozom 574. bölge 5987 tane

7. Kromozom 1. bölge 3997 tane

7. Kromozom 2. bölge 4115 tane

….

7. Kromozom 421. bölge 4005 tane

+ MANTIK – İkiz Gebelik

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

T

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

G

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

+ Yanlış pozitif

Plasentaya sınırlı mozaisim

Yanlış pozitif sıklığı % 3

YANLIŞ NEGATİF YOK’A YAKIN

Pozitif çıkan her hastada

invaziv girişim ile teyid

gerekir.

+ NIFTY tarama testi midir?

NIFTY bir tarama testidir. Ana amaç tüm gebe toplumu

taramaktır.

NIFTY sadece bir tarama testi değildir. Tanı koyan bir tarama

testidir.

Yanlış pozitif ve yanlış negatif olasılığı bir testi tanı testi

tasnifinden çıkarmaz.

Plasenta proteinleri için yapılan indirekt testler “sadece”

taramadır. Bu doğrudan bir DNA testidir.

+ Bugün yapılan

Yarın olacak olan

Bugün parası olan- gazeteden bu konuyu okuyan hanımlar

istiyor

Amaç ikili üçlü tarama yerine bunu uygulamaya koymak

Ne zaman?

Test başına maliyet 50-100 TL’ye düştüğü zaman

3-5 yıl

+ Testi kimler nerede yapıyor?

Life Codex (Almanya)

Panorama

BGI (Çin)

ABD’de bir kaç merkez. Türkiye’den gönderen yok.

Türkiye’de henüz yapan yok

Cihazlar

Hiseq 2000

Miseq

Sequenom

+ Kaça mal oluyor?

850-1250 Euro

Rapor süresi 3 hafta

+ Materyal

Özel tüplere alınmış 10-20 cc kan

Transport 1-4 gün içinde- oda ısısında

Sonuç verme yüzdesi % 98-99

Yeniden materyal gerekebilir.

10. haftadan sonra alınabilir.

Teknik olarak 6. haftadan itibaren test yapılabilir.

+ Endikasyon

Tüm isteyen aileler

Down sendromu riski olup invaziv işlem istemeyenler

Down sendromu olup olmadığını bilmek isteyen ama tahliye

istemeyenler

Trizomi 13- Trizomi 18 riski olanlar?

+ Dezavantajlar

13-18-21 nolu kromozomların sayısal bozuklukları dışındaki

diğer kromozom hastalıklarını göstermez.

Süre hala amniyosentez – koryon villus kadar uzun

Sonuç anormal gelirse girişimsel işlem gerekli

+ Strateji

Uygun endikasyonlarda ve isteyen herkese NIFT YAPMAK

NIFT sonucu anormal geldiğinde QF-PCR ya da FISH ile 1-2

günde tanının teyidini yapmak ve tahliye

Ultrason anomalilerinde

Translokasyon gibi yapısal anomali taşıyıcısı ailelerde

Tek gen hastalıklarında İNVAZİV İŞLEM YAPMAK

İnvaziv ile alınan materyalden kültür yapmayı sürdürüp

mozaik ve translokasyonlu tipleri ayırt edip tekrarlama riski

konusundaki danışmanlığı ondan sonra vermek

+ Strateji

NIFTY öncesi NT bakılmalıdır. NT yüksekse invaziv

önerilmelidir.

İleride taramalarda da NIFTY + NT + ikinci trimester USG

kombinasyonu en olası ideal kombinasyon olacaktır.

+ Strateji

Anomalilerin hepsinde invaziv işlem ile örnek almak

Tahliye bile etsek etiyolojiyi araştırmak

Etiyoloji için genetik konsültasyon, fetal muayene, fetal

örneklerden kromozom ve DNA eldesi

PRENATAL TANI KOYDUĞUMUZ HASTALARIN

ETİYOLOJİSİNİN, SONRAKİ GEBELİK İÇİN GEREKLİ

BİLGİLERİNİ, TEKRARMA RİSKİNİ, TEKRARLAMA HALİNDE

YAPILACAKLARI ORTAYA KOYMUYORSAK İŞİMİZİ YAPRIM

YAPTIK DEMEKTİR.

+ Maternal Serum DNA toplumsal

tarama ihtiyacını karşılıyor mu?

Sensitivite ve spesifite yüksek olmalı

Uygulaması kolay olmalı

İlk trimesterda uygulanabilir olmalı

Ucuz olmalı

+ MATERNAL SERUM RNA

DNA ---- RNA ---- PROTEİN

RNA çok kolay yıkılan bir moleküldür.

İlginç olarak fetal RNA çok stabildir.

Bu zaten fetal RNA’nın küçük fragmanlar halinde olmasından

ve RNAz enziminin etkisinden kaçabilmesinden

kaynaklanmaktadır

+ MATERNAL SERUM RNA

RNA DNA gibi diğer bir biyomarkerdır

Sorun her dokuda ve çeşitli durumlarda farklı genlerin

RNA’larının farklı miktarda üretilmesidir.

Lo tarafından geliştirilen alelik ayrım yöntemi ile PLAC4

geninde yapılan çalışmalarda Down sendromu tanısı başarı

ile konulabilmiştir.

+ Alelik ayrım

1:1

A

A

T

T

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

T

G

C

A

A

A

T

A

G

C

A

A

A

T

T

G

C

A

2:1

+ Alelik ayrım

Sensitivite %90

Spesivite %96,5

Tek marker ile elde edilen bu başarı çoklu markerlara

taşınmaya ve çok ucuz bir tarama yöntemi daha

geliştirilmeye çalışılmaktadır.

+

İNTERGEN SERDAR CEYLANER

DÖRT BOYUTLU USG

+ Holoprozensefali

Kromozom analizi (%25-50 tanı koydurucu)

Trizomi 13- Trizomi 18- Triploidi

del13q veya dup13q, del(18p), del(7)(q36), dup(3)(p24-pter),

del(2)(p21), del(21)(q22.3)

+ Holoprozensefali

Kromozom analizi normal ise

Array CGH (CNV- Copy Number Variation)(Kopya sayısı

değişikliği) (Özetle delesyon- duplikasyon) (%10-20) (2000-

2500 TL)

+ Sendromik tek gen hastalıkları – Ekzom

sekanslama (% 18-25) (2000-4000 Euro)

Otosomal Dominant

Pallister-Hall syndrome

Rubinstein-Taybi syndrome

Kallmann syndrome

Martin syndrome (with clubfoot, spinal anomalies)

Steinfeld syndrome (with congenital heart disease, absent gallbladder, renal dysplasia, radial defects) (OMIM

184705)

Ectrodactyly and ocular hypertelorism

Otosomal Resesif

"Pseudotrisomy 13 syndrome," in which affected individuals have a normal karyotype and polydactyly. Other

commonly seen features of trisomy 13, including scalp defects, overlapping fingers, and nail hypoplasia, are

not generally observed [Cordero et al 2008].

Smith-Lemli-Opitz syndrome [Kelley et al 1996, Weaver et al 2010]

Meckel syndrome

Genoa syndrome (with craniosynostosis) (OMIM 601370)

Lambotte syndrome (with microcephaly, prenatal growth retardation, ocular hypertelorism) (OMIM 245552)

Hydrolethalus syndrome (with hydrocephalus, polydactyly, and other anomalies) (OMIM 236680)

Facial clefts and brachial amelia (OMIM 601357)

Otosomal dominant vs multifaktoriyel

Microtia-anotia (OMIM 600674) and other anomalies

HPE-agnathia spectrum disorders

Holoprozensefali

+ Non- sendromik tek gen hastalıkları – Ekzom

sekanslama (% 5-10) (2000-4000 Euro)

SHH 7q36 30%-40% <5% 600725 142945

ZIC2 13q32 5% 2% 603073 609637

SIX3 2p21 1.3% Rare 603714 157170

TGIF1 18p11.3 1.3% Rare 602630 142946

GLI2 2q14 ? ? 610829 165230

PTCH1 9q22.3 ? ? 601309 610828

DISP1 1q42 Rare Rare 607502

FGF8 10q24 Rare Rare 600483

FOXH1 8q24.3 Rare Rare 603621

NODAL 10q22.1 Rare Rare 601265

TDGF1 (CRIPTO) 3p23-p21 Rare Rare 187395

GAS1 9q21.33 are Rare 139185

DLL1 6q27 Rare Rare 606582

CDON 11q24.2 Rare Rare 608707

Holoprozensefali

+ Holoprozensefali

Çevresel etkenler

Diabet

Alkol

Retinoik asit

Hiperkolesterolemi?

Kolesterol düşürücü ajanlar (Statinler)

+ Diğer nimetler

Maternal kanda fetal DNA artışı (preeklempsi-eklempsi)

Rh grubu tayini (Kan uyuşmazlığı)

HPA1 tayini (Trombosit grup uyumsuzlukları)

Fetal cinsiyet tayini (Cinsiyet seçen hastalıklar- 21

hidroksilaz)

Babadan kalıtılan mutasyonlar

+ Yeni jenerasyon dizi analizinin

nimetleri

Muayene ile tanı konulamayan hastalarda tanı

Akraba evliliklerinde her iki eşin birden taşıdığı

mutasyonların tespiti

Çok genli yada büyük genleri olan hastalıkların araştırılması

Yanlış tanı oranında azalma

+ Çok yakında serbest fetal DNA’dan

Tüm kromozomların tüm bölgeleri analize edilebilecek

21.000 genin tamamı analiz edilebilecek

Anomaliye ve tek gen hastalıklarına bağlı sorunlar çok

azalacak

10 yıl içinde hasta bu işleri evde

yapabilecek

+ Oxford Nanopore Minion

+ Çok yakında serbest fetal DNA

sayesinde GENETİKÇİ PERİNATOLOG

PERİNATOLOG USTA

Genetikçi Lazım Olursa Dr. Serdar Ceylaner serdarceylaner@intergen.com.tr

05332145337