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Simpósio de Sanidade Avícola (AVISULAT/UFSM)IV Congresso Sul Brasileiro de Avicultura, Suinocultura e Laticínios
Thales Quedi Furian
5 de Novembro - 2014
Atualidades em Cólera Aviária
• Uma das patologias aviárias mais antigas;
• Diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória;
Casos frequentes entre pequenas criações independentes
Cólera Aviária
Grande concentração de unidades de produção
Alta densidade populacional aviários
+
Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....
(Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009)
Cólera Aviária
Grande concentração de unidades de produção
Alta densidade populacional aviários
(Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009)
Baixos níveis de biosseguridade
Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....
Cólera Aviária
Doenças respiratórias
Grande concentração de unidades de produção
Alta densidade populacional aviários
Baixos níveis de biosseguridade
(Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009)
Cólera Aviária
Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....
Doenças respiratórias
Diferentes hospedeiros e cronicamente
infectados
Grande concentração de unidades de produção
Alta densidade populacional aviários
(Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009)
Baixos níveis de biosseguridade
Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....
Cólera Aviária
Denominação do gênero emhomenagem a Louis Pasteur
Família Pasteurellaceae
• 10 gêneros (Pasteurella, Actinobacillus, Haemophilus, Avibacterium);(MUHAIRWWA et al., 2001; SNIPES et al., 2002; LEOTA et al., 2006, NASCIMENTO et al., 2009)
(HARPER et al., 2006)
- constantes reclassificações taxonômicas;
“A bactéria Pasteurella multocida é um patógeno enigmático” (WILKIE et al., 2012)
número de síndromes relacionadas e de hospedeiros acometidos;
agente primário (rinite atrófica, septicemia hemorrágica, cólera aviária)
• Bacilo Gram negativo;
• Imóvel, não formador de esporos;
• Coloração bipolar típica;
• Anaeróbio facultativo;
Figura 1. Micrografia eletrônica – Pasteurella spp
Figura 2. Coloração esfregaço sanguineo – P. multocida
(CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; GLISSON, 2008 )
Pasteurella multocida
• anorexia, cianose, estertores, descargas nasais, diarréia, morte súbita;• petéquias, hemorragias, ausência lesões;
Cólera Aviária
• lesões edematosas/inflamatórias associadas com o local de infecção;• lesões no sistema reprodutivo;
Forma aguda Forma crônica
Fot
os: C
OR
NE
LL
UN
IVE
RSI
TY
, C
DPA
/UF
RG
S)
Aves silvestresDescrita em mais de 100 espécies
Epidemiologia
Aves entre 16-40 semanasmais susceptíveis
Lotes clinicamente recuperadosReservatório do agente
Aves aquáticas
Mamíferos
(PETERSEN et al., 2001) (SAMUEL et al., 2007)
(MUHAURWA et al., 2001)(WILKIE et al., 2012)
Como realizar o diagnóstico laboratorial atualmente?
Isolamento convencional
(A laboratory manual for the isolation, identification and characterization of avian pathogens - GLISSON et al., 2008)
BHI
Ágar Sangue5% sangue ovino desf.
Ágar MacConkey
37o C 24 horas
37o C 24 horas
Testes bioquímicos
Teste Catalase
Teste Oxidase
Colôniascompatíveis
37o C 24 horas
BHI
anaerobiose
aerobiose
Coloração Gram/Azul de metileno
FígadoPulmão
Sangue cardíacoMedula óssea
• Meios de isolamento: ágar sangue, TSA, DSA
- 5% soro sanguíneo;
• Colônias geralmente acinzentadas e lisas;
• Inoculação em camundongos;
- morte em 24 a 48 horas;
(Fonte: CDPA/UFRGS, 2008)
Figura 3. Colônias de Pasteurella multocida isoladas de diferentes hospedeiros
Aves - UFRGS Bovinos - UFRGS
Suínos - UFRGS ATCC 29545 (CHRISTENSEN et al., 2007)
Diagnóstico
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA Preservação
Amostras liofilizadas
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA Preservação
Congeladas a -80oC
sangue total ovino
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA Preservação
Congeladas a -80oC
soro bovino + 7,5% de glicose(LAPAGE & REDWAY, 1974)
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA Preservação
Congeladas a -80oC
BHI+ glicerol
• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos
- Isolamento regiões contaminadas;
- Período para obtenção de subcultivos puros;
- Questão bem estar animal;
Métodos moleculares de diagnóstico
Diagnóstico
Detecção do gene pls
Detecção do gene kmt
(KASTEN et al., 1997)
(LEE et al., 2000)
(LIU et al., 2004)
Detecção dos genes pm0762/pm231
Ensaio 5’ Taq nuclease
(CORNEY et al., 2007)
(TOWNSEND et al., 1998)
Variação método extração DNA Preservação
Congeladas a -20oC
soro bovino + 7,5% de glicose sangue total ovinoBHI+ glicerol
Patogenia
Habitante normal dasvias aéreas Cólera
Aviária
Agente
AmbienteHospedeiro
Manejo inadequado
Nutrição deficiente
Infestação parasitária
Infecções concomitantes
(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)
Trato respiratório superiorPrincipal sítio
Infecção do pulmãoe sacos aéreos
Disseminação paradiferentes tecidos
Corrente sanguínea
MorteChoque septicêmico
Patogenia e a virulência das cepasPatogenia e a virulência das
cepas
Sítio inicial de colonização
Vacinação ideal
Patogenicidade das cepas
?
?
Invasão da mucosas
Vacinas vivas e inativadas
Microrganismos oportunistas em
vertebrados
?
?
?(CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; DZIVA et al., 2008; HARPER et al., 2010)
Após mais de 125 anos dos trabalhos desenvolvidos por Pasteur...
3511 document results
Acesso em 10/10
1167 document results
Acesso em 10/10
406 document results
Acesso em 10/10
“A manipulação genética de P. multocida deve auxiliar na elucidação dos mecanismos patogênicos e da associação com diferentes hospedeiros.”
Ian Wilkie – 2012Department of MicrobiologyAustralian Research Council Centre of Excellence in Structural andFunctional Microbial Genomics, Monash University, Australia
• menor uso de ferramentas de manipulação/análise genética nos últimos 25 anos;
• primeiro sequenciamento completo do genoma em 2001;
Cepa Completo Hospedeiro/tecido
Genoma (Mbp) G+C
Pm70 sim ave 2.26 40.40
36950 sim bovino/pulmão 2.35 40.44
Anand1G não caprino 2.29 40.52
Anand1P não ave/fígado 2.02 40.22
P3480 não suíno/pulmão 2.08 40.15
X73 não ave 2.31 40.31
VP161 não ave 2.26 40.21
P903 não suíno 2.35 40.14
M1404 não Bovino 2.30 40.27Boyce et al., 2012
Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas
Isolados de CA
(May et al., 2001)
Todas as cepas são fortemente relacionadas;
Análise filogenética
Não há correlação entre o parentesco filogenético e o local de isolamento, o sorogrupo ou o hospedeiro de origem das amostras;
Como e por que classificar os isolados de P. multocida?
P. multocida subsp. multocida subsp. septicasubsp. gallicida
Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar
• Biotipificação: fator chave na identificação de P. multocida;(DZIVA et al., 2008 )
(MUTTERS et al., 1985 )
Teste P. multocida P. septica P. gallicida
Dulcitol - - +
Sorbitol + - +
• Enzima α-glicosidase e sequenciamento de genes housekeeping;(HUNT et al., 2001; KUHNERT, P & KORCZAK, B.M., 2006 )
Tabela 2. Características bioquímicas para diferenciação de subespécies de Pasteurella multocida
Fermentação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14
Xilose - + + - + - + + + + + + +
Maltose - - - - - - - - - + - - -
Ornitina + + + + + + + + - + + - -
Trehalose - + - + - - + - + + - - -
Sorbitol + + + + - - - + + - + + +
Dulcitol - - - - - - - + - - - - -
Lactose - - - - - - - - - - + - +
(FEGAN et al., 1995; BLACKALL et al., 1997)
Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar
• Classificação das amostras em 13 diferentes biovares
Tabela 3. Características bioquímicas dos biovares de Pasteurella multocida
Subespécie Percentual (%)
multocida 87,50
septica 10,71
gallicida 1,79
Total 100
(Dados não publicados, 2014)
Biovar Percentual (%)
1 8,93
2 7,14
3 35,71
4 1,79
5 3,57
7 1,79
8 1,79
9 12,50
10 3,57
13 23,21
NT 0,00
Total 100
Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária
(Dados não publicados, 2014)
Biovar Percentual (%)
1 8,93
2 7,14
3 35,71
4 1,79
5 3,57
7 1,79
8 1,79
9 12,50
10 3,57
13 23,21
NT 0,00
Total 100
MUHAIRWA et al., 2001
PEDERSEN et al., 2003
LEOTTA et al., 2006
Subespécie Percentual (%)
multocida 87,50
septica 10,71
gallicida 1,79
Total 100
Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária
(Dados não publicados, 2014)
Biovar Percentual (%)
1 8,93
2 7,14
3 35,71
4 1,79
5 3,57
7 1,79
8 1,79
9 12,50
10 3,57
13 23,21
NT 0,00
Total 100
FEGAN et al., 1995
VARGA et al., 2013
Subespécie Percentual (%)
multocida 87,50
septica 10,71
gallicida 1,79
Total 100
Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária
Biovar 2: hgbB-; pfhA+
Biovar 3: hgbB+; pfhA-
(Dados não publicados, 2014)
Biovar Percentual (%)
1 8,93
2 7,14
3 35,71
4 1,79
5 3,57
7 1,79
8 1,79
9 12,50
10 3,57
13 23,21
NT 0,00
Total 100
Não houve associação entre os biovares e a presença de 23 genes de virulência pesquisados (p˃ 0,05)
Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar
• Grande número de isolados não tipificáveis;
• Variações de reprodutibilidade dos testes;
• Menor poder discriminatório
Limitações
(MATSUMOTO & STRAIN; 1993; VARGA et al., 2007; DZIVA et al., 2008 ; GARCIA et al., 2011)
Combinada com técnicas moleculares de tipificação
Tipificação molecular
• Tipificação: isolados compartilham propriedades que os diferenciam;
Testes moleculares X testes de biotipificação
Tipificação molecular
( MUHAIRWA et al., 2001; CHRISTENSEN & BISGAARD, 2006)
Testes moleculares X testes de biotipificação
Análise de enzima de restrição - REA
Ribotipagem
Análise do Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso - RAPD
Sequência Palindrômica Repetitiva - REP
Análise do Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição - RFLP
Tipificação por sequenciamento de múltiplos loci - MLSTDife
renc
iaçã
o de
cep
as d
e P.
mul
toci
da
Tipificação molecular
• Técnica de PCR-RFLP em P. multocida;
- discriminação do gene ompH;
- estrutura do lipopolissacarídeo;(BOROWSKI et al., 2001; JABBARI et al., 2005; SELLYEI et al., 2013)
(TSAI et al., 2011)
• Amplificação dos genes ompH (Sellyei et al., 2013); oma87 (Furian et al., 2013);
Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo - produto de amplificação gene ompH (aprox. 1000 pb). A seta preenchida indica fragmento de 500pb.
Restriction mapper version 3
GenBank U50907 – ompH gene strain X-73
DraI
HindIII
PvuII
5’-TTT AAA-3’3’-AAA TTT-5’
5’-A AGCT T-3’3’-T TCGA A -5’
5’-GTPy PuAC-3’3’-CApu PyTG-5’
IVIVI V V VIVVIIIIII PMPMFigura 2. Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII
PCR-RFLP
Grupo genético
Frequênciarelativa (%)
I 12,28II 42,11III 3,51IV 3,51V 17,54VI 8,77VII 12,28
Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII
Associação do perfil VII com o biovar 13;
Alta homologia de alguns perfis com determinados sorotipos;
Perfil II
Sorotipo 3
Perfil VII
Sorotipo 11
Sorotipo 3,4
Sorotipo 2
Perfil III
Sorotipo 4
Sorotipo 9
Sorotipo 15
Sorotipo 4
Sorotipo 5,16
Perfil V
Sorotipo 10
Sorotipo 12
Sorotipo 14
Sorotipo 6
Sorotipo 7
Sorotipo 8
Sorotipo 13
Perfil VI
Figura 3. Relação filogenética da sequência nucleotídica de 638pb do gene ompH entre os perfis gerados através de PCR-RFLP e os diferentes sorotipos de Pasteurella multocida
Kruskall-Wallis test (p<0,01)
Distribuição do índice de patogenicidade versus perfil genético de isolados de origem aviária de Pasteurella multocida
6,05
8,97
5,81
4,03
8,77
5,62
Grupo genético IP médio
I 6,05a
II 8,97b
III/IV 8,77b
V 5,81a
VI 4,03a
VII 5,62a
• Métodos de classificação de P. multocida são empregados em estudos epidemiológicos e na diferenciação de cepas isoladas em surtos (DZIVA et al., 2008).
• A variabilidade antigênica dificulta o estabelecimento de uma vacina eficiente (DAVIES et al., 2003).
Importante determinar os sorotipos de P. multocida: bacterinas protegem pobremente contra desafios das cepas heterólogas.
• Cápsula e LPS: base para a classificação de P. multocida
• Classificadas em cinco sorogrupos (A, B, D, E, F)
• Classificadas em 16 sorovares
• Casos de CA predominantes: sorogrupo A e sorovares 1-3 ou 3-4;
antígenos capsulares;
antígenos somáticos;
(BISGAARD, 2008; HARPER et al., 2012)
Cápsula
Heparina
Glicosaminoglicanos idênticos aos componentes da matriz celular
da célula eucariótica
Pode não ocorrer resposta imune do hospedeiro
(DAVIES et al., 2004; BOYCE et al., 2010)
N-acetil-glicosaminaÁcido glicurônico
Ácido hialurônico
Condroitina
Cápsula
• Resistência à dessecação;
• Maior adesão (?);
• Atividade antifagocitária;
• Interação com o sistema complemento;
• Importante papel na interação com o organismo infectado
cepas com cápsula X mutantes acapsulares
(JACQUES et al., 1993; PRUIMBOOM et al., 1996; CHUNG et al., 2001,;BOYCE et al., 2010; HARPER et al., 2012)
Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade
• Classificação fundamental:
- relação entre tipo capsular, patogenia e predisposição do hospedeiro a um
sorogrupo;rinite atrófica septicemia hemorrágica cólera aviária
tipo D tipo B ou E tipo A
(JAGLIC et al., 2005; WOO;KIM , 2006; HAPER et al., 2012)
• Prevalência pode variar conforme a distribuição geográfica e ao longo do tempo;
Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade
(CARTER & RUNDELL, 1973; CARTER & SUBRONTO, 1973; GLISSON et al., 2008; BORRATHYBAY et al., 2003)
• Tipificação: teste de hemaglutinação indireta
- isolados podem não aglutinar com antissoros homólogos;
- depende da presença do antígeno capsular;
• Métodos fenotípicos não-sorológicos
- Teste da hialuronidase: amostras do tipo A despolimerização do ácido hialurônico
- Teste da acriflavina: amostras do tipo D floculação em caldo
- microscopia com luz oblíqua colônias iridescentes
- microscopia eletrônica espessura da cápsula
(CARTER, 1955)
patogenicidade
Cepa Completo Hospedeiro/tecido
Genoma (Mbp) G+C
Pm70 sim ave 2.26 40.40
36950 sim bovino/pulmão 2.35 40.44
Anand1G não caprino 2.29 40.52
Anand1P não ave/fígado 2.02 40.22
P3480 não suíno/pulmão 2.08 40.15
X73 não ave 2.31 40.31
VP161 não ave 2.26 40.21
P903 não suíno 2.35 40.14
M1404 não Bovino 2.30 40.27
Boyce et al., 2012
Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas
locus de biossíntese da cápsula B:2(Boyce et al., 2000)
locus de biossíntese da cápsula A:1(Chung et al., 1998)
Cápsula
(adapatado de: BOYCE et al., 2000)
• Região 1: proteínas para transporte dos polissacarídeos da cápsula;
• Região 3: enzimas para fosforilação;
• Região 2: enzima para biossíntese dos monômeros de açúcar;
cexA cexB cexC cexD lipA bcbI bcbH bcbF
lipB
bcbG bcbE bcbD bcbC bcbB bcbA
hexA hexB hexC hexD hyaA hyaB hyaC hyaD hyaE
phyA phyB
Pasteurella multocida A:1
Pasteurella multocida B:2
(CHUNG et al., 1998, BOYCE et al., 2010)
Região 01 Região 02 Região 03
AnáliseSorogrupo
A (%) D (%) NT (%) Total (%)
Testes fenotípicos 41 (75,93)a 2 (3,7)a 11 (20,37)a 54 (100)
Multiplex-PCR 49 (90,74)b 3 (5,56)a 2 (3,7)b 54 (100)
X2 (1) = 4,267 p= 0,034 (p<0,05)
Tabela 4. Tipificação capsular de 54 isolados de Pasteurella multocida de origem aviária com testes fenotípicos não sorológicos e multiplex-PCR
Leotta et al. (2006), Shivachandra et al. (2006), Jabbari et al. (2006)
Fatores de virulência
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
FHA
PtfA
Fatores de virulência
(adaptado de HATFALUDI et al., 2010)
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
Fatores de virulência
OmpHOma87
(adaptado de HATFALUDI et al., 2010)
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
Fatores de virulência
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
Fatores de virulência
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
GlicolipídeoGlicoproteína
Porçãolipídica
Porçãolipídica
Porçãoglicosídica
(adaptado de FÁTIMA et al., 2005)
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
Fatores de virulência
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
Cu
Zn
Ligaçãodissulfeto
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
• Sialidases;
• Superóxido dismutase;
• Relacionados ao metabolismo do ferro;
Fatores de virulência
• Cápsula e LPS
• Fímbrias e adesinas
• Proteínas externas de membrana
• Toxina dermonecrótica
(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)
(ompH, oma87, ompA, plpB)
(toxA)
(adaptado de KREWULAK; VOGEL, 2008)
Transferrina Sideróforos Hemoglobina
Periplasma
Citoplasma
Complexo energético TonB
(nanH, nanB)
(sodA, sodC)
(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);
Processo ou enzima GeneFrequência absoluta e relativa
(%) – cepas aviáriasFrequência absoluta e relativa
(%) – cepas suínas
Proteínas de membrana externa
ompH 96% 98%oma87 100% 100%ompA 61% 95%plpB 98% 98%psl 96% 98%
Metabolismo do ferro
exbD-tonB 98% 98%fur 96% 98%
hgbA 98% 92%hgbB 93% 58%
SialidasesnanH 95% 85%nanB 98% 100%
Superóxido dismutasessodA 96% 100%sodC 96% 100%
Hyaluronic synthetase pmHAS 88% 92%
Toxina dermonecrótica toxA 0% 3%
Adesinas
ptfA 96% 98%pfhA 63% 53%tadD 38% 85%hsf-1 50% 20%
Tabela 5. Distribuição de 22 genes associados à virulência em Pasteurella multocida detectados por m-PCR conforme o hospedeiro de origem
Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)
• A maioria dos genes de virulência apresenta uma distribuição regular;
• Alguns genes estão associados com a presença de pasteurelose
(EWERS et al., 2006; BETHE et al., 2009; TANG et al., 2009)
tbpA+, pfhA+, hgbB+ toxA+
• Em aves não existem relatos de acordo com o status sanitário dos animais
• Alguns genes estão associados a determinados sorogrupos:
Sorogrupo A
pfhA+, pmHAS+, hsf-1-
Sorogrupo D
toxA+, pmHAS-, hsf-1-
Tabela 6. Frequência absoluta e relativa (%) dos genes associados à virulência detectados por PCR conforme os sorogrupos A e D de Pasteurella multocida
GeneSorogrupo A
(gene hyaD-hyaC)(n=88)
Sorogrupo D (gene dcbF)
(n=6)
ompH 85 (97%) 6 (100%)
ompA 65 (74%) 6 (100%)
plpB 86 (98%) 6 (100%)
psl 86 (98%) 5 (83%)
exbD-tonB 86 (98%) 6 (100%)
fur 85 (97%) 6 (100%)
hgbA 84 (95%) 6 (100%)
hgbB 67 (76%) 6 (100%)
nanH 79 (90%) 6 (100%)
nanB 87 (99%) 6 (100%)
sodA 86 (98%) 6 (100%)
sodC 86 (98%) 6 (100%)
pmHAS 86 (98%)b 0 (0%)b
toxA 0 (0%) 1 (17%)a
ptfA 85 (97%) 6 (100%)
pfhA 56 (64%)a 0 (0%)a
tadD 53 (60%) 0 (0%)a
hsf-1 28 (32%)b 6 (100%)a
Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)
aem negrito: associação significativa (p<0.05)bem negrito: associação significativa (p<0.001)
ompH toxA ptfA nanHexbD-
tonB sodA pfhA hgbA sodC nanB hgbBoma8
7hsf-1 fur pmHAS psI ompA plpB tadA
ompH 100
toxA 1 100
ptfA 97 1 100
nanH 93* 100 90 100
exbD-tonB 100* 100 98 100* 100
sodA 98 100 98 99 98 100
pfhA 58 0 57 60 59 59 100
hgbA 96 100 96 99* 96 96 100* 100
sodC 99 1 98 99 99* 98 100 98 100
nanB 100* 100 99 100 100* 99 100 99 100* 100
hgbB 78 100 78 80 78 78 77 82* 78 78 100
oma87 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
hsf-1 36* 100 38 33* 36 37 38 35* 36 37 42 38 100
fur 99* 100 97 99* 99* 97 96 97 98 98* 96 97 92* 100
pmHAS 90 0 90 89 89 89 98* 90 89 90 87 90 78* 90 100
psl 99* 100 97 99* 99* 97 98 97 98 98* 96 97 92* 99* 98 100
ompA 77* 100 76 76* 44 75 63* 74 77 76 68* 75 39** 77* 73 76 100
plpB 100* 100 98 100* 100** 98 98 98 99 99* 97 98 94 100* 98 100* 100 100
tadD 60 0 58 57* 59 56 48* 55 59 58 45** 57 28* 59* 62* 59 74* 59 100
Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas
*em negrito: indica associação significativa (p<0.05)**em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)
ompH toxA ptfA nanHexbD-
tonB sodA pfhA hgbA sodC nanB hgbBoma8
7hsf-1 fur pmHAS psI ompA plpB tadA
ompH 100
toxA 1 100
ptfA 97 1 100
nanH 93* 100 90 100
exbD-tonB 100* 100 98 100* 100
sodA 98 100 98 99 98 100
pfhA 58 0 57 60 59 59 100
hgbA 96 100 96 99* 96 96 100* 100
sodC 99 1 98 99 99* 98 100 98 100
nanB 100* 100 99 100 100* 99 100 99 100* 100
hgbB 78 100 78 80 78 78 77 82* 78 78 100
oma87 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
hsf-1 36* 100 38 33* 36 37 38 35* 36 37 42 38 100
fur 99* 100 97 99* 99* 97 96 97 98 98* 96 97 92* 100
pmHAS 90 0 90 89 89 89 98* 90 89 90 87 90 78* 90 100
psl 99* 100 97 99* 99* 97 98 97 98 98* 96 97 92* 99* 98 100
ompA 77* 100 76 76* 44 75 63* 74 77 76 68* 75 39** 77* 73 76 100
plpB 100* 100 98 100* 100** 98 98 98 99 99* 97 98 94 100* 98 100* 100 100
tadD 60 0 58 57* 59 56 48* 55 59 58 45** 57 28* 59* 62* 59 74* 59 100
Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas
*em negrito: indica associação significativa (p<0.05)**em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)
Houve associação significativa na combinação da presença dos genes de virulência em 45 situações.
cólera aviária
saúde animal
Habitante normal das vias aéreas(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)
?? ??
cólera aviária
saúde animal
Habitante normal das vias aéreas(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)
?? ??
A bactéria é patogênica?
?BIOVAR 3 BIOVAR 13
multocidaseptica gallicida
BIOVAR 2
A:1
A1:3
sorogrupo D
cápsula tipo F
colônia iridescente
pfhA+
hgbA+
toxA+
hgbB+Β-hemólisefur
nanH
Dendrograma com a relação de cepas de P. multocida conforme o perfil de
virulência
Genoma Pm70 Alinhamento e comparação da sequência de aminoácidos da
proteína OmpH da cepa P52 com diferentes sorotipos de P. multocida
Utilização da inoculação de animais para determinar a patogenicidade dos isolados
(Ibrahim et al., 1998; Shivachandra et al., 2006; Mohamed et al.,2012)
rarosvariáveis quanto ao padrão de avaliação
Lei 11.794 (08/10/08)Procedimentos para o uso científico de animais
estabelecer um modelo de classificação da patogenicidade de P. multocida a partir da inoculação de pintos de corte.
Estabelecimento de um índice de patogenicidade em pintos de corte de um dia de idade para cepas de Pasteurella multocida isoladas de de aves e de suínos.
Parâmetros avaliados
1. tempo de morte (dias): observação das aves por 07 dias
2. presença de lesões macroscópicas
(Pilatti, 2014)
A B C
D E FA) aerossaculite B) Lesão local aplic. C) onfalite D) pericardite
E) perihepatite F) peritonite
*TM: Tempo de Morte; PC: Pericardite; PH: Perihepatite; PT: Peritonite; ASS: Aerossaculite; LA: local de aplicação; ONF: Onfalite;
(Pilatti, 2014)IP = ∑(IPI) N
Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IPI) para cada animal
Dia de Morte TM TM x 5Somatório do Escore de Lesões (EL)
N° de Lesões Valor1 1 5 6 5,0002 0,8572 4,286 5 4,1653 0,7144 3,571 4 3,3334 0,571 2,857 3 2,5005 0,4284 2,143 2 1,6676 0,2857 1,428 1 0,8337 0,1428 0,714 0 0,000
7* 0 0 *** ***
*IPI = TM x 5 + (PC + PH + PT + ASS + CL + ONF)
Tabela 8. Relação entre o tempo de morte ou o número de lesões e o respectivo valor atribuído
Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IP) para a cepa inoculada
10 aves p/ cada cepa
(Souza, 2010)
somatório escore de lesões
Fator de bonificação de sobrevivência: 0,1428
Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP
1 10 17 10 33 7,80 49 6,11 65 4,44 81 2,25
2 10 18 9,18 34 7,75 50 5,81 66 4,43 82 2,17
3 10 19 9,13 35 7,69 51 5,63 67 4,39 83 2,1
4 10 20 8,93 36 7,69 52 5,46 68 3,95 84 2
5 10 21 8,87 37 7,5 53 5,44 69 3,89 85 1,75
6 10 22 8,69 38 7,57 54 5,26 70 3,79 86 1,67
7 10 23 8,6 39 7,44 55 5,24 71 3,60 87 1,58
8 10 24 8,51 40 7,25 56 5,17 72 3,5 88 1,42
9 10 25 8,44 41 7,20 57 5,07 73 3,31 89 1,33
10 10 26 8,27 42 6,93 58 4,93 74 3,27 90 1,33
11 10 27 8,26 43 6,77 59 4,89 75 3,12 91 1,33
12 10 28 8,13 44 6,65 60 4,88 76 2,99 92 1,33
13 10 29 8,06 45 6,56 61 4,80 77 2,6 93 1,25
14 10 30 7,93 46 6,43 62 4,73 78 2,5 94 1,17
15 10 31 7,90 47 6,42 63 4,69 79 2,42 95 1,08
16 10 32 7,82 48 6,31 64 4,56 80 2,29 96 0,17
Tabela 9. Valores dos Índices de Patogenicidade (IP) das 96 cepas de Pasteurella multocida inoculadas em frangos de corte com 01 dia idade
Classificação de Patogenicidade N° de Amostras Mediana ± DP
Alta (8-10) 37 9,13 ± 0,953 ᵃ
Intermediária (4-7) 35 5,24 ± 1,159 ᵇ
Baixa (0-3) 24 1,75 ± 0,837 ᶜ
Tabela 10. Mediana dos valores dos Índices de Patogenicidade (IP) de acordo com a distribuição das cepas de Pasteurella multocida nos grupos de patogenicidade
Letras diferentes na mesma coluna representam diferença estatística significativa (p<0,01) (Pilatti, 2014)Kruskall-Wallis test
Redes Neurais Artificiais
• Explicar, simular e predizer os resultados zootécnicos da cadeia avícola;
Gerenciamento de reprodutoras
pesadas
Gerenciamento de frangos de corte
Gerenciamento de matadouros-
frigoríficos de aves
Guahyba, 2001 Realli, 2004 Pinto, 2006 Spohr, 2010
Gerenciamento da cadeia avícola
• Explicar, simular e predizer os resultados em temas sanitários da cadeia avícola;
Avaliação da depleção
linfocitária da Bursa de Fabricius
Moraes, 2008
Avaliação da depleção
linfocitária do timo
Carvalho, 2013
Classificação da patogenicidade de
Escherichia coli
Rocha, 2006; Tejkowski, 2013
Classificação da resistência
antimicrobiana de Escherichia coli
Salle, 2009; Da Rocha, 2012
Redes Neurais Artificiais
• Simula em computadores o funcionamento do cérebro humano implementando modelos matemáticos que se assemelhem às estruturas neurais biológicas;
(FERNEDA, 2006)
• RNAs calculam funções matemáticas normalmente não lineares e estão dispostas em uma ou mais camadas interligadas por um grande número de conexões associados a determinados pesos conforme as informações de entrada recebidas.
(BRAGA et al., 2000; LUDWIG & COSTA, 2007)
dendritos
sinapses
Presença de 22 genes de virulência Classificação do índice de patogenicidade das cepas
Redes Neurais Artificiais
Alta
Intermediária
Baixa
Camada de entrada Camada de saída
Programa Neuroshell Classifier 2.1
Programa Neuroshell Classifier 2.1
Alternativa para determinação da patogenicidade sem a utilização de modelos animais
• Obtenção de amostras isoladas em outros hospedeiros (ruminantes, suínos, pets);
Possibilidade de transmissão horizontal de genes de virulência(DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009)
Comparação perfis genéticos e tipificação molecular(ZAGLIC et al., 2005; SUBAAHARAN et al., 2010)
Amostras isoladas de animais sadios e doentes
Amostras de diferentes origens
CA na forma aguda
CA na forma crônica
Relação epidemiológica de um grupo de
genes
• Os genes toxA, tbpA e pfhA: marcadores do potencial patogênico em outras espécies (DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009)
Obrigado pela atençã[email protected]