Sintesis Hapten dan Konjugat untuk ELISA Fitoestrogen

Sintesis Haptena dan Konjugat untuk ELISA Fitoestrogen. Pengembangan Uji Imunologi

C Bennetau-Pelissero,*, C le Heurou, V Lamothe, F le Menn, P Babin, dan B Bennetau*,

ENITA de Bordeaux, 1 cours du Gnral de Gaulle, 33175 Gradignan, Perancis

Tujuh haptena asam karboksilat dari isoflavonoid disintesis, dengan lengan penjarak pada atom oksigen posisi C7 untuk satu seri, dengan formononetin, daidzein, ekuol, biokanin A, dan genistein, dan posisi C8 untuk seri kedua, dengan hanya formononetin dan daidzein. Haptena-haptena yang berbeda digabungkan dengan albumin serum sapi (BSA) dan tiroglobulin babi (Thyr). Antibodi poliklonal dibentuk terhadap konjugat BSA. Uji imunosorben terkait-enzim (ELISA) dikembangkan berdasarkan persaingan antara fitoestrogen bebas dan konjugat Thyr-haptena untuk antibodi spesifik. Nilai IC50 untuk kurva standar berkisar antara 0.8 dan 20 ng/mL yaitu, 0.3 dan 9.2 pmol/lubang. Antibodi yang diperoleh akan berguna untuk uji pada bahan sayuran maupun cairan biologis setelah tahap pemisahan. ELISA ini juga akan berharga bagi industri makanan untuk mengendalikan konsentrasi fitoestrogen sebelum dan sesudah pemrosesan.

Kata kunci: Fitoestrogen; isoflavonoid; hapten; antibodi poliklonal; ELISA

* Penulis yang menerima korespondensi (e-mail c-bennetau@enitab.fr atau b.bennetau@lcoo.u-bordeaux.fr ).

Alamat kini: Laboratoire de Biologie de la Reproduction des Poissons, Universite Bordeaux I, Avenue des facultes 33405 Talence, Perancis.

Alamat kini: LCOO, UMR 5802 CNRS, Universite Bordeaux I, 351 cours de la Liberation, 33405 Talence, Perancis.

Alamat kini: Laboratoire de Pharmacie Chimique, Universite Bordeaux II, Place de la Victoire, 33000 Bordeaux, Perancis.

Pendahuluan

Fitoestrogen merupakan estrogen alami dalam jumlah besar (hingga 1-4 mg/g; Anderson dan Wolf, 1995) dalam bermacam sayuran, beberapa di antaranya termasuk makanan hewan dan manusia (Farnsworth et al., 1975a,b). Senyawa ini terbukti bertanggung jawab untuk efek meluas pada reproduksi hewan dan perkembangan spesies mamalia, seperti domba (Bennets et al., 1995). Sebenarnya, pada domba yang makan semanggi merah atau bawah tanah, kesuburan ternyata menurun (Bennetts et al., 1946). Uji menyeluruh terhadap siklus reproduktif endokrin menunjukkan adanya gangguan endokrin seperti pengurangan kadar progesteron, laju penanaman embrio yang lebih rendah (Obst dan Seamark, 1970), atau kadar hormon gonadotrofin yang berkurang (Findlay et al., 1973; Hughes et al., 1991a,b). Estrus hewan umumnya menjadi tetap dan bobot rahimnya naik (Braden et al., 1967).

Pada manusia, oleh karena eksposur yang lebih rendah, hanya efek menguntungkan yang terdata sejauh ini. Kebanyakan penelitian epidemiologi membandingkan konsumen Barat dan Asia. Hasilnya menunjukkan bahwa vegetarian dan konsumen Asia, yang dikenai konsentrasi fitoestrogen yang lebih tinggi, menunjukkan keterjadian penyakit bergantung-estrogen yang lebih rendah seperti kanker payudara atau rahim (Tham, 1998). Ekstrak kedelai yang lebih kini tampaknya menurunkan keterjadian ruam merah wanita menopause (Murkies et al., 1995). Penelitian terhadap binatang juga membawa pada kesimpulan bahwa fitoestrogen dapat melindungi wanita menopause dari osteoporosis (Anderson dan Garner, 1998). Secara in vitro, tampak adanya pelekatan terhadap protein pengikat steroid (hSHBG dan protein-(Feto manusia) (Marin et al., 1978); Garreau et al., 1991). Lebih kini, Kuiper et al. (1998) menunjukkan bahwa geistein 4 (Gambar 1) terikat pada bentuk ( reseptor estradiol mamalia. Akhir-akhir ini, perhatian berkembang pada efek meluas potensial dari senyawaan ini pada manusia, mengingat tingginya kadar fitoestrogen yang ditemukan dalam formula bayi pengganti susu yang berdasar kedelai (Setchell et al., 1998; Knight et al., 1998). Sebenarnya, efek yang dilaporkan sebelumnya pada tikus setelah in utero (Hilakivi-Clarke et al., 1998; Golden et al., 1998) atau eksposur baru-lahir (Medlock et al., 1995; Santti et al., 1998) diuji secara hati-hati. Isu ini masih dalam penyelidikan.

Piranti baru untuk unit fitoestrogen dikembangkan baru-baru ini untuk mengukur eksposur hewan dan manusia, yang tampaknya bervariasi dari satu budaya diet dengan yang lainnya. Sebagian besar merupakan uji imunologi. Radioimunoesai (RIA) dikembangkan pada formononetin 1 (Wang et al., 1994; Hampl et al., 1998), daidzein 2 (Lapeik et al., 1997), dan 4 (Lapeik et al., 1998) dengan haptena yang dilekati lengan penjarak pada atom oksigen posisi C7 atau C4. Untuk mengembangkan ELISA, kami mencoba mereproduksi sintesis yang dilaporkan sebelumnya. Namun, yang kami dapatkan adalah campuran kompleks, bukannya asam yang diperlukan. Terlebih lagi, dalam sintesis hapten 8 dan 11 sebelumnya, data fisik dan spektroskopik tidak dilaporkan. Sebagai hasil kurangnya informasi dan kesulitan dalam reproduksi reaksi, kami memutuskan untuk melakukan proses baru sintesis hapten yang diperlukan dengan lengan penjarak pada atom oksigen pada posisi C7 dan untuk mensintesis hapten baru dengan lengan penjarak pada posisi C8.

Dalam jurnal ini kami melaprokan sintesis hapten 8-11 dari isoflavon 1,2, biokanin A 3, 4, dan ekuol 5. Karena RIA menggunakan radioisotop, yang tidak sesuai untuk uji kendali di industri makanan, kami juga menyajikan sintesis konjugat haptena-protein, produksi antibodi yang berhubungan, dan uji ELISA. Reaktivitas-silang antibodi juga akan dibahas.

Prosedur Percobaan

Bahan. Bahan awal organik untuk sintesis haptena diperoleh dari Sigma-Aldrich Chimie a.a.r.l. (St. Quentin Fallavier, Perancis), Acros Organics France (Noisy, Perancis), dan Lancaster Synthesis Ltd. (Bishheim, France). Kromatografi lapis-tipis (TLC) dikinerjakan di atas lembar plastik terpralapisi 0.25 mm silika gel 60 F254 dari SDS (Peypin, Perancis). Kromatografi kolom dilakukan dengan silika gel (SDS 200, 60 CC, 35-70 (m, Peypin, Perancis). Dietil eter dan dklorometana dikeringkan pada saringan molekular 4 (SDS, Peypin Perancis) dan kemudian disuling dari kalsium hidrida. Etanol dikeringkan dengan perlakuan menggunakan magnesium diikuti oleh pemanasan dengan refluks dan penyulingan. Dimetilformamida dan piridina disuling dari barium oksida. Aseton dikeringkan pada saringan molekular 4 dan kemudian disuling di bawah nitrogen. Semua reagen untuk tahap pekerjaan biologis dibeli dari Sigma-Aldrich Chimie s.a.r.l. kecuali untuk antibodi kedua, yaitu imunoglobulin babi anti-kelinci yang digabungkan dengan peroksidase lobak dibeli dari Dako (Trappes, Perancis).

Alat. Titik lebur ditentukan dengan alat Kofler atau alat titik lebur kapiler Mettler FP 62 dan dikoreksi. Spektra inframerah dicatat pada Paragon 1000 Perkin-Elmer dengan polistirena sebagai standar; nilai bilangan gelombang (cm-1) diberikan. Spektra resonansi magnetik proton (NMR 1H) dicatat dengan spektrometer Bruker AC 200 pada 200 MHz atau dengan Bruker AC 250 pada 250 MHz. Spektra resonansi magnetik Karbon (NMR 13C) dicatat dengan spektrometer Bruker AC 250 pada 62.9 MHz atau dengan Bruker AC 200 pada 50.3 MHz. Geseran kimia (() diberikan dalam bagian per juta (ppm) menggunakan tetrametilsilana sebagai standar internal pada 0.00 ppm. Spektra massa tubrukan elektron ditentukan dengan alat VG Auto Spec-Q pada 70 eV; data dilaporkan sebagai m/z (intensitas relatif). Teknik ELISA dilakukan pada pelat mikrotitrasi (maksisorp NUNC) dengan 96 lubang. Kerapatan optik (OD) dibaca dengan pembaca pelat mikrotitrasi Dynex MRX II pada 490 nm. Kendali positif adalah lubang yang diberi lapisan dan antibodi spesifik tanpa fitoestrogen bebas apa pun. Kurva standar dibuat sesuai dengan rumus ODcontoh/ODkontrol positif = f[log(konsentrasi)].

Sintesis Haptena. Sintesis haptena 8-12 diperlihatkan pada Gambar 2, dan sintesis haptena 20 dan 21 ditunjukkan pada Gambar 3. Struktur senyawa dipastikan dengan metode spektral.

7-Etoksikarbonilmetoksi-3-(4-metoksifenil)-4H-kromen-4-on (6). La-rutan 1 (3 g, 11.2 mmol), etil bromoasetat (3.8 g, 22.7 mmol), dan kalium karbonat serbuk (3 g, 33 mmol) dalam aseton (50 mL) direfluks selama 48 jam (reaksi dimonitor dengan TLC). Setelah pendinginan, pengambilan pelarut di bawah tekanan yang dikurangi memberikan produk kasar, yang disaring dan dimurnikan dengan pencucian dengan air (50 mL), NaOH (1 M, 30 mL), dan air lagi (30 mL) untuk memberikan hasil 6 sebagai suatu serbuk putih (3.2 g, 81%): ....... (data angka tidak diterjemahkan)

7-Etoksikarbonilmetoksi-5-hidroksi-3-(4-metoksifenil)-4H-kromen-4-on (7). Larutan 3 (3 g, 10.5 mmol), etil bromoasetat (3 g, 17.9 mmol), dan kalium karbonat serbuk (2.9 g, 21 mmol) dalam aseton (50 mL) direfluks selama 48 jam (reaksi dimonitor dengan TLC). Setelah pendinginan, pengambilan aseton di bawah tekanan yang dikurangi memberikan hasil kasar, yang disaring dan dimurnikan dengan pencucian dengan air (50 mL), NaOH (1 M, 30 mL), dan air lagi (30 mL) untuk memberikan hasil 7 sebagai serbuk putih (3.7 g, 95%): ....... (data angka tidak diterjemahkan)

7-Karboksimetoksi-3-(4-metoksifenil)-4H-kromen-4-on (8). Larutan natrium karbonat (5% dalam air, 8 mL, berlebih) ditambahkan pada larutan ester 6 (1 g, 2.82 mmol) dalam aseton (50 mL). Campuran direfluks selama 48 jam (reaksi dimonitor dengan TLC). Setelah pendinginan, pengambilan pelarut di bawah tekanan yang dikurangi, dan pengasaman dengan HCl (1M) memberikan hasil kasar, yang disaring dan dimurnikan dengan pencucian dengan air (50 mL) untuk memberikan hasil 8 sebagai suatu serbuk putih (800 mg, 87%): ..... (data angka tidak diterjemahkan)

7-Karboksimetoksi-5-hidroksi-3-(4-metoksifenil)-4H-kromen-4-on (9). Ester 7 (850 mg, 2.29 mmol) dalam aseton (25 mL) ditambah natrium karbonat (5%, 10 mL, berlebih). Campuran direfluks selama 48 jam (reaksi dimonitor dengan TLC). Setelah pendinginan, pengambilan aseton di bawah tekanan yang dikurangi dan pengasaman dengan HCl (1 M) memberikan hasil kasar, yang disaring dan dimurnikan dengan pencucian dengan air (50 mL), untuk menghasilkan 9 berupa serbuk putih (710 mg, 91%): ........ (data angka tidak diterjemahkan)

7-Karboksimetoksi-3-(4-hidroksifenil)-4H-kromen-4-on (10). BBr3 (1 M dalam diklorometana, 54 mL, 53.68 mmol) ditambahkan tetes demi tetes dengan siring ke dalam larutan ester 6 (3.17 g, 8 95 mmol) yang diaduk dalam diklorometana (30 mL). Setelah adisi sempurna, campuran diaduk selama 24 jam pada suhu kamar dan kemudian dituangkan ke atas air es (500 mL). Penyaringan hasil kasar memberikan residu kuning, yang dimurnikan dengan kromatografi kolom silika gel yang dielusi dengan 50% dietil eter dalam diklorometana dan kemudian dengan 20% etanol dalam diklorometana untuk memberikan hasil 10 sebagai suatu serbuk kuning (2 g, 71%): ...... (data angka tidak diterjemahkan)

7-Karboksimetoksi-5-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)-4H-kromen-4-on (11). BBr3 (1 M dalam diklorometana, 38 mL, 37.8 mmol) ditambahkan tetes demi tetes dengan siring ke dalam larutan ester 7 (2 g, 5.4 mmol) yang diaduk dalam diklorometana (40 mL). Setelah adisi sempurna, campuran diaduk selama 24 jam pada suhu kamar dan kemudian dituangkan ke atas air es (400 mL). Penyaringan hasil kasar memberikan residu kuning, yang dimurnikan dengan kromatografi kolom silika gel yang dielusi dengan 50% dietil eter dalam diklorometana dan kemudian dengan 20% etanol dalam diklorometana untuk memberikan hasil 11 sebagai suatu serbuk kuning (2 g, 71%): ...... (data angka tidak diterjemahkan)

7-Karboksimetoksi-3,4-dihidro-3-(4-hidroksifenil)-2H-kromena (12). Campuran asam 10 (765 mg, 2.45 mmol) dan paladium (10% di atas batu bara, 2 g, 5 mol %) diaduk semalam di bawah atmosfer hidrogen. Karena sifat sangat mudah terbakarnya, hidrogen dimanipulasi sesuai dengan petunjuk keselamatan umum. Campuran disaring dan filtratnya diuapkan untuk memberikan hasil residu padat putih, yang dimurnikan dengan kromatografi kolom silika gel, dielusi dengan 40% metanol dalam diklorometana, untuk memberikan hasil 12 sebagai suatu serbuk putih (350 mg, 47%): ........

1-(2,4-Dihidroksi-3-metilfenil)-2-(4-metoksifenil)etanon (15). BF3(Et2O (200 mL, 1.61 mol) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam campuran 2-metilresorsinol 13 (10 g, 80.55 mmol) dan asam benzilik 14 (13.4 g, 80.63 mmol). Campuran dipanaskan selama 12 jam pada 70oC. Setelah pendinginan, campuran dituangkan ke atas air es. Hasil disaring dan direkristalisasi dari kloroform untuk memberikan hasil deoksibenzoin 15 sebagai kristal berwarna gading (15.3 g, 70%): .........

7-Hidroksi-3-(4-metoksifenil)-8-metil-4H-kromen-4-on (16). BF3(Et2O (45 mL, 224.76 mmol) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan deoksibenzoin 15 (15.3 g, 56.2 mmol) yang diaduk dalam dimetilformamida (DMF) (150 mL) pada suhu ruang. Campuran dipanaskan hingga 50oC, dan mesil klorida (15 mL, 168.57 mmol) ditambahkan dengan siring. Larutan dihangatkan hingga 70oC dan diaduk selama 3 jam. Setelah pendinginan, campuran dituangkan ke atas air es (700 mL). Penyaringan hasil kasar memberikan residu kuning, yang direkristalisasi dari kloroform untuk mmeberikan isoflavon 16 sebagai suatu serbuk putih (11 g, 70%): ...........

7-Asetoksi-3-(4-metoksifenil)-8-metil-4H-kromen-4-on (17). Anhidrida asetat (25 g, 244.9 mmol) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan isoflavon 16 (5 g, 17.71 mmol) yang diaduk dalam piridina (80 mL). Campuran dipanaskan hingga 120oC selama 24 jam. Setelah pendinginan dan pengambilan pelarut pada tekanan yang dikurangi residu coklat diperoleh dan kemudian dimurnikan dengan kromatografi kolom, dielusi dengan 10% etil asetat dalam diklorometana untuk memberikan hasil 17 sebagai serbuk putih (5.1 g 89%):......

8-Bromoetil-7-asetoksi-3-(metoksifenil)-4H-kromen-4-on (18). Campuran teraduk-baik asetat 17 (9 g, 27.75 mmol), N-bromosuksinimida (5 g, 28.05 mmol), dan benzoil peroksida (0.5 g) dalam karbon tetraklorida kering (100 mL) direfluks selama 4 jam. Setelah pendinginan, campuran disaring, dan filtrat diuapkan untuk memberikan residu padat kuning, dan dimurnikan dengan kromatografi kolom, dielusi dengan 5% dietil eter dalam diklorometana untuk memberikan hasil 18 sebagai serbuk putih (10.6 g, 70%):.......

7-Asetoksi-8-[2,2-bis(etoksikarbonil)etil]-3-(4-metoksifenil)-4H-kro-men-4-on (19). Larutan bromida 19 (6 g, 14.88 mmol), dietil malonat (8 g, 50 mmol), dan kalium karbonat serbuk (6.6 g, 47.7 mmol) dalam DMF (60 mL) diaduk pada suhu ruang selama 4 hari (reaksi dimonitor dengan TLC). Campuran diencerkan dengan air dan diklorometana (100 mL dan 100 mL) dan diasamkan (pH 1-2) dengan HCl (1 M). Lapisan organik dicuci dengaqn air (2 x 50 mL) dan dikeringkan di atas magnesium sulfat. Penghilangan pelarut memberikan residu padat kuning, yang digunakan untuk memperoleh haptena 20. Fraksi kecil dimurnikan dengan kromatografi kolom, dielusi dengan 5% dietil eter dalam diklorometana untuk memberikan 19 sebagai padatan kuning (10 g): .........

8-(2-Karboksietil)-7-hidroksi-3-(4-metoksifenil)-4H-kromen-4-on (20). Ke larutan 19 (10 g) dalam aseton (70 mL) ditambahkan natrium karbonat (5% larutan air, 100 mL, berlebih). Campuran direfluks selama 24 jam (reaksi dimonitor dengan TLC). Setelah pendinginan, penghilangan aseton pada tekanan yang dikurangi dan pengasaman dengan HCl (1 M) memberikan hasil kasar, yang disaring dan dimurnikan dengan pencucian dengan diklorometana (50 mL) untuk memberikan haptena 20 sebagai suatu serbuk kering (2.7 g, 53% dari 18): .........

8-(2-Karboksietil)-7-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)-4H-kromen-4-on (21). BBr3 (1 M dalam diklorometana, 22 mL, 21.5 mmol) ditambahkan tetes demi tetes dengan siring ke dalam larutan haptena 20 (1.22 g, 3.58 mmol) yang diaduk dalam diklorometana (30 mL). Setelah adisi sempurna, campuran diaduk selama 24 jam pada suhu ruang dan kemudian dituangkan ke atas air es (300 mL). Penyaringan hasil kasar memberikan residu kuning, yang direkristalisasai dari etanol/air (1:1, v/v) untuk memberikan hasil 21 sebagai serbuk kuning (875 mg, 75%): .............

Persiapan Konjugat. Haptena 8-12, 20, dan 21 digabungkan baik dengan BSA (untuk injeksi ke kelinci) maupun dengan Thyr (untuk pelapisan). Prosedur konjugasi diadaptasi dari Riggles et al. (1990) dan Szurdoki et al. (1992). Secara singkat, 0.072 mmol tributilamina 17.3 uL), 0.036 mmol isobutil kloroformat (4.7 uL), dan 0.036 mmol haptena dilarutkan dalam 1 mL DMF pada 4oC dan kemudian diaduk di atas penangas es selama 30 menit. Larutan haptena teraktivasi yang dihaslkan dalam DMF ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan protein (BSA, 0.72 umol, 6.1 mg; Thyr, 0.072 umol, 48.24 mg) dalam 5 mL bufer borat (0.2 M borat-bufer borat, pH 8.7). Campuran diaduk selama 6 jam pada suhu ruang dan kemudian didialisis, terhadap garam tersangga-fosfat (PBS; 0.01 M, pH 7.4, 0.9% NaCl) dan kemudian terhadap air suling. Konjugat haptena-protein diliofilisasi dan disimpan pada -20oC.

Imunisasi Kelinci. Imunisasi dilakukan pada kelinci Selandia Baru dari CEGAV (Perancis). Kelinci pertama kali dicuplik untuk uji praimunserum. Konjugat haptena-BSA (500 ug) diinjeksikan setiap kali. Untuk injeksi pertama konjugat dilarutkan dalam 1 mL adjuvan Freund lengkap PBS (v/v). Untuk injeksi lanjutan antigen dilarutkan dalam adjuvan Freund taklengkap-PBS (v/v). Injeksi dikinerjakan pada titik majemuk sesuai dengan jadwal injeksi sebgai berikut. Tiga injeksi pertama dikinerjakan pada interval 1-minggu. Dua injeksi tambahan mengikuti setelahnya pada interval 3-minggu. Satu minggu setelah injeksi kelima, suatu uji dikinerjakan pada sampel darah 5 mL untuk menguji spesifisitas dan titer antibodi. Dua injeksi terakhir dikinerjakan pada interval 1-bulan. Lima puluh mililiter sampel darah dikumpulkan 1 minggu setelah injeksi terakhir. Serum diperoleh setelah pembekuan darah pada 4oC. Serum disimpan pada -20oC dalam alikuot kecil. Efisiensi imunisasi diuji dalam ELISA (seperti digambarkan di bawah) dengan pelekatan langsung antibodi ke atas konjugat terlapisi. Titer dari semua antiserum dibandingkan menggunakan antigen pelapis Thyr-konjugat yang sama (2.5 ug/mL) dan membandingkan OD untuk pengenceran antibodi 1/4000 (lihat Tabel 2).

Prosedur Esai. Pelapisan lubang dikinerjakan dengan konjugat Thyr-konjugat (200 (L/lubang) dalam larutan dalam bufer karbonat (0.05 M, pH 9.6) pada 4oC, semalaman. Haptena yang sama digunakan untuk pelapisan seperti untuk imunisasi; yaitu, esai merupakan homolog haptena. Konsentrasi konjugat didaftarkan pada Tabel 3. Lubang dijenuhkan dengan PBS-T-PS-DMSO (PBS mengandung 0.1% serum babi, 0.05% Tween 20, dan 1% DMSO) pada 37oC selama 30 menit. Pelat dicuci tiga kali dengan PBS-T-PS-DMSO (PBS, 0.05% Tween 20, dan 1% DMSO). Pengenceran serial analat dalam PBS-T-PS-DMSO disiapkan sebagai kurva standar, dan 100 (L/lubang ditambahkan ke pelat (lihat Tabel 3). Antibodi spesifik (lihat konsentrasi pada Tabel 3 dalam PBS-T-PS-DMSO) ditambahkan (100 (L/lubang). Inkubasi berlangsung selama 2 jam pada 37oC. Pelat dicuci tiga kali dengan PBS-T-DMSO. Kemudian 200 (L/lubang antibodi kedua ditambahkan ke dalam PBS-T-PS-DMSO (lihat Tabel 3 untuk konsentrasi). Inkubasi dikinerjakan pada 37oC selama 30 menit. Untuk mengukur aktivitas peroksidase, 200 (L/lubang larutan substrat yang mengandung 0.005 M o-fenilenadiamina (10 mg dalam 20 mL) dan 0.00025% H2O2 30% (5 uL dalam 20 mL) dalam bufer sitrat-fosfat (0.15 M, pH 5.0) ditambahkan. Reaksi terjadi pada suhu ruang selama 30 menit dan dihentikan dengan 50 (L/lubang 4 M H2SO4. Nilai OD dibaca pada 490 nm. Kurva standar menghitung 12 titik dalam duplikat dengan kenaikan 2-kali antara konsentrasi.

Uji Reaktivitas-Silang. Reaktivitas-silang antibodi diuji dalam cara kompetitif, sesuai dengan kondisi optimal yang diringkas dalam Tabel 3. Dalam kasus tersebut di samping kurva standar yang diperoleh dengan analat, antibodi dikenakan pengenceran serial fitoestrogen lain dalam PBS-T-PS-DMSO. Konsentrasi kompetitor beragam dari 50 hingga 0.003 ug/mL dengan penurunan 4-kali antara konsentrasi. Hasil diberikan pada Tabel 3.

Hasil dan Pembahasan

Kerja Sintetik. Lima haptena asam karboksilat dari isoflavonoid disintesis dengan lengan penjarak pada posisi O7 (8-12) dan dua haptena (20 dan 21) dengan lengan penjarak pada posisi C8.

Seri Haptena dengan Lengan Penjarak pada Atom Oksigen C7. Seperti disebutkan sebelumnya, reaksi yang dicoba, mengikuti prosedur sebelumnya, untuk mensintesis asam yang diperlukan tidak menyediakan haptena yang diharapkan, malahan campuran kompleks yang diperoleh. Lebih lagi, laporan sebelumnya tentang sintesis haptena dengan alkilasi regioselektif geistein pada posisi 4-O atau pun 7-O tidak menyajikan prosedur percobaan yang terperinci (Lapeik et al., 1998, dan referensi yang disebutkan di dalamnya). Secara mengejutkan, referensi yang disebutkan (Wahala et al., 1995), dalam prosedur percobaan untuk bahan kimia, hanya menyebutkan sintesis dan pelabelan isoflavon. Oleh karena itu, kami mengalihkan perhatian kami pada penciptaan proses baru untuk mensintesis asam yang diperlukan.

Berawal dari 1 dan 3 (Gambar 2), diperoleh seperti dilaporkan sebelumnya (Pelissero et a., 1991), lengan penjarak diikatkan pada atom oksigen pada posisi C7 menggunakan etil bromoasetat dengan kalium karbonat dalam aseton. Penyabunan ester 6 dan 7 menghasilkan asam yang berkaitan 8 dan 9. Dengan 3, gugus hidroksil C7 dialkilasi secara selektif sesuai dengan data 2D NMR. Ini bisa dijelaskan oleh adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil dan karbonil cincin B. Haptena 10 dan 11 diperoleh dalam rendemen yang baik dengan demetilasi selektif dengan boron tribromida (Bhatt dan Kulkarni, 1983). Hidrogenasi 10 menghasilkan haptena 12, cocok untuk produksi antibodi terhadap ekuo 5.

Sintesis Haptena C8. Untuk meningkatkan spesifisitas antibodi, kami mencoba menghindari konjugasi langsung menggunakan gugus hidroksil isoflavon S, yang merupakan determinan antigenik dari kelas senyawa ini. Dengan variasi metode Wahala (Wahala dan Hase, 1991), kami memperoleh deoksibenzoin termetilasi 15 (gambar 3). Setelah proteksi gugus hidroksil dengan anhidrida asetat, senyawa terbrominasi 18 diperoleh dengan brominasi dengan B-bromosuksinimida dan suatu jumlah katalitik benzoil peroksida dalam karbon tetraklorida (Zammatio et al., 1991). Suatu sintesis ester malonat [lihat, sebagai contoh, Szurdoki et al. (1992) dan referensi yang disebutkan] menghasilkan haptena 20. Perlakuan haptena 20 dengan broron tribromida, dalam kondisi yang sama seperti di atas memberikan haptena 21.

Uji Konjugasi. Konjugasi yang diperoleh, sesuai dengan metode yang disebutkan di atas, diuji untuk efisiensi dengan mengikuti metode spektrofotometrik yang dilaporkan Erlanger et al. (1957).

Uji Imunisasi. Sesuai dengan Tabel 1, titer antibodi sangat tinggi kecuali P 37159. dalam kasus tersebut kami menginjeksikan empat kelinci yang berbeda (tidak didaftarkan di sini) dengan hasil yang sama.

Uji ELISA. Kondisi optimum ELISA ditunjukkan pada Tabel 2. Kurva sigmoid standar yang diperoleh untuk setiap antibodi yang digunakan disajikan pada Gambar 4 dan 5. Dalam seri yang terfungsikan pada atom oksigen posisi C7, sensitivitas esai umumnya bagus dengan batas kurva standar antara 250 dan 0.244 ng/mL dan IC50 sekitar 10 ng/mL. Dalam hal P 14422 agak berbeda karena batas kurva standarnya 62.5 dan 0.0304 ng/m dan IC50-nya adalah pada 0.8 ng/mL. Ini bisa dihubungkan dengan nisbah konjugasi yang diperoleh dengan BSA, yang merupakan yang terbaik dari seri. Kemiringan yang diperoleh dalam seri ini hampir serupa semuanya (Gambar 4). Namun, dalam beberapa kasus, keragaman yang dihitung pada sembilan uji yang berbeda tinggi, mungkin karea fenomena adsorpsi pada alat gelas atau pelat mikrotitrasi. Sebenarnya, kami menggunakan alat gelas terlapis-silikon, ujung terlapis-silikon, dan bufer dengan 1% DMSO untuk mengurangi fenomena adsorpsi.

Dalam seri C8, sensitivitas lebih rendah. Untuk P 49550 batas kurva standar adalah 1000 dan 0.488 ng/mL dan IC50 adalah pada 15.6 ng/mL, dan untuk P 49639 batas kurva standar adalah 500 dan 0.244 ng/mL dengan IC50 pada 7.8 ng/mL. Ini bisa terjadi karena rekognisi nonspesifik konjugat Thyr-haptena. Hasil sensitivitas kami memiliki urutan yang sama seperti yang diperoleh dengan ELISA dari dua herbisida (norflurazon dan bromasil), digambarkan oleh Riggles et al. (1990) dan Szurdoki et al. (1992). Sebenarnya, mereka memperoleh nilai IC50 antara 1 dan 10 ng/mL, yaitu, 1-10 (g/L atau 1-10 ppb, seperti yang kami peroleh. Ketika kami membandingkan ELISA kami dengan RIA fitoestrogen, kami mengamati bahwa RIA fitoestrogen umumnya 10-100 kali lebih sensitif dari ELISA. Lapeik et al. (1997) memperoleh IC50 0.170 ng/mL untuk 2 dan 0.311 atau 0.150 ng/mL untuk 4 bergantung pada antibodi yang digunakan (Lapeik et al., 1998). Sebagai tambahan, Wang et al. (1994) melaporkan IC50 0.4 ng/mL untuk 1. Namun, data sebelumnya menunjukkan bahwa fitoestrogen hadir dalam konsentrasi tinggi dalam makanan (Anderson dan Wolf, 1995) maupaun dalam cairan hewan dan manusia (Setchell, 1985). Terlebih lagi, fitoestrogen ditengarai 1000-10000 kali kurang estrogenik dibandingkan estradiol (Setchell, 1985). Jadi, sebuah esai yang sangat tinggi sensitivitasnya tidak diperlukan untuk kuantifikasi dalam makanan atau pengukuran relevansi fisiologis.

Reaktivitas-Silang Antibodi. Hasil yang diperoleh mengenai reaktivitas-silang disajikan pada Tabel 3. Dapat dilihat bahwa reaksi-silang dari semua fitoestrogen dengan P 14422 rendah. Secara berkebalikan, antiserum yang lain menghasilkan reaksi yang sangat rendah dengan 5. Ini dapat diinterpreatasikan dalam syarat fitur sterik dan struktural elektronik 5, yang sangat berbeda dari isoflavon kebanyakan. Pada sisi lain, kadar tinggi reaksi silang dicatat antara senyawa lain dari dua seri. Dalam gugus haptena terfungsikan pada atom oksigen posisi C7, reaksi-silang tertinggi dicatat antara 2 dean 4; P 37159 mengenal 2 pada 45%, dan P 14422 mengenal 4 pada 40%. Ini berarti bahwa gugus hidroksil tambahan dalam 11 pada posisi C5 tidak dikenal oleh antibodi. Fenomena yang sama diamati dengan P 49636, yang mengenal 1, pada 51%. Wang et al. (1994) memperoleh hasil yang sama dengan antibodi mereka anti-formomonetin 7-O-karboksimetil eter.

Dalam gugus haptena terfungsikan pada posisi C8, spesifisitas lebih buruk. Kadar tinggi reaksi-silang teramati antara P 49550, 1, dan 4, sedangkan P 49639 secara kuat mengenal 2 dan 3. Dalam kasus tersebut reaksi-silang antara 2 dan 1 dapat diharapkan berkenaan dengan keserupaan antara gugus OMe dan OH pada C4 (Sherry, 1992). Namun, reaktivitas-silang ini lebih tinggi pada seri C8 daripada seri O7. Sebenarnya, pada seri pertama, lengan penjarak yang pendek pada posisi 7 memproyeksikan kesatuan yang berlawanan (posisi 4) dari molekul haptena untuk pengenalan yang kuat dalam konjugat yang mengimunisasi. Jadi, lengan penjarak mengarahkan spesifisitas dari seri antibodi turunan-O7 ke arah bagian imunodominan (posisi 4) dari haptena (Szurdoki et al., 1995). Dalam seri C8 , posisi penghubung pada haptena tampaknya mengizinkan kebebasan konformasi yang lebih tinggi dari haptena dalam konjugat pengimunisasinya; jadi, selektivitas antiserum yang dihasilkannya lebih rendah. Lapeik et al. (1994, 1998) bekerja dengan molekul yang digantikan dalam 4 dan pada atom oksigen C7. Seperti kami tunjukkan dalam seri C8, mereka memperoleh reaksi-silang yang tinggi antara 1 dan 2 maupun antara 3 dan 4.

Kesimpulannya, antibodi yang diperoleh berharga untuk esai fitoestrogen (Picherit et al., tidak dipublikasikan). Namun, karena reaksi-silang yang tinggi, pemisahan senyawa, sebelum uji, seharusnya berguna. Lagi pula, karena tingginya kada fitoestrogen dalam makanan, sensitivitas esai kami tampaknya cukup. Terlebih lagi, ELISA lebih mudah digunakan daripada RIA karena tidak memerlukan radioisotop. Semua fakta ini membuat ELISA kami sangat mudah dan cocok untuk pengukuran kadar fitoestrogen dari relevansi fisiologis dalam cairan hewan dan untuk perusahaan makanan utnuk mengendalikan bahan mereka sebelum dan sesudah pemrosesan.

Singkatan yang Digunakan

BSA, albumin serum bovin; DMF, N,N-dimetilformamida; DMSO, dimetil sulfoksida; ELISA, uji imunosorben terhubung-enzim; IC50, konsentrasi penghambatan 50%; IR, spektroskopi inframerah; NBS, N-bromosuksinimida; NMR, resonansi magnet inti; OD, kerapatan optik; PBS, garam tersangga-fosfat; ppb, bagian per miliar; ppm, bagian per juta; PS, serum babi; RIA, uji radioimun; T, Tween 20; TLC, kromatografi lapis tipis; Thyr, tiroglobulin.