SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU ...lib.ui.ac.id/file?file=digital/20312705-T31477-Sintesis senyawaa.pdf · 2.3 Komponen Teh ... Komponen Penyusun. Teh..... 9

UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK

TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM

PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY

(ALLIUM CEPA L.)

TESIS

HERONIATY

1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM PASCASARJANA

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA

DEPOK

JULI 2012

Sintesis senyawa..., Heroniaty, FMIPA UI, 2012

UNIVERSITAS INDONESIA

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK

TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KATALIS ENZIM

PEROKSIDASE DARI KULIT BAWANG BOMBAY

(ALLIUM CEPA L.)

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar

Magister Sains Ilmu Kimia

HERONIATY

1006734451

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM PASCASARJANA

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU KIMIA

DEPOK

JULI 2012




iv

KATA PENGANTAR

Rasa syukur terindah dan terdalam penulis panjatkan kepada pemilik raga

yang Maha Agung Allah SWT berkat karunia dan izin-Nya maka penulis dapat

menyelesaikan tesis yang berjudul ”Sintesis Senyawa Dimer Katekin Dari Ekstrak

Teh Hijau Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase Dari Kulit Bawang

Bombay (Allium cepa L.)” dengan baik. Tesis ini disusun sebagai salah satu

persyaratan untuk menempuh ujian akhir Program Studi Magister Ilmu Kimia

pada Program Pascasarjana Universitas Indonesia.

Dalam penyusunan tesis ini penulis telah dibantu berbagai pihak baik

berupa dukungan materil maupun moril yang sangat berarti bagi penyelesaian

tesis ini. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Herry Cahyana, selaku pembimbing I penelitian yang telah banyak

membantu dan memberikan bimbingan serta arahan sehingga tesis ini

dapat diselesaikan dengan baik.

2. Dr. Widajanti Wibowo, selaku pembimbing II penelitian yang telah

banyak membantu dan membimbing dalam penyelesaian tesis ini.

3. Dr. Emil Budianto, selaku pembimbing akademis yang telah banyak

memberikan bimbingan selama penulis menjalani masa pendidikan di

Universitas Indonesia.

4. Dr. Endang Saepudin, selaku ketua Program Studi Magister Ilmu Kimia,

Program Pasca Sarjana Universitas Indonesia.

5. Seluruh Bapak Ibu dosen mata kuliah pada Program Studi Magister Ilmu

Kimia yang telah banyak memberikan ilmu yang sangat menunjang dalam

memahami penelitian ini dan sebagai sumber informasi dalam penulisan

tesis.

6. Bapak Jaswanto, dari Pusat Laboratorium Forensik Maber Polri atas waktu

dan bimbingannya dalam penelitian tugas akhir.

7. Ayahanda tercinta di surga, ibunda terkasih, kakak, dan adikku yang telah

memberikan doa, semangat dan dukungan moril yang tiada terkira selama

penelitian ini.


v

8. Teman-teman mahasiswa S2 atas bantuan, dan dorongan semangatnya.

9. Semua orang tercinta yang banyak memberikan dukungan dan doa kepada

penulis.

Tesis ini khusus penulis persembahkan kepada Almarhum Ayahanda Heri

Suparto, yang telah memberikan kasih sayang yang tulus dan semua itu menjadi

motivasi untuk penulis dalam menyelesaikan pendidikan di Universitas Indonesia.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Saran dan

kritik sangat penulis harapkan. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan

sumbangan yang bermanfaat bagi kita semua.

Depok, 22 Juni 2012

Penulis



vii

ABSTRAK

Nama : Heroniaty

Program Studi : Magister Sains Ilmu Kimia

Judul : Sintesis Senyawa Dimer Katekin dari Ekstrak Teh Hijau

Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase dari

Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.)

Penelitian ini bertujuan untuk meneliti aktivitas peroksidase yang berasal

dari kulit bawang bombay (Allium cepa L) untuk dapat melakukan reaksi

dimerisasi oksidatif dengan menggunakan substrat senyawa katekin dari ekstrak

teh hijau.

Sintesis senyawa dimer katekin yang dikatalis oleh peroksidase (EC

1.11.1.7) dari kulit bawang bombay, telah dilakukan dan menghasilkan suatu

senyawa baru. Aktivitas peroksidase optimum terjadi pada pH 5 dan suhu 300C.

Peroksidase merupakan enzim kelompok oksidoreduktase yang dapat mentransfer

atom H dari senyawa fenolik sehingga menghasilkan radikal fenoksi. Dua radikal

fenoksi yang bergabung melalui reaksi kopling oksidatif, menghasilkan senyawa

dimer. Senyawa yang terbentuk diidentifikasikan dengan instrumen GC-MS. Pada

radikal fenolik katekin, terjadi kopling pada posisi C-4’ dan C-8” yang

membentuk senyawa 4’- 8” dikatekin. Senyawa hasil reaksi dan substrat asalnya

dibandingkan aktifitas antioksidannya dengan menggunakan metode radical

scavenger DPPH sehingga diketahui IC50 masing-masing sebesar katekin : dimer

katekin = 60,248 : 58,928.

Kata kunci: Peroksidase, Katekin, Reaksi Kopling Oksidatif, Aktivitas

Antioksidan


viii

ABSTRACT

Name : Heroniaty

Study Program : Magister of Chemistry Science

Title : Synthesis of Catechin Dimer from Green Tea Extract

using Peroxidase as Catalist from Onion (Allium cepa

L.)

This study, aims to examine the activity of peroxidase from skin of onion

(Allium cepa L) to be able to perform oxidative dimerization reaction with the

substrate catechin compounds from green tea extract.

Synthesis of catechin dimer which catalized by peroxidase (EC 1.11.1.7)

from onion skins have been carried out and produce a compound of reaction.

Optimum activity of peroxidase occurs at pH 5 and temperature 300C. Peroxidase

is an oxidoreductase group that can transfer hidrogen from phenolic compound to

produce phenoxy radicals. Two phenoxy radicals are joined through the oxidative

coupling reaction, resulting a dimer compound. Compound formed were

identified by GCMS instrument. In a catechin phenolic radical, coupling occurs at

position C-4 'and C-8 "which form the compound 4'-8" dicatechin. Compounds of

reaction and native substrate were identified antioxidant activity by using DPPH

radical scavenger that is known IC50 respectively by catechins: catechin dimer =

60.248: 58.928.

Keywords: peroxidase, catechin, oxidative coupling reaction, antioxidant

activity


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................. i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS..................................... ii

LEMBAR PEGESAHAN ......................................................................... iii

KATA PENGANTAR ............................................................................... iv

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .............. vi

ABSTRAK ................................................................................................. vii

DAFTAR ISI .............................................................................................. ix

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xi

DAFTAR TABEL...................................................................................... xiii

BAB I: PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ................................................................................ 1

1.2 Perumusan Masalah .......................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 2

1.4 Hipotesis ........................................................................................... 3

1.5 Ruang Lingkup ................................................................................. 3

1.6 Manfaat Penelitian ............................................................................ 3

1.7 Batasan Penelitian ............................................................................ 4

BAB II: TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teh ................................................................................................... 5

2.2 Macam-Macam Teh ........................................................................ 5

2.3 Komponen Teh ................................................................................ 8

2.4 Antioksidaan Pada Teh Hijau ......................................................... 9

2.5 Katekin ............................................................................................ 10

2.6 Bawang Bombay ............................................................................. 12

2.7 Kandungan Bawang Bombay .......................................................... 13

2.2 Peroksidase ...................................................................................... 15

2.3 Reaksi Kopling Oksidatif ................................................................ 19

2.4 Antioksidan ..................................................................................... 22

BAB III: METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan bahan ................................................................................. 24

3.1.1 Alat yang digunakan ............................................................ 24

3.1.2 Bahan yang digunakan ........................................................ 24

3.2 Metode Kerja ................................................................................... 24

3.2.1 Preparasi Larutan ................................................................. 24

3.2.2 Isolasi Enzim Peroksidase dari Kulit Bawang

Bombay ................................................................................ 26 3.2.3 Pemurnian Enzim Peroksidase dengan Ammonium

Sulfat .................................................................................... 27

3.2.4 Karakterisasi Enzim Peroksidase ........................................ 28


x

3.2.5 Penentuan Aktivitas Peroksidase ......................................... 28

3.2.6 Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode

Lowry .................................................................................. 29

3.2.7 Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim

Peroksidase .......................................................................... 30

3.2.8 Uji KLT dan Pemisahan Komponen Hasil Reaksi .............. 31

3.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH .............. 31

BAB IV: HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidase ...................................... 33

4.2 Karakterisasi Enzim Peroksidase .................................................... 35

4.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein ......................... 36

4.4 Sintesis Senyawa Dimer Katekin .................................................... 39

4.5 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Menggunakan DPPH ................ 49

BAB V: KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 54

5.2 Saran ................................................................................................ 54

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 55


xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Komponen Teh .................................................................. 8

Gambar 2.2 Struktur Katekin ................................................................ 11

Gambar 2.3 Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang

Mengandung Heme ........................................................... 18

Gambar 2.4 Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik ..................................... 19

Gambar 2.5 Resonansi radikal senyawa katekin ................................... 20

Gambar 2.6 Kemungkinan Dimer katekin yang Terbentuk .................. 21

Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil

pemurnian (b) .................................................................... 34

Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan

grafik penentuan suhu optimum (bawah) ......................... 35

Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina ............................................... 36

Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b) .......................... 38

Gambar 4.5 Kurva Larutan Standar BSA ............................................. 38

Gambar 4.6 Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin

dengan enzim peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil

reaksi (b)............................................................................ 39

Gambar 4.7 KLT senyawa katekin (a) dan KLT senyawa hasil

reaksi (b)............................................................................ 40

Gambar 4.8 Instrumen GCMS Mabes Polri .......................................... 41

Gambar 4.9 Kromatogram GC senyawa katekin .................................. 42

Gambar 4.10 Spektrum massa senyawa dimer dari katekin ................... 43

Gambar 4.11 Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi .......................... 43

Gambar 4.12 Kromatogram GC senyawa hasil reaksi ............................ 44


xii

Gambar 4.13 Spektrum Massa hasil reaksi ............................................. 45

Gambar 4.14 Struktur 4’-8” Dikatekin ................................................... 46

Gambar 4.15 Pola Fragmentasi senyawa hasil reaksi. ............................ 47

Gambar 4.16 Pembentukan Radikal Katekin .......................................... 48

Gambar 4.17 Struktur dimer katekin ...................................................... 48

Gambar 4.18 Reaksi antioksidan dengan DPPH ..................................... 49

Gambar 4.19 Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol,

(b) senyawa katekin, (d) senyawa hasil reaksi .................. 50

Gambar 4.20 Perubahan warna larutan pada reaksi radikal

DPPH dengan antioksidan ................................................ 50

Gambar 4.21 Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin .............................. 51

Gambar 4.22 Grafik Aktivitas Antioksidan Dimer Katekin .................. 51

Gambar 4.23 Grafik % inhibisi Katekin ................................................. 52

Gambar 4.24 % inhibisi Dimer Katekin ................................................. 52

Gambar 4.25 Nilai IC50 antara monomer dimer katekin (1) dan

katekin (2) ......................................................................... 52

Gambar 4.25 Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus

hidroksil............................................................................. 53


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Struktur Komponen Penyusun Teh ........................................ 9

Tabel 2.2 Komposisi Bermaca-Macam Katekin Pada Teh Hijau ......... 11

Tabel 2.3 Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin ..................... 12

Tabel 2.4 Kandungan Nutrisi Bawang Bombay .................................... 14

Tabel 2.5 Klasifikasi Enzim ................................................................... 16

Tabel 2.6 Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama

Enzim ..................................................................................... 17

Table 4.1 Aktivitas enzim peroksidase fraksi III ................................... 39

Tabel 4.2 Hasil Analisis GC-MS Katekin .............................................. 42

Tabel 4.3 Penbandingan antara spektrum massa hasil sintesis

senyawa dimer katekin dengan hasil penelitian Angelyne

Benavides dan Paolo Montoro ............................................... 45


1 Universitas Indonesia

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Satu dari sekian banyak hasil riset kesehatan yang paling menarik

sekarang ini adalah bidang nutrien antioksidan. Berbagai perbincangan mengenai

antioksidan, mau tidak mau harus menyertakan penjelasan mengenai oksidan

termasuk didalamnya adalah radikal bebas. Radikal bebas acapkali dijumpai

dalam bentuk oksigen yang reaktif. Molekul yang sangat reaktif ini, jika tidak

dikendalikan dapat merusak tubuh dan berperan terhadap timbulnya berbagai

penyakit.

Secara sederhana antioksidan dinyatakan sebagai senyawa yang mampu

menghambat atau mencegah terjadinya oksidasi. Antioksidan memiliki

kemampuan dalam memberikan elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi

berantai radikal bebas yang mematikan. Antioksidan yang dipakai kemudian

didaur ulang oleh antioksidan lain untuk mencegahnya menjadi radikal bebas

(bagi dirinya sendiri) atau tetap dalam bentuk tersebut tetapi dengan struktur yang

tidak dapat merusak molekul lainnya. Salah satu antioksidan yang kini tengah

mendapat perhatian yang sangat luas dalam berbagai penelitian adalah senyawa

katekin dalam teh hijau.

Berbagai penelitian memberikan bukti–bukti bahwa senyawa katekin yang

banyak terdapat pada teh hijau bermanfaat dalam meningkatkan sistem imun. Teh

hijau yang diminum secara teratur dalam kurun waktu tertentu dapat

meningkatkan sistem imun tubuh dengan meningkatkan ketahanan limfosit dan

respon proliferasi limfosit, daya fagositosis, dan sekresi IL-12 makrofag yang

kemudian menyebabkan meningkatnya sekresi interferon-γ yang akan

mengaktifkan makrofag sehingga makrofag dapat membunuh kuman penyebab

penyakit.

Hasil ini bisa dilihat dari banyaknya gugus hidroksi (OH) yang dimiliki

senyawa katekin. Gugus hidroksi ini dapat berfungsi sebagai antiradikal bebas


2

Universitas Indonesia

atau antioksidan. Semakin banyak gugus hidroksi suatu senyawa, maka

kemampuannya sebagai senyawa antioksidan semakin baik.

Efektivitas senyawa katekin sebagai antioksidan dapat ditingkatkan

melalui proses dimerisasi oksidatif. Dimerisasi oksidatif dari beberapa senyawa

fenolik banyak terjadi di alam dan mengarah pada pembentukan produk dimer,

dimana proses biotransformasinya sendiri dikatalisis oleh enzim, yaitu enzim

peroksidase. Enzim peroksidase dapat membentuk pertahanan terhadap oksidan

atau radikal bebas di dalam tubuh dan mencegah kerusakan sel dengan cara

mengkatalisa peroksida menjadi air dan oksigen. Karena kemampuannya inilah

maka enzim ini disebut sebagai antioksidan.

Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan

bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase

yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi

juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam

penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah

sebagai sumber dari enzim peroksidase untuk mengkatalisis reaksi dimerisasi

senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.

1.2 Perumusan Masalah

Penggunaan senyawa fenolik saat ini yang cukup besar dalam bidang

industri membuat banyak penelitian yang ditujukan untuk mensintesis senyawa

fenolik. Proses sintesis senyawa fenolik ini dilakukan dengan menggunakan reaksi

kopling oksidatif dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari ekstrak

bawang bombay. Pada penelitian perumusan masalah yang dapat diambil dalam

penelitian ini adalah sintesis senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis

enzim peroksidase yang berasal dari kulit bawang bombay dan meneliti aktivitas

antioksidannya dari senyawa dimer katekin yang dihasilkan.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Mengisolasi enzim peroksidase dari bawang bombay yang akan digunakan

sebagai katalis dalam reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak teh hijau.


3


2. Mengkarakterisasi enzim peroksidase yang diisolasi dari kulit bawang bombay

3. Mensintesis senyawa dimer katekin dari ekstrak teh hijau dengan

menggunakan enzim peroksidase dari bawang bombay.

4. Mengetahui aktivitas antioksidan dari senyawa dimer katekin.

1.4 Hipotesis

Hipotesis dari penelitian ini adalah dapat dibuat senyawa dimer katekin

dari ekstrak teh hijau dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari kulit

bawang bombay dan terdapat aktivitas antioksidan dari senyawa dimer yang

dihasilkan tersebut.

1.5 Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan senyawa dimer katekin dari

ekstrak teh hijau dengan menggunakan bantuan enzim peroksidase yang berasal

dari kulit bawang bombay. Dan setelah senyawa dimer katekin terbentuk,

senyawa dimer tersebut akan diteliti aktivitas antioksidannya dengan

menggunakan metode radical scavenger DPPH. Dimerisasi dari senyawa katekin

dengan bantuan enzim peroksidase ini dilakukan melalui reaksi kopling oksidatif.

Pada reaksi kopling oksidatif, enzim peroksidase akan mengoksidasi senyawa

katekin yang menyebabkan terbentuknya senyawa radikal katekin. Senyawa

radikal ini dapat beresonansi dengan posisi orto atau para pada cincin aromatiknya

dan selanjutnya akan bergabung dengan radikal yang lain membentuk senyawa

dimer baru.

1.6 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi dunia ilmu

pengetahuan, khususnya mengenai reaksi dimerisasi senyawa katekin dari ekstrak

daun teh hijau dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit bawang

bombay dan senyawa ini memiliki aktivitas antioksidan yang dapat bermanfaat

bagi kepentingan manusia.


4


1.7 Batasan Penelitian

Penelitian ini terbatas pada studi pengaruh kondisi reaksi (temperatur dan

pH) terhadap mekanisme pembentukan dimer katekin dan menyimpulkan

mekanisme reaksinya dan juga efek antioksidannya.



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teh

Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh

yaitu sinensis, assamica, irrawadiensiesis. Menurut Graham HN (1984); Van

Steenis CGGJ (1987) dan Tjitrosoepomo (1989), tanaman teh Camellia sinensis

diklasifikasikan sebagai berikut (Tuminah, 2004).

Divisi : Spermatophyte (tumbuhan biji)

Sub divisi : Angiospermae (tumbuhan biji terbuka)

Kelas : Dicotylydoneae (tumbuhan biji belah)

Sub Kelas : Dialypetalae

Ordo (bangsa) : Guttiferales (Clusiales)

Famili (suku) : Camelliaceae (Tehaceae)

Genus (marga) : Camellia

Spesies (Jenis) : Camellia sinensis

2.2 Macam-Macam Teh

Teh dikelompokan berdasarkan cara pengolahan. Daun teh Camellia

sinensis segera layu dan mengalami oksidasi kalau tidak segera dikeringkan

setelah dipetik. Proses pengeringan membuat daun menjadi berwarna gelap,


6


karena terjadi pemecahan klorofil dan terlepasnya unsur tanin. Proses selanjutnya

berupa pemanasan basah dengan uap panas agar kandungan air pada daun

menguap dan proses oksidasi bisa dihentikan pada tahap yang sudah ditentukan.

Pengolahan daun teh sering disebut sebagai "fermentasi" walaupun

sebenarnya penggunaan istilah ini tidak tepat. Pemrosesan teh tidak menggunakan

ragi dan tidak ada etanol yang dihasilkan seperti layaknya proses fermentasi yang

sebenarnya. Pengolahan teh yang tidak benar memang bisa menyebabkan teh

ditumbuhi jamur yang mengakibatkan terjadinya proses fermentasi. Teh yang

sudah mengalami fermentasi dengan jamur harus dibuang, karena mengandung

unsur racun dan unsur bersifat karsinogenik.

Pengelompokan teh berdasarkan tingkat oksidasi:

Teh putih

Teh yang dibuat dari pucuk daun yang tidak mengalami proses oksidasi dan

sewaktu belum dipetik dilindungi dari sinar matahari untuk menghalangi

pembentukan klorofil. Teh putih diproduksi dalam jumlah lebih sedikit

dibandingkan teh jenis lain sehingga harga menjadi lebih mahal. Teh putih

kurang terkenal di luar Tiongkok, walaupun secara perlahan-lahan teh putih

dalam kemasan teh celup juga mulai populer.

Teh hijau

Daun teh yang dijadikan teh hijau biasanya langsung diproses setelah dipetik.

Setelah daun mengalami oksidasi dalam jumlah minimal, proses oksidasi

dihentikan dengan pemanasan (cara tradisional Jepang dengan menggunakan

uap atau cara tradisional Tiongkok dengan menggongseng di atas wajan

panas). Teh yang sudah dikeringkan bisa dijual dalam bentuk lembaran daun

teh atau digulung rapat berbentuk seperti bola-bola kecil (teh yang disebut

gun powder).

Oolong

Proses oksidasi dihentikan di tengah-tengah antara teh hijau dan teh hitam

yang biasanya memakan waktu 2-3 hari.

Teh hitam atau teh merah

Daun teh dibiarkan teroksidasi secara penuh sekitar 2 minggu hingga 1 bulan.

Teh hitam merupakan jenis teh yang paling umum di Asia Selatan (India, Sri


7


Langka, Bangladesh) dan sebagian besar negara-negara di Afrika seperti:

Kenya, Burundi, Rwanda, Malawi dan Zimbabwe. Terjemahan harafiah dari

aksara hanzi untuk teh bahasa Tionghoa (红茶) atau (紅茶) dalam bahasa

Jepang adalah "teh merah" karena air teh sebenarnya berwarna merah. Orang

Barat menyebutnya sebagai "teh hitam" karena daun teh berwarna hitam. Di

Afrika Selatan, "teh merah" adalah sebutan untuk teh rooibos yang termasuk

golongan teh herbal. Teh hitam masih dibagi menjadi 2 jenis: Ortodoks (teh

diolah dengan metode pengolahan tradisional) atau CTC (metode produksi

teh Crush, Tear, Curl yang berkembang sejak tahun 1932). Teh hitam yang

belum diramu (unblended) dikelompokkan berdasarkan asal perkebunan,

tahun produksi, dan periode pemetikan (awal musim semi, pemetikan kedua,

atau musim gugur). Teh jenis Ortodoks dan CTS masih dibagi-bagi lagi

menurut kualitas daun pasca produksi sesuai standar Orange Pekoe.

Pu-erh (Póu léi dalam bahasa Kantonis)

Teh pu-erh terdiri dari dua jenis: "mentah" dan "matang." Teh pu-erh yang

masih "mentah" bisa langsung digunakan untuk dibuat teh atau disimpan

beberapa waktu hingga "matang". Selama penyimpanan, teh pu-erh

mengalami oksidasi mikrobiologi tahap kedua. Teh pu-erh "matang" dibuat

dari daun teh yang mengalami oksidasi secara artifisial supaya menyerupai

rasa teh pu-erh "mentah" yang telah lama disimpan dan mengalami proses

penuaan alami. Teh pu-erh "matang" dibuat dengan mengontrol kelembaban

dan temperatur daun teh mirip dengan proses pengomposan. Teh pu-erh

biasanya dijual dalam bentuk padat setelah dipres menjadi seperti batu bata,

piring kecil atau mangkuk. Teh pu-erh dipres agar proses oksidasi tahap

kedua bisa berjalan, karena teh pu-erh yang tidak dipres tidak akan

mengalami proses pematangan. Semakin lama disimpan, aroma teh pu-erh

menjadi semakin enak. Teh pu-erh yang masih "mentah" kadang-kadang

disimpan sampai 30 tahun bahkan 50 tahun supaya matang. Pakar bidang teh

dan penggemar teh belum menemui kesepakatan soal lama penyimpanan

yang dianggap optimal. Penyimpanan selama 10 hingga 15 tahun sering

dianggap cukup, walaupun teh pu-erh bisa saja diminum setelah disimpan

kurang dari setahun. Minuman teh pu-erh dibuat dengan merebus daun teh


8


pu-erh di dalam air mendidih seringkali hingga lima menit. Orang Tibet

mempunyai kebiasaan minum teh pu-erh yang dicampur dengan mentega dari

lemak yak, gula dan garam.

2.3 Komponen Teh

Teh mengandung komponen volatile sebanyak 404 macam dalam teh

hitam dan sekitar 230 macam dalam teh hijau. Komponen volatile tersebut

berperan dalam memberikan cita rasa yang khas pada teh. Komponen aktif yang

terkandung dalam teh, baik yang volatile maupun yang nonvolatile. Seperti yang

terlihat pada gambar diata ini, komponen teh terdiri dari polifenol (termasuk

katekin), kafein, asam amino, vitamin, flavonoid, polisakarida dan florin.

Polifenol dan kafein merupakan komponen yang paling penting dari teh.

Gambar 2.1. Komponen teh


9


Tabel 2.1. Beberapa Struktur Komponen Teh

Komponen

Penyusun Teh Rumus Struktur Komponen Teh

1. Katekin

2. Kafein

3. Theanine

4. Saponin

2.4 Antioksidan Pada Teh Hijau

Salah satu zat antioksidan non nutrien yang terkandung dalam teh, yaitu

katekin dapat menyimpan atau meningkatkan asam askorbat pada beberapa proses

metabolisme. Studi epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi teh hijau


10


berbanding terbalik dengan kadar serum kolesterol total (TC) dan low density

lipoprotein (LDL-C), tetapi tidak terhadap trigliserida (TG) dan high density

lipoprotein (HDL-C).

Antioksidan digunakan untuk mencegah kerusakan tingkat seluler yang

akan mengakibatkan penyakit tertentu, khususnya kanker. Antioksidan dalam

makanan juga digunakan untuk mencegah terjadinya proses oksidasi, seperti pada

lemak.

Potensi antioksidan dari polifenol teh hijau khususnya senyawa katekin

secara langsung berhubungan dengan kombinasi cincin aromatis dan kelompok

hidroksil yang membangun struktur katekin dan sebagai hasilnya adalah mengikat

dan menetralkan radikal bebas oleh grup hidroksil. Sebagai tambahan, polifenol

teh hijau mendorong aktivitas detoksifikasi komponen xenobiotika, dan juga dapat

mengikat (kelator) ion logam seperti besi yang mana dapat mengakibatkan radikal

bebas oksigen (Anonymous, 2000 dalam skripsi Imannulkhan, 2006).

Menurut Ong dan Pocker (1992) dalam skripsi Imanulkhan (2006)

menyatakan bahwa cara kerja flavonoid sebagai antioksidan sebagai berikut:

1. Sebagai “Scavenger” radikal bebas yang terbentuk baik selama

persiapan bahan pangan atau radikal bebas yang dihasilkan proses

metabolik tertentu di dalam substrat.

2. Sebagai kelator, flavonoid dapat membentuk kompleks dengan logam

transisi seperti tembaga, dan mencegah kerusakan asam askorbat

dengan besi sehingga dapat mencegah reaksi inisiasi radikal bebas.

3. Mencegah peroksida lemak melalui cara mengkombinasikan sifat

kelator dan sifat antioksidan flavonol. “Quercetin” ditemukan efektif

mengahambat ion besi.

2.5 Katekin

Kunci utama dari khasiat teh pada komponen bioaktifnya, yaitu polifenol

yang secara optimal terkandung dalam daun teh yang masih muda dan utuh.

Katekin merupakan senyawa polifenol utama pada teh sebesar 90% dari total

kandungan polifenol (Anonymous, 2007).


11


Katekin adalah senyawa dominan dari polifenol teh hijau yang merupakan

senyawa larut dalam air, tidak berwarna dan memberikan rasa pahit (Alamsyah,

2006). Katekin merupakan kerabat tanin terkondensasi yang juga sering disebut

polifenol karena banyaknya gugus fungsi hidroksil yang dimilikinya. Katekin teh

hijau tersusun sebagian besar atas senyawa-senyawa katekin (C), epikatekin (EC),

galokatekin (GC), epigalokatekin (EGC), epikatekin galat (ECG), dan

epigalokatekin galat (EGCG). Perbedaan dari beberapa jenis katekin dilihat dari

jumlah gugus hidroksilnya (Robinson, 1995).

Tabel 2.2. Komposisi Bermacam-Macam Katekin Pada Daun Teh Hijau

No Komponen Kadar (%)

1 Katekin 1-2

2 Epikatekin 1-3

3 Epikatekin galat 3-6

4 Gallokatekin 1-3

5 Epigallokatekin 3-6

6 Epigallokatekin galat 7-13

Konsentrasi katekin sangat tergantung pada umur daun. Pucuk dan daun

pertama paling kaya katekin galat. Kadar katekin bervariasi tergantung pada

varietas tanaman tehnya. Sifat-sifat kimia dan fisik pucuk daun teh akan

mempengaruhi perubahan katekin dalam pucuk daun tehnya.

Gambar 2.2. Struktur Katekin

Katekin bersifat asam lemah (pKa1=7,72 dan pKa2=10,22). Sukar larut

dalam air dan sangat tidak stabil diudara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada

pH mendekati netral (pH 6,9). Katekin juga mudah terurai oleh cahaya dengan

laju reaksi lebih besar pada pH rendah (3,45) dibanding pH 4,9 (Lucida, 2006).


12


Sifat fisikokimianya menjadi tantangan tersendiri dalam formulasi katekin sebagai

bahan alam.

Katekin biasanya disebut juga asam catechoat dengan rumus kimia

C15H14O6, tidak berwarna, dan dalam keadaan murni sedikit tidak larut dalam air

dingin tetapi sangat larut dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil asetat,

hampir tidak larut dalam kloroform, benzen dan eter. Selain itu, Katekin

berbentuk kristal halus menyerupai jarum, larut dalam air mendidih dan alkohol

dingin. Katekin dalam larutan asam asetat akan membentuk larutan yang bening,

tetapi jika direaksikan dengan besi klorida (FeCl3) akan membentuk cairan

berwarna hijau. Katekin merupakan senyawa fenolik yang komplek (polifenol).

Katekin memiliki dua atom karbon yang simetris yang membuatnya

memiliki 4 isomer, yaitu (+) katekin, (-) katekin, (+) epikatekin dan (-) epikatekin.

(+) katekin dan (-) epikatekin paling banyak terdapat di alam. Katekin dan

epikatekin memiliki tiga jenis turunannya, yaitu katekin galat, galokatekin,

galokatekin galat, epikatekin galat dan epigalokatekin galat.

Tabel 2.3. Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin

Sifat Fisika Sifat Kimia

Warna: putih

Melting point: 104-106 ºC

Boiling point: 254 ºC

Tekanan uap: 1 mm Hg pada 75 ºC

Densitas uap:3,8 g/m3

Flash point: 137 ºC

Eksplosion limit:1,79 %

Sensitif terhadap oksigen

Sensitif terhadap cahaya (dapat

mengalami perubahan warna

apabila mengalami kontak

langsung dengan udara terbuka)

Substansi yang dihindari: unsur

oksidasi, asam klorida, asam

anhidrida, basa, dan asam nitrit.

Larut dalam air hangat

Stabil dalam kondisi agak asam

atau netral ( pH optimum 4-8)

Sumber: Anonim, 2001, Micheal dan Irene, 1997 dan Alamsyah, 2006.

2.6 Bawang Bombay

Istilah bawang bombay berasal ketika komoditas ini pertama kali dibawa

oleh pedagang-pedagang dari kota Bombay (sekarang disebut Mumbay), India, ke

Indonesia. Bawang bombay (Allium cepa L.) termasuk herba biennial yang


13


dibudidayakan sebagai tanaman annual (semusim), kecuali untuk produksi benih.

Bawang bombay adalah sejenis bawang yang biasa digunakan dalam memasak

makanan di Indonesia, tidak hanya digunakan sebagai hiasan tapi juga bagian dari

masakan karena bentuknya yang besar dan tebal dagingnya. Klasifikasi bawang

bombay adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil)

Sub Kelas : Liliidae

Ordo : Liliales

Famili : Liliaceae (suku bawang-bawangan)

Genus : Allium

Spesies : Allium cepa L.

Bawang bombay atau bawang timur berada dalam satu garis keturunan

dengan bawang merah (Allium cepa L). Perbedaannya tidak terlalu menyolok,

kecuali bentuk dan bau atau aromanya. Ia memiliki umbi yang berlapis, yang

terbentuk dari pangkal daun / lapisan-lapisan yang membesar dan bersatu dan

selanjutnya membentuk batang yang berubah bentuk dan fungsi, membesar, dan

menjadi umbi berlapis. Tanamannya sendiri memiliki akar serabut dengan daun

berbentuk silinder berrongga.

2.7 Kandungan Nutrisi Bawang Bombay

Di dalam bawang bombay terdapat kandungan allicin, asam amino,

kalsium, mangan, sodium, sulfur, vitamin C, vitamin E, minyak asiri, quercitin,


14


dan curcumin Berdasarkan penelitian, bahan-bahan yang dikandung oleh bawang

bombay memiliki manfaat untuk menekan kadar kolesterol dalam darah,

meningkatkan jumlah HDL (kolesterol baik) hingga 30%, memperbaiki

penyempitan pembuluh darah dan hipertensi, meredakan pilek, meredakan sakit

perut, menurunkan kadar gula dalam darah, mencegah kanker, mencegah

pemecahan insulin di hati, merangsang produksi insulin oleh pankreas, dan

menekan serangan osteoporosis.

Zat utama dalam bawang Bombai, alicin, memberikan manfaat untuk

menstabilkan tekanan darah, mengontrol gula darah, sebagai anti kolesterol dan

anti peradangan. Yang dimaksud peradangan ini adalah suatu reaksi dari tubuh

yang berlebihan karena rangsangan dari luar. Berikut ini disajikan tabel

kandungan nutrisi dari bawang bombay.

Tabel 2.4. Kandungan Nutrisi Bawang Bombay (dalam 100 g bawang bombay)

Komponen Gizi Jumlah Komponen Gizi Jumlah

Air 89,11 g Tembaga 0,039 mg

Energi 40 kcal Mangan 1,129 mg

Protein 1,1 g Fluor 1,1 mg

Lemak 0,10 g Selenium 0,15 g

Abu 0,35 g Vitamin C 7,4 mg

Karbohidrat 7,34 g Vitamin B1 0,046 mg

Serat 1,7 mg Vitamin B2 0,116 mg

Gula Total 4,24 g Vitamin B3 0,123 mg

Kalsium 23 mg Vitamin B5 0,126 mg

Zat Besi 0,21 mg Vitamin B6 0,120 mg

Magnesium 10 mg Folat 19 mg

Fosfor 29 mg Choline 6,1 mg

Kalium 146 mg Vitamin E 0,02 mg

Natrium 4 mg Vitamin K 0,4 mg

Seng 0,17 mg

Sumber: Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI (1992)


15


Pemanfaatan sampah dari tanaman seperti lobak, sawi, kentang dan

bawang bombay ternyata dapat digunakan sebagai sumber enzim peroksidase

yang dapat berkontribusi tidak hanya mengurangi limbah industri makanan tetapi

juga dapat meningkatkan jumlah produk bernilai tinggi. Oleh karena itu, dalam

penelitian ini digunakan bagian dari kulit bawang bombay yang dianggap sampah

sebagai sumber dari enzim peroksidase.

2.8 Peroksidase

Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh

sel.Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme

dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka

reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan sel juga terganggu.

Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat memperoleh

makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel,

memperoleh energi Kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan,

pergerakan, dan lain-lain.Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul

substrat untuk menghasilkan senyawa intermediat melalui suatu reaksi kimia

organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan

reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi

membutuhkan waktu lebih lama.

Meskipun senyawa katalis dapat berubah pada reaksi awal, pada reaksi

akhir molekul katalis akan kembali ke bentuk semula. Sebagian besar enzim

bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu

macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur

kimia tiap enzim yang bersifat tetap.

Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama

adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan

suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim

adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman

berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja

secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan


16


menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga

dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan

aktivitas enzim, sedangkan aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim.

Banyak obat dan racun adalah inihibitor enzim.

Penamaan enzim secara trivial, yaitu secara non –sistematik misalnya

pepsin, tripsin, katalase tidak menerangkan sifat dan macam reaksi yang terjadi.

Penamaan dan klasifikasi enzim secara sistematik telah ditentukan oleh suatu

badan internasional bernama : Commission on Enzim of the international union of

Biochemistry (CEIUB). Dalam sistim yang baru ini enzim dibagi menjadi sub

bagian. Dalam beberapa hal tertentu, penanaman trivial masih dipakai, yaitu bila

nama sistematiknya terlalu panjang.

Klasifikasi enzim CEIUB meliputi nama golongan, nomor kode dan cara

reaksi yang dikatalisernya dan tiap golongan utama terbagi menjadi kelompok–

kelompok enzim berdasarkan gugus substrat yang diserangnya. Sistim CEIUB

atau International Enzym Commision (IEC) adalah sebagai berikut.

Tabel 2.5. Klasifikasi Enzim


17


Tabel 2.6. Rangkuman Kelompok dan Sub Kelompok Utama Enzim

Peroksidase (EC 1.11.1.7) merupakan salah satu enzim yang tahan panas.

Jenis reaksi yang dikatalis oleh peroksidase melibatkan hidrogen peroksida

sebagai penerima, dan senyawa AH2 sebagai donor atom hidrogen, seperti

ditunjukkan berikut ini:

Pada reaksi ini tidak ada oksigen molekul yang terbentuk. Kerja

peroksidase dalam sayuran berguna untuk pendeteksian keefektifan pemutihan,

sedangkan enzim tersebut dapat juga merusak sayuran sehingga mengakibatkan

bau rasa yang menyimpang. Selain itu juga berguna dalam penentuan glukosa

dalam suatu bahan pangan yang dikombinasikan dengan glukosa peroksidase.

Kerja peroksidase dalam buah yaitu mengakibatkan terjadinya pencoklatan.

Dalam buah terdapat peroksidase, itu sebabnya buah dan sayur yang dikupas atau

dipotong akan berwarna kecoklatan jika didiamkan begitu saja.

Dari hasil penelitian diketahui bahwa peroksidase memiliki peranan dalam

proses lignifikasi, cross linking struktur protein pada dinding sel, katabolisme

auksin, dan pertahanan diri terhadap pathogen.

Peroksidase pada tumbuhan mengandung dua ion kalsium (Ca2+

) yang

sangat penting untuk stabilitas struktural dan stabilitas termal dari enzim agar


18


sama seperti aktivitas in vitro ketika dianalisis (Manu and Prasada Rao, 2009).

Peroksidase secara luas digunakan pada laboratorium kesehatan dan industri

sebagai aplikasi untuk konservasi lingkungan.

Peroksidase merupakan enzim yang mengandung kofaktor “heme” pada

sisi aktifnya, yang dapat mengkatalisis reaksi oksidasi dari berbagai senyawa

organik maupun anorganik dengan adanya H2O2 sebagai akseptor elektron.

Gambar 2.3. Siklus Katalitik Enzim Peroksidase yang Mengandung Heme

Siklus katalitik dimulai dari bentuk Fe3+

. Molekul H2O2 berikatan

koordinasi dengan ion Fe3+

dan sudut histidine menjadi perantara transfer proton

sehingga kedua atom H ditempatkan pada atom O. Polarisasi ikatan secara

serempak oleh rantai samping guanidinium menghasilkan pemutusan heterolitik

ikatan O-O. Sebagian membentuk H2O dan sisanya terikat dengan Fe

menghasilkan intermediet dengan bilangan oksidasi tinggi.

Beberapa peroksidase seperti Horse Raddish Peroxidase (HRP)

mengalami keadaan inaktivasi permanen ketika H2O2 hadir secara berlebihan atau

ketika produk akhir polimer berada pada sisi aktifnya yang menyebabkan


19


inaktivasi permanen yang disebabkan perubahan pada konfigurasi geometrisnya

(Villalobos and Buchanan, 2002).

2.3 Reaksi Kopling Oksidatif

Reaksi kopling oksidatif adalah suatu reaksi penggabungan antara dua

molekul fenol atau lebih melalui proses reaksi oksidasi. Penggabungan dari dua

residu fenolat, dapat terjadi secara inetr dan intra molekuler dari dua radikal yang

dibentuk melalui oksidasi elektron tunggal pada masing-masing senyawa fenol.

Reaksi yang dikatalisis oleh peroksidase dengan adanya H2O2,

menghasilkan produk radikal, dimana radikal tersebut akan mengalami

penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal. Oleh karena itu,

enzim peroksidase sering kali digunakan sebagai katalis pada reaksi polimerisasi

dan reaksi kopling pada senyawa fenolik.

Ikatan eter C-C linkage C-C linkage

Gambar 2.4. Reaksi Kopling Oksidatif Fenolik

O

OHOH

OH

OHOH


20


Hasil kopling radikal fenoksi ini dapat membentuk dimer fenol, baik pada

posisi orto-orto, para-para, maupun orto-para. Selain itu, juga terdapat

kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, O-O, dan C-C.

Reaksi yang dikatalis dengan menggunakan peroksidase dengan

menggunakan H2O2 akan menghasilkan produk radikal dimana radikal tersebut

akan mengalami penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal.

Senyawa katekin dapat mengalami proses kopling oksidatif yang sama dengan

senyawa fenolik.

Gambar 2.5. Resonansi radikal senyawa katekin


21


Dari kemungkinan resonansi radikal fenoksi katekin tersebut, maka dapat

diduga kemungkinan-kemungkinan kopling oksidatif yang dapat terbentuk antara

sesama radikal fenoksi katekin. Kemungkinan dimer yang terbentuk sebagai

berikut:

OOH

OH

OH

OH

OH

O

OH OH

OH

OH

OH

5’-8” dimer katekin

OOH

OH

OH

OH

OH

OOH

OH

OH

OH

OH

O

OH OH

OH

OH

OH

Katekin 2’-8” dimer katekin

OH

OH

O

OH

OH

OH

O OH

OHOH

OH

OH

4’-8” dimer katekin

OOH

OH

OH

OH

OH

O

OH OH

OH

OH

OH

4’-6” katekin dimer

Gambar 2.6. Kemungkinan dimer katekin yang terbentuk


22


2.4 Antioksidan

Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah

proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat

oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah.

Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi

sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan

penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor

eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki

elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam

makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat

merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat

menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit

lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa

golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak

terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan

untuk menangkap radikal bebas.

Tipe radikal bebas turunan oksigen reaktif sangat signifikan dalam tubuh.

Oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2•-), hidroksil (•OH), peroksil

(ROO•), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), oksida nitrit (NO•),

peroksinitril (ONOO•) dan asam hipoklorit (HOCl).

Sumber radikal bebas, bisa berupa sumber endogen maupun eksogen.

Sumber endogenous berasal dari hasil metabolism tubuh. Hal ini berlangsung

secara normal, dan tubuh memiliki enzim antioksidan alami yang dapat

menangkalnya. Sedangkan sumber radikal bebas eksogen berasal dari luar system

tubuh, diantaranya sinar UV dan zat kimia polutan.

Keberadaan radikal bebas yang membahayakan ini dapat ditangkal oleh

antioksidan. Antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim, vitamin, dan

senyawa-senyawa fenolik. Antioksidan vitamin lebih popular sebagai antioksidan

dibandingkan enzim. Antioksidan vitamin mencakup alfa tokoferol (vitamin E),

beta karoten dan asam askorbat (vitamin C). Sedangkan senyawa fenolik

merupakan antioksidan yang banyak terdapat pada teh, buah-buahan dan sayuran.


23


Aktivitas antioksidan fenolik tergantung pada struktur molekunya terutama gugus

OH pada cincin aromatiknya.



BAB III

METODE PENELITIAN

Penelitian ini terbagi menjadi empat tahap utama, yaitu isolasi enzim

peroksidase dari kulit bawang bombay, karakterisasi enzim peroksidase, sintesis

senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit

bawang bombay yang telah diisolasi dan uji aktivitas antioksidan dari senyawa

dimer yang terbentuk.

3.1 Alat dan bahan

3.1.1 Alat yang digunakan

Alat-alat gelas laboratorium, icebath & magnetic stirrer, sentrifuge, pH

universal, kertas saring, KLT, spektrofotometer, vortex, dan GC-MS.

3.1.2 Bahan yang digunakan

Ekstrak teh hijau sebagai sumber senyawa katekin, kulit bawang bombay

sebagai sumber enzim peroksidase, (NH4)2SO4 padat, metanol, H2O2 30%, air

bidestilasi, 4-aminoantipyrine, katekin, Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, K-Na

tartarat, glisin, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, CMC, asam sitrat, sodium nitrat,

pereaksi follin ciocalteau, bovin serum albumin (BSA), etil asetat, Na2SO4

anhidrat, HCl, FeCl3.6H2O, MgSO4, kertas kromatografi lapis tipis.

3.2 Metode Kerja

3.2.1 Preparasi Larutan

a. Pembuatan Larutan Buffer HCl pH 2

Larutan Stok A: 0,1 M larutan glisin (7,507 g glisin dilarutkan dalam 1 L

aquades)

Larutan Stok B: 0,1 M larutan HCl

Untuk membuat larutan buffer HCl pH 2 maka campurkan 50,7 mL larutan

stok A dengan 49,3 mL larutan stok B.


25


b. Pembuatan Larutan Buffer Sitrat pH 3, 4, dan 5

Larutan Stok A: 0.1 M larutan asam sitrat (21.01 gram asam sitrat dilarutkan

dalam 1 L aquades)

Larutan Stok B: 0.1 M larutan sodium sitrat atau natrium sitrat (29.41 gram

natrium sitrat atau C6H5O7Na3.2H2O dilarutkan dalam 1 L aquades)

Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 3 maka campurkan 46,3 mL larutan

stok A dengan 3,5 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan

aquades hingga 100 mL

Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 4 maka campurkan 33 mL larutan

stok A dengan 17 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan


Untuk membuat larutan buffer sitrat pH 5 maka campurkan 20,5 mL larutan



c. Pembuatan Larutan Buffer Fosfat pH 6, 7, dan 8

Larutan Stok A: 0,2 M larutan monobasic sodium phosphate atau NaH2PO4

(2,78 gram NaH2PO4 dilarutkan dalam 100 mL aquades).

Larutan Stok B: 0,1 M larutan dibasic sodium phosphate atau Na2HPO4

(5,365 gram Na2HPO4. 7H2O atau 7,17 gram Na2HPO4. 12H2O dilarutkan

dalam 100 mL aquades).

Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 6 maka campurkan 87,7 mL larutan


aquades hingga 200 mL.

Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 7 maka campurkan 39 mL larutan

stok A dengan 61 mL larutan stok B, lalu cukupkan volumenya dengan


Untuk membuat larutan buffer fosfat pH 8 maka campurkan 5,3 mL larutan




26


d. Pembuatan Larutan H2O2 mM Dalam Buffer Fosfat pH 7

Sebanyak 1 mL H2O2 30% dilarutkan dengan air bidestilasi hingga volumenya

100 mL. Sebanyak 1 mL larutan ini dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2 M pH 7

hingga volumenya mencapai 50 mL.

e. Pembuatan Larutan 4-aminoantipirin 2,5 mM Dalam Fenol 0,17 M

Melarutkan 810 mg fenol ke dalam 40 mL air bidestilasi. Ke dalam larutan

tersebut ditambahkan sebanyak 25 mg 4-aminoantipirin dan dilarutkan dengan air

bidestilasi hingga volumenya 50 mL.

f. Pembuatan Reagen Lowry

Lowry A: 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N

Lowry B: 0,25 g CuSO4.5.H2O 50 mL larutan K-Na tartrat 1%

Lowry C: Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B

Lowry D: pereaksi follin ciocalteu 1 N

g. Pembuatan Standar Bouvine Serum Albumin

Larutan standar BSA (0,0625; 0,1250; 0,2500; 0,5000; 0,7500; 1,000 mg/mL),

0,2 g bouvine serum albumin dilarutkan dala aquades hingga 100 mL, dari larutan

ini kemudian diencerkan untuk membuat larutan konsentrasi diatas.

h. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM

Sebanyak 10 g DPPH dilarutkan dalam 25 mL aquades sehingga diperoleh

konsentrasi DPPH 1mM. Lalu larutan tersebut diencerkan menjadi 0,4 mM

dengan penambahan aquades.

3.2.2 Isolasi Enzim Peroksidasi dari Kulit Bawang Bombay

Sebanyak 350 g kulit bawang bombay dihancurkan dengan blender

menggunakan larutan buffer fosfat pH 7 dalam keadaan dingin (0-50C).

Homogentat kemudian disaring dengan kain katun, filtrat yang diperoleh

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3400 rpm selama 6 menit untuk


27


memisahkan molekul enzim ekstrak kasar dari debris (serpihan sel). Supernatan

yang diperoleh dipisahkan dari endapannya.

3.2.3 Pemurnian Enzim Peroksidase Dengan Ammonium Sulfat

Ekstrak enzim kasar (supernatan) yang diperoleh dimurnikan dengan

penambahan garam (NH4)2SO4 dengan tingkat kejenuhan berturut-turut 0-30%,

30-50%, dan 50-70% (b/v).

Ammonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan dengan tingkat

kejenuhan S1-S2% dihitung dengan menggunakan rumus:

Supernatan dalam beaker glass yang dilengkapi dengan ice salt bath

ditambahkan ammonium sulfat 0-30% sedikit demi sedikit pada suhu 0-50C, lalu

diaduk selama 2 jam. Kemudian larutan dibiarkan mengendap selama 1 malam di

lemari pendingin. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada 3400 rpm selama 6

menit pada suhu ruang.

Hal yang sama juga dilakukan untuk penambahan (NH4)2SO4 30-50% dan

50-70%. Pada penambahan garam dengan kejenuhan 50-70% endapan yang

diperoleh melalui sentrifugasi kemudian ditentukan aktivitas enzim dan kadar

proteinnya.


28


Bagan 3.1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidasi dari Kulit bawang

Bombay

3.2.4 Karakterisasi Enzim Peroksidase

3.2.4.1 Penentuan pH optimum

Penentuan pH optimum enzim dilakukan dengan reaksi enzim pada

berbagai pH mulai dari 2-8 (selang 1) dengan substrat CMC dalam buffer

fosfat 0,2 M, diinkubasi pada suhu 390C selama 45 menit.

3.2.4.2 Penentuan Suhu Optimum Enzim

Penentuan suhu optimum enzim dilakukan dengan menguji

aktivitas enzim pada berbagai suhu percobaan mulai dari 10-600C (selang

100C) pada pH optimum selama 45 menit.

3.2.5 Penentuan Aktivitas Peroksidase

Substrat yang digunakan:

Endapan Filtrat

Supernatan Endapan

disaring

Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Supernatan Endapan

+ (NH4)2SO4 0-30%, Sentrifugasi 3400 rpm 6 menit

Supernatan Endapan


Supernatan Endapan


Kulit bawang bombay diblender

dengan larutan buffer fosfat pH 7


29


Larutan H2O2 0,0017 M dalam buffer K-fosfat 0,2 M pH 7,0:

Larutan 4-aminoantipyrine 0,0025 M dalam katekin 0,17 M.

Langkah kerja:

1,4 mL larutan 4-aminoantipyrine/katekin dan 1,5 mL H2O2 1,7 mM

dicampur ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0,1 mL enzim dan

dibiarkan bereaksi selama 1 menit. Reaksi dihentikan setelah 1 menit dengan

memanaskan larutan tersebut ke dalam penangas air mendidih (1000C) selama 3

menit. Sebagai kontrol digunakan larutan blanko, dimana larutan enzim diganti

dengan aquabides.

Pengukuran aktivitas dilakukan dengan spektrofotometri pada λ 510 nm

berdasarkan pembentukan produk dari substrat yang teroksidasi. Aktivitas spesifik

enzim dihitung dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme

yang dimodifikasi:

3.2.6 Penentuan Kadar Protein Enzim Dengan Metode Lowry

Pereaksi Lowry:

A. 2 g Na2CO3 dalam 100 mL NaOH 0,1 N

B. 0,25 g CuSO4.5H2O dalam 50 mL K-Na Tartarat 1%

C. Campuran 50 mL larutan A dan 1 mL larutan B

D. Pereaksi follin ciocalteau 1N

Langkah kerja:

Sebanyak 1 mL larutan enzim (protein) dicampurkan dengan 5 mL

pereaksi C, kemudian diaduk hingga merata lalu dibiarkan selama 10 menit.

Selanjutnya ke dalam campuran di atas ditambahkan 0,5 mL pereaksi D, lalu

diaduk kembali hingga merata dan dibiarkan selama 30 menit. Serapannya diukur

pada spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Sebagai larutan standar

digunakan BSA dengan variasi konsentrasi mulai dari 0,0625 mg/mL hingga 1,00

mg/mL. pada pengukuran blanko, larutan enzim diganti dengan air.


30


3.2.7 Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase

Ke dalam gelas kimk ukuran 100 mL, dimasukkan enzim peroksidase (15

mg dalam 2 mL buffer fosfat 0,2 M pH 5,0) dan 6,7 mmol H2O2 30%, kemudian

ditambahkan 13,4 mmol katekin perlahan-lahan dengan menggunakan pipet tetes

dan sambil dikontrol suhunya (tidak melebihi 370C). Reaksi berlangsung melalui

proses pengadukan dengan magnetic stirrer pada suhu ruang, sampai semua

katekin tercampur.

Keberhasilan reaksi diamati secara kualitatif dengan terjadinya perubahan

warna campuran reaksi. Kemudian campuran hasil reaksi diekstraksi dengan

menggunakan pelarut etil asetat. Didapat fasa organik (etil asetat) dan fasa air.

Fasa air dipisahkan, dan sisa air yang masih terdapat pada fasa organik

dihilangkan dengan cara menambahkan Na2SO4 anhidrat. Ekstrak yang diperoleh

kemudian dipekatkan dengan cara menguapkan pelarutnya. Untuk memeriksa

produk reaksi yang terbentuk, selanjutnya dilakukan pengecekan dengan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dimana sebagai pembanding digunakan larutan

katekin dalam metanol. Bila hasil samping (by product) tidak terlalu banyak,

dapat langsung dilakukan rekristalisasi dengan dua pelarut yang berbeda

kepolarannya. Tetapi jika hasil samping cukup banyak, maka perlu dilakukan

pemurnian melalui kromatografi kolom. Selanjutnya kristal murni hasil reaksi,

ditimbang.

Bagan 3.2. Reaksi Dimerisasi Katekin Menggunakan Enzim Peroksidase

Enzim Peroksidase + Buffer Fosfat pH 5 + H2O2 30%

+ Katekin Aduk 60 menit pada

suhu ruang

Campuran Hasil Reaksi

Fase organik Fase air

Cairan kental

Isolat

+ Na2SO4 lalu dipekatkan

Uji KLT

Identifikasi

Ekstraksi dengan etil asetat


31


3.2.8 Uji KLT dan Pemisahan komponen Hasil Reaksi

Untuk mengetahui jumlah komponen yang terdapat di dalam senyawa

hasil reaksi, maka dilakukan uji KLT. Uji KLT dilakukan dengan menggunakan

pelarut etil asetat : metanol dengan perbandingan yang paling optimum yaitu 1:3.

Hasil uji KLT digunakan untuk mengidentifikasikan secara kualitatif berapa

banyak komponen yang terdapat didalam senyawa hasil reaksi.

3.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger dengan

Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol

Disiapkan sampel yang masing-masing terdiri dari larutan katekin, dan

senyawa hasil reaksi dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50

ppm, 60 ppm, dan 70 ppm dalam metanol, dan juga disiapkan larutan DPPH 0,4

mM dalam metanol. Pertama kali diukur absorbansi larutan DPPH, sebagai

kontrol (A0) dengan menggunakan spektrometer pada panjang gelombang 515

nm.

Sebanyak 2 mL larutan sampel 10 ppm ditambahkan 2 mL larutan DPPH

kemudian diaduk segera hingga bereaksi sempurna, dan diukur absorbansinya

(Ab). Pengukuran diulangi dengan menggunakan larutan sampel dengan

konsentrasi berbeda. Aktivitas antioksidan diukur sebagai penurunan serapan

campuran larutan DPPH dan sampel, akibat adanya aktivitas antioksidan dari

sampel. Aktivitas antioksidan dapat dihitung berdasarkan % inhibisi dengan

rumus:

Berdasarkan % inhibisi yang didapat dari perhitungan dapat ditentukan nilai IC50

dari sampel dengan menggunakan grafik % inhibisi dengan konsentrasi.


32


Bagan 3.3. Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radical Scavenger

dengan Menggunakan Larutan DPPH dalam Metanol

4 mL DPPH 0,4 mM dalam

metanol (kontrol)

2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL

sampel 10 ppm dalam metanol

(kontrol)






sampel 30 ppm dalam metanol Diukur absorbansinya pada

maks 515 nm









BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, dilakukan sintesis suatu senyawa dimer katekin dengan

menggunakan katalis peroksidase dari kulit bawang bombay. Setelah peroksidase

berhasil diisolasi, kemudian dilakukan pemurnian dengan menggunakan

ammonium sulfat pada berbagai tingkat konsentrasi. Kemudian dilakukan

karakterisasi enzim meliputi pH optimum, dan suhu optimum.

Untuk mengetahui aktivitas dari peroksidase yang diperoleh maka

dilakukan uji aktivitas dan kadar protein dari enzim. Sedangkan penentuan kadar

protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan metode Lowry.

Peroksidase yang diperoleh kemudian digunakan untuk mensintesis

senyawa dimer katekin dari daun teh. Pada senyawa hasil reaksi kemudian

dilakukan uji kromatigrafi lapis tipis (KLT), untuk mengetahui kehadiran senyawa

baru yang terbentuk. Untuk mengetahui struktur senyawa yang terbentuk maka

dilakukan pengujian dengan menggunakan Gas chromatography – mass

spectrometry (GC-MS).

Hasil reaksi yang diperoleh, kemudian diuji aktivitas antioksidannya

dengan menggunakan metode radical scavenger menggunakan larutan DPPH

dalam metanol.

4.1 Isolasi Peroksidase dari Bawang Bombay

Pada penelitian ini digunakan bagian kulit dari bawang bombay sebagai

sumber enzim karena aktivitas peroksidase tertinggi ditemukan pada bagian kulit.

Peroksidase tergolong ke dalam jenis enzim intraseluler sehingga untuk

melepaskan enzim diperlukan pemecahan dinding sel, salah satunya dengan alat

homogenizer seperti blender. Kulit bawang bombay dihaluskan dengan blender

dalam buffer Na-fosfat pH 7,0 pada suhu 40C. pada kondisi tersebut akan

diperoleh aktivitas enzim peroksidase yang optimum. Selain itu, suhu dingin juga

akan mencegah terjadinya degradasi proteolitik.


34


Setelah dinding sel dipecahkan, maka enzim yang dihasilkan harus

dipisahkan dari sel penghasilnya dan senyawa-senyawa lain seperti enzim–enzim

lain, protein, metabolit, dan lain-lain. Pemisahan ini dilakukan dengan sentrifugasi

yang akan menghasilkan filtrat sebagai enzim kasar dan endapan. Pemisahan

dengan sentrifugasi akan berlangsung lebih cepat dan lebih mudah tercapai salah

satunya dengan radius putaran yang besar.

Ekstrak enzim kasar selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan metode

pengendapan dengan garam (NH4)2SO4 pada berbagai tingkat konsentrasi. Prinsip

pengendapan ini didasarkan pada perbedaan kelarutan dari protein-protein.

Protein-protein yang mempunyai berat molekul besar mempunyai tingkat

kelarutan yang rendah sehingga akan mengendap terlebih dahulu, lalu diikuti

dengan protein-protein yang memiliki berat molekul lebih kecil. Dengan

memvariasikan tingkat konsentrasi (NH4)2SO4, diharapkan protein-protein dapat

dipisahkan dalam berbagai kelompok (fraksi) yang memiliki berat molekul sama

ataupun sangat berdekatan.

Penelitian ini menggunakan enzim fraksi III yang dihasilkan dari

pemurnian dengan menggunakan (NH4)2SO4 50 – 70% untuk mengkatalisis reaksi

karena diperoleh aktivitas peroksidase tertinggi pada fraksi ketiga. Volume enzim

fraksi III yang diperoleh pada penelitian ini sebanyak 5 mL yang seluruhnya akan

digunakan untuk mengkatalisis reaksi.

(a) (b)

Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil pemurnian (b)


35


4.2 Karakterisasi Peroksidase

Karakterisasi peroksidase meliputi penentuan pH dan suhu optimum.

Pengujian pada berbagai pH dilakukan pada pH 2 sampai dengan pH 8 dengan

selang 1 unit menggunakan buffer glisin HCl (pH 2), buffer sitrat (pH 3-5) dan

buffer fosfat (pH 6-8). Suhu yang digunakan adalah 10˚C sampai dengan 60˚C

dengan selang 10˚C dalam substrat CMC 1% dalam buffer pH optimum dan

inkubasi selama 30 menit.

Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan grafik penentuan suhu optimum

(bawah)

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0 2 4 6 8 10

Ab

sorb

ansi

(n

m)

pH

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

0.003

0.0035

0.004

0 10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

ansi

(n

m)

Suhu (0C)


36


4.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein

Enzim hasil karakterisasi yang telah didapat kemudian ditentukan

aktivitasnya berdasarkan reaksi oksidasi aminoantipyrine dan fenol dengan H2O2.

Reaksi yang terjadi adalah:

Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina

Adapun tahapan reaksi pembentukan kuinonimina adalah sebagai berikut:

Inisiasi

Propagasi

Fenol

4-aminoantipirin Kuinonimina


37


Terminasi

Dalam reaksi ini, 4-amoniantipyrine dan fenol bertindak sebagai substrat

donor H yang akan membentuk senyawa berwarna merah, quinonimina. Senyawa

ini mempunyai serapan maksimum pada λ = 510 nm.

Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur absorbansi pada λ = 510 nm.

Satu unit enzim dihasilkan dari dekomposisi 1 µmol H2O2 per menit pada 300C

dan pH = 5,0 pada kondisi spesifik. Uji aktivitas enzim merupakan cara untuk

mengetahui apakah enzim yang sudah diisolasi dan dimurnikan merupakan enzim

peroksidase atau bukan serta memiliki aktivitas atau tidak. Senyawa quinonimina

berwarna merah yang terbentuk menandakan bahwa enzim peroksidase bekerja

mengkatalis reaksi redoks. Penggunaan substrat 4-aminoantipyrine dan fenol

didasarkan pada kemudahan kedua senyawa ini dalam mendonorkan H dan

menghasilkan produk berwarna merah yang intensif yang dapat dideteksi secara

spektroskopi pada daerah visible. Uji aktivitas ini pun dapat menggunakan

substrat lain yang mudah menghasilkan produk berwarna yang intensif, seperti

substrat guaikol.

Penentuan kadar protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan

metode Lowry. Metode ini memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi karena

menghasilkan warna yang intensif. Dalam metode ini, terjadi reaksi biuret yaitu

ion Cu2+

dari CuSO4 bereaksi dengan ikatan peptide protein membentuk kompleks

dan mengalami reduksi menjadi Cu1+

. Kemudian pereaksi Follin direduksi oleh

gugus tirosin dan triptofan. Reaksi Biuret ini tidak terlalu sensitive karena tidak


38


menghasilkan warna yang jelas, namun saat ditambahkan Follin terbentuk warna

ungu muda dan lebih sensitive dibanding reaksi Biuret saja.

(a) (b)

Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b)

Sebagai larutan standar, digunakan larutan BSA dengan berbagai

konsentrasi sehingga menghasilkan kurva standar. Pada uji aktivitas enzim

diperoleh absorbansi pada λ 510 nm = 1,411 dan pada uji kadar protein diperoleh

absorbansi pada λ 750 nm = 1,278. Dengan menggunakan persamaan yang

diperoleh dari grafik regresi, maka akan diperoleh nilai kadar protein enzim

sebesar 0,756 mg/mL dengan perhitungan sebagai berikut:

mg/mL

Gambar 4.5. Kurva Larutan Standar BSA

y = 1.5942x + 0.0721 R² = 0.9871

0

0.5

1

1.5

2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Ab

sorb

ansi

(n

m)

Konsentrasi (mg/mL)


39


Setelah menentukan kadar protein pada enzim, maka dapat dihitung aktivitas

spesifik enzim dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme yang

dimodifikasi:

Table 4.1 Aktivitas enzim peroksidase fraksi III

A510 A750 Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg)

1,411 1,278 0,756 0,284

4.4 Pembentukan Senyawa Dimer Katekin

Senyawa katekin yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari ekstrak

tek hijau yang berwujud cairan kental berwarna coklat tua. Katekin adalah

senyawa fenolik yang mampu menyumbangkan proton dari gugus fenolnya jika

direaksikan dengan larutan H2O2, yang bertindak sebagai akseptor proton. Enzim

peroksidase yang digunakan dalam penelitian ini berfungsi sebagai biokatalisator.

Enzim peroksidase pada kulit bawang bombay memiliki aktivitas optimum pada

pH 5 dan suhu 300C, sehingga pada penelitian ini enzim peroksidase dilarutkan

dalam larutan buffer pH 5. Terjadinya reaksi kopling oksidatif antara katekin

dengan enzim peroksidase dapat dilihat secara visual dengan adanya perubahan

warna, yang semula berwarna coklat tua, berubah menjadi hijau tua, hal ini

menandakan adanya senyawa baru yang terbentuk. Seperti terlihat pada gambar

dibawah ini.

(a) (b)

Gambar 4.6. Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin dengan enzim

peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil reaksi (b).


40


Enzim peroksidase dapat mengkatalisa reaksi karena adanya gugus heme

protoforfirin IX besi yang bereaksi dengan H2O2 menghasilkan intermediet radikal

hidroksi yang berikatan dengan enzim. Radikal ini akan berikatan dengan

senyawa katekin dan menghasilkan radikal fenoksi yang dapat mengalami

terminasi kopling.

Reaksi dihentikan setelah 30 menit, kemudian larutan diekstraksi dengan

etil asetat sebanyak 3 kali masing-masing 25 mL. Hasil ekstraksi yang diperoleh

berwarna hijau kekuningan. Ekstrak ini kemudian dipekatkan (diuapkan) sampai

kering dan diperoleh berat endapan campuran produk sebesar (0,2170 g).

Untuk mengetahui jumlah senyawa yang terdapat pada hasil reaksi antara

katekin dengan enzim peroksidase, maka dilakukan uji KLT. KLT dilakukan

sebagai analisis kualitatif dari suatu sampel dengan memisahkan komponen-

komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Umumnya fasa diam (silica

gel) pada KLT bersifat polar dan senyawa polar akan melekat lebih kuat pada

lempeng daripada senyawa nonpolar akibat interaksi tarik-menarik dipol-dipol.

Senyawa nonpolar kurang melekat erat pada fasa diam polar sehingga bergerak

maju lebih jauh ke atas lempeng. Jadi, jarak tempuh ke atas lempeng merupakan

gambaran dari polaritas suatu senyawa. Peningkatan polaritas pelarut akan

menurunkan ineraksi senyawa dengan fasa diam sehingga memungkinkan

senyawa dalam fasa gerak bergerak lebih jauh pada lempeng. Uji KLT dilakukan

dengan mengunakan pengembang etil asetat:metanol = 1:3.

Gambar 4.7. KLT senyawa katekin dan KLT senyawa hasil reaksi

Katekin (monomer)

Hasil reaksi


41


Dari hasil pengujian, diperoleh 3 spot yang terdiri dari spot 1 dengan Rf =

0,91 (spot ini sama dengan spot katekin, berarti menunjukkan bahwa masih ada

katekin yang belum bereaksi), spot 2 dengan Rf = 0,60 (berukuran lebih kecil

daripada spot ketiga, berarti menunjukkan hasil samping reaks, by product). Spot

3 dengan Rf = 0,45 (berukuran lebih besar dibandingkan dengan spot kedua,

berarti menunjukkan hasil reaksi utama, main product).

Pada senyawa substrat (katekin) dan senyawa hasil reaksi dilakukan uji

dengan menggunakan instrument GC-MS untuk melihat berat molekul senyawa

yang dihasilkan. GC-MS adalah metode yang menggabungkan kromatografi gas

(pemisahan senyawa) dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi zat-zat

yang terdapat dalam sampel dan menentukan berat molekulnya serta pola

fragmentasinya untuk mengetahui struktur molekul suatu senyawa. Saat sampel

diinjeksikan dalam injector GC, kemudian sampel diubah menjadi gas pada suhu

tinggi. Gas yang terbentuk dibawa oleh fase gerak, gas nitrogen melewati kolom

kapiler yang berisi fasa diam. Zat yang memiliki afinitas lebih rendah terhadap

fasa diamnyanakan keluar terlebih dahulu sehingga waktu retensinya rendah.

Sebaliknya zat yang memiliki afinitas lebih besar akan keluar lebih lama sehingga

waktu retensinya tinggi.

Gambar 4.8. Instrumen GC-MS Mabes Polri


42


Setelah zat terpisah dalam GC, dalam bentuk aliran gas akan masuk

kedalam separator jet, yang akan mempercepat momentum molekul analit yang

berat, sedangkan atom nitrogen yang ringan sebagai fasa gerak akan dibelokkan

oleh pompa vakum. Molekul analit akan masuk dan ditembak oleh sumber ion

dalam spektrometer massa, sehingga terbentuk spektrum massa berbagai puncak

dalam bentuk fragmen-fragmen. Setelah pemisahan selesai, rekonstruksi spektrum

massa untuk tiap puncak dapat ditampilkan pada komputer. Senyawa katekin dari

ekstrak teh hijau dianalisis dengan GC-MS, menghasilkan kromatogram sebagai

berikut:

Gambar 4.9. Kromatogram GC senyawa katekin

Dilihat dari kromatogram di atas, terlihat adanya 2 puncak yang memiliki

waktu retensi 8, 499 menit dengan luas area 73,34%, dan 8,697 menit dengan

luas area 26,66%, seperti disajikan pada Tabel 4.2 dibawah ini:

Tabel 4.2. Hasil Analisis GC-MS senyawa katekin

Waktu Retensi (menit) Luas Area (%) m/z

8, 499 73,34 280,9

8,697 26,66 290,0


43


Dari data GC, selanjutnya dilakukan analisis lebih lanjut dengan

menggunakan Mass Spectroscopy (MS) hasil analisis GC-MS diketahui pada

waktu retensi 8,697 menit terdapat senyawa dengan berat molekul 290 yang

diduga merupakan senyawa katekin dengan rumus molekul C15H14O6, seperti

terlihat pada Gambar 4.10 di bawah ini:

Gambar 4.10. Spektrum massa senyawa katekin

Dari data ini dapat terlihat bahwa terdapat senyawa dengan merat molekul 290

dengan pola fragmentasi seperti ditunjukkan pada Gambar 4.11 di bawah ini:

OOH

OH

OH

OH

OH

O

CH2OH

OH OH

OH

OH

Gambar 4.11. Fragmentasi senyawa katekin

H+

m/z = 290 m/z = 139 m/z = 152


44


Setelah diperoleh senyawa katekin dari ekstrak teh hijau, maka dilakukan

reaksi dimer senyawa katekin. Pada senyawa hasil reaksi dilakukan analisis

dengan menggunakan instrumen yang sama yaitu GC-MS. Hasil analisis

ditunjukkan oleh Gambar 4.12 di bawah ini:

Gambar 4.12. Kromatogram GC senyawa hasil reaksi

Dari kromatogram di atas dapat dilihat bahwa ada satu puncak tertinggi

dengan waktu retensi 13,878 menit. Pada waktu retensi tersebut diketahui terdapat

senyawa dengan berat molekul 578,1. Senyawa ini diduga sebagai senyawa dimer

katekin. Data m/z sebesar 578,1 ini menunjukkan terbentuknya kopling dari 2

molekul katekin yang masing-masing kehilangan 2 atom H, dengan perhitungan:

2 x (Mr katekin) – 2H = (2 x 290) – 2 = 578. Gambar spektrum massa hasil reaksi

dapat dilihat pada Gambar 4.13 di bawah ini:


45


Gambar 4.13. Spektrum massa hasil reaksi

Spektrum massa yang dihasilkan dibandingkan dengan penelitian yang

dilakukan oleh Angelyne Benavides dan Paola Montoro tentang senyawa turunan

katekin. Ternyata terdapat persamaan antara nilai m/z dari senyawa hasil reaksi

yang terbentuk dengan m/z senyawa hasil penelitian Angelyne Benavides dan

Paola Montoro, seperti ditunjukkan pada Tabel 4.3 berikut ini:

Tabel 4.3 Perbandingan antara spektum massa hasil sintesis senyawa dimer katekin dengan

hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro

Spektrum massa senyawa hasil reaksi

(m/z)

Spektrum masaa penelitian Angelyne

Benavides dan Paola Montoro (m/z)

247,0 247,0

288,9 288,9

300,8 300,8

302,9 302,9

408,9 408,9

426,8 426,8

438,9 438,9

452,9 452,9

560,8 560,8

578,1 578,1


46


Dalam penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro, senyawa

tersebut diidentifikasikan sebagai 4’-8” dikatekin.

OH

OH

O

OH

OH

OH

O OH

OHOH

OH

OH

Gambar 4.14 Struktur 4’-8” dikatekin

Dalam sebuah spektrometer massa, sampel dalam keadaan gas

dibombardir dengan elektron berenergi tinggi. Tumbukan ini menyebabkan

lepasnya sebuah elektron n (lone pair electron) dari molekul suatu sampel dan

terbentuknya suatu ion organik. Ion organik yang dihasilkan ini tidak stabil dan

pecah menjadi fragmen kecil, dapat terbentuk radikal bebas ataupun ion-ion lain.

Dari peak untuk radikal ion (biasanya terletak paling kanan dalam spektrum) ini,

bobot molekul suatu senyawa dapat ditentukan.

Setelah ionisasi awal, ion molekul akan mengalami fragmentasi, dimana

radikal-radikal bebas atau molekul netral kecil dilepaskan dari ion molekul

tersebut. Sebuah ion molekul tidak pecah secara acak, melainkan cenderung

membentuk fragmen-fragmen yang sestabil mungkin. Adapun pola

fragmentasinya dapat dilihat pada Gambar 4.15 dibawah ini:


47


m/z = 452

OH

OH

O

OH

OH

OH

O OH

OHOH

OH

OH

Gambar 4.15 Pola Fragmentasi Senyawa Hasil Reaksi

Pembentukan dimer katekin pada penelitian ini didasarkan pada reaksi

radikal, dimana digunakan enzim peroksidase dan H2O2. Peroksidase membentuk

suatu komplek dengan hidrogen peroksida yang kemudian dipecah menjadi dua

radikal hidroksi. Atom hidrogen pada gugus –OH senyawa katekin akan diambil

oleh radikal hidroksi, sehingga dihasilkan radikal katekin yang distabilkan oleh

resonansi.

Dimer yang mungkin terbentuk dari dua radikal katekin terjadi pada atom

C-4’ dan C-8”, karena pada posisi ini senyawa mempunyai hambatan ruang yang

lebih kecil sehingga didapat struktur yang stabil.

Mekanisme yang terjadi:

m/z = 578 m/z = 126

_

m/z = 152

m/z = 426

_

_

m/z = 170

m/z = 408

m/z = 332 m/z = 120

_

OOH

OH

OH

OH

OH

m/z = 290


48


Gambar 4.16. Pembentukan radikal katekin dan resonansi radikalnya.

Gambar 4.17. Struktur dimer katekin


49


4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Katekin dan Dimer Katekin

Senyawa fenolik merupakan salah satu sumber antioksidan yang

menghambat reaksi radikal dengan cara bereaksi dengan radikal bebas tersebut,

memberikan hidrogen, dan membentuk radikal fenolik yang tidak reaktif dan

terstabilkan dengan adanya resonansi. Senyawa katekin dan senyawa yang

dihasilkan pada reaksi ini merupakan senyawa yang mengandung gugus fenolik

yang akan diuji aktivitas bioaktifnya sebagai antioksidan.

Metode yang dipakai adalah metode radical scavenger dengan

menggunakan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH dipilih karena

sedernaha, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Radikal DPPH

secara luas digunakan untuk mengukur kemampuan suatu senyawa yang dapat

bertindak sebagai penangkap radikal bebas atau donor hidrogen. Radikal yang

ditangkap oleh senyawa antioksidan melalui donor elektron membentuk DPPH

yang tereduksi, sehingga terjadi perubahan warna larutan dari ungu menjadi

kuning yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.18. Reaksi antioksidan dengan DPPH


50


(a) (b) (c) (d)

Gambar 4.19. Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol, (b) senyawa katekin, (d)

senyawa hasil reaksi

DPPH memberikan warna ungu karena adanya radikal bebas pada atom N

yang dapat membentuk diazo, dimana absorbansi maksimumnya adalah 515 nm.

Adanya penambahan sampel yang diduga berperan sebagai antioksidan dapat

menangkap radikal bebas DPPH. Penangkapan ini menurunkan terjadinya

pembentukan diazo, sehingga penurunan warna warna ungu selaras dengan

kemampuan aktivitas sebagai radical scavenger. Proses perubahan warna dari

ungu menjadi kuning ini diukur pada panjang gelombang 515 nm.

Gambar 4.20. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan

(Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)

Pengujian terhadap aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan variasi

konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm dan 70 ppm untuk

senyawa katekin dan senyawa hasil reaksi.


51


Gambar 4.21. Grafik Aktivitas Antioksidan Katekin

Gambar 4.22. Grafik Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi

Semakin besar konsentrasi senyawa yang ditambahkan ke dalam larutan

DPPH, semakin besar penurunan intensitas warna larutan DPPH. Hal ini

menandakan semakin tinggi kemampuan senyawa sebagai radical scavenger. Dari

grafik di atas terlihat aktivitas antioksidan dari senyawa hasil reaksi katekin

hampir sama dibandingkan dengan substrat awalnya, katekin. Dapat dikatakan

bahwa pembentukan senyawa baru dengan cara dimerisasi dengan katalis enzim

peroksidase dapat memiliki aktivitas antioksidan yang sama baiknya dengan

substrat awal.

Dari data pengukuran pada menit ke 30, maka dapat dihitung % inhibisi

untuk masing-masing konsentrasi sampel. Aktivitas radical scavenger ditentukan

berdasarkan persamaan:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 20 40 60 80

Ab

sorb

ansi

(51

5 n

m)

Konsentrasi (ppm)

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 20 40 60 80

Ab

sorb

ansi

(51

5 n

m)

Konsentrasi (ppm)


52


Gambar 4.23. Grafik % inhibisi Katekin

Gambar 4.24. % inhibisi Senyawa Hasil Reaksi

Dari hasil perhitungan, diperoleh kemampuan menginhibisi (IC50)

senyawa hasil reaksi sebesar 58,928 ppm dan katekin sebesar 60,248 ppm.

Perbandingan IC50 dapat dilihat pada Gambar 4.25 dibawah ini:

Gambar 4.25. Nilai IC50 antara katekin dan senyawa hasil reaksi

y = 0.4953x + 20.159 R² = 0.9708

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80%

inh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

y = 0.4265x + 24.867 R² = 0.9787

0.000

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

0 20 40 60 80

% in

hib

isi

Konsentrasi (ppm)

58

58.5

59

59.5

60

60.5

Katekin Hasil Reaksi


53


Gambar di atas menunjukkan bahwa senyawa hasil reaksi mempunyai

aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan monomernya

(katekin) yang ditandai dengan nilai IC50 yang lebih kecil. Reduksi DPPH menjadi

DPPH-H disebabkan adanya donor hidrogen dari senyawa katekin atau dimer

produk. Oleh karena itu dapat diprediksikan bahwa didalam katekin maupun

senyawa hasil reaksi terdapat senyawa yang berperan dalam aktivitas antioksidan

yaitu golongan flavonoid dengan jumlah gugus hidroksil cukup sedikit. Jadi,

semakin banyak gugus hidroksil bebas yang dapat menyumbangkan hidrogen

maka semakin banyak juga reduksi yang dapat dilakukan terhadap DPPH.

Gambar 4.26. Orientasi besarnya reduksi DPPH oleh gugus hidroksil.



BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan

bahwa:

1. Bawang bombay (Allium cepa L.) mengandung enzim peroksidase dengan

aktivitas spesifik 0,284 unit/mg protein.

2. Senyawa dimer dari katekin berhasil disintesis dengan katalis enzim

peroksidase dari kulit bawang bombay dengan kondisi optimum

peroksidase pada pH 5 dan suhu 300C.

3. Reaksi antara katekin dan H2O2 yang dikatalisis oleh peroksidase

menghasilkan produk berupa padatan hijau tua dengan berat 0,2170 gram.

4. Produk dimer yang terbentuk merupakan senyawa 4’-8” dikatekin, melalui

mekanisme reaksi kopling oksidatif radikal katekin pada posisi C-4’ dan

C-8”.

5. Senyawa 4’-8” dikatekin mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih

besar dibandingkan dengan katekin dengan perbandingan IC50 adalah

60,248 : 58,928. (katekin : dimer katekin).

5.2. Saran

Berdasarkan hasil dan kesimpulan yang diperoleh, maka disarankan

sebagai berikut:

1. Belum maksimalnya hasil yang diperoleh dari sintesis senyawa dimer

katekin yang telah dilakukan, maka disarankan untuk melakukan

penelitian lanjutan dengan menggunakan optimasi terhadap perbandingan

substrat, H2O2, dan enzim yang dipakai, serta optimasi kondisi reaksi yang

berlangsung.

2. Perlu dilakukan pemurnian kristal yang diperoleh dari hasil reaksi

sehingga bisa dianalisis dengan menggunakan alat yang lain.



DAFTAR PUSTAKA

Anonymous, 2007. Mengenal Tanaman Teh,

http://www.sosro.com/indonesia/it_Mengenal Teh.htm. diakses pada

tanggal 11 April 2012.

Alamsyah, 2007. Antioksidan dan Peranannya Bagi Kesehatan.

http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidan-

dan-peranannya-Bagi-Kesehatan.shtml. Diakses tanggal 27 Feb 2012.

Benadives, Angelyne et al. 2006. Catechin derivatives in Jatropha macrantha

stems: Characterisation and LC/ESI/MS/MS quali–quantitative analysis.

Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Facolt´a di Farmacia, Universit´a

di Salerno, Via Ponte don Melillo, 84084 Fisciano, SA, Italy 40 (2006)

639–647.

D’ Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovanni C and Masella

R. (2007). Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Istituto

Superior di Sanita 43(4), 348-361.

Gunawijaya, F. A. 1999. Efek Pemberian Katekin Teh Hijau Pada Pertumbuhan

Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain Gr. (J Kedokteran Trisakti 1999; (2):

61-7).

Imanulkhan, 2006. Karakterisasi “Edibel Film” Beraktivitas dari Pati Ganyong

(Canna Edulis Kerr) dan Ekstrak Teh Hijau (Camellia Sinensis). Skripsi

Mahasiswa Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi

Pertanian, Universitas Brawijaya.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N.,

2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A

Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis,

13, 8-17.


http://www.sosro.com/indonesia/it_Mengenal%20Teh.htm

http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidan-dan-peranannya-Bagi-Kesehatan.shtml

http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidan-dan-peranannya-Bagi-Kesehatan.shtml

56


Lindiyah. (2008). Reaksi Dimerisasi Eugenol dan Isoeugenol dengan bantuan

Enzim Peroksidase dari Horseradish. FMIPA-UI: Depok.

Lucida, H. 2006. Determination of the ionization constants and the stability of

catechin from gambir (uncaria gambir (Hunter) Roxb), ASOPMS 12

International Conference, Padang November 2006.

Puspitasari, Agriana. 2006. Pengaruh Pemberian Katekin Teh Hijau Terhadap

Jumlah Sel Mononuklear Darah Tepi Pada Manusia, Karya Tulis Ilmiah.

Semarang: Universitas Diponegoro.

Robinson, T., 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Penerbit ITB,

Bandung, hal 57 dan 211.

Rohdiana, Dadan. 2005. Aktivitas Antioksidan Beberapa Klon Teh Unggulan.

Bandung: Jurusan Teknologi Pangan Universitas Pasundan

Sonia, Mousounni. 2011. Crude Peroxidase From Onion Solid Waste as a Tool

For Organic Synthesis. Part II: Oxidative Dimerization-Cyclization of

Methyl p-Coumarate, Methyl Caffeat and Methyl Ferulate. Greece:

Elsevier.

Tuminah, S., 2004. [(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] Sebagai

Salah Satu Sumber Antioksidan, Pusat Penelitian dan Pengembangan

Pemberantasan Penyakit, Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan,

Departemen Kesehatan RI, Jakarta, Cermin Dunia Kedokteran No. 144,

2004.

Urquiaga I. and Leighton F. (2000). Plant Polyphenol Antioxidants and Oxidative

Stress Biological Research. 33(2), 55-64.

Villalobos D. A., and Buchanan I. D. (2002). Removal of Aqueous phenol by

Arthomyces Ramosus Peroxidase. Journal of environmental Engineering

Science I, 65-73.


57


Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of

Scavenger Properties, http://www.baltic-analytics.de/index.

php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 April 2012.

Zaveri, Nurulain. 2005. Green tea and its polyphenolic catechins: Medicinal uses

in cancer and noncancer applications. USA: Science direct.


Lampiran 1

Tabel hasil pengukuran kadar protein dengan metode LowryKonsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi pada λ 750 nm

0.0625 0.12800.1250 0.26000.2500 0.45900.5000 0.95000.7500 1.34501.0000 1.5750Sampel 1.2780

Perhitungan aktivitas spesifik enzim:dari persamaan regresi linier di atas, maka:

Aktivitas spesifik enzim:

y = 1.5942x + 0.0721R² = 0.9871

0.0000

0.5000

1.0000

1.5000

2.0000

0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000

Abso

rban

si (n

m)

Konsentrasi (mg/mL)

Kurva Larutan Standar BSA

= , ,, = 0,756mg/mL

⁄ = ⁄6,58 ⁄ = 1,4116,58 0,756 = 0,284 ⁄


Lampiran 2

Absorbansi kontrol yaitu DPPH 0,4 mM = 1,074

1 2 1 21 10 0.845 0.836 0.734 0.7512 20 0.725 0.728 0.712 0.7143 30 0.686 0.677 0.695 0.6764 40 0.647 0.625 0.642 0.6335 50 0.589 0.590 0.582 0.5876 60 0.539 0.547 0.533 0.5417 70 0.485 0.508 0.453 0.479

0.84050.72650.6815

0.6360.5895

0.5430.4965

NoAbsorbansiHasil Reaksi

AbsorbansiKatekinKonsentrasi (ppm)

00.20.40.60.8

1

0 20 40 60 80

Abso

rban

si

Konsentrasi (ppm)

Aktivitas Antioksidan Katekin

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 20 40 60 80

Abso

rban

si

Konsentrasi (ppm)

Aktivitas Antioksidan Senyawa Hasil Reaksi


Lampiran 3

Contoh Perhitungan % inhibisi dan tabel % inhibisi

Katekin 10 ppm:

Tabel % inhibisi KatekinKonsentrasi (ppm) Katekin (%)

10 21.78820 32.35630 36.54640 40.78250 45.11260 49.44170 53.771

Tabel % inhibisi Senyawa Hasil ReaksiKonsentrasi (ppm) Katekin (%)

10 30.86620 33.61330 36.17340 40.64250 45.57760 50.00070 56.611

Penentuan nilai IC50 antara Katekin dan Senyawa Hasil ReaksiSampel IC50

Katekin 60.248Hasil Reaksi 58.928

% = , ,, 100 % = 21,788 %

y = 0.4953x + 20.159R² = 0.9708

0102030405060

0 20 40 60 80%

inhi

bisi

Konsentrasi (ppm)

y = 0.4265x + 24.867R² = 0.9787

0.00010.00020.00030.00040.00050.00060.000

0 20 40 60 80

% in

hibi

si

Konsentrasi (ppm)

58

58.5

59

59.5

60

60.5

Katekin Hasil Reaksi


4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

Time-->

Abundance

TIC: CATECHIN SIM.D\data.ms

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

m / z -->

A b u n d a n c e

# 1 1 8 2 7 4 : C a te c h in

1 3 9 .0

2 9 0 .0

6 9 .0

3 9 .01 0 7 .0 1 6 7 .0

1 8 7 .0 2 7 1 .02 4 5 .08 8 .0 2 0 8 .0


6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

T ime -->

A b u n d a n c e

T IC: CA T E CH IN S CA N .D \ d a ta .ms

1 3 .8 7 8


Documents

SINTESIS SENYAWA DIMER KATEKIN DARI EKSTRAK TEH HIJAU ...lib.ui.ac.id/file?file=digital/20312705-T31477-Sintesis senyawaa.pdf · 2.3 Komponen Teh ... Komponen Penyusun. Teh..... 9