sintetaze 1

Sveučilište u Splitu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Odjel za kemiju

Ines Tomić

Utjecaj vezanja supstrata na fluorescencijska

svojstva adenilacijske domene tirocidin-

sintetaze 1

Diplomski rad

Split, ožujak 2015.

I

Ovaj je rad izrađen na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu u Splitu pod

vodstvom prof. dr. sc. Maje Pavela-Vrančić. Predan je na ocjenu Odjelu za

kemiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Splitu radi stjecanja

zvanja magistar/magistra edukacije biologije i kemije.

II

Zahvaljujem

Mentorici prof. dr. sc. Maji Paveli-Vrančić na susretljivosti, svim stručnim savjetima i pomoći

tijekom izrade ovog rada.

Posebno se zahvaljujem dr. sc. Matildi Šprung na neizmjernoj pomoći, stručnim i korisnim

savjetima i raspravama prilikom izrade ovog rada. Hvala na posvećenom vremenu, velikoj

podršci i razumijevanju.

Zahvaljujem doc. dr. sc. Stjepanu Orhanoviću na susretljivosti, stručnim savjetima i pregledu

rada.

Zahvaljujem mr. sc. Roku Vladušiću na susretljivosti i pregledu metodičkog dijela rada.

Hvala svim kolegama i prijateljima koji su mi pružali potporu tijekom studiranja i bili uz

mene kad god je trebalo. Posebno hvala kolegici i prijateljici Viki koja me je trpila sve ove

godine, neumorno slušala i imala razumijevanja za sve moje 'gluposti'. Bez nje ovo studiranje

i ne bi bilo tako zabavno.

Najveće hvala ide mojim roditeljima i bratu, jer su mi omogućili studiranje i zato jer bez

njihove pomoći ništa ovo i ne bi bilo moguće. Hvala na strpljenju, razumijevanju, moralnoj

podršci i hvala što ste sve ove godine vjerovali u mene.

III

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Splitu Diplomski rad

Prirodoslovno – matematički fakultet

Odjel za kemiju

Utjecaj vezanja supstrata na fluorescencijska svojstva adenilacijske domene

tirocidin-sintetaze 1

Ines Tomić

Neribosomske peptid-sintetaze (NRPS) su veliki multienzimski kompleksi koji

kataliziraju sintezu različitih medicinski značajnih peptidinih spojeva. Proces biosinteze

započinje na adenilacijskoj (A) domeni koja u prvom koraku katalizira nastanak aminoacil-

adenilata, dok se u drugom koraku odvija prijenos aktivirane aminokiseline na susjednu

tiolacijsku (T) domenu.

U ovom radu, strukturna dinamika A-domene tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A) ispitana

je metodom fluorescencijske spektroskopije. Aminokiselinski slijed TycA-A proteina sadrži

pet triptofanskih ostataka: W227, W301, W323, W376 i W406. Gašenjem fluorescencije

divljeg tipa i mutanti TycA-A akrilamidom, definirane su dvije skupine triptofana s različitim

stupnjem dostupnosti njihovih bočnih ogranaka okolnom otapalu. Prisustvo supstrata (L-Phe i

ATP) induciralo je konformacijsku promjenu proteinu divljeg tipa i svim mutantama, osim

W227F. Naime, konformacijska promjena proteina, nastala kao posljedica vezanja supstrata,

izostaje ukoliko se triptofan na položaju 227 zamijeni fenilalaninom. To upućuje na zaključak

da je promjena konformacije proteina, lokalizirana upravo oko ovog triptofanskog ostatka.

Gašenje fluorescencije proteina TycA-A kalijevim jodidom, zajedno s analizom učinkovitosti

pojedinih molekula gasitelja, pokazuje kako je akrilamid u usporedbi s KI učinkovitiji

gasitelj.

Ključne riječi: neribosomske peptid-sintetaze/ adenilacijska domena/ tirocidin-sintetaza 1/

strukturna dinamika

(30 + V stranica/ 26 slika/ 18 literaturnih navoda/ jezik izvornika: hrvatski)

Mentor: dr. sc. Maja Pavela-Vrančić, red. prof. u trajnom zvanju

Ocjenitelji: dr. sc. Matilda Šprung

dr. sc. Stjepan Orhanović, doc.

Rad prihvaćen: 16. 3. 2015.

IV

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Split Diploma thesis

Faculty of Science

Department of Chemistry

The influence of substrate binding on fluorescence properties of the adenylation

domain in tyrocidine synthetase 1

Ines Tomić

Nonribosomal peptide synthetases (NRPS) are large multienzyme complexes that

catalyze synthesis of various medically important peptide compounds. The biosynthetic

process starts with the adenylation (A) domain, which catalyzes in the first half reaction the

synthesis of the aminoacil-adenylate, while in the second half reaction, the activated amino

acid is transferred to the adjacent thiolation (T) domain.

In this study, the structural dynamics of the A-domain from tyrocidine synthetase 1

were investigated by the fluorescence spectroscopy method. The amino acid sequence of

TycA-A has five tryptophan residues: W227, W301, W323, W376 and W406. Quenching of

fluorescence of the wild type and mutant TycA-A proteins with acrylamide, revealed two

populations of tryptophan residues with a different degree of their side chain accessibility to

the surrounding solvent. The presence of substrates (L-Phe and ATP) induced a

conformational change in the wild type and all mutant TycA-A proteins, except W227F. The

conformational change of the protein, as a consequence of substrate binding, does not occur

when tryptophan 227 is substituted with phenylalanine. This leads to the conclusion that the

conformational change of the protein is localized in the vicinity of this specific tryptophan

residue. Quenching of fluorescence of the TycA-A proteins with potassium iodide, along with

an analysis of the quencher efficiency, shows that acrylamide, in comparison with potassium

iodide, is a more efficient quencher.

Keywords: nonribosomal peptide synthetases/ adenylation domain/ tyrocidine synthetase 1/

structural dynamics

(30 + V pages/ 26 figures/ 18 references/ original in Croatian)

Mentor: dr. Maja Pavela-Vrančić, Full Professor

Reviewers: dr. Matilda Šprung

dr. Stjepan Orhanović, Assistant Professor

Thesis accepted: 16. 3. 2015.

V

SADRŽAJ

1. UVOD ......................................................................................................................... 1

1.1. Neribosomske peptid-sintetaze ........................................................................................ 2

1.2. Tirocidin-sintetaza ........................................................................................................... 4

1.3. Reakcijska i strukturna obilježja NRPS domena ............................................................. 5

1.3.1. A-domena ................................................................................................................. 5

1.3.2. T-domena .................................................................................................................. 6

1.3.3. C-domena ................................................................................................................. 7

1.3.4. TE-domena ............................................................................................................... 7

1.4. Fluorescencija .................................................................................................................. 8

2. MATERIJALI I METODE ....................................................................................... 11

2.1. Materijali ....................................................................................................................... 11

2.1.1. Kemikalije .............................................................................................................. 11

2.1.2. Otopine ................................................................................................................... 11

2.1.3. Bakterijski sojevi i plazmidi ................................................................................... 11

2.2. Metode ........................................................................................................................... 12

2.2.1. Mjerenje intrinzične fluorescencije na LS 55 spektrofluorimetru .......................... 12

2.2.2. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A akrilamidom .......................................... 13

2.2.3. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A akrilamidom u prisustvu supstrata ........ 14

2.2.4. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A kalijevim jodidom ................................. 14

3. REZULTATI ............................................................................................................ 15

3.1. Gašenje fluorescencije proteina akrilamidom bez prisutnih supstrata........................... 15

3.2. Gašenje fluorescencije proteina akrilamidom u prisustvu supstrata .............................. 19

3.3. Gašenje fluorescencije kalijevim jodidom .................................................................... 23

3.4. Analiza dosega gašenja fluorescencije korištenjem akrilamida i kalijevog jodida ....... 24

4. RASPRAVA ............................................................................................................. 26

5. ZAKLJUČCI ............................................................................................................ 28

6. LITERATURA ......................................................................................................... 29

7. METODIČKI DIO .................................................................................................... 31

1

1. UVOD

Neribosomske peptid-sintetaze (NRPS) su veliki multifunkcionalni proteini sačinjeni

od različitih domena združenih u module. Ovi proteini kataliziraju sintezu različitih

medicinski važnih peptidnih spojeva kao što su antibiotici, citostatici i imunosupresori.

Minimalni sastav modula, koji je odgovoran za aktivaciju i ugradnju jedne

aminokiseline u rastući polipeptidni lanac, čine adenilacijska (A), tiolacijska (T) te

kondenzacijska (C) domena. Proces biosinteze započinje na A-domeni koja je odgovorna za

prepoznavanje i odabir specifičnog aminokiselinskog supstrata. Ova domena u prisustvu

Mg2+, iz aminokiseline i ATP-a sintetizira aminoacil-adenilat.

Kristalne strukture su pokazale da se A-domena sastoji od dvije poddomene: velike N-

terminalne i male C-terminalne poddomene, koje međusobno zatvaraju procjep aktivnog

mjesta. U trenutku kada aktivno mjesto enzima veže supstrate (aminokiselinu i ATP (Mg2+)),

enzim prelazi u adenilat-formirajuću konformaciju. Tijekom katalitičkog ciklusa mala se C-

terminalna poddomena rotira za 140° što dovodi do prestrukturiranja aktivnog mjesta i enzim

iz adenilat-formirajuće prelazi u tioestersku konformaciju. Za vrijeme takve konformacije,

vrši se prijenos aktivirane aminokiseline na susjednu T-domenu. Aminoacilni i/ili peptidilni

međuprodukti se posredstvom T-domene prenose na aktivno mjesto C-domene, koja katalizira

nastanak peptidne veze [1].

Tirocidin-sintetaza građena je od tri multifunkcionalna enzima: tirocidin-sintetaze 1

(TycA), tirocidin-sintetaze 2 (TycB) i tirocidin-sintetaze 3 (TycC). Monomodularna TycA,

građena je od tri domene: adenilacijske (A), tiolacijske (T) i epimerazne (E).

Kako bi ispitali strukturnu dinamiku A-domena, u ovom radu korištena je A-domena

tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A) koja u svojoj primarnoj strukturi sadrži pet potencijalno

fluorescirajućih triptofana (Trp).

Cilj ovog rada bio je ispitati dosege gašenja fluorescencije proteina TycA-A, koristeći

akrilamid i kalijev jodid kao molekule koje gase fluorescenciju Trp. Također se željelo ispitati

izloženost pojedinih Trp, kod proteina TycA-A divljeg tipa i mutanti, praćenjem gašenja

intrinzične fluorescencije akrilamidom. Posljednji cilj ovog rada bio je ispitati utjecaj

supstrata, L-Phe i ATP-a, na fluorescencijska svojstva te na promjenu konformacije proteina

TycA-A divljeg tipa i mutanti, praćenjem gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom.

2

1.1. Neribosomske peptid-sintetaze

Neribosomske peptid-sintetaze (NRPS) su multimodularni enzimski kompleksi, koji

kataliziraju sintezu peptida neovisno o kalupu RNA. Proizvodi ovih enzima su najčešće

makrociklički peptidi (slika 1.) koji imaju široku primjenu u proizvodnji terapeutskih

sredstava, kao što su antibiotici, citostatici i imunosupresori.

Slika 1. Neribosomski sintetizirani makrociklički peptidi.

Za razliku od ribosomski sintetiziranih peptida, koji sadrže 20 uobičajenih

aminokiselina, neribosomski sintetizirani peptidi odlikuju se znantno većom strukturnom

3

raznolikošću. Osim osnovnih L-aminokiselina, sadrže i jedinstvene strukturne elemente, kao

što su D-konfigurirane aminokiseline, metilirani, glikozilirani i fosforilirani ostaci,

heterociklički elementi i lanci masnih kiselina. Ova raznovrsnost kemijske građe

neribosomski sintetiziranih peptida, ključna je za široki spektar njihove biološke aktivnosti [2,

3, 4].

Neribosomske peptid-sintetaze (NRPS) građene su od modula od kojih je svaki

odgovoran za ugradnju jednog aminokiselinskog monomera u konačni peptidni produkt.

Razlikujemo tri vrste modula: početni, elongacijski i terminacijski (slika 2.).

Slika 2. Shematski prikaz modularne građe NRPS. Prikazani su: početni, elongacijski i

terminacijski modul.

Početni modul sadrži dvije katalitičke domene, adenilacijsku (A) i tiolacijsku (T)

domenu. Na ovom modulu započinje neribosomska sinteza peptida. Nakon početnog modula

slijedi elongacijski modul, koji se sastoji od tri katalitičke domene: kondenzacijske (C), A-

domene i T-domene [1]. Elongacijski moduli omogućavaju produljenje peptidnog lanca od

amino prema karboksilnom kraju pri čemu se u svakom elongacijskom koraku lanac pomiče s

jednog modula na drugi. Terminacijski modul sastoji se od: C-domene, A-domene, T-domene

i tioesterazne (TE) domene, a odgovoran je za oslobađanje konačnog peptidnog produkta s

biosintetskog kompleksa procesom hidrolize ili ciklizacije.

Sve navedene katalitičke domene imaju točno određenu ulogu u sintezi peptida i

neprestano se ponavljaju u svim modulima, jedino je tioesterazna (TE) domena iznimka jer se

nalazi samo u terminacijskom modulu.

A-domena započinje sintezu peptidnog produkta odabirom specifičnog

aminokiselinskog supstrata. U tom prvom katalitičkom koraku A-domena katalizira nastanak

aminoacil-adenilata, dok je T-domena bez vlastite katalitičke aktivnosti, ali sadrži 4'-

4

fosfopanteteinski kofaktor preko kojega su aminoacilni i/ili peptidilni međuprodukti

kovalentno vezani u obliku tioestera. C-domena katalizira nastanak peptidne veze između

međuprodukata vezanih na dvije susjedne T-domene, a TE-domena je zadužena za

oslobađanje konačnog peptidnog produkta s biosintetskog kompleksa.

Neki NRPS moduli osim spomenutih domena, mogu sadržavati i pomoćne domene

koje vrše dodatnu modifikaciju konačnog peptidnog produkta. Tako primjerice epimerazna

(E) domena epimerizira L- u D-aminokiselinu [4, 5, 6, 7].

Ako usporedimo ribosomsku i neribosomsku sintezu peptida, radi se o potpuno

različitim sustavima za sintezu peptida. Ipak, neke sličnosti postoje, pa tako recimo uloga A-

domene odgovara ulozi aminoacil-tRNA-sintetaze, uloga T-domena je slična molekulama

tRNA, dok akceptorska i donorska mjesta na C-domeni odgovaraju A- i P- mjestima na

ribosomu [2].

1.2. Tirocidin-sintetaza

Tirocidin-sintetaza (slika 3.) građena je od tri multifunkcionalna enzima: tirocidin-

sintetaze 1 (TycA), tirocidin-sintetaze 2 (TycB) i tirocidin-sintetaze 3 (TycC).

Slika 3. Struktura tirocidin-sintetaze.

5

TycA sadrži samo početni modul, TycB tri elongacijska modula, a TycC pet

elongacijskih i jedan terminacijski modul. Sva tri multifunkcionalna enzima sudjeluju u

procesu biosinteze cikličkog dekapeptidnog antibiotika tirocidina A [8].

1.3. Reakcijska i strukturna obilježja NRPS domena

1.3.1. A-domena

A-domena (~550 aminokiselina) odgovorna je za prepoznavanje i odabir specifičnog

aminokiselinskog supstrata. Katalitička reakcija na ovoj domeni odvija se u dva koraka. U

prvom koraku dolazi do aktivacije aminokiseline te nastaje aminoacil-adenilat. Potrebna

energija dobiva se utroškom ATP-a u prisustvu Mg2+ iona. U sljedećem koraku, aktivirana se

aminokiselina prenosi na sulfhidrilnu skupinu fosfopanteteinskog kofaktora susjedne T-

domene i pritom nastaje aminoacil-tioester.

A-domena zajedno s acetil-CoA-sintetazom iz Salmonella enterica i luciferazom iz

Photinus pyralis pripada adenilat-formirajućoj obitelji enzima. Kristalne strukture pripadnika

ove obitelji enzima pokazale su da se enzim sastoji od dviju različitih poddomena, velike N-

terminalne i male fleksibilne, C-terminalne poddomene. Dvije poddomene međusobno su

povezane "linker" regijom. C-terminalna poddomena za vrijeme katalitičkog ciklusa zauzima

različite položaje u odnosu na N-terminalnu poddomenu, pa zbog toga enzim osim otvorene

konformacije zauzima adenilat-formirajuću i tioester-formirajuću konformaciju (slika 4.) [9].

Slika 4. Katalitički ciklus A-domene s istaknute tri različite konformacije.

6

U odsutnosti supstrata, A-domena se nalazi u otvorenoj konformaciji. U trenutku kada

aktivno mjesto enzima, koje se nalazi između dviju poddomena, veže supstrate (aminokiselinu

i ATP (Mg2+)), enzim prelazi u adenilat-formirajuću konformaciju. U ovoj konformaciji

aktivno mjesto se zatvara radi zaštite vezanih supstrata i/ili nastalog adenilata od hidrolize.

Uslijed oslobađanja PPi, dolazi do rotacije C-terminalne poddomene za 140°, te enzim iz

adenilat-formirajuće konformacije prelazi u tioestersku konformaciju (zatvorena

konformacija) [1, 10]. U ovoj konformaciji odvija se prijenos aminoacilne skupine na 4'-

fosfopanteteinski kofaktor vezan za T-domenu.

Kristalna struktura A-domene prvog modula tirocidin-sintetaze još nije riješena.

Objavljena je kristalna struktura A-domene prvog modula gramicidin-sintetaze iz bakterije

Bacillus brevis koja s A-domenom prvog modula tirocidin-sintetaze ima više od 90%

sličnosti. Otkriće te kristalne strukture kao i analiza aminokiselinskog slijeda različitih A-

domena, doveli su do spoznaje da je samo deset aminokiselinskih ostataka uključeno u

vezanje supstrata („neribosomski kod“). Dva ostatka su konzervirana, tri ostatka su

hidrofobna i imaju koordinacijsku ulogu, tri ostatka nisu očuvana jer o njima ovisi supstratna

specifičnost A-domene i dva ostatka nemaju ulogu u supstratnoj specifičnosti A-domene

(slika 5.).

Slika 5. Deset aminokiselinskih ostataka A-domene prvog modula PheA s istaknutim vezanim

L-Phe i AMP-om.

1.3.2. T-domena

Mala, T-domena (~80 aminokiselina) sačinjena je od četiri α-uzvojnice, te se u

strukturi NRPS nalazi nizvodno od A-domene. Svaka T-domena ima konzervirani serinski

7

(Ser) ostatak koji se posttranslacijski modificira s fosfopanteteinskim kofaktorom. Za vrijeme

sinteze, svi aminoacilni supstrati i peptidilni međuprodukti su kovalentno vezani na

fosfopanteteinski kofaktor u obliku tioestera. Acil-S-PCP međuprodukti se radi modifikacije,

stvaranja peptidne veze ili otpuštanja produkta dostavljaju katalitičkim mjestima susjednih

NRPS domena.

Do danas nije u potpunosti poznato, kako T-domene, koje su jednostavno građene i

sadrže samo četiri uzvojnice, prepoznaju sve partner-domene [2, 11, 12].

1.3.3. C-domena

C-domene (~450 aminokiselina) imaju važnu ulogu u neribosomskoj sintezi peptida

jer kataliziraju nastanak peptidne veze između dva međuprodukta vezana na susjednim T-

domenama. Broj C-domena neke neribosomske peptid-sintetaze odgovara broju peptidnih

veza u produktu.

C-domene posjeduju akceptorsko i donorsko mjesto, gdje se vežu aminoacil-S-PCP i

peptidil-S-PCP supstrati. Stvaranje peptidne veze unutar C-domene pokreće se nukleofilnim

napadom α-amino skupine akceptorskog supstrata na tioestersku skupinu donorskog supstrata.

Kao rezultat tog nukleofilnog napada, stvara se peptidna veza, a čitavi se peptidilni lanac

prenosi s donorskog mjesta na nizvodno smješteno akceptorsko mjesto. U sljedećem,

kondenzacijskom koraku, taj peptid služi kao donorski supstrat za novi nukleofilni napad i

tvorbu nove peptidne veze, što će katalizirati C-domena koja se nalazi na nizvodno

smještenom modulu. Sve reakcije kondenzacije su jednosmjerne i prenose rastući peptidilni

lanac prema tioesteraznoj (TE) domeni [2, 11, 13].

1.3.4. TE-domena

TE-domena (~250 aminokiselina) najčešće se nalazi samo u C-terminalnom modulu.

Ova domena katalizira oslobađanje peptidnog produkta hidrolizom ili makrociklizacijski. TE-

domene pripadaju skupini α,β-hidrolaza. U aktivnom mjestu tih domena nalazi se visoko

očuvani serin koji katalizira hidrolizu i otpuštanje gotovog peptidnog produkta. Aktivno

mjesto nadsvođuje fleksibilna regija za koju se smatra da regulira dostupnost tog mjesta

supstratima [2, 11, 14].

8

1.4. Fluorescencija

Pojava emisije svijetlosti iz bilo koje tvari, naziva se luminiscencija i javlja se kod

elektronski pobuđenih stanja. Luminiscencija se ovisno o prirodi pobuđenog stanja, javlja kao

fluorescencija i fosforescencija.

Molekule koje se nalaze u osnovnom elektronskom i vibracijskom stanju, apsorpcijom

fotona iz UV/VIS spektra svjetlosti prelaze u pobuđeno vibracijsko stanje. Da bi uopće došlo

do prijelaza iz osnovnog u pobuđeno stanje, apsorbirana energija mora biti ekvivalentna

razlici energija osnovnog i pobuđenog stanja. Molekula se iz pobuđenog stanja može vratiti u

osnovno stanje emitiranjem fotona ili neradijacijskim putem (bez emisije fotona).

Neradijacijskim gubitkom energije molekula prelazi u najniže pobuđeno vibracijsko stanje.

Do pojave fluorescencije dolazi prelaskom molekule iz najnižeg vibracijskog stanja u

osnovno vibracijsko stanje. Važno je napomenuti, da je kod fluorescencije životni vijek

pobuđenih čestica vrlo kratak (10-9 s) [15, 16].

Sposobnost fluorescencije pokazuju samo neke tvari, najčešće spojevi koji sadrže

aromatske prstenove ili konjugirane dvostruke veze. Takve tvari nazivaju se fluorofori (slika

6.).

Slika 6. Tipični fluorescentni spojevi.

Fluorofori se dijele na intrinzične i ekstrinzične, odnosno na one koji potječu od same

tvari koju promatramo i na one koji se dodaju uzorku koji ne pokazuje željena spektralna

svojstva. Dominantni fluorofor u proteinima je indolni prsten aminokiseline triptofan (Trp)

(slika 7.).

Slika 7. Aminokiselina triptofan.

9

Maksimum apsorpcije Trp je na 280 nm, dok je maksimum njegove emisije na 308-

355 nm te ovisi o aminokiselinskom okruženju u kojem se promatrani Trp nalazi. Tako je u

polarnom okruženju (površina proteina) maksimum njegove emisije na višim valnim

duljinama, dok je u nepolarnom okruženju (unutrašnjost proteina) maksimum emisijskog

spektra na nižim valnim duljinama. Osim susjednih aminokiselina, na intenzitet emisijskog

spektra Trp utječu i konformacijske promjene, prisustvo supstrata i denaturacija proteina.

Denaturacijom proteina triptofani postanu više izloženi otapalu pa dolazi do pomaka

emisijskog maksimuma prema višim valnim duljinama [17, 18].

Smanjenje intenziteta fluorescencije naziva se gašenje fluorescencije (eng. quenching).

U fluorimetrijskim istraživanjima gašenje fluorescencije se koristi da bi se odredio položaj

fluorofora u proteinima i njihova dostupnost gasitelju (eng. quencher). Gašenje fluorescencije

može biti statično i dinamično. Kod statičnog gašenja, fluorofori mogu stvoriti

nefluorescentne komplekse s gasiteljima te je takvo gašenje otkriveno kod denaturiranih

proteina ili proteina koji sadrže samo jedan fluorofor. Kod dinamičnog gašenja dolazi do

sudara fluorofora u pobuđenom elektronskom stanju s molekulom gasitelja. Pritom dolazi do

smanjenja intenziteta fluorescencije. Različite tvari, kao što su amini, molekulski kisik,

halogeni elementi, molekule s manjkom elektrona mogu imati ulogu gasitelja.

Akrilamid i KI su gasitelji koji se najčešće koriste za gašenje fluorescencije triptofana.

Ionski gasitelji, kao što je KI, negativno su nabijeni i jako hidratizirani pa gase samo one Trp

koji se nalaze na površini proteina. Triptofanski ostatci smješteni u unutrašnjosti proteina

slabije su dostupni, zbog interakcija jodidnog iona s nabojem okoline. Elektrostatska

privlačenja i odbijanja mogu jako utjecati na gašenje fluorescencije i stvoriti krivu predodžbu

o izloženosti triptofanskih ostataka. Za razliku od KI, akrilamid je velika, nenabijena

molekula koja relativno slabo prodire u hidrofobne dijelove proteina (slika 8.).

Slika 8. Struktura akrilamida.

Kod proteina koji pokazuju maksimalni intenzitet fluorescencije pri nižim valnim

duljinama i kod kojih su triptofani smješteni u unutrašnjosti, gašenje fluorescencije je

10

ograničeno mogućnošću difuzije molekule gasitelja u hidrofobni matriks proteina. Kod

proteina koji pokazuju maksimum intenziteta fluorescencije pri višim valnim duljinama,

fluorescencija se gasi gotovo jednako dobro kao i kod slobodnog Trp u otopini [11].

11

2. MATERIJALI I METODE

2.1. Materijali

2.1.1. Kemikalije

U radu su korištene sljedeće kemikalije, kupljene od dobavljača koji su navedeni u

zagradama: adenozin-trifosfat (ATP) (Fluka), akrilamid (Serva), kalijev jodid, kalijev klorid,

klorovodična kiselina (Kemika), L-fenilalanin (L-Phe) (Sigma), magnezijev klorid heksahidrat

(Merck), Tris(hidroksimetil)-aminometan (Tris) (Sigma).

Korištena voda dobivena je uređajem za pročišćavanje vode Mili-Q Ultrapure Water

Purification System (Millipore).

2.1.2. Otopine

1. 3,64 M akrilamid

2. 0,0986 M ATP

3. 5 M kalijev jodid

4. 2,5 M kalijev klorid

5. 50 mM L-fenilalanin (L-Phe)

6. 50 mM Tris pufer (pH 7,8)

7. 1 M magnezijev klorid

2.1.3. Bakterijski sojevi i plazmidi

Sve proteine TycA-A, korištene u ovom radu, ljubazno je ustupila M. Šprung.

Ukratko, plazmid pQE-60 (Qiagen) koji sadrži gen za adenilacijsku domenu (TycA-A) i

heksahistidinski biljeg (slika 9.), unesen je u bakterijske stanice E. coli soja XL1Blue. Nakon

prekomjerne ekspresije, proteini su pročišćeni afinitetnom kromatografijom i pohranjeni u

puferu sastava: HEPES (50 mM), NaCl (100 mM), MgCl2 (10 mM), EDTA (1 mM), DTE (2

mM), pH 7,8 na -20 °C.

12

Slika 9. Plazmid pQE-60 sadrži gen za rezistenciju na ampicilin te gen iz sustava za sintezu

tirocidina koji kodira za adenilacijsku domenu (TycA-A), ukloniran između NcoI i BamHI

mjesta kloniranja.

2.2. Metode

2.2.1. Mjerenje intrinzične fluorescencije na LS 55 spektrofluorimetru

Za mjerenje fluorescencije korišten je LS 55 spektrofluorimetar (Perkin Elmer), kojim

se upravlja uz pomoć računala (slika 10.).

Slika 10. LS 55 spektrofluorimetar (Perkin Elmer).

13

Sva mjerenja su izvedena u kvarcnim kivetama. Za potrebe mjerenja korišteno je

pobudno zračenje valne duljine 295 nm, širina emitirajućeg otvora od 5,5 nm, širina

pobudnog otvora od 2,5 nm i brzina snimanja spektra 300 nm min-1. Pobudno svjetlo valne

duljine 295 nm omogućuje da se selektivno pobudi samo fluorescencija triptofana. Emisija je

mjerena u rasponu valnih duljina od 308 do 355 nm. Mjerenja su provedena u puferu sastava

Tris (50 mM), pH 7,8 uz dodatak MgCl2 (1 M) pri temperaturi od 25 °C.

2.2.2. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A akrilamidom

Praćeno je gašenje intrinzične fluorescencije divljeg tipa TycA-A i mutanti tijekom

titracije akrilamidom. Na samom početku, potrebno je odrediti fluorescenciju čistog pufera

odnosno slijepe probe. U kvarcnu kivetu se uz pomoć mikropipete doda 2020 μL pufera

sastava Tris (50 mM), pH 7,8 uz dodatak MgCl2 (1 M), te se snimi fluorescencijski spektar.

Taj spektar se koristi za korekciju ostalih spektara. Nakon snimanja slijepe probe, kiveta se

isprazni, opere i osuši. U sljedećem koraku, u kivetu se doda 2015 μL pufera i 5 μL proteina

TycA-A divljeg tipa te se snimi emisijski spektar uzorka. Nakon toga, uzorku se dodaju

alikvoti otopine akrilamida (3,64 M) do konačne koncentracije od 400 mM. Nakon svakog

dodatka akrilamida snimljeni su emisijski spektri proteina s kojih su očitane vrijednosti

maksimuma intenziteta fluorescencije. Na isti način, provedena su i mjerenja za mutante

W227F, W301F, W323F, W376F te W406F.

Proces gašenja fluorescencije, koji je posljedica sudara molekula fluorofora s

molekulama gasitelja opisuje Stern-Volmerova jednadžba:

gdje je F0 početni intezitet fluorescencije, F izmjereni intezitet fluorescencije, Ksv

Stern-Volmerova konstanta i [Q] molarna koncentracija gasitelja.

Pri svakom dodatku alikvota akrilamida koncentracija proteina TycA-A u uzorku se

smanjuje, stoga je potrebno korigirati opažene maksimume intenziteta fluorescencije za faktor

razrjeđenja.

Također, akrilamid apsorbira dio svjetlosti iz pobudnog snopa što se naziva efektom

unutarnjeg filtera (engl. inner filter effect). Zbog toga se zapaženi intenzitet fluorescencije

mora korigirati i za vrijednost faktora kojega opisuje izraz:

14

gdje je Fcorr korigirani intenzitet fluorescencije, Fobs zapaženi intenzitet fluorescencije,

ODex apsorbancija pri valnoj duljini pobude i ODem apsorbancija pri valnoj duljini emisije.

Ukoliko su svi triptofani nekog promatranog proteina jednako izloženi akrilamidu,

Stern-Volmerov grafički prikaz izgledat će kao pravac koji prikazuje linearnu promjenu F0 / F

u ovisnosti od [Q].

2.2.3. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A akrilamidom u prisustvu

supstrata

Praćeno je gašenje fluorescencije divljeg tipa TycA-A i mutanti u prisustvu supstrata.

Kao supstrati su korišteni aminokiselina L-fenilalanin (L-Phe) i ATP. Ponovno se odredi

fluorescencija čistog pufera, odnosno u kivetu se uz pomoć mikropipete doda 2025 μL pufera

sastava Tris (50 mM), pH 7,8 uz dodatak MgCl2 (1 M), te se snimi emisijski spektar. Nakon

toga, kiveta se isprazni, opere i osuši. Zatim se pripremi reakcijska smjesa tako što se u kivetu

doda 1957 μL pufera, 5 μL proteina TycA-A, 22,5 μL ATP (0,09 M) te 40,5 μL L-Phe (50

mM) te se snimi fluorescencijski spektar uzorka. Daljna mjerenja provode se na isti način kao

i bez supstrata tj. uzorku se dodaju alikvoti otopine akrilamida (3,64 M) do konačne

koncentracije od 400 mM te se snimaju emisijski spektri.

Izmjereni intenziteti fluorescencije korigiraju se za faktor razrjeđenja i za efekt

unutrašnjeg filtera, kao i u slučaju bez supstrata.

2.2.4. Gašenje fluorescencije proteina TycA-A kalijevim jodidom

Eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije kalijevim jodidom provedeni su na

proteinima divljeg tipa TycA-A i mutantama. Otopina proteina titrirana je alikvotima KI (5

M) do konačne koncentracije od 400 mM. Kako je KI za razliku od akrilamida, ionski

gasitelj, povećanjem koncentracije KI raste i ionska jakost otopine. Zbog toga su provedeni i

dodatni eksperimenti s kalijevim jodidom gdje su u reakcijsku smjesu dodani točno određeni

alikvoti KCl kako bi ukupna ionska jakost u svakoj točki mjerenja bila jednaka. Pri obradi

eksperimentalnih podataka korištena je Stern-Volmerova jednadžba.

15

3. REZULTATI

Adenilacijska domena tirocidin sintetaze 1 (TycA-A) u svojoj primarnoj strukturi ima

ukupno pet potencijalno fluorescentnih triptofana: W227, W301, W323, W376 i W406 (slika

11.). Triptofan se može selektivno pobuditi na valnoj duljini od 295 nm i pritom je emisijski

spektar promatranog proteina odraz emisije prisutnih Trp. Maksimalni intenzitet emisije

proteina TycA-A nalazi se na valnoj duljini od 341 nm.

Slika 11. Model proteina TycA-A u tioester-formirajućoj konformaciji. Istaknute su velika N-

terminalna (sivo) i mala C-terminalna poddomena (žuto). Crveno su označeni bočni ogranci

Trp. (M. Šprung, Konformacijska dinamika adenilacijske domene tirocidin-sintetaze 1

praćena metodom fluorescencijske spektroskopije., Doktorska disertacija 2014)

3.1. Gašenje fluorescencije proteina akrilamidom bez prisutnih supstrata

Proces u kojem dolazi do smanjenja intenziteta fluorescencije naziva se gašenje

fluorescencije i posljedica je sudara između molekula gasitelja i molekula fluorofora. Kako bi

se ispitala izloženost pojedinih Trp okolnom otapalu, provedeni su eksperimenti gašenja

intrinzične fluorescencije akrilamidom i to po tri nezavisna mjerenja za proteine divljeg tipa

TycA-A i mutante. Korišten je raspon koncentracija akrilamida od 0-400 mM. Dobiveni

rezultati poslužili su za izradu grafičkih prikaza (slika 12-17).

16

Slika 12. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije proteina TycA-A

divljeg tipa s akrilamidom, na kojemu su prikazana tri nezavisna mjerenja, srednja vrijednost

tih mjerenja te je istaknuta standardna devijacija.

Slika 13. Stern-Volmerov dijagram gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom za mutantu

W227F.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0 100 200 300 400 500

F 0/

F

c (akrilamid) / mmol dm-3

WT - 1

WT- 2

WT - 3

WT

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W227F - 1

W227F - 2

W227F - 3

W227F

17

Slika 14. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom za

mutantu W301F.

Slika 15. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom za

mutantu W323F.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W301F-1

W301F-2

W301F-3

W301F

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W323F-1

W323F-2

W323F-3

W323F

18


W376F.


W406F.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W376F-1

W376F-2

W376F-3

W376F

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W406F-1

W406F-2

W406F-3

W406F

19

Dobiveni rezultati poslužili su za izradu zajedničkog grafičkog prikaza (slika 18.) na

kojemu se jasno vidi kako se proteini TycA-A svrstavaju u dvije skupine koje se međusobno

razlikuju po dostupnosti triptofana gasitelju.

Slika 18. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije divljeg tipa TycA-

A i mutanti s akrilamidom. Mjerenja su prosjek tri nezavisna eksperimenta.

Mutante W301F i W376F imaju jednak doseg gašenja fluorescencije kao i protein

divljeg tipa što znači da triptofani na položaju 301 i 376 ili ne pridonose ukupnoj

fluorescenciji proteina ili nisu dostupni gašenju akrilamidom. Mutante W227F, W323F i

W406F u usporedbi s proteinom divljeg tipa, pokazuju manji doseg gašenja fluorescencije pa

se može zaključiti da su triptofani na položaju 227, 323 i 406 izloženiji djelovanju akrilamida.

3.2. Gašenje fluorescencije proteina akrilamidom u prisustvu supstrata

Eksperimenti su provedeni na proteinima divljeg tipa TycA-A i mutantama u prisustvu

L-Phe i ATP-a. U prisustvu supstrata smanjeno je gašenje fluorescencije akrilamidom što se

može objasniti konformacijskom promjenom zbog koje fluorescentni triptofani postaju manje

izloženi gašenju akrilamidom (slika 19-24).

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


WT

W227F

W301F

W323F

W376F

W406F

20

Slika 19. Stern-Volmerov dijagram gašenja intrinzične fluorescencije divljeg tipa TycA-A bez

supstrata te s 1 mM L-Phe i 1 mM ATP-om. Prikazana mjerenja su prosjek tri nezavisna

eksperimenta.

Slika 20. Stern-Volmerov dijagram gašenja intrinzične fluorescencije bez supstrata te s 1 mM

L-Phe i 1 mM ATP-om za mutantu W301F.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


WT

WT + L-Phe/ATP

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W301F

W301F + L-Phe/ATP

21





1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W323F

W323F + L-Phe/ATP

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W376F

W376F + L-Phe/ATP

22



Eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije mutante W227F u prisustvu supstrata

(L-Phe i ATP) pokazali su drukčije rezultate.

Slika 24. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije bez supstrata te s

1 mM L-Phe i 1 mM ATP-om za mutantu W227F.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 100 200 300 400 500

F 0 /

F


W406F

W406F + L-Phe/ATP

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F


W227F

W227F + L-Phe/ATP

23

Iz dijagrama (slika 19-24) za divlji tip proteina TycA-A i sve mutante vidljivo je da je

doseg gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom u prisustvu supstrata manji od onoga

bez prisustva supstrata. Naime, vezanje supstrata inducira konformacijsku promjenu proteina

tijekom koje indolni bočni ogranci promatranih triptofana postaju manje izloženi i teže

dostupni gasitelju. Mutanta W227F (slika 24.) pokazuje neznatnu razliku u dosegu gašenja

fluorescencije s obzirom na prisustvo supstrata. Iz toga proizlazi, da konformacijska promjena

proteina, nastala kao posljedica vezanja supstrata, izostaje ukoliko se triptofan na položaju

227 zamijeni fenilalaninom. Stoga se može zaključiti da je promjena konformacije proteina,

lokalizirana upravo u blizini ovog aminokiselinskog ostatka.

3.3. Gašenje fluorescencije kalijevim jodidom

Za razliku od akrilamida, kalijev jodid je ionski gasitelj. Zbog negativnog naboja i

hidratacije I- iona, KI teško prodire u hidrofobni matriks proteina i gasi fluorescenciju samo

onih triptofana koji se nalaze na površini proteina.

Provedeni su eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije kalijevim jodidom za

proteine divljeg tipa TycA-A i za mutante. Korišten je raspon koncentracija KI od 0-400 mM.

Dobiveni rezultati poslužili su za izradu grafičkog prikaza (slika 25.).

Slika 25. Stern-Volmerov grafički prikaz gašenja intrinzične fluorescencije divljeg tipa TycA-

A i mutanti s kalijevim jodidom. Mjerenja su prosjek tri nezavisna eksperimenta.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 100 200 300 400 500

F 0/

F

c (KI) / mmol dm-3

W323F

W301F

W376F

W227F

WT

W406F

24

Gašenjem fluorescencije kalijevim jodidom svi proteini TycA-A pokazuju odstupanje

od linearnog Stern-Volmerovog grafičkog prikaza. Iz dijagrama je vidljivo kako mutante

W323F, W301F i W376F pokazuju veći doseg gašenja fluorescencije kalijevim jodidom.

Divlji tip proteina TycA-A te mutante W227F i W406F pokazuju manji doseg gašenja

fluorescencije.

3.4. Analiza dosega gašenja fluorescencije korištenjem akrilamida i kalijevog

jodida

Kako bi se ispitala učinkovitost pojedinih molekula gasitelja, provedeni su

eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije proteina TycA-A s akrilamidom i kalijevim

jodidom. Prikazana mjerenja su prosjek tri nezavisna eksperimenta. Korišten je raspon

koncentracija molekula gasitelja od 0-400 mM. Iz grafičkih prikaza vidljivo je kako je kod

svih proteina TycA-A doseg gašenja intrinzične fluorescencije s akrilamidom puno veći nego

u slučaju s KI (slika 26. A) i B)).

A)

0

0.5

1

0 100 200 300 400

Rel

ativ

na

flu

ore

sce

nci

ja


WT

W227F

W301F

W323F

W376F

W406F

25

B)

Slika 26. Usporedba gašenja intrinzične fluorescencije proteina TycA-A: A) akrilamidom i B)

kalijevim jodidom. Mjerenja su prosjek tri nezavisna eksperimenta. Korišten je raspon

koncentracija molekula gasitelja 0-400 mM.

Iz dobivenih rezultata može se zaključiti da je akrilamid, u usporedbi s kalijevim

jodidom učinkovitiji gasitelj. Daljni eksperimenti s kalijevim jodidom nisu provedeni, zbog

nemogućnosti obrade dobivenih eksperimentalnih podataka na Stern-Volmerov grafički

prikaz.

0

0.5

1

0 100 200 300 400

Rel

ativ

na

flu

ore

sce

nci

ja

c (KI) / mmol dm-3

WT

W227F

W301F

W323F

W376F

W406F

26

4. RASPRAVA

Tirocidin-sintetaza građena je od tri multifunkcionalna enzima: tirocidin-sintetaze 1

(TycA), tirocidin-sintetaze 2 (TycB) i tirocidin-sintetaze 3 (TycC). TycA je monomodularna

peptid-sintetaza i građena je od tri domene: adenilacijske (A), tiolacijske (T) i epimerazne (E).

Proces biosinteze tirocidina započinje na A-domeni tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A).

Ova domena u prisustvu Mg2+ iz aminokiseline i ATP-a sintetizira aminoacil-adenilat. TycA-

A se sastoji od dvije poddomene: velike N-terminalne i male C-terminalne poddomene, koje

međusobno zatvaraju procjep aktivnog mjesta. U trenutku kada aktivno mjesto enzima veže

supstrate (aminokiselinu i ATP (Mg2+)), enzim prelazi u adenilat-formirajuću konformaciju.

Tijekom katalitičkog ciklusa, mala se C-terminalna poddomena u odnosu na veliku N-

terminalnu poddomenu rotira za 140° te enzim iz adenilat-formirajuće konformacije prelazi u

tioestersku konformaciju. Za vrijeme takve konformacije odvija se prijenos aktiviranog

aminokiselinskog supstrata na T-domenu.

Kako bi se ispitala strukturna dinamika A-domene, u ovom radu korištena je A-

domena tirocidin sintetaze 1 (TycA-A), koja u aminokiselinskom slijedu ima ukupno pet

triptofana. Maksimalni intenzitet emisije proteina TycA-A nalazi se na valnoj duljini od 341

nm, što upućuje na zaključak da većina opažene fluorescencije potječe od triptofana iz

polarnog mikrookoliša.

Kako bi ispitali izloženost pojedinih triptofana u proteinu TycA-A, provedeni su

eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije akrilamidom za protein divljeg tipa i mutante.

Rezultati ukazuju da se proteini TycA-A mogu svrstati u dvije skupine, koje se međusobno

razlikuju po obimu izloženosti promatranog triptofana okolnom otapalu. Tako primjerice,

mutante W323F, W406F i W227F pokazuju manji doseg gašenja fluorescencije akrilamidom,

dok protein divljeg tipa te mutante W376F i W301F pokazuju znatno veći doseg gašenja

ukupne fluorescencije. Budući da su kod mutanti W323F, W406F te W227F, triptofani na

položaju 323, 406 i 227 zamijenjeni fenilalaninom, gašenje fluorescencije zapravo je odraz

gašenja fluorescencije preostalih triptofana ovih mutanti. Stoga, možemo zaključiti kako su

triptofani na spomenutim položajima, više dostupni molekulama gasitelja. Kako mutante

W376F i W301F, u kojima su triptofani na položaju 376 i 301 zamijenjeni fenilalaninom,

pokazuju isti obim gašenja fluorescencije kao i protein divljeg tipa, možemo zaključiti da je

njihov doprinos ukupnoj fluorescenciji zanemariv ili da ovi ostaci nisu dostupni molekulama

gasitelja.

27

Za razliku od spomenutog, prisustvo supstrata (L-Phe i ATP) u reakcijskoj smjesi

rezultira sveukupno nižim dosegom gašenja fluorescencije kod proteina divljeg tipa i svih

mutanti. To upućuje na zaključak da vezanje supstrata dovodi do promjene konformacije

proteina tijekom koje promatrani triptofani postaju manje izloženi i teže dostupni molekulama

gasitelja. Mutanta W227F pokazuje neznatnu razliku u dosegu gašenja bez i sa supstratima.

Naime, ispitivanjem adenilacijske aktivnosti mutante W227F utvrđeno je kako ova mutanta

veže aminokiselinski supstrat jednako učinkovito kao i protein divljeg tipa [11]. Iz toga

proizlazi da konformacijska promjena proteina, nastala kao posljedica vezanja supstrata,

izostaje ukoliko se triptofan na položaju 227 zamijeni fenilalaninom. To upućuje na zaključak

da je promjena konformacije proteina, lokalizirana upravo oko ovog triptofanskog ostatka.

Također su provedeni eksperimenti gašenja intrinzične fluorescencije kalijevim

jodidom za proteine divljeg tipa TycA-A i mutante. Korištenjem kalijevog jodida, svi proteini

TycA-A pokazuju znatno manji doseg gašenja fluorescencije nego u slučaju s akrilamidom.

Ispitivanje učinkovitosti pojedinih molekula gasitelja, upućuje na zaključak da gašenje

fluorescencije akrilamidom u usporedbi s KI ima sveukupno veći efekt gašenja te da je

akrilamid učinkovitiji gasitelj. Gašenjem intrinzične fluorescencije kalijevim jodidom svi

proteini TycA-A pokazuju odstupanje od linearnog Stern-Volmerovog grafičkog prikaza, pa

daljni eksperimenti s KI nisu provedeni zbog kompleksnosti obrade dobivenih rezultata.

28

5. ZAKLJUČCI

Adenilacijska domena tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A) u svojoj primarnoj strukturi ima

ukupno pet triptofana s maksimumom emisije kod valne duljine od 341 nm. Nejednaki

dosezi gašenja fluorescencije akrilamidom ukazuju na dvije skupine triptofana u

proteinu TycA-A, koje se međusobno razlikuju po stupnju dostupnosti okolnom

otapalu.

Gašenje fluorescencije u prisustvu supstrata, ukazuje na manji obim gašenja za razliku

od onog bez supstrata, što upućuje na konformacijsku promjenu proteina.

Mutanta W227F pokazuje najmanju razliku u dosegu gašenja bez i sa supstratima. Iz

toga se može zaključiti kako je konformacijska promjena do koje dolazi zbog vezanja

supstrata, lokalizirana oko ovog triptofana.

Gašenje fluorescencije kalijevim jodidom u usporedbi s akrilamidom, ukazuje na

sveukupno manji efekt gašenja, što upućuje na zaključak da je akrilamid učinkovitiji

gasitelj.

29

6. LITERATURA

1. M. A. Marahiel, L. O. Essen, Nonribosomal peptide synthetases: mechanistic and

structural aspects of essential domains, Meth. Enzymol. 458 (2009) 337-351.

2. M. A. Marahiel, R. Finking, Biosynthesis of nonribosomal peptides, Annu. Rev.

Microbiol. 58 (2004) 453-488.

3. S. A. Sieber, M. A. Marahiel, Molecular mechanisms underlying nonribosomal

peptide synthesis: approaches to new antibiotics. Chem. Rev. 105 (2005) 715–738.

4. M. A. Marahiel, Protein templates for the biosyntesis of peptide antibiotics, Chem.

Biol. 4 (1997) 561-567.

5. G. Mittenhuber, R. Weckermann, M. A. Marahiel, Gene cluster containing the genes

for tyrocidine synthetases 1 and 2 from Bacillus brevis: evidence for an operon, J.

Bacteriol. 171 (1989) 4881-4887.

6. M. A. Marahiel, T. Stachelhaus, H. D. Mootz, Modular peptide synthetases involved

in nonribosomal peptide synthesis, Chem. Rev. 7 (1997) 2651-2674.

7. D. Schwarzer, R. Finking, M. A. Marahiel, Nonribosomal peptides: From genes to

products, Nat. Prod. Rep. 20 (2003) 275-287.

8. H. D. Mootz, M. A. Marahiel, The tyrocidine biosynthesis operon of Bacillus brevis:

complete nucleotide sequence and biochemical characterization of functional internal

adenylation domains, J. Bacteriol. 179 (1997) 6843-6850.

9. V. Bučević-Popović, Neribosomske peptid-sintetaze: Utjecaj očuvanih regija

adenilacijske domene na strukturna i funkcionalna obilježja tirocidin-sintetaze 1,

Doktorska disertacija, Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet,

Zagreb (2010) 14-28.

10. M. A. Marahiel, Working outside the protein-synthesis rules: insights into

nonribosomal peptide synthesis, J. Pept. Sci. 15 (2009) 799-807.

11. M. Šprung, Konformacijska dinamika adenilacijske domene tirocidin-sintetaze 1

praćena metodom fluorescencijske spektroskopije, Doktorska disertacija, Sveučilište u

Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb (2014) 11-19.

12. T. Stachelhaus, A. Hüser, M. A. Marahiel, Biochemical characterization of peptidyl

carrier protein (PCP), the thiolation domain of multifunctional peptide synthetases,

Chem. Biol. 3 (1996) 913-921.

30

13. S. A. Samel, G. Schoenafinger, T. A. Knappe, M. A. Marahiel, L. O. Essen, Structural

and functional insights into a peptide bond-forming bidomain from a nonribosomal

peptide synthetase, Structure 15 (2007) 781-792.

14. J. W. Trauger, R. M. Kohli, H. D. Mootz, M. A. Marahiel, C. T. Walsh, Peptide

cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase, Nature 407

(2000) 215-218.

15. J. T. Vivian, P. R. Callis, Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins,

Biophys. J. 80 (2001) 2093-2109.

16. J. R. Lakowitz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer, New York (2006).

17. C. P. Pan, P. L. Muiño, M. D. Barkley, P. R. Callis, Correlatio of tryptophan

fluorescence spectral shifts and lifetimes arising directly from heterogeneous

environment, J. Phys. Chem. 115 (2011) 3245-3253.

18. Y. Chen, M. D. Barkley, Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins.

Biochemistry, 37 (1998) 9976-9982.

31

7. METODIČKI DIO

STUDENT/ICA: Ines Tomić datum:

MENTOR/ICA: mr.sc. Roko Vladušić ŠKOLA: Razredni

odjel: 4

NASTAVNI PREDMET: KEMIJA

NASTAVNA CJELINA / TEMA: Biomolekule

NASTAVNA JEDINICA: Enzimi (globularni proteini)

CILJ SATA: Stjecanje znanja o građi i ulozi enzima te upoznavanje s metodom

fluorescencijske spektroskopije.

ZADATCI NASTAVE:

Obrazovni:

- razumijeti ulogu enzima

- stjecanje znanja o građi enzima

- razumijeti konformacijske promjene aktivnog mjesta

- naučiti razliku između ireverzibilnih i reverzibilnih inhibitora

- upoznati metodu fluorescencijske spektroskopije

Funkcionalni:

- razvijati sposobnosti promatranja, uočavanja i logičkog zaključivanja

- razvijati sposobnosti usmenog i pismenog izražavanja

- razvijati intelektualne sposobnosti

- poticati interes učenika za biokemijska istraživanja

Odgojni:

- razvijati komunikacijske sposobnosti

- razvijati radne navike, urednost, marljivost i preciznost

- razvijati suradnju s drugim učenicima

- razvijati znatiželju za izučavanjem kemije

IZVORI ZNANJA

- živa riječ nastavnika

32

- učenikovo iskustvo

- eksperiment

Nastavna sredstva: udžbenik, Power point prezentacija – Enzimi

Izvorna stvarnost: Eksperiment: Raspad vodikova peroksida djelovanjem katalaze iz jetre

NASTAVNA POMAGALA:

- ploča, kreda, računalo, LCD projektor, projekcijsko platno, pokazivač

NASTAVNE METODE:

- metoda razgovora

- metoda usmenog izlaganja

- metoda pisanja

- metoda praktičnog rada

OBLICI RADA:

- frontalni rad

- individualni rad

- grupni rad

TIP SATA: Obrada novih sadržaja.

KORELACIJA:

Hrvatski jezik – pravilno izražavanje

Biologija- Fiziologija čovjeka

ETAPA

SATA

(vrijeme)

Uvodni dio

5 min

ARTIKULACIJA NASTAVNOG SATA

Kratkim pitanjima uvesti ću učenike u nastavnu jedinicu. (metoda razgovora;

frontalni rad)

- Koje namirnice su bogate proteinima? (meso, riba, jaja..)

- Koje su osnovne građevne jedinice proteina? (aminokiseline)

- Kako se naziva veza kojom se aminokiseline povezuju u lanac?

(peptidna veza)

- Koja je uloga proteina u organizmu? (djeluju kao enzimi, hormoni;

izgrađuju kožu, kosu, nokte...)

- Jesu li svi proteini enzimi? (nisu)

33

Glavni dio

30 min

- Jesu li svi enzimi proteini? (jesu)

NAJAVA CILJA I ZAPIS NA PLOČI: Enzimi

Podijelit ću učenike u 5 skupina. Učenici će dobiti stalak sa po 3

epruvete u koje će uliti po 3 ml vodikovog peroksida (w=3%). Prvu epruvetu

će ostaviti za usporedbu, u drugu će dodati malo manganovog (IV) oksida, a u

treću komadić svježe jetre. Nakon toga, učenici će dobiti po još 4 epruvete u

kojima će ispitivati kako promjena temperature i pH utječu na enzimsku

aktivnost. (metoda praktičnog rada; rad u skupini)

Učenici će dobiti radne listove koji će ih voditi kroz eksperiment i koje

će morati samostalno riješiti. (metoda pisanja; individualni rad)

Zajednički ćemo napraviti analizu radnih listova. (metoda razgovora;

frontalni rad)

Nakon izvedenog eksperimenta zaključit ćemo da su katalizatori tvari

koje ubrzavaju kemijsku reakciju, a iz nje izlaze nepromijenjeni. Oni snizuju

energiju aktivacije odnosno minimalnu energiju koju molekule moraju imati da

bi uopće došlo do reakcije. Za razliku od njih, enzimi su biokatalizatori koji

kataliziraju složene biokemijske reakcije koje se odvijaju u organizmu, te iz

njih izlaze nepromijenjeni. Također ćemo zaključiti da promjena temperature

ili pH utječe na konformaciju enzima a time i na njegovu aktivnost.

Postavljanjem kratkih pitanja i uz pomoć 'powerpoint' prezentacije

upoznat ću učenike s različitim vrstama enzima. (metoda razgovora i metoda

demonstracije; frontalni rad)

- Nabrojite mi neke poznate enzime. (laktaza, amilaza, ureaza..)

- Obratite pozornost na nazive tih enzima. Što im je zajedničko?

(nastavak - aza)

Na 'powerpoint' prezentaciji prikazati ću tablicu s različitim vrstama enzima te

reakcijama koje kataliziraju.

- Hoće li laktaza katalizirati hidrolizu proteina, a proteaza hidrolizu

mliječnog šećera? (ne)

Zaključit ćemo da su enzimi visokospecifične molekule koje mogu katalizirati

samo jednu vrstu reakcije ili skup srodnih reakcija.

34

- Zašto laktaza neće katalizirati hidrolizu proteina? (zbog oblika aktivnog

mjesta)

Pokazat ću učenicima na 'powerpoint' prezentaciji kako oblik aktivnog

mjesta odgovara točno određenom supstratu i upoznati ih s tzv. modelom

izazvanog pristajanja. (metoda demonstracije i metoda razgovora; frontalni

rad)

- Kako se zovu tvari na koje enzimi djeluju? (supstrati)

- Što je aktivno mjesto? (dio enzima koji veže supstrat)

Zaključit ćemo da oblik aktivnog mjesta enzima odgovara obliku supstrata.

Reakcijom enzima sa supstratom, nastaje kompleks enzim-supstrat.

- Mijenja li se konformacija aktivnog mjesta nakon vezanja

supstrata?(mijenja, jer aktivno mjesto nije krute strukture, fleksibilno

je)

Zaključit ćemo da tzv. model izazvanog pristajanja slikovito prikazuje način na

koji enzimi djeluju na supstrate. Vezanje supstrata u aktivno mjesto enzima,

dovodi do promjene konformacije aktivnog mjesta, tako da se ono u potpunosti

prilagodi supstratu. Reakcijom enzima sa supstratom, nastaje kompleks enzim-

supstrat. Nakon završene reakcije produkti se otpuštaju s aktivnog mjesta koje

onda opet poprima početnu konformaciju.

Metodom razgovora i postavljanjem kratkih pitanja učenicima ću

objasniti što su inhibitori. (metoda razgovora; frontalni rad)

- Kako se zovu tvari koje ometaju djelovanje pojedinih enzima?

(inhibitori)

- Što su ireverzibilni inhibitori? (tvari koje se nepovratno vežu u aktivno

mjesto enzima i blokiraju njegovo djelovanje)

- Što su reverzibilni inhibitori? (tvari koje se slabim vezama vežu na

aktivno mjesto enzima)

Zaključit ćemo da se kompeticijski inhibitori natječu sa supstratom za vezanje

na aktivno mjesto enzima. Suprotno tome, nekompeticijski inhibitori se vežu

bilo gdje na molekulu enzima i time narušavaju njegovu konformaciju i

ometaju vezanje supstrata.

- Što su aktivatori? (tvari koje aktiviraju jedan ili više enzima)

35

Ponavljanje

10 min

Učenici će dobiti radne listove koje će riješavati samostalno. (metoda pisanja;

individualni rad) Nakon toga ćemo zajedno napraviti analizu.

PLAN PLOČE

ENZIMI

- biokatalizatori

- nastavak – aza

- aktivno mjesto

- enzim + supstrat → kompleks (enzim-supstrat) → enzim + produkti

- tzv. model izazvanog pristajanja

- osjetljivi na promjenu pH i T

- ireverzibilni inhibitori

- reverzibilni inhibitori: 1. kompeticijski

2. nekompeticijski

- aktivatori

RADNI LIST ZA PONAVLJANJE

1. Na slici označi: enzim, supstrat, produkt, kompleks enzim-supstrat i aktivno

mjesto.

2. Nadopuni rečenice:

a) _______________ inhibitori se vrlo često kovalentno vežu na aktivno

mjesto enzima, ______________ inhibitori se vežu slabim vezama na aktivno

mjesto enzima.

b) ______________ inhibitori se vežu bilo gdje na molekulu enzima i time

36

narušavaju njegovu nativnu konformaciju, što ometa vezanje __________ na

aktivno mjesto enzima.

3. Zaokruži ispravnu tvrdnju.

a) Enzimi povisuju energiju aktivacije.

b) Enzimi nisu osjetljivi na promjenu pH.

c) Enzimi su biokatalizatori koji sudjeluju u reakciji, ali iz nje izlaze

nepromijenjeni.

4. Što je tzv. model izazvanog pristajanja? Objasni!

_______________________________________________________________

RADNI LIST

Raspad vodikova peroksida djelovanjem katalaze iz jetre

Ime i prezime: ___________________

Pribor i kemikalije: stalak sa sedam epruveta, plastična žličica, kapalice,

pinceta, menzura, treščica, čaše, plamenik, 3 % vodikov peroksid, manganov

(IV) oksid, natrijeva lužina (1M), klorovodična kiselina (1M) i pileća jetra.

MJERE OPREZA: Koristiti kutu i zaštitne naočale.

POSTUPAK:

1. Ulijte u 3 epruvete po 4 mL 3% vodikovog peroksida.

2. Prvu epruvetu ostavite za usporedbu.

3. U drugu epruvetu dodajte malo manganovog (IV) oksida, tek toliko koliko

stane na vrh noža. Promućkajte sadržaj epruvete i zabilježite opažanja.

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

4. Unesite tinjajuću treščicu u epruvetu i zabilježi opažanja.

_______________________________________________________________

5. Manganov (IV) oksid je _______________ koji ubrzava reakciju raspada

vodikovog peroksida.

6. U treću epruvetu uz pomoć pincete dodajte mali komadić pileće jetre.

Promućkajte sadržaj epruvete i zabilježite opažanja.

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

37

7. Unesite tinjajuću treščicu u epruvetu i zabilježi opažanja.

_______________________________________________________________

8. Katalaza iz jetre je _____________ koji ubrzava reakciju raspada vodikovog

peroksida na vodu i plin __________.

9. Kemijskom jednadžbom prikaži reakciju razlaganja vodikovog peroksida.

2. dio

POSTUPAK:

1. U prvu epruvetu pincetom dodajte mali komadić pileće jetre i ulijte 5 mL

vode. Sadržaj epruvete zagrijavajte na plamenu plamenika, dok voda ne

provrije. Ostavite da se hladi 2 minute, odlijte vodu te u epruvetu dodajte 3 mL

3% vodikovog peroksida.

Zabilježi opažanja.

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

2. Kako promjena temperature utječe na aktivnost enzima?

_______________________________________________________________

3. U tri epruvete ulijte 3 mL 3% vodikovog peroksida.

4. U prvu epruvetu dodajte 5 kapi natrijeve lužine (1M), u drugu 5 kapi

klorovodične kiseline (1M), a u treću 5 kapi destilirane vode. Nakon toga,

pokušajte istovremeno u sve tri epruvete dodati mali komadić pileće jetre.


_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

5. Kako promjena pH utječe na aktivnost enzima?

_______________________________________________________________

_______________________________________________________________

ZA NADARENE UČENIKE

Kratkim pitanjima te uz pomoć 'powerpoint' prezentacije učenike ću

upoznati sa strukturom tirocidin-sintetaze. (metoda razgovora i metoda

demonstracije; frontalni rad)

Na 'powerpoint' prezentaciji pokazat ću im sliku tirocidin-sintetaze.

38

Postavljanjem pitanja te uz moje navođenje, učenici će doći do zaključka da je

tirocidin-sintetaza veliki multifunkcionalni protein koji se sastoji od tri

multifunkcionalna enzima: tirocidin-sintetaze 1, tirocidin-sintetaze 2 i

tirocidin-sintetaze 3. Sva tri enzima sastoje se od različitih modula koji se pak

sastoje od različitih domena. Iz svega ovoga možemo zaključiti kako je

struktura proteina poprilično kompleksna.

Naime, da bi se u potpunosti razumjela funkcija proteina, potrebno je poznavati

njegovu strukturu. Za otkrivanje strukture proteina često se koristi metoda

fluorescencijske spektroskopije, jer gotovo svi proteini posjeduju svojstvo

fluorescencije. (metoda usmenog izlaganja; frontalni rad)

- Koje aminokiseline u svojoj strukturi imaju aromatske prstenove?

(triptofan, tirozin, fenilalanin)

Upravo te aminokiseline odgovorne su za fluorescenciju proteina. Pošto

najveći udio fluorescencije potječe od triptofana, ta aminokiselina se najčešće

koristi za određivanje strukture proteina.

Na 'powerpoint' prezentaciji pokazat ću im sliku adenilacijske domene

tirocidin- sintetaze 1, koja u svojoj primarnoj strukturi ima ukupno pet

triptofana. (metoda demonstracije; frontalni rad)

Objasnit ću im da je maksimum apsorpcije triptofana na 280 nm, dok je

maksimum njegove emisije u proteinima na 308-355 nm i ovisi o okruženju u

kojem se promatrani triptofan nalazi.

Podijelit ću učenike u 5 skupina. Učenici će dobiti proteine kojima će

metodom fluorescencijske spektroskopije na spektrofluorimetru mjeriti

fluorescenciju. (metoda praktičnog rada; rad u skupini)

Podijelit ću učenicima radne listove koji će ih voditi kroz eksperiment i koje će

morati samostalno riješiti. (metoda pisanja; individualni rad)

RADNI LIST

Mjerenje fluorescencije proteina metodom fluorescencijske

spektroskopije

Ime i prezime:_________________

Pribor i kemikalije: gumene rukavice, kiveta, mikropipeta, protein TycA-A,

destilirana voda, 50 mM Tris pufer.

39

POSTUPAK:

Za mjerenje fluorescencije koristi se LS 55 spektrofluorimetar, kojim se

upravlja uz pomoć računala.

1. Upaliti računalo i spektrofluorimetar.

2. Pokrenuti program –FL WinLab.

3. Kivetu oprati destiliranom vodom i osušiti.

4. Na samom početku, potrebno je odrediti fluorescenciju čistog pufera

odnosno slijepe probe. Uz pomoć mikropipete u kivetu dodajte 2020 μL Tris

pufera.

5. Otvorite spektrofluorimetar i kivetu postavite na točno odgovarajuće mjesto,

nakon toga zatvorite spektrofluorimetar.

6. Snimite emisijski spektar i zabilježite opažanja.

_______________________________________________________________

7. Nakon snimanja slijepe probe, kiveta se isprazni, opere i osuši.

8. U sljedećem koraku, u kivetu se uz pomoć mikropipete doda 2015 μL Tris

pufera i 5 μL proteina TycA-A.

9. Kiveta se ponovno postavi u spektrofluorimetar te se snimi emisijski spektar

uzorka.


_______________________________________________________________

PRIKAZ SADRŽAJA NA PROJEKCIJI

40

MODEL “izazvanog pristajanja”

41

TIROCIDIN-SINTETAZA

LITERATURA, IZVORI ZA UČENIKA:

- D. Stričević, B. Sever, Organska kemija, udžbenik za četvrti razred

gimanzije, Profil, Zagreb (2003.)

- D. Stričević, B. Sever, Organska kemija, radna bilježnica za četvrti

razred gimanzije, Profil, Zagreb (2003.)

LITERATURA, IZVORI ZA NASTAVNIKA:

STRUČNA:

- Stryer, Biokemija, Školska knjiga, Zagreb (1991.)

- D. Stričević, B. Sever, Organska kemija, udžbenik za četvrti razred

42

gimnazije, Profil, Zagreb (2003.)

- D. Stričević, B. Sever, Organska kemija, radna bilježnica za četvrti

razred gimnazije, Profil, Zagreb (2003.)

METODIČKA:

- M. Sikirica, Metodika nastave kemije, Školska knjiga, Zagreb (2003.)

- Ž. Mrklić, Metodika nastave kemije, Split (1999.)

Documents

sintetaze 1