Sintezna biologija

za

bionanotehnologijo

Roman Jerala

Kemijski inštitut

FKKT UL

6. Nanotehnološki dan 17. september 2010

Bio-Nanomateriali

Biološki sistemi so nanosistemi,

ki dejansko delujejo !

Prednosti !

Ali znamo sestaviti umetne

nanostroje in nanostrukture ?

Nanomateriali imajo številne

tehnološke ugodne lastnosti.

Večinoma so pripravljeni iz

anorganskih ali organskih

materialov enega tipa –

relativno enostavne strukture.

Bio-nanostrukture v

naravi

Prednosti Bio-Nanomaterialov

-Samosestavljivost

-Tvorba kompleksnih 3D struktur in njihovo

povezovanje

-Raznolike lastnosti – mehanske, električne,

optične, kemijske...

-Cenena izdelava z industrijskimi

mikroorganizmi

-Biokompatibilnost za medicinske aplikacije

Kaj je sintezna biologija

• Načrtovanje in ustvarjanje novih bioloških funkcij in sistemov

• Inženiring bioloških sistemov

• “Celična tovarna“

Dva temeljna pristopa

sintezne biologije

Modularna osnova sintezne biologije

•Spreminjanje

obstoječih bioloških

sistemov

•Rekonstrukcija novih bioloških

sistemov:

•Tvorba celotnega genoma

•Sestavljanje najmanjših

sistemov, ki se lahko

podvajajo

BioBricks (BioKocke) kot modularni gradniki:

- regulatorna zaporedja

- zapisi za proteine

DNK moduli kot navodilo za

izvajanje celičnega programa

Modularna osnova sintezne biologije

Kemijska sinteza genov

Avtomatska sinteza določenega

nukleotidnega zaporedja

1985 prvi sintetični gen v tedanji

Jugoslaviji pr. 300 nukleotidov – danes

ga za 250 € dobimo v dveh tednih

Danes s pomočjo robotov lahko

sestavimo DNK velikosti več 10,000 nt

kemijska sinteza

oligonukleotidov

parjenje

povezovanje

vstavitev v

plazmid

vnos v

celico

Področja uporabe

sintezne biologije

• diagnostika in zdravljenje bolezni

• obnovljivi viri energije

• novi materiali & bionanomateriali

• procesiranje informacij

• biosenzorji in bioremediacija okolja...

Sinteza zdravila proti malariji

artemisinin

250 milijonov okuženih

1 milijon žrtev letno

Izolacija iz

enoletnega

pelina

visoka cena

Sintezna biologija za pripravo zdravil

Prenos biosintezne poti v bakterije

pomočjo sintezne biologije

Sintezna biologija za pripravo zdravil

Obnovljivi viri energije iz biomase

CO2

celuloza sladkorji

gorivo

biomasa iz rastlin

pretvorba z

mikroorganizmi

encimi

Sintezna biologija za obnovljive vire energije

Priprava goriva iz rastlinske

biomase v bakterijah

Steen in sod. Nature 2010

Uporaba celic za procesiranje

informacij

• DNK vsebuje gostoto informacije ~1 bit/nm3,

kar je bistveno več kot obstoječi elektronski

mediji

• DNK omogoči izvajanje logičnih operacij

Sinhrona bakterijska uraDanino, Nature 2010

Bakterijski števec Friedland, Science 2009

Dosežki sintezne biologije na

Kemijskem inštitutu

• Sintezna imunologija:

– Spreminjanje celične

signalizacije – detekcija

virusa, spreminjanje

celičnega odziva

– Priprava cepiv nove

generacije

• Bionanotehnologija:

– Priprava

nanomaterialov na

osnovi DNK in

peptidov

iGEMmednarodno tekmovanje gensko

spremenjenih strojev

• 2004: srečanje petih ameriških ekip (MIT, BU, Caltech, UT Austin, Princeton)

• 2005: prvo mednarodno srečanje: 13 ekip, 2 evropski (ETH in Cambridge), ni formalnih nagrad in sodnikov

• 2006: 37 ekip iz vsega sveta

• 2007: 54 ekip

• 2008: 84 ekip

• 2009: 121 ekip

• 2010: 128 ekip

Projekt 2006 – zmanjšanje

pretiranega imunskega odziva

Osnovni koncept:

zmanjšanje pretiranega

celičnega odziva

Sepso sproži pretiran

vnetni odziv, ki ga sprožijo

sestavine patigenih bakterij

200,000 žrtev letno v EU,

ni učinkovitega zdravila

OkužbaCe

lič

ni o

dziv

zmanjšanje

odziva

Model z dodano negativno povratno zanko

vnetni posredniki

signalna

veriga

zaviralec zaustavi

pretiran odziv

Slovenska ekipa je v prvem nastopu osvojila Grand Prize.

detekcija virusne okužbe, ki je neobčutljiva

za mutacije

Slovenski iGEM projekt 2007

Virusni senzor na osnovi dimerizacije

CD4

prepisovanje protivirusnih obrambnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)

fuzija receptorja z deli TEV

proteaze

HIV-I

virus

cepitev membranskega sidra

(TEV substrate

CCR5

aktivirana TEV

proteaza

T7 RNAP

NLS signal

premik v jedro

Povezava dveh korakov:

aktivacija celic na osnovi TEV-T7

kontrola + gp120 + HIV psevdovirus

Sintetično cepivo proti

bakteriji Helicobacter pylori

iGEM2008

NFκBP50/52

E. coli

Aktivacija celice:

•kemokini

•citokini

•interferon...

Izogibanje imunskega sistema

Flagelin

H. pylori

TLR5 ne

prepozna

flagelina

H. pylori

FlagelinTLR5

Sestava sintetičnega cepiva

Variabilna domena

flagelina H.

pylori

H. pylori antigen

(npr. UreB)

proteinski antigeni

(aktivacija adaptivne

imunosti)

Aktivacija prirojene

imunosti (TLR5)

prirojen imunski odziv

pridobljen imunski odziv (proti antigenom H.pylori)

Celični in humoralni imunski odziv

Prezentacija antigena, aktivacija citokinov, ... DC, makrofagi…

activation

NFκBP50/52

TLR5

himerni flagelin-H. pylori antigen

DNK cepivo

Tkivo

DNKcepivo

[primerjava DNK in polipeptidov

kot gradnikov nanostruktur]

DNK polipeptidi

vsebuje 4 nukleotide s podobnimi

lastnostmi -vsebujejo 20 AK z različnimi

kemijskimi lastnostmi +se lahko zvije v določene 3D

strukture +/-se lahko zvijejo v določene 3D

strukture +v naravi shranjuje informacije

-v naravi gradijo strukture in

funkcionalne “naprave” +lahko se programira (W-C bazni

pari)

+

informacija kodira strukturo na

kompleksen način -

intro

[kontrola sestavljanja struktur iz DNK]

S pomočjo parjenja baz lahko kontrolirano povezujemo

verige DNK

[sestavljanje DNK origami]

[geometrijski liki iz DNK]

Rothemund, Nature 2006He et al., Nature 2008, ChemComun 2006

[bolj kompleksne sestavljene strukture]

100 nm

[Nano zemljevid Slovenije iz DNK]

Miha Jerala, Gimnazija Vič

Iva Hafner Bratkovič, KI

Sestavljen iz

7249 nt dolgega

DNK genoma

bakteriofaga

M13 ter

227 sintetičnih

oligonukleotidov

Uporaba DNK za pripravo

nanometerskih tranzistorjev

Winfree in sod. Nat Nanotech 2009

[obvite polipeptidne vijačnice kot gradniki]

obvite vijačnice s paralelno ali

antiparalelno orientacijo

stabilnost in specifičnost parjenja –

izbrani AK ostanki na določenih mestih

ponovitev heptad = dva zavoja vijačnice

1 nm/heptado

[kaj lahko sestavimo z obvitimi vijačnicami? ]

Z uporabo peptidov, sestavljenih iz dveh vrst komplementarnih vijačnic, lahko sestavimo le linearne strukture: tvorba fibril.

[uporaba treh segmentov namesto dveh ]

Za tvorbo 2D ali 3D struktur potrebujemo vsaj 3 različne,

med seboj komplementarne vijačne segmente.

[kombinacija oligomerizacijske domene inobvite vijačnice]

oligomerizacijska

domena (≥3) + segment,

ki tvori antiparalelno

obvito vijačnico

mreža s porami ,

definiranimi z dolžino in

lastnostmi segmenta, ki

tvori obvito vijačnico

segment, ki tvori

antiparalelno

obvito vijačnico

gradnik:

Only 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

p53 tetramerizacijska

domena

[sestavljanje proteinske mreže]

Only 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

[sestavljanje proteinske mreže]

Pore:

velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico

kemijske lastnosti pore določajo AK ostanki na povšini obvite vijačniceOnly 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

[sestavljanje proteinske mreže]

Only 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

Pore:

velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico

kemijske lastnosti pore določajo ak ostanki na povšini obvite vijačnice

[ultrafiltracija čez polipeptidno membrano]

Odstranjevanje virusov:

Only 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

Only 0.22um PVDF

Filter

0.22um PVDF Filter

with protein membrane

PVDF filter

with 0.22

um pores

PVDF filter

with 0.22

um pores

Protein

membrane

Možnosti uporabe: naprave za filtracijo in ločevanje, kataliza.

[kako sestaviti kocko iz ene vrste polipeptidov?]

a b a’

[samosestavljanje v heksagonalno mrežo – gradniki

so enaki kot pri kocki]

a b a’

[druge kombinacije:

segmenti iz treh ali več obvitih vijačnic]Primer:

trije homodimeri se lahko zvijejo v tetraeder, kocko ali planarno mrežo

A B C

C – antiparalelni homodimeri

iz obvitih vijačnic: segment C-C

B– antiparalelni homodimeri

iz obvitih vijačnic: segment B-B

A – antiparalelni homodimeri

iz obvitih vijačnic: segment A-A

[eksperimentalni rezultati]

190 200 210 220 230 240 250 260

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

P1

P2

P1+P2

Elli

pticity (

mdeg)

Wavelength (nm)

P1 P2

P1-P2

heterodimer

Le pari heterodimernih vijačnih segmentov lahko tvorijo obvite vijačnice.

200 210 220 230 240 250 260

-10

-5

0

5

10

Ellip

ticity (

md

eg)

Wavelength (nm)

K2:

P1 GCN P2

[samosestavljiva polipeptidna mreža]

napoved

Posnetek TEM: samosestavljen K2

rezultat !!!

[nanokocka sestavljena iz peptidov]

Posnetek TEM: samosestavljena struktura iz peptida K2 pri nizki koncentraciji

To je prvi primer mrež ali 3D struktur, zgrajenih na osnovi obvitih vijačnic!

[možne aplikacije bio-nanomaterialov]

ultrafiltracija, kemijska kataliza itd [samosestavljive

polipeptidne membrane]

dostava zdravil [nanokletke, regulirano

sestavljanje/razstavljanje]

biomedicinska uporaba – rast in diferenciacija celic,

regeneracija tkiv, celjenje ran ... [funkcionalni

biomateriali]

ogrodje za gradnjo drugih nanostruktur –

elektronska vezja, biomineralizacija...

materiali s posebnimi lastnostmi – prožnost,

absorpcija energije, samočistilne tkanine...

Trenutna ozka grla SB

Orodja

Bolj zmogljiva kemijska sinteza (razvoj 2.generacije DNK sintetizatorjev)

Modularnost, standardizacija

Avtomatizacija sestavljanja genomov (laboratorij na čipu)

Razumevanje osnov delovanja bioloških sistemov

Razumevanje celice kot kompleksnega sistema (sistemska biologija)

Razumevanje zvitja proteinov in njihovih interakcij

Prihodnost sintezne biologije

• Aplikacije v bližnji prihodnosti– obnovljivi viri energije

– napredni (nano)biomateriali

– medicinske aplikacije

– industrijska biosinteza

• Raziskave bioloških sistemov s sintezno biologijo– Sinteza celotnih genomov bakterij in njihova aktivacija

– Identifikacija minimalnega genoma

– de novo programiranje genoma

[think outside the box !]

Meje potencialov uporabe sintezne biologije v nanotehnologiji postavljajo samo naše razumevanjenaravnih principov in ustvarjalnost.

Σ

Škatla je šele začetek...

Ekipe 2006-2009

MentorjiMojca Benčina (KI), Monika Ciglič (KI), Karolina Ivičak (KI), Nina Pirher (KI), Gabriela Panter

(KI), Mateja Manček Keber (KI), Marko Dolinar(FKKT), Simon Horvat (BF), Roman Jerala (KI, FKKT)

2008

Eva Čeh, BF

Vid Kočar, FKKT

Katja Kolar, FKKT

Ana Lasič, MF

Jan Lonzarić, FKKT

Jerneja Mori, BF

Anže Smole, BF

2006

Monika Ciglič, BF

Ota Fekonja, BF

Jernej Kovač, FKKT

Alja Oblak, BF

Jelka Pohar, BF

Matej Skočaj, BF

Rok Tkavc, BF

2007

Marko Bitenc, BF

Peter Cimermančič, FKKT

Rok Gaber, BF

Saša Jereb , FKKT

Katja Kolar, FKKT

Anja Korenčič, FKKT

Andrej Ondračka, FKKT

2008

Sabina Božič, FKKT

Nika Debeljak, BF

Tibor Doles, BF

Urška Jelerčič;FMF

Anja Lukan, FKKT

Špela Miklavič, BF

Marko Verce, BF