Sipos Ferenc

Új PNS oligomerek és P-királis mononukleotidok

szintézise és szerkezetvizsgálata

Doktori (Ph.D.) értekezés

Témavezető:

Sági Gyula, C.Sc.

MTA Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézet

ELTE-TTK Kémia Doktori Iskola

Vezető: Inzelt György, D.Sc.

Szintetikus kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program

Programvezető: Horváth István Tamás, D.Sc.

2009

2

Köszönetnyilvánítás

Doktori értekezésemet az MTA Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézetben

készítettem el. Témavezetőm Dr. Sági Gyula volt. Köszönöm az értékes segítségét, melyet

a kémiai munkám során, valamint a publikációs, pályázati dokumentumok elkészítésében

nyújtott. Köszönöm továbbá türelmét, amivel munkámat mindvégig támogatta.

Köszönöm Dr. Pálinkás Gábornak az MTA Kémiai Kutatóközpont főigazgatójának és Dr.

Hajós Györgynek a Biomolekuláris Kémiai Intézet Igazgatójának, hogy a Magyar

Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpontjában készíthettem el doktori munkámat.

A műszeres mérésekért Dr. Gács-Baitz Eszternek, Lejtoviczné Dr. Egyed Orsolyának, Dr.

Tőke Orsolyának, Dr. Szabó Pálnak és Dr. Pollreisz Ferencnek tartozom köszönettel.

Köszönöm az alábbi szervezeteknek, hogy anyagi támogatásukkal lehetőséget teremtettek

eredményeim bemutatására nemzetközi konferenciákon:

Alapítvány a Magyar Peptid és Fehérjekutatásért

Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány

NKFP MediChem2 (1/A/005/04)

Center of Excellence (QLK2-CT-2002-90436)

Köszönettel tartozom a következő személyeknek a szeretetükért és segítségükért, amellyel

körülvettek és a munkám eredményességéhez hozzájárultak: Sendula Róbert, Baraczka

Balázsné, Braun Andrásné, Sipos Szabolcs, Jablonkai István, Kőhalmy Krisztina, Szabó

Bernadett.

Szeretném megköszönni volt általános iskolai, középiskolai és egyetemi tanáraimnak, hogy

munkájukkal megalapozták bennem a kémia iránti szeretetet.

Köszönöm továbbá szüleimnek és az egész családomnak, hogy végig biztosították a

nyugodt hátteret a munka sikeres elvégzéséhez és a disszertáció megírásához.

3

Az értekezés alapjául szolgáló közlemények

Gacs-Baitz, E.; Sipos, F.; Egyed, E.; Sagi G.: „Synthesis and structural study of variously

oxidized diastereomeric 5’-dimethoxytrityl-thymidine-3’-O-[O-(2-cyanoethyl)-N,N-

diisopropyl]-phosphoramidite derivatives. Comparison of the effects of the P=O, P=S, and

P=Se Functions on the NMR spectral and Chromatographic Properties”

Chirality 2008, 21(7). 663-685.

Sipos, F.; Sagi, G.: „Synthesis of new, base-modified PNA monomers”

Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2007, 26 (6-7), 681-685.

Sipos, F.; Sagi, G.: „Synthesis of 5-substituted-uracil PNA monomers by Pd-catalyzed

cross-couplings”

Journal of Peptide Science 12: 137-137 Suppl. S 2006

Egyéb közlemények

Gunduz, O.; Sipos, F.; Spagnolo, B.; Kocsis, L.; Magyar, A.; Orosz, G.; Borsodi, A.; Calo,

G.; Benyhe, S.: "In vitro binding and functional studies of Ac-RYYRIKol and its

derivatives, novel partial agonists of the nociceptin/orphanin F/Q receptor"

Neurosignals 2006, 15, 91-101.

4

Rövidítések jegyzéke

A szövegben leggyakrabban alkalmazott rövidítések az alábbiak voltak:

Boc terc-butiloxikarbonil

BSA N,O-bisz-trimetilszilil-acetamid

CAN cérium(IV) ammónium nitrát

DCC N,N’-diciklohexilkarbodiimid

DCE diklóretán

DCM diklórmetán

DIC N,N’-diizopropilkarbodiimid

DIEA N,N-diizopropil-etil-amin

DMAP 4-dimetilamino-piridin

DME dimetoxi-etán

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetilszulfoxid

DMT dimetoxi-tritil

DNS dezoxiribonukleinsav

EDA etilén-diamin

EDTA etiléndiamin-tetraecetsav

EtOAc etilacetát

HOBt benzotriazol-1-ol-hidrát

HPLC nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia

MBHA metilbenzhidrilamin-gyanta

mRNS messenger RNS

MS tömegspektrometria

NMP N-metil-pirrolidon

NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia

ODN oligodezoxinukleotid

OSu O-szukcinimidil

PCR polimeráz láncreakció

PNS peptid-nukleinsav

PMB para-metoxi-benzil

RNS ribonukleinsav

5

RP fordított fázis

TBTU O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónium tetrafluoroborát

T-CED 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropil]-

foszforamidit

TEA trietil-amin

TEAA trietilammónium acetá

TFA trifluorecetsav

TFMSA trifluorometánszulfonsav

TMS trimetilszilil

VRK vékonyréteg kromatográfia

Z benziloxikarbonil

6

Tartalomjegyzék

Köszönetnyilvánítás .............................................................................................................. 2

Az értekezés alapjául szolgáló közlemények ........................................................................ 3

Rövidítések jegyzéke............................................................................................................. 4

Tartalomjegyzék .................................................................................................................... 6

1. Bevezetés ......................................................................................................................... 10

1.1. DNS bázis-módosítások ........................................................................................... 10

1.2. A peptid-nukleinsavak.............................................................................................. 11

1.3. Keresztkapcsolási reakciók ...................................................................................... 14

1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis.................................................................................... 15

1.4.1 A Boc és az Fmoc technika ................................................................................ 16

1.4.2. A szilárdfázisú PNS szintézis ............................................................................ 17

1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és NMR analízise...................................... 18

2. Célkitűzések .................................................................................................................... 20

3. Eredmények ..................................................................................................................... 22

3.1. Boc-gerinc szintézise................................................................................................ 22

3.2. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise ...................................................................... 23

3.3. Stille kapcsolások ..................................................................................................... 25

3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise ..................................................... 28

3.5. Sonogashira kapcsolások.......................................................................................... 29

3.6. Suzuki kapcsolások .................................................................................................. 31

3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett ............................................... 33

3.7. PNS T monomer előállítása...................................................................................... 35

3.8. PNS C monomer szintézise ...................................................................................... 36

3.9. Oligomer szintézis .................................................................................................... 37

3.9.1. PNS oligomer szintézise.................................................................................... 37

3.9.2. A komplementer DNS oligomer szintézise ....................................................... 38

3.10. Stabilitás vizsgálatok .............................................................................................. 40

3.11. P-királis mononukleotidok szintézise......................................................................... 42

3.11.1. Szintézis........................................................................................................... 43

3.11.2. NMR vizsgálatok............................................................................................. 45

3.11.3. HPLC analízisek .............................................................................................. 49

4. Összefoglalás ................................................................................................................... 51

7

5. Kísérleti rész .................................................................................................................... 55

5.1. Vékonyréteg-kromatográfia...................................................................................... 55

5.1.1. Előhívó reagensek: ............................................................................................ 55

5.1.1.1. Klór-tolidin ................................................................................................. 55 5.1.1.2. Ninhidrin..................................................................................................... 55

5.2. HPLC vizsgálat......................................................................................................... 55

5.3. A gyanta kapacitásának meghatározása ................................................................... 56

5.3.1. Kvantitatív pikrinsavas teszt.............................................................................. 56

5.3.2. Kaiser (ninhidrin) teszt ...................................................................................... 57

5.4. Boc-gerinc szintézis.................................................................................................. 58

5.4.1. Boc-etilén-diamin előállítása............................................................................. 58

5.4.2. N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (Boc-gerinc) szintézise.......................... 59

5.5. 5-jód-uracil PNS monomer szintézis........................................................................ 60

5.5.1. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észter előállítása ...................................... 60

5.5.2. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav előállítása ................................................................ 61

5.5.3. N-(5-jód-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (5-jód-uracil

PNS monomer) szintézise............................................................................................ 61

5.6. Stille-kapcsolások..................................................................................................... 63

5.6.1. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

szintézise...................................................................................................................... 63

5.6.2. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

előállítása ..................................................................................................................... 64

5.6.3. N-(5-fenil-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise 65

5.6.4. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin szintézise ...... 66

5.6.5. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

előállítása ..................................................................................................................... 67

5.6.6. N-[5-(2-fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

szintézise...................................................................................................................... 68

5.7. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise......................................................... 69

5.7.1. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása....... 69

5.7.2. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav előállítása................................. 70

5.7.3. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-

etilészter (3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer) szintézise.......................................... 71

5.8. Sonogashira-kapcsolások.......................................................................................... 72

8

5.8.1. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-feniletinil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 72

5.8.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(hex-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter előállítása ........................................................................................... 73

5.8.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(prop-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 74

5.9. Suzuki-kapcsolások .................................................................................................. 75

5.9.1. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter előállítása ........................................................................................... 75

5.9.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(bifenil-4-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 76

5.9.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter előállítása ......................................................................... 77

5.9.4. N-[3-(4-metoxibenzil)- (5-(4-dimetilamino)fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter szintézise.......................................................................... 78

5.10. In situ szilezés Suzuki kapcsolás során .................................................................. 79

5.10.1. [5-(2-tienil)-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása ........................... 79

5.10.2. [5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]ecetsav t-butil észter................................ 81

5.10.3. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin-etilészter

előállítása ..................................................................................................................... 82

5.10.4. N-[5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin

etilészter....................................................................................................................... 83

5.11. Timin PNS monomer szintézise ............................................................................. 84

5.11.1. timin-1-il-ecetsav............................................................................................. 84

5.11.2. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise .......... 85

5.11.3. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin (Timin PNS monomer)

előállítása ..................................................................................................................... 86

5.12. Citozin PNS monomer szintézise ........................................................................... 87

5.12.1. Uracil-1-il-ecetsav terc-butil észter előállítása................................................ 87

5.12.2. (2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter ....... 88

5.12.3. Citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észter előállítása .............................................. 89

5.12.4. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter szintézise...................................... 90

5.12.5. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav előállítása ............................................................... 90

5.12.6. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise .. 92

9

5.12.7. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin előállítása ................. 93

5.13. Oligomer szintézisek .............................................................................................. 94

5.13.1. A PNS oligomerek szintézise .......................................................................... 94

5.13.2. A komplementer ODN szintézise.................................................................... 94

5.14. 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit

származékok szintézise.................................................................................................... 95

5.14.1. A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-

diizopropil]-foszforamidit szintézise........................................................................... 95

5.14.2. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-

diizopropil]-foszforamidát előállítása ......................................................................... 96

5.14.3. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-

N,N-diizopropil]-foszforamidotioát szintézise ............................................................ 98

5.14.4. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-

N,N-diizopropil]-foszforamidoszelenoát előállítása.................................................... 99

6. Irodalomjegyzék ............................................................................................................ 101

Összefoglalás ..................................................................................................................... 105

Summary............................................................................................................................ 106

10

1. Bevezetés

1.1. DNS bázis-módosítások

Minden természetes nukleotid három összetevőből áll: egy heterociklusos bázisból,

(pirimidin- vagy purin-bázis); egy cukorból (ribóz vagy 2’-dezoxiribóz) és végül egy

foszfátcsoportból. Ebből következik, hogy a DNS módosítások lehetséges helyei: a

cukorrész, a foszfát-csoport és a bázis, illetve lehetőség van extra részek beépítésére

(interkaláció) és a cukor-foszfát gerinc részleges vagy teljes átalakítására (peptid-

nukleinsav) is. A módosítások célja leggyakrabban az olvadáspont (Tm), a DNáz

rezisztencia vagy a sejtpenetráció növelése.

1. Tm pont meghatározása

A DNS elméleti olvadáspontja alatt a hőmérséklet növekedés és a fényelnyelés mértéke

által alkotott görbe inflexiós pontját (1. ábra) értjük. Ez a jelenség csak analóg folyamat, de

közel sem azonos az olvadással. A Tm függ a G és C bázispárok arányától, ugyanis ezeket

a bázisokat három hidrogénkötés kapcsolja össze, így a G és C bázispárok százalékos

arányának növelésével nő a duplex olvadáspontja.

Rövid oligodezoxinukleotid modellvegyületeken végzett korábbi tanulmányok 1 2 szerint

az uracil bázis 5-heteroaril ill. alkinil szubsztitúciója ∆Tm/módosítás = +0,3 - +2,2 °C

mértékben növeli a 3’-végen 5 módosított bázist tartalmazó 15-mer ODN-RNS duplexek

stabilitását. A pirimidin bázis és a különböző aromás gyűrűk π elektronjainak

delokalizációja folytán a nukleozidok UV spektrumaiban ∆λmax = +35 - +58 nm-es

11

vöröseltolódás észlelhető a timidinhez viszonyítva ( λmax = 262 nm), ami ugyancsak a

pirimidin és a megfelelő heteroaromás gyűrűk koplanáris orientációjára utal. A stacking

ezzel együtt a ∆Tm még nagyobb mértékben növelhető, ha a pirimidin bázis 4,5 azaz [d]

helyzetben benzoxazin ill. benzotiazin kondenzált gyűrűket tartalmaz. Az így kapott

triciklusos fenoxazin ill. fenotiazin módosított bázisok beépítése a DNS-be ∆Tm/módosítás

= +4 - +5 °C-kal növeli a megfelelő DNS-RNS duplexek stabilitását amennyiben a szóban

forgó módosított egységek egymás mellett helyezkednek el. 3

1.2. A peptid-nukleinsavak

A peptid-nukleinsav (PNS) molekula egy szintetikus nukleotid analóg 4,5, melyet a

génterápiás eljárásokban és a molekuláris diagnosztikában alkalmaznak.

2. A DNS és PNS szerkezete

A PNS molekulában két funkcionális egységet különítünk el: a cukorfoszfát gerincet

kiváltó, poli[N-(2-aminoetil)glicin] vázat, melyben az építőelemek peptidkötéssel

kapcsolódnak egymáshoz , valamint a nukleobázisokat tartalmazó oldalláncokat. A

nukleobázisok egy-egy acetilcsoporton keresztül kapcsolódnak a vázhoz. (2. ábra) A

peptid-nukleinsavak, annak ellenére, hogy akirális és semleges vázat tartalmaznak,

rendelkeznek a natív nukleinsavak bázispárosodási képességével 6. A PNS:DNS és

különösen a PNS:RNS duplexek jóval stabilabbak, mint a megfelelő DNS hasonmások 7.

Ezenkívül a PNS teljesen rezisztens peptidázokkal és proteázokkal szemben.

3. A PNS és a királis PNS szerkezete

12

A peptid-nukleinsav akirális tulajdonsága miatt a PNS oligomerek egyaránt

képezhetnek jobb és bal menetes hélixet 8. A preferált irányultság kialakulását elősegíti az

oligomer C terminálisához kötődő királis aminosav (pl L- vagy D-lizin) 9. Királis

információ bevitelére egy másik lehetőség az ha a PNS monomerben a glicint különböző

L- ill. D-aminosavakkal helyettesítjük (3. ábra), amely azonban az aminosav oldalláncok

sztérikus gátló hatása miatt duplex destabilizációhoz vezet 10. Ugyanakkor a hidrofób

(leucin, valin stb.) és különösen az oldalláncban negatív töltést hordozó (glutaminsav)

aminosavaktól eltérően a lizin egységek láncvégi aminocsoportja ionos kötést tud

kialakítani a komplementer DNS vagy RNS foszfátcsoportjaival ezáltal optimális esetben

duplex stabilizáló hatást fejt ki 11. Az említett két ellentétes hatás eredője kismértékben

ugyan de pozitív és többek között függ a két lánc orientációjától is. Három szeparált D-

lizin tartalmú PNS egység beépítése a megfelelő antiparallel PNS-DNS duplexet, míg az

ugyanilyen L-lizines egységek beépítése a parallel duplexet stabilizálja ~∆Tm/módosítás =

+1°C mértékben. Ugyanakkor, ha ugyanez a 3 D-lizin-PNS egység a szekvencia közepén

egy blokkban 12 helyezkedik el akkor ez 7 °C-os Tm csökkenést eredményez

(∆Tm/módosítás = -2.3 °C) a megfelelő akirális (glicin-PNS egységeket tartalmazó) PNS-

DNS duplex Tm-jéhez viszonyítva 13. Másfelől viszont rendkívül figyelemreméltó az

említett királis blokk mismatch felismerő tulajdonsága. Amennyiben a target DNS-ben a

téves bázis (mismatch) a királis blokk középső D-lizin-PNS-t egységével szemben

helyezkedik el akkor ez teljesen destabilizálja a duplexet, míg ha a mismatch a királis

blokk valamelyik szélső egységével szemben áll ez is jelentős (∆Tm = -12-(-22) °C) Tm

csökkenéshez vezet 13.

Mivel a PNS-DNS de különösen a PNS-RNS duplexek stabilitása nagyobb, mint a

megfelelő DNS hasonmásoké így a DNS-ben már kipróbált valamint a még ismeretlen

hatású 5-heteroaril ill. alkinil szubsztituensek beépítése homogén PNS-be várhatólag

hasonló vagy még nagyobb mértékű Tm növekedést eredményezhet.

A PNS-t terápiás felhasználásra a duplexképző tulajdonságai teszik különösen

alkalmassá. Antigénként és antiszenszként is egyaránt felhasználható. Az előbbi esetén a

különböző kórokozók homopurin DNS szakaszaival komplementer PNS-ek a stabil

inváziós triplex képzés alapján gátolják a transzkripciót. Erre a célra PNS-peptid ill. más, a

sejtmagba történő bejutást megkönnyítő, konjugátumokat kell alkalmazni. Utóbbi során a

kórokozók megfelelően kiválasztott, hozzáférhető szakaszait célzó PNS-ek gátolják a

13

transzlációt. A jobb sejtpenetráció biztosítása céljából itt is különböző kimérákat ill.

konjugátumokat célszerű alkalmazni.

A diagnosztikai alkalmazások közül legjelentősebbek a PNS fluoreszcens in situ

hibridizációs (FISH) próbák, a polimeráz láncreakció (PCR) blokkolása PNS-el és PNS

mikrochipek. A FISH során a fluoreszcens festékkel jelzett nukleinsav elegyből a keresett

DNS vagy RNS ismert szekvenciájú szakasza nagy affinitással és szelektivitással kötődik a

vele komplementer, immobilizált PNS-hez. A nem kötődő nukleinsavak lemosása után a

fluoreszcencia intenzitás mérése alapján meghatározható a megkötött target nukleinsav

mennyisége. Főbb alkalmazások: rák-diagnosztika a telomer próbák alapján, baktériumok

kimutatása a rájuk jellemző riboszomális RNS hibridizációja alapján, kromoszóma hibák

kimutatása. Mivel az alapvető szerkezeti különbségek miatt a PNS nem használható PCR

primerként így alkalmas arra, hogy egy primer kötőhelyre célzott PNS egy vad típusú vagy

mutáns gén nem kívánt amplifikációját megakadályozza. Ez a módszer lehetővé teszi a

viszonylag kis mennyiségben előforduló génmutációk kimutatását is. A PNS mikrochipek

szilárd hordozóhoz kötött PNS oligomerek, amelyek a nagyon erős és szelektív

hibridizáció alapján megkötik a velük komplementer, többnyire fluoreszcens jelzett DNS

vagy RNS szekvenciákat, ami a DNS és RNS szekvenálását is lehetővé teszi.

14

1.3. Keresztkapcsolási reakciók

A σ-kötésű átmenetifém-organikus vegyületek legelterjedtebb alkalmazásai az új

szén-szén kötés kialakításával járó keresztkapcsolási reakciókban való részvételükre

épülnek. A reakciót általában palládium(0) vagy nikkel(0) katalizálja. A folyamat lépéseit

a 4. ábra mutatja be.

MLn

RMXLn

RMR'Ln

RMLn

R'

RX

oxidativ addició

R'M'

M'X

transzmetallálásizomerizáció

R-R'

reduktivelimináció

MLn : Pd(0), Pd(II), Ni(0) X : I, Br, Cl,M' : B(OH)2 , SnR3 , Cu, ZnX, MgX

4. A keresztkapcsolási reakciók általános mechanizmusa

Az első lépés egy szerves halogén tartalmú vegyület oxidatív addíciója az alacsony

oxidációs állapotú átmenetifémre, azaz az átmeneti fém beékelődik egy szén-heteroatom

kötésbe. Az átmeneti fémek közül a palládium és a nikkel emelkedik ki, illetve a telítetlen

szerves halogenidek az elsődleges reagensek. Alkilhalogenidek alkalmazását befolyásolja,

hogy a képződő alkil-átmenetifém-halogenid könnyen elbomlik β-eliminációval. A szerves

halogenidek reaktivitása I>Br>>Cl sorrendben változik. Gyakorlati szempontból az olcsó

és stabil klórvegyületek alkalmazása lenne a leginkább megfelelő, azonban az oxidatív

addiciós készségük olyan csekély, hogy csak ritkán alkalmazhatóak.

A keresztkapcsolási reakció második lépése a transzmetallálás, amely során a kapcsolni

kívánt másik szerves molekularészlet kerül az átmenetifémre. Ennek az egyensúlyi

folyamatnak a hajtóereje általában az újonnan kialakuló fém-halogén kötés termodinamikai

stabilitása. A szerves részlethez kapcsolódó átmenetifém elektronokban gazdagabbá válik a

folyamat során. Általában ez a lépés a ciklusban a sebességmeghatározó.

15

A következő lépésben az átmenetifém körüli átrendeződés történik meg, azaz a transz

elhelyezkedésű csoportok egy gyors izomerizációs lépés eredményeképp cisz-helyzetbe

kerülnek. A záró reduktív eliminációs lépés eredményeképp leszakad a kapcsolt termék és

a katalitikus ciklus bezárul az alacsonyabb oxidációs állapotú átmenetifém

újraképződésével.

Az alkalmazott átmenetifém általában komplex formában jelenlévő nikkel(0) vagy

palládium(0), ligandumként leggyakrabban a trifenilfoszfin származékok jöhetnek szóba.

A kapcsoló partner, amely a transzmetallálással kerül az átmeneti fémre valamilyen

fémorganikus reagens. A palládium által katalizált keresztkapcsolási reakciók előnye, hogy

olyan kevéssé poláris elemorganikus vegyületek is kiválóan használhatóak (boronsavak,

ón-, réz, és szilícium reagensek) melyek számos funkciós csoport jelenlétét tolerálják a

molekulában. A keresztkapcsolási reakciókat az alkalmazott fémorganikus reagensek

típusától függően különböző néven szokás említeni. A boronsavakat alkalmazó palládium

katalizálta reakciókat Suzuki kapcsolásnak, az ón-reagenseket használót Stille

kapcsolásnak nevezzük. A Negishi-reakcióban cinkorganikus vegyületet, a Karasch-

reakcióban Grinard reagenst, míg a Sonogashira kapcsolásokban rézorganikus reakció

partnert alkalmaznak.

1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis

A szilárd fázisú szintéziseket gyakran alkalmazzák nagyobb molekulák előállítása

során. A különböző oligomerek (peptid, DNS, PNS) szintézise ezen a módon sokkal

egyszerűbb és hatékonyabb, mint folyadékfázisban. Ezt a módszert Merrifield 1963-ban

publikálta, segítségével egy tetrapeptidet állított elő 14 15. Később néhány apróbb technikai

fejlesztés után a peptidkémikusok rutinszerűen alkalmazták az eljárást 16.

16

5. A szilárdfázisú peptidszintézis

A módszer elve igen egyszerű: az első aminosavat a szilárd hordozóhoz kötjük, és ezt

építjük tovább ciklusosan, olyan módon, hogy a peptidlánc és a gyanta közötti kovalens

kötés stabil maradjon (5. ábra). A reagensek nagy feleslegben alkalmazhatóak, a felesleget

többszöri mosással és szűréssel könnyen eltávolíthatjuk. Ezáltal az egyes reakciólépések

kitermelése közel 100 % és így jó minőségű nyerstermék állítható elő. A kapcsolások

sikerét kvalitatív és kvantitatív módon is vizsgálhatjuk 17. A szintézis végén a kész

terméket lehasítjuk a gyantáról és HPLC-vel tisztíthatjuk. Az ismétlődő lépések miatt a

módszer automatizálható.

1.4.1 A Boc és az Fmoc technika

A peptidek felépítésében az aminosavak -amino- és -karboxilcsoportjai vesznek

részt. A peptidlánc a C terminálistól az N terminális felé haladva épül fel a szilárd fázisú

szintézis során. Ebből adódik, hogy a beépülő aminosavban a karboxilcsoport mindig

szabad, és az aminocsoportot ideiglenes védelemmel látják el, mely a kapcsolás után

minden ciklusban könnyen lehasítható. A standard Merrifield módszer a N-terc-

butiloxikarbonil (Boc) amino-védőcsoportot használja, mely szerves (pl. TFA) és

szervetlen (pl. HCl) savakra hasad 18. Atherton és Sheppard dolgozta ki a N-9-

fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc) védőcsoporton alapuló technikát 19. Az aminocsoport

védelmére szolgáló Fmoc csoport szerves, szekunder aminokkal hasítható.

17

1.4.2. A szilárdfázisú PNS szintézis

A peptidnukleinsav oligomerek szintézise is megvalósítható szilárd fázison, a

peptid szintézis protokolljának kisebb változtatásával. A Boc- 20és az Fmoc- 21 technika

egyaránt alkalmazható. A szilárdfázisú szintézis során alkalmazott pirimidin bázisokat

tartalmazó védett PNS monomerek szerkezetét a 6. és a 7. ábra szemlélteti.

6. Boc-timin és a Boc/Z-citozin PNS momomer

7. Fmoc-védett timin és citozin PNS monomer

Az Fmoc-stratégia előnye, hogy az egyes kapcsolások hozama spektrofotometriásan

mérhető. Nagy hátránya viszont az N3→N6 acilvándorlás és az N-terminális egység

eliminációjával járó két mellékreakció (8. ábra). A Boc/Z módszer előnye, hogy a

védőcsoport eltávolítása után az N terminális protonált formában nem képes nukleofil

támadásra, így nincsenek mellékreakciók. A hasítás során alkalmazott TFA gátolja a

növekvõ láncok intermolekuláris aggregációját is. A szilárd fázisú szintézis manuális úton

is biztonsággal végezhető.

18

8. Mellékreakciók az Fmoc-csoport hasítása során

1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és NMR analízise

Lankhorst és mtsai. természetes dinukleotidok NMR adatainak analízise során

többek között megállapították, hogy a C3’-O3’ kötés körüli konformációs egyensúly jól

jellemezhető a 3J (P, C4’) és a 3

J (P, C2’) vicinális csatolási állandókkal 22. Ebből

kiindulva az MTA Kémiai Kutatóközpont NMR és Nukleotidkémiai Kutatócsoportjai

közötti együttműködés eredményeként számos új P-sztereokémiailag egységes P-királis

mono- és dinukleotid szintézisére és hasonló NMR vizsgálatára került sor 23 24 25 26 27 28 29 30 31. Ennek során kiderült, hogy a P-izomerek esetében az említett csatolási állandók

különbsége nevezetesen a ∆J = 3J (P, C4’) – 3J (P, C2’) érték egyértelműen korrelál a

transz vagy a gauche konformerek dominanciájával az adott konformációs egyensúlyi

elegyben. A pozitív ∆J értékek az εt (transz) míg a negatív értékek az ε- (gauche-)

konformer túlsúlyát jelzik. Ezenfelül a P-diasztereomerek ∆J értékei minden vizsgált

esetben jellemzőek voltak az abszolút P-konfigurációra is, amelyet NOE mérések is

alátámasztottak.

Az előállított vegyületek NMR paramétereinek elemzéséből több fontos

következtetés vonható le így pl.: 1, Az N-glikozidos kötés körüli konformációra

vonatkozólag megállapítható, hogy a torziós szögek valamint a H1’ és a H6 protonok

nagyon hasonló kémiai eltolódásai minden izomer pár esetében a nukleobázisnak a

cukorhoz viszonyított anti konformációját igazolják. 2, A C3’-O3’ kötés körüli

konformációs egyensúlyt, ezáltal a ∆J értékeket több funkciós csoport is befolyásolja, így

pl. az 5’-ODMT védőcsoport 27 valamint a foszfátrészen lévő ugyancsak nagy térkitöltésű

izopropil vagy terc-butil csoportok 29 jelenléte növeli a P-diasztereomerek ∆J értékei

közötti különbséget. 3, Az 5’-ODMT védett nukleozidok esetében a hőmérséklet

19

növelésével nő az εt (transz) konformer aránya az egyensúlyi elegyben 28 29. 4, Ugyanez

tapasztalható akkor is, ha a spektrumokat CDCl3 helyett C6H6-ban vesszük fel. Ez utóbbi

jelenség az aromás gyűrű és a nukleobázisok között valószínűleg létrejövő stacking

kölcsönhatással magyarázható, amely ezek szerint ugyancsak hatással van a konformációs

egyensúlyra 25 28 29 30.

20

2. Célkitűzések

Az MTA Kémiai Kutatóközpont Nukleotidkémiai Laboratóriumában folyó

szintetikus kémiai kutatásokba 2003-ban kapcsolódtam be. Doktori kutatásaim során új, 5-

szubsztituált uracil bázisokat tartalmazó, PNS monomerek szintézisét tűztem ki célul (9.

ábra). Az alkinil és aril analógok szintézisét palládium katalizálta keresztkapcsolási

reakciókkal kívántam megvalósítani.

9. Tervezett PNS monomerek

A bevezetésben idézett irodalmi adatok alapján nagyrészt olyan 5-aril ill. 5-alkinil

szubsztituensek beépítését terveztem, amelyek eddig még DNS módosításként sem

fordultak elő. Ugyanakkor néhány már ismert, DNS-ben kipróbált, és eltérő Tm növelő

hatással rendelkező analóg (5-(1-propinil)-, 5-(2-tienil)-uracil) beépítése is indokolt a

korábbi DNS próbákkal történő összehasonlítás miatt annak kiderítése céljából, hogy ezek

a PNS-ben is hasonló mértékű vagy esetleg eltérő ∆Tm/módosítás értékeket adnak-e. A

propinil és feniletinil szubsztitúciók hatásának összehasonlítása ugyancsak informatív lehet

a hármas kötésen keresztül kapcsolódó aromás gyűrű konjugációját és esetleges extra

stabilizáló hatását illetően.

Az említett módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc protokoll

alkalmazásával a H-t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer modell szekvenciába terveztem

21

beépíteni az aláhúzott 3 középső t egység helyére. A komplementer DNS szál szintézisét

követően vizsgálni kívántam a PNS:DNS duplexek stabilitását.

A PNS oligomer szintéziséhez szükséges timin és citozin monomerek előállításának

irodalomból ismert körülményeit is optimalizálni kívántam.

Munkám során P-királis mononukleotidok szintézisébe is bekapcsolódtam. A

bevezetésben említett korábbi munkák folytatásaként és kiterjesztéseként az NMR

vizsgálatok célja az volt, hogy megvizsgáljuk különböző, a P-atomhoz kettős kötéssel

kapcsolódó heteroatomok (O, S, és Se) (10. ábra) hatását a konformációs egyensúlyra.

Mivel az említett heteroatomok mérete és elektronegativitása jelentős mértékben

különbözik, ez várhatólag befolyásolja az egyes izomerek ∆J értékei közötti különbséget

is. Az említett NMR paraméterek tanulmányozásán kívül a P-izomerek kromatográfiás

(normál és reverz fázisú HPLC) tulajdonságait is vizsgáltam az abszolút P-konfiguráció és

a tR értékek közötti esetleges korreláció megállapítása céljából.

10. Tervezett oxidált timidin foszforamidit (T-CED) származékok

22

3. Eredmények

3.1. Boc-gerinc szintézise

A peptidnukleinsav monomerek két szerkezeti egységből épülnek fel: az N-(2-

aminoetil)-glicin gerincből és a hozzá karboxi-metilén linkeren keresztül kapcsolódó

bázisból. A védett PNS monomer retroszintetikus analízissel így két kisebb részre bontható

(11. ábra). Az etil N-(2-(terc-butoxikarbonilamino)etil glicinát (Boc-gerinc) és az alkilezett

bázis a peptidkémiában közismert módon kapcsolható.

11. Timin PNS monomer retroszintetikus analízise

A Boc-gerinc első szintézisét Dueholm és munkatársai írták le 1993-ban 32. A 3-amino-

1,2-propándiol aminocsoportját Boc-védőcsoporttal látták el, és oxidáció során Boc-

aminoacetaldehidet állítottak elő, melyet glicin-észterrel reduktív aminálásnak vetettek alá

és végül katalitikus hidrogénezéssel jutottak a védett gerinchez 46 %-os bruttó termeléssel.

Hudson kutatócsoportja Boc-etilén-diaminból (Boc-EDA) etil-glioxilát hidráttal állította

elő a megfelelő imint, az utolsó lépés ebben az esetben is katalitikus hidrogénezés volt 33.

Az irodalomban ismert az aminoacetonitrilből kiinduló háromlépéses szintézis út is 34.

Ezek az eljárások alacsony termeléssel eredményezik a Boc-gerincet és olyan módszereket

is alkalmaznak, melyek nem minden laboratóriumban hozzáférhetőek (pl. katalitikus

hidrogénezés).

12. Boc-gerinc szintézise

23

A Boc-gerinc szintézisére új módszert dolgoztam ki (12. ábra) amely során első lépésben

az etilén-diamint (EDA) (1) di-t-butil-dikarbonáttal reagáltattam diklórmetánban, az EDA

felesleget vizes extrakcióval eltávolítottam, majd a Boc-etilén-diamint (Boc-EDA) (2)

izolálás nélkül bróm-ecetsav-etilészterrel alkileztem trietilamin jelenlétében. Ilyen

körülmények között a védett Boc-gerincet (3) elfogadható termeléssel (60 %) állítottam

elő, azonban a melléktermékek (di-Boc-EDA és dialkil származék) jelenléte

megnehezítette a tisztítást és rontotta a reakció hozamát. A tiszta Boc-gerinc csak

oszlopkromatográfia alkalmazásával nyerhető ki. Ezt az eljárást módosítottam az oldószer

megváltoztatásával és a Boc-etilén-diamin izolálásával 35 20 36. Az első lépést dioxánban

végeztem, és nagy felesleg etilén-diamint használtam. Ezáltal főleg Boc-EDA keletkezik.

A dioxán bepárlása után a maradékot vízben oldottam és ekkor a minimálisan keletkező di-

Boc-etilén-diamin csapadékként, szűréssel eltávolítható. Diklórmetánnal extrahálva a

termék a szerves fázisba vihető, míg az etilén-diamin feleslege a vizes fázisban marad. A

nyersterméket végül vákuumdesztilláltam. A tiszta Boc-EDA-t vízmentes DMF-ben

alkileztem bróm-ecetsav-etilészterrel trietilamin jelenlétében. A dialkil származék

képződését az által szorítottam vissza, hogy a bróm-ecetsav-etilésztert minimális

feleslegben és lassan adagoltam a reakcióelegyhez. Az oldószer eltávolítása után a

maradékot DCM-ben oldottam, majd az elegy vizes mosását és szárítását követően

bepárlással jutottam a nyerstermékhez, melyet oszlopkromatográfiával tisztítottam. A

megfelelő frakciók bepárlása után sűrű áttetsző olajként sikerült a Boc-gerincet

előállítanom. A Boc-EDA izolálása és az ezáltal kevesebb szennyezést tartalmazó

reakcióelegy kromatográfiás tisztítása sokkal egyszerűbb volt és a két lépés bruttó

termelése is növekedett (75 %). Ezen az úton a Boc-gerinc egyszerűbben és hatékonyabban

állítható elő, mint az irodalomban leírt eljárásokban.

3.2. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise

Az 5-szubsztituált uracil származékok szintézise során azt a koncepciót terveztem,

hogy az analogonokat keresztkapcsolási reakciók (Stille, Suzuki, Sonogashira, stb…)

alkalmazásával állítom elő. Ehhez szükséges volt az 5-jód-uracil PNS monomer szintézise,

melyet három lépésben valósítottam meg az irodalomból ismert reakcióút módosításával 37.

Az eredeti recept két lépésben írja le a monomer szintézisét. Az első az 5-jód-uracil

káliumhidroxiddal történő deprotonálását követő alkilezés klórecetsavval, majd ezt követi

a karbonsav Boc-gerinchez kapcsolása. Utóbbi reakció a peptidkémiában általánosan

24

elfogadott módszerrel történt, azonban az alkalmazott kapcsolószer (DCC) erősen allergén

hatású, ezért ennek kiváltása ajánlott. Említést érdemel, hogy mindkét lépés csak közepes

hozammal eredményezi a terméket, így a bruttó termelés elég alacsonynak mondható. Ezen

okok miatt szükséges volt a reakcióút módosítása, optimalizálása.

13. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise

A szintézis során először az 5-jód uracilt (4) brómecetsav-terc-butilészterrel alkileztem

kálium-karbonát jelenlétében. A reakció során főleg N1-alkil uracil származék keletkezik,

de kismértékben az N3-alkil és az N1,N3-dialkil vegyületek is képződnek. Utóbbi

képződése kis feleslegben alkalmazott és lassan adagolt alkilező reagens felhasználásával

visszaszorítható. A termék átkristályosítással könnyen és jó termeléssel tisztítható, az

anyalúgból oszlopkromatográfia alkalmazásával minimális mennyiség izolálható. A

második lépésben az észtert (5) diklórmetánban TFA-val hasítottam. A reakció 4 óra alatt

végbemegy. Az oldószert bepároltam, a maradékot metanolban szuszpendáltam és szűrtem.

A karbonsav (6) kvantitatív hozammal nyerhető ki.

Végeztem olyan kísérletet, amely során az első lépésben brómecetsav-etilészterrel

alkileztem az 5-jód-uracilt, majd az észtert lúggal hidrolizáltam. Ez esetben azonban

bizonyos mértékű dejódozódás figyelhető meg, ugyanis a szén-jód kötés ilyen

körülmények között nem stabil. Ez alapján az észter savas közegben történő hasítása a

megfelelő módszer és így előnyösebb a brómecetsav-t-butilészter alkalmazása.

Harmadik lépésben a karbonsavat a védett Boc-gerinchez kötöttem egy, a

peptidkémiában megszokott kapcsolási módszer alkalmazásával. A karbonsavat egy

benzotriazol származékkal (TBTU) aktiváltam, majd a Boc-gerinc vízmentes DMF-es

oldatához adtam, végül trietilamint adagoltam az elegyhez. A reakció szobahőmérsékleten

három óra alatt végbemegy. A termék oszlopkromatográfiával tisztítható. Ezáltal az

irodalomból ismertnél jobb bruttó hozammal (78 %) állítottam elő az 5-jód-uracil PNS

monomert (7) (13. ábra) amely a keresztkapcsolási reakciók kiindulási vegyülete.

25

3.3. Stille kapcsolások

A keresztkapcsolási eljárások egyik legelterjedtebb képviselője a Stille nevével

fémjelzett reakció 38. A folyamatban a transzmetallálás ónorganikus reagensről történik a

palládiumra. A különböző szerves csoportok átvitele az ónról palládiumra jelentősen eltérő

sebességgel történik, a leggyakrabban a megfelelő tributil-ón származékokat használják.

Az ón bórhoz viszonyított kisebb elekronegativítása, és ezáltal erősebb fémes karaktere

miatt az aril-trialkil-sztanánnok jobb aril-csoport donorok, mint a megfelelő aril-

boronsavak.

Az irodalomban több olyan szintézisút ismert, mely során trialkil-vegyületek

alkalmazásával állítottak elő nukleotid származékokat. Yamamoto és munkatársai aril-

tributil-sztannán reagensekkel Pd(0) katalizátor jelenlétében 10B jelzett nukleozidokat

szintetizáltak 39. Az 5-(2-tienil)-uridin származékok antivirális hatással is rendelkeznek 40.

Farina és kutatócsoportja számos 5-szubsztituált uracil és uridin analóg szintézisét írta le 41. Crisp és munkatársai számos uridin és 2’-dezoxiuridin származékot állítottak elő Stille

kapcsolás alkalmazásával 42 43 44 45.

Az 5-jód-uracil PNS monomer és a kereskedelmi forgalomban kapható ónvegyületek

(2-tienil-tributilsztannán, 2-furanil-tributilsztannán és fenil-tributilsztannán)

felhasználásával végeztem el a Stille-reakciókat. A reakció során vízmentes dioxánt és

argon védőgázt alkalmaztam. 1,50 ekvivalens ónvegyület és 2-5 % Pd(PPh3)4 katalizátor

hozzáadásával 90 oC-on a reakció 5-8 óra alatt végbemegy. A termékek (8 a-c)

oszlopkromatográfiával tisztán, jó termeléssel (60-73 %) izolálhatók. Az 5-fenil-uracil

PNS monomer (8c) és az 5-jód-uracil vegyület nagyon hasonló kromatográfiás

tulajdonságokkal rendelkezik, azaz a termék és a kiindulási anyag nem választható el.

Ebben az esetben szükséges volt a maradék kiindulási anyag uracil származékká történő

redukciója. A nyersterméket vízmentes etilalkoholban oldottam és cink por jelenlétében 3

órán keresztül forraltam az elegyet. Ezt követően az uracil PNS monomer és az 5-fenil

származék már könnyen elválasztható oszlopkromatográfiával.

Az észtereket dioxán és 1 N NaOH oldat elegyében lúgosan hidrolizáltam 4 órán

keresztül. A dioxán eltávolítása után a nyersterméket etil-acetátban oldottam, és 1 M

NaHSO4 oldattal extraháltam, majd az oldószer bepárlása után etilalkoholban

szuszpendáltam, végül kiszűrtem és megszárítottam. Ezáltal jó termeléssel állítottam elő az

5-(2-tienil), az 5-(2-furanil) és az 5-fenil analogonokat (9 a-c) (14. ábra), melyek a szilárd

fázisú oligomer szintézisben felhasználhatóak.

26

14. Stille-kapcsolások az 5-jód uracil PNS monomeren,

Lehetséges reakció út az ún. „inverz”-Stille kapcsolás 46, mely során az uracil PNS

monomer trialkil sztannán származékát terveztem előállítani, majd ezt a vegyületet

kapcsolási reakcióba vinni különböző aromás halogén vegyületekkel. (15. ábra).

15. Az „Inverz”-Stille kapcsolás alkalmazása

Az első lépés a trialkil-sztannil csoport kialakítása. Az 5-jód-uracil PNS monomert

hexabutil- és hexametil-disztannánnal reagáltattam Pd(PPh3)4 katalizátor jelenlétében

dioxánban 80 oC-on, argon védőgáz alkalmazása mellett. Terméket (10) csupán az utóbbi

esetben izoláltam 16 órás reakcióidő után oszlopkromatográfiával, mindössze 35 %-os

hozammal. Ezt a vegyületet dioxánban palládium katalizátor hozzáadásával 2-bróm-

tiofénnel és 2-bróm-1,3-tiazollal reagáltattam 80 oC-on. A várt termékeket (11 a-b)

mindkét esetben sikerült izolálni, de nagyon alacsony (28 és 19 %) hozammal. A két lépés

bruttó termelése messze elmarad a Stille kapcsolások hozamától.

Egy másik lehetőség az 5-szubsztituált uracil PNS monomerek előállítására az ún.

dupla Stille kapcsolás 47. A „one pot” reakció során az 5-jód-uracil PNS monomer és

aromás halogenidek kapcsolása valósítható meg hexabutil-disztannán alkalmazásával.

Először a brómvegyületet (2-bróm-tiofén és 2-bróm-1,3-tiazol) reagáltattam az

ónreagennsel Pd(0) katalizátor jelenlétében vízmentes dioxánban 80 oC-on. Miután

27

képződött a tributil-sztannil származék (12) hozzáadtam az elegyhez az 5-jód-uracil PNS

monomert (7) és folytattam a reagáltatást 4 órán keresztül. Az 5-(2-tienil)-uracil PNS

monomer (8 a) 56 %-os hozammal izolálható a kromatográfiás tisztítás után. (16. ábra)

SBr

SSn

SnSn

Pd(PPh3)4

HN

N

O

O

I

N

O

O

O

HNBoc

HN

N

O

O

N

O

O

O

HNBoc

SPd(PPh3)4

12

12 +

7 8 a

dioxán

dioxán

16. A „dupla” Stille kapcsolás alkalmazása

A másik reakció során azonban a várt termék helyett az 1,3-tiazol dimerje keletkezett

(17. ábra). Az első lépésben keletkező aril-tributil-sztannil vegyület (13) a még jelenlevő el

nem reagált brómvegyülettel is reakcióba lép amennyiben az ónvegyület képződése nem

elég gyors, és ezáltal homodimer (14) keletkezik.

17. Homodimer képződés „dupla” Stille kapcsolás során

28

Megállapítható, hogy ez a kapcsolási módszer nem vezet feltétlenül a várt termékhez és

sikeres reakció esetén is elmarad a termelés a „normál” Stille kapcsolással elérhető

hozamtól.

Mivel egyrészt kevés aril-trialkilsztannán reagens kapható a kereskedelemben és

ezen vegyületek mérgezőek is, másrészt a hexaalkil-disztannán alkalmazhatósága erősen

korlátolt, így a további 5-aril-uracil PNS monomerek előállítását Suzuki kapcsolással

terveztem megvalósítani.

3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise

Az uracil származékok laktám funkciója bizonyos esetekben mellékreakciókat

eredményezhet. A Sonogashira kapcsolások során furano[2,3-d]-pirimidin gyűrűs

vegyületek is képződnek az alkinil származékok mellett 48. Ezzel a problémával

szembesültem a terminális alkinok és az 5-jód-uracil PNS monomer palládium katalizált

kapcsolása során. A Suzuki kapcsolásokkal folytatott kísérleteim is eredménytelennek

bizonyultak a laktám csoport deprotonálódása miatt. Szükségessé vált egy N3-védőcsoport

bevezetése, mely az 5-jód-uracil PNS monomer keresztkapcsolási reakciója után

szelektíven távolítható el.

Az irodalomban gyakran átmeneti védelemmel látják el a laktámcsoportot. Uridin

származékok esetén gyakori a p-metoxi-benzil (PMB) védőcsoportként történő

alkalmazása 49 50 51 52 53 54 55. A védelem kialakítására több lehetőség áll rendelkezésre. A

p-metoxi-benzil-bromid, -klorid és az -alkohol is alkalmas reagens valamilyen bázis

jelenléte mellett. Az eltávolítása oxidatív módon, cérium(IV)-ammónium nitráttal vagy

aluminíum-kloriddal valósítható meg. Mivel a Suzuki kapcsolás körülményei között stabil,

így első látásra ortogonális védőcsoportnak volt tekinthető. Ezen ismeretek alapján a PMB

védőcsoport kialakítása az 5-jód-uracil PNS monomeren megvalósíthatónak tűnt.

Az 5-jód-uracil PNS monomer benzilezését NaH jelenlétében p-metoxibenzil-

bromiddal kíséreltem meg, azonban a reakció több terméket eredményezett és a termék

nehezen, alacsony hozammal volt izolálható. Ezután az N3-PMB-5-jód-uracil PNS

monomer szintézisére új eljárást dolgoztam ki (18. ábra).

29

18. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise

Korábban az 5-jód-uracil PNS monomer szintézise során első lépésben az 5-jód

uracilt alkileztem brómecetsav-t-butilészterrel. Ezen a vegyület laktámcsoportját sikeresen

benzileztem. Az uracil származékot (5) DMF-ben oldottam és nátrium-hidriddel

deprotonáltam a laktám-csoportot, majd p-metoxi-benzil-bromidot adtam az elegyhez. A 3-

PMB-5-jód-uracil származék (15) a kromatográfiás tisztítás után megfelelő hozammal

fehér kristályos formában izolálható. A következő 2 lépés megegyezik az 5-jód-uracil PNS

monomer esetében alkalmazottakkal. Az észtert TFA-val hasítottam diklórmetánban, majd

az oldószer bepárlása után a maradékot metil-alkoholban szuszpendáltam és szűrtem. Így

kvantitatív hozammal izolálható a karbonsav (16), melyet ezt követően TBTU aktiválószer

és trietil-amin bázis jelenlétében a Boc-gerinchez (3) kapcsoltam. A reakció

szobahőmérsékleten 3 óra leforgása alatt teljes mértékben lezajlik, és a termék

oszlopkromatográfia alkalmazásával tisztítható. Ezen az úton N3-PMB-5-jód-uracil PNS

monomert (17) állítottam elő, melyet sikeresen alkalmaztam a keresztkapcsolási

reakciókban. A négy lépés bruttó termelése 58 %.

3.5. Sonogashira kapcsolások

A rézorganikus reagensek szintézise és alkalmazása a szerves szintézisben hosszú

múltra tekint vissza. Bár reakcióik elektrofilekkel általában spontán is lejátszódnak, több

esetben palládium jelenléte gyorsítja a folyamatot. Sonogashira nevéhez fűződik az a

felismerés, hogy in situ előállított alkinilréz reagensek palládium jelenlétében kapcsolási

reakcióba vihetőek aril- és alkenil-halogenidekkel 56. A folyamat rézre nézve is

katalitikussá tehető ekvivalens mennyiségű bázis (általában trietil-amin) alkalmazásával. A

folyamat során a réz(I) só és az alkin a bázis hatására a rézorganikus vegyületet adja,

amely transzmetallál az aril- vagy alkenil-palládium-halogenidre. A tarnszmetallálás során

újra felszabadul a réz(I)só, ezért lehet katalitikus mennyiségben alkalmazni.

30

Az irodalomban számos uridin származék szintézise során alkalmazták már a

Sonogashira kapcsolást. Robins és munkatársai 5-szubsztituált uracil és 2’-dezoxiuridin

analógokat állítottak elő sikeresen terminális alkinok palládium katalizált kapcsolásával. 48.

Sharma és Ma kutatócsoportja 5-etinil-pirimidin nukleozidok szintézisét és biológiai

aktivitásuk vizsgálatát végezte el 57 58. Hasimoto az ikerionos DNS szintézise során szintén

alkalmazta ezt a módszert 59. Ismert az irodalomban 5-alkinil-uracil PNS monomerek

szintézise is 37. Hudson és munkatársai az 5-jód-uracil PNS monomert vitték kapcsolási

reakciókba alkinokkal és közepes termeléssel izoláltak új analógokat, melyeket sikeresen

építettek be oligomerekbe.

Az 5-jód-uracil PNS monomerrel sikeres Stille kapcsolásokat hajtottam végre és a

Sonogashira kapcsolás számára is megfelelő kulcsvegyületnek tűnt. A kapcsolási reakciók

során a jódvegyületet 5 % (PPh3)2PdCl2, 5 % CuI és 2,0 ekvivalens trietil-amin

jelenlétében terminális alkinekkel reagáltattam szobahőmérsékleten, argon védőgáz

alkalmazása mellett. Oldószerként vízmentes DMF-et használtam. A kapcsolás pár óra

alatt végbement. A DMF eltávolítása után a maradékot DCM-ben oldottam, a réz

nyomoktól extrakcióval szabadultam meg 5 %-os EDTA oldat felhasználásával. A termék

oszlopkromatográfiával izolálható közepes termeléssel. Ennek oka, hogy jelentős

mértékben (30-40 %) gyűrűzárt melléktermék is képződik (19. ábra). A gyűrűzárást szintén

a réz(I)só katalizálja.

19. A gyűrűzárt melléktermék szerkezete

Ezen tapasztalatok után szükségessé vált az uracil laktám-csoportjának védelme. A 3-

PMB-5-jód uracil PNS monomert (17) alkalmazva, a fenti körülmények mellett a védett 5-

(1-propinil)-, 5-feniletinil- és 5-(1-hexin-1-il)-uracil PNS monomereket (18 a-c) állítottam

elő közel kvantitatív termeléssel (20. ábra). A termékek kromatográfiás tisztítását

nagymértékben megkönnyítette a kezelhetőbb szennyezésprofil.

31

N

N

O

O

I

O

N COOEtHNBoc

R

(PPh3)2PdCl2CuI, TEA

O

N

N

O

O

O

N COOEtHNBoc

O

R

R: Me, Ph, Bu

17 18 a-c

DMF

20. Sonogashira kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomeren

3.6. Suzuki kapcsolások

Az aril-boronsavak és aril- vagy alkenil-halogenidek palládium(0) által katalizált

keresztkapcsolási reakciója, az ún. Suzuki-reakció rendkívüli népszerűségre tett szert az

elmúlt évtizedekben 60. A folyamat során a halogenidből kialakuló σ-kötésű átmenetifém-

organikus vegyület a bórvegyülettel transzmetallálási reakcióban a diorganopalládium-

származékot adja, amelynek reduktív eliminációjával jutunk a kívánt termékhez. A

transzmetallálási lépésben, más keresztkapcsolási reakcióktól eltérően egy ekvivalens bázis

jelenlétére van szükség. A szerves bórszármazékok nukleofil jellege nem elég erős, így az

organopalládium-halogenid-komplexet kell elektrofilebbé tenni a halogenidet alkoxi- vagy

karbonátionra cserélve.

A Suzuki kapcsolás nukleotidkémiai alkalmazására több példa található az

irodalomban. Casalnuovo és munkatársai az 5-jód-2’-dezoxiuridinnel és az 5-jód-2’-

dezoxicitidinnel egyaránt sikeres kapcsolást hajtottak végre 61. Az 5-jód-2’-dezoxiuridin

reakcióit pirénszármazékokkal Amann 62, fenilboronsavakkal pedig Western 63 írta le,

utóbbi vízoldékony palládium katalizátort alkalmazott a szintézis során.

Az irodalmi ismeretek alapján az 5-jód-uracil PNS monomert arilboronsavakkal

reagáltattam. Többféle palládium katalizátort, (Pd(PPh3)4, (PPh2)Cl2, Pd(OAc)2 + dppf)

különböző bázisokat (K2CO3, Cs2CO3, KOtBu, NaOEt) és oldószereket (DMF, 1,2-

dimetoxietán, EtOH) kipróbáltam, de szinte egyáltalán nem tapasztaltam termékképződést

(1. táblázat). Ennek oka valószínűleg az, hogy bázikus közegben az uracil laktám csoportja

deprotonálódik és a közeli negatív töltés hatására a palládium elekrofil jellege csökken,

amely a transzmetallálást nagymértékben gátolja (21. ábra). Minden esetben vízmentes

oldószert és argon védőgázt alkalmaztam a reakció során az etilészter hidrolízisének

kiküszöbölése céljából.

32

katalizátor bázis boronsav oldószer eredmény

Pd(PPh3)4 Cs2CO3 / K2CO3 2-tienil- DMF ~ 50 %

konverzió

Pd(PPh3)4 Cs2CO3 2-tienil- DMF ~ 50 %

konverzió

(PPh3)2PdCl2 Cs2CO3 / K2CO3 2-tienil- DMF nincs termék

Pd(OAc)2 + dppf K2CO3 2-tienil- DMF nincs termék

Pd(PPh3)4 Cs2CO3 / KOtBu 2-tienil- DME kis konverzió

Pd(PPh3)4 Cs2CO3 / K2CO3 /

NaOEt

2-tienil- EtOH kis konverzió

hidrolizis

Pd(PPh3)4 Cs2CO3 2-naftil- DME kis konverzió

Pd(PPh3)4 K2CO3 2-tienil- DMF > 50 %

konverzió

1. táblázat Suzuki kapcsolások körülményei

21. Laktim-laktám tautoméria

Az N3 védőcsoport alkalmazása, azaz a laktám funkció védelme ez esetben feltétlenül

szükséges a sikeres kapcsolási reakció eléréséhez. Ezen elképzelés alapján a 3-PMB-5-jód-

uracil PNS monomert alkalmaztam a további kísérletekben. Az 5-jód-uracil PNS

monomeren végzett kapcsolások során szerzett tapasztalatokat figyelembe véve

oldószerként vízmentes DMF-et, bázisként kálium-karbonátot használtam. A Pd(PPh3)4

katalizátor mennyiségét sikerült 2 %-ra csökkenteni. A kapcsolásokat 100 oC-on végeztem

5 órán keresztül. Hosszabb reakcióidő alkalmazása esetén a mellékreakciók miatt az

izolálható termék hozama csökken valamint a preparálása is nehézkesebb. Mivel a

kiindulási jódvegyület és a képződő aril származékok kromatográfiás tulajdonságai nagyon

hasonlóak mind a reakció követése, mind a termék izolálása kissé nehézkes és az

oszlopkromatográfia során a nem megfelelő elválasztás a hozam csökkenését eredményezi.

Ez utóbbi probléma a Stille kapcsolással előállított 5-fenil-uracil PNS monomer tisztítása

során alkalmazott szén-jód kötés redukciójával orvosolható.

33

Különböző boronsavak felhasználásával sikeres Suzuki-reakciókat hajtottam végre,

előállítottam az N3-PMB-védett 5-(2-tienil)-, 5-(4-bifenil)-, 5-(benzo[b]tiofén-2-il)- és az

5-(4-dimetilaminofenil)-uracil PNS monomereket (19 a-d) (22. ábra). A reakciók

termelése 37-85 % közötti, amelyek kissé elmaradnak a Stille reakciók hozamaitól, de

mivel a boronsavak könnyen hozzáférhetőek ezzel a módszerrel számos új analóg

előállítható. A boronsavak helyett boronsav-pinakolésztereket alkalmazva a konverzió kb.

10 %-kal növelhető.

22. Suzuki kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomeren

3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett

A PMB védőcsoport szelektív eltávolítása nem problémamentes, mivel a CAN

vizes oldata erősen savas kémhatású, ezáltal a Boc-csoport is lehasad a PMB-vel együtt.

Ebből adódóan az uracil laktám csoportját más csoporttal próbáltam védeni a kapcsolási

reakciók során.

A szililezett természetes nukleobázisoktól eltérően az 5 és 7 kiindulási anyagok 4-

OSiMe3 (TMS) származékai a várható igen magas forrpont miatt nem tisztíthatók

desztillációval másrészt a TMS csoport extra érzékeny minden protikus oldószerre így a

kromatográfiás tisztítás sem jöhet szóba. Ezért a laktám funkciót in situ kellett szilileznem

feltételezve, hogy a szililezőszer feleslege nem gátolja a kapcsolási reakciót. Erre a célra a

Vorbrüggen féle nukleozid szintézisekben is általánosan alkalmazott N,O-bisz-

trimetilszilil-acetamid (BSA), mint igen hatékony szilil donor reagens, tűnt a legjobb

választásnak. Előkisérleteim során azt találtam, hogy a diklóretánban (DCE) rosszul

oldódó 5 2 ekv. BSA-val 1-1,5 órán át keveretetve teljesen oldatba megy, amely jelzi, hogy

a reakció lejátszódott. Mivel a tervezett Suzuki kapcsolásokhoz a dioxán több ok miatt is

alkalmasabb oldószer, mint a DCE ezért a szililezéseket eleve ebben végeztem. Boronsav

reakciópartnerekként a 2-tienil- és a tianaftén-2-il-boronsavakat választottam, mivel a

34

termékek mindkét esetben fluoreszkálnak, így a reakciók, az 5 és a termékek közötti

viszonylag kis Rf különbség ellenére is, jól követhetők UV-ben 360 nm-en detektálva.

Katalizátorként a Pd(PPh3)4 mellett a (Ph3P)2PdCl2-t is kipróbáltam, de a fluoreszcens

termékek aránya az elegyekben minden esetben kisebb volt, mint a Pd(0) katalizált

reakciókban azonos körülmények között.

23. In situ laktám védett N1-alkil-5-jód-uracil Suzuki kapcsolása

24. In situ laktám védett 5-jód-uracil PNS monomer Suzuki kapcsolása

Kisérleteim azt mutatták, hogy az 5 kapcsolásai mindkét boronsavval jobb termeléssel

(42,2 ill. 51,1%) játszódnak le mint a PNS gerincet is tartalmazó 7 reakciói (22,8 ill.

40,4%) annak ellenére, hogy az utóbbi esetekben nagyobb boronsav felesleget és kétszer

annyi katalizátort használtunk. Ennek oka a PNS monomerek kisebb kémiai stabilitása, a

Boc és/vagy az Et észter védőcsoportok részleges lehasadása az adott körülmények között.

Erre utal az is, hogy a 7 reakcióinál hosszabb ideig (5-6 óra) tartó melegítés után poláros

melléktermékek jelennek meg az elegyekben a főtermékek rovására ezért az optimális

reakcióidő itt 2-2,5 óra. Ezzel szemben az 5 kapcsolásainál még 15 óra után sem láttam

hasonló bomlástermékeket.

35

Mindebből az a következtetés vonható le, hogy az 5-aril-uracil bázisokat tartalmazó

PNS monomerek szintézisét célszerűbb a kémiailag ellenállóbb 5 Suzuki kapcsolásával

kezdeni mivel így magasabb bruttó hozam érhető el figyelembe véve, hogy t-Bu észter

acidolízise majd a gerinchez kapcsolás csaknem kvantitatív reakciók. Ezenfelül a kapott 5-

aril-uracil-1-il-ecetsavak mind a Boc- mind az Fmoc-védett PNS monomerek szintéziséhez

felhasználhatók. A kapcsolások hozamának növelése céljából a jövőben további Pd

katalizátorok kipróbálását is tervezzük.

3.7. PNS T monomer előállítása

Az új 5-szubsztituált uracil PNS monomereket egy H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-

mer szekvenciában kívántam beépíteni a középső 3 egység helyére. A szilárd fázisú

oligomer szintézishez szükséges volt a megfelelően védett timin és citozin monomerek

előállítására.

Az irodalomban több módszer ismert a timin PNS monomer előállítására. Dueholm és

munkatársai egy négylépéses szintézisutat írtak le 64. Elsőként a timint brómecetsav-metil-

észterrel alkilezték kálium-karbonát jelenlétében, majd az észtert lúgos közegben

hidrolizálták, az így előállított karbonsavat DCC-vel kapcsolták a Boc-gerinchez, végül az

etilésztert hidrolizálták. A négy lépés bruttó termelése alacsonynak mondható és az

alkalmazott DCC allergén jellegű, melyek miatt új eljárás fejlesztése volt szükséges.

Ugyanez a kutatócsoport fejlesztette ki a Boc-védett timin PNS monomer pentafluorfenil-

észtert, melyet oligomer szintézis során sikeresen alkalmaztak 5. A timin nukleobázis

kálium-hidroxid vizes oldatában deprotonálható és klórecetsavval is alkilezhető 65, azaz a

Duelholm-féle reakcióút lerövidíthető.

Ezt az eljárást sikeresen reprodukáltam. A timint (24) brómecetsavval alkileztem, de a

reakció hozama csak közepesnek tekinthető (46%). Az uracil alkilezése során szerzett

tapasztalatok alapján megállapítható, hogy a brómecetsav-tercbutilészterrel történő

alkilezés és ezt követően az észter hasítása TFA-val hatékonyabb eljárás lehet, mint a

brómecetsavval vagy brómecetsav-etilészterrel történő alkilezés.

Az így előállított karbonsavat (25) az uracil származékokhoz hasonló módon,

kapcsoltam a Boc-gerinchez (3) DMF-ben. Az allergén DCC helyett TBTU aktiválószert

és trietil-amin bázist alkalmaztam. A terméket oszlopkromatográfiával izoláltam jó

termeléssel. Végül az etilészter (26) lúgos hidrolizisével az N-terminálison Boc-csoporttal

védett, a C-terminálison szabad karbonsav funkcióval rendelkező timin PNS monomerhez

36

jutottam (27), amely felhasználható a szilárdfázisú PNS oligomer szintézisében (25. ábra).

A korszerű kapcsolási módszernek köszönhetően a háromlépéses szintézisút bruttó hozama

is elfogadhatónak tekinthető.

25. A PNS timin monomer szintézise

3.8. PNS C monomer szintézise

A citozin PNS monomer szintézisére a timin monomer esetében alkalmazott út

nehezen járható, melynek oka a citozin rossz oldhatósága. A probléma kiküszöbölésére új

eljárást dolgoztam ki (26. ábra). Irodalomból ismert, hogy az uracil triazolil-vegyületen

keresztül citozinná alakítható 66 67 68 69 70 71.

26. Védett citozin PNS monomer szintézise

37

Az uracilt kálium-karbonát jelenlétében brómecetsav-terc.butil-észterrel alkileztem,

vízmentes DMF-ben. Minimális reagens felesleg és lassú adagolás alkalmazásával csak

elhanyagolható mennyiségű melléktermék (N3- és N1, N3-dialkil származék) keletkezik. A

termék kristályosítással könnyen tisztítható és jó termeléssel állítható elő (28). Következő

lépésben az alkil-uracilt vízmentes piridinben oldottam és 1,2,4-triazollal reagáltattam

foszfor-oxiklorid jelenlétében. Az N1-alkil-uracil triazolil-származéka izolálható (29),

extrakcióval és oszlopkromatográfiával tisztítható. Az ammonolízis során a triazolil-

vegyületet dioxánban oldottam, majd 25 %-os ammónia oldatot adtam az elegyhez. A

reakció során 12 óra alatt kvantitatív termeléssel alkilezett citozinhoz jutottam, melyet

dietiléterrel szuszpendálva tisztítottam (30). A három lépés bruttó hozama 51 %, amely

azonban elmarad a citozin közvetlen alkilezésével elérhető termeléstől (64 %) 72

Az amino-csoportot benziloxi-karbonil (Z) védelemmel láttam el. A védőcsoport

bevitelére több módszert is kipróbáltam. Z-OSu alkalmazásával sem piridinben, sem víz-

acetonitril elegyben TEA jelenlétében nem tapasztaltam termékképződést. Ennek

feltehetően az az oka, hogy a Z-OSu nem elég aktív. Az irodalomból ismert úton, Z-Cl

reagenssel piridinben sikeresen megoldható a citozin amino-csoportjának védelme, de több

melléktermék is keletkezik 64 5 73 74. 1,00 ekvivalens DMAP hozzáadásával a reakció

DCM-ben jó termeléssel megvalósítható 72 21. A reakció során először a DMAP-t és a Z-

Cl-ot reagáltattam -15 oC-on, majd hozzáadtam a citozin származékot ugyanezen a

hőmérsékleten. Hagytam felmelegedni és 12 órán át reagáltattam. Extrakcióval és

kromatográfiával tisztítottam és közel kvantitatív termeléssel izoláltam a Z-védett alkil-

citozint (31). Az észtert dioxán és 1 M NaOH oldat elegyében hidrolizáltam, majd az így

kapott karbonsav (32) Boc-gerinchez kötését, illetve az etil-észter hasítását az 5-jód-uracil

származékok és timin monomer esetében már alkalmazott körülmények mellett hajtottam

végre. Végül a Boc/Z védett PNS C monomert kaptam (34), mely a szilárd fázisú szintézis

során felhasználható.

3.9. Oligomer szintézis

3.9.1. PNS oligomer szintézise

A módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc/Z

peptidszintézis protokoll 75 alkalmazásával a H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer

modell szekvenciába építettem be az aláhúzott 3 középső egység helyére. A szekvenciát a

38

következő szempontok alapján terveztük: 1. Csak pirimidinbázisokat tartalmaz így

nemcsak a PNS:DNS illetve PNS:RNS duplexek, de a megfelelő 2 PNS láncot tartalmazó,

tripla hélixek stabilitása is tanulmányozható. 2. A szekvencia nem szimmetrikus, így a

megfelelő antiparalell DNS ill. RNS targetekkel csakis egyféle, a jóval stabilabb

antiparalell duplexek képződhetnek. 3. Mind a C-terminális végen mind pedig középen 3

egymást követő, így blokkot képező, t vagy t-analóg egységet tartalmaz, amely lehetővé

teszi a módosítások hatásának a hely függvényében történő tanulmányozását is. 4. A

szekvencia hossza (11-mer) alapján a Tm értékek várhatólag a mérési tartomány közepébe

(45-65 °C) esnek, így a Tm görbe közel vízszintes szakaszai is jól kimérhetők lesznek.

27. A 4-metil-benzhidril-amin gyanta

A szintézist manuálisan MBHA gyantán (27.ábra), a peptidkémiában megszokottól

alacsonyabb kapacitás alkalmazásával hajtottam végre. A D-lizin kapcsolása után

kvantitatív pikrinsavas tesztet végeztem, míg a PNS monomerek kapcsolásának

hatékonyságát Kaiser teszttel ellenőriztem. A szintézis végén az oligomert lehasítottam a

gyantáról és HPLC-vel tisztítottam. Az így előállított PNS oligomerek:

H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 (I a.) referencia, középen 3 timin egység

H–t c c c tPr tPr tPr c t t t-D-Lys-NH2, (I b.) középen 5-propinil-uracil egységek

H–t c c c tPh tPh tPh c t t t-D-Lys-NH2, (I c.) középen 5-fenil-uracil egységek

H–t c c c tPhE tPhE tPhE c t t t-D-Lys-NH2,, (I d.) középen 5-feniletinil-uracil egységek

H–t c c c tTie tTie tTie c t t t-D-Lys-NH2, (I e)középen 5-(2-tienil)-uracil egységek.

3.9.2. A komplementer DNS oligomer szintézise

A target d(5’-AAA GAA AGG GA-3’) ( II. )oligodezoxinukleotidot standard

szilárd-fázisú foszforamidit szintézis protokoll (28. ábra) alkalmazásával

MilliGen/Biosearch 8700 DNS szintetizátor segítségével állítottuk elő.

39

28. Szilárd-fázisú oligonukleotid szintézis foszforamidit módszerrel

A szintézis egy többször ismétlődő ciklus. A láncvégi dimetoxi-tritil-csoportot (DMT)

híg klórecetsav oldattal hasítottam le (detritilezés), a következő monomer lánchoz

kapcsolását tetrazol jelenlétében végeztem, az oxidációs lépésben jód oldatot alkalmaztam.

Ezt követően az el nem reagált láncvégi OH-csoportokat ecetsavanhidriddel acetileztem

(keppelés), majd a detritilezéssel indul a következő ciklus. A szintézis során derivatizált

hordozót alkalmaztam, azaz az első nukleotid egység már a szilárd fázisra volt kötve, ezért

ennek detritilezésével indult a ciklus. A szintézis végén az oligomert tömény ammónia

oldattal hasítottam le a hordozóról és egyúttal a védőcsoportokat is eltávolítottam a

láncvégi DMT kivételével. Ennek az a jelentősége, hogy az előtisztítás során a szilárd

fázisú extrakcióval a rövidebb oligomerektől a kartridzson egyszerű mosással

megtisztíthatjuk a terméket. A DMT védett oligomer a szilárd fázishoz kötődve marad a

mosás során, majd a védőcsoport hasítása után ez is eluálható. A nyersterméket RP-HPLC-

vel tisztítottam, a csúcsfrakciókat összegyűjtöttem és liofilizáltam.

40

3.10. Stabilitás vizsgálatok

A DNS: PNS duplexek termikus stabilitását Beckman DU 7400 spektrofotométerrel

vizsgáltam. A komplexet alkotó oligomerekből 1mg / ml koncentrációjú oldatot

készítettem nátrium-kloridra és magnézium-kloridra nézve 0,01 M-os Tris-pufferben (pH:

7,4), majd az oldatokat 150-szeresére higítottam. A DNS: PNS oldatokat páronként 1:1

térfogatarányban összemértem, a kapott elegyet forrásig melegítettem, majd lassan

hagytam szobahőmérsékletre hűlni. Az abszorbanciát 260 nm-en mértem a hőmérséklet

függvényében. A fűtés sebessége 1 oC / perc volt.

A II.: I a: komplex, azaz a módosításokat nem tartalamó PNS esetén meglepően

magas (65 oC) Tm pontot mértem (29. ábra).

10 20 30 40 50 60 70 80 90 1001,00

1,05

1,10

1,15

1,20

1,25

1,30

1,35

Tm = 65 oC

Rel. Absz = Absz (T) / Absz (25oC

Hõmérséklet / oC

29. A refencia DNS: PNS duplex Tm pont mérése

Az 5-fenil- és az 5-(2-tienil)-uracilt tarlmazó PNS oligomerek (I c és I e) DNS

komplexeinek vizsgálata során a mért tartományban nem alakul ki a telítődés (30. ábra). A

görbék deriváltjából kapott inflexiós pont helye (58,0 és 63,8 oC ) nem tér el jelntősen a

referencia duplexétől, tehát a módosított duplexek termikus stabilitása hasonló a

módosítást nem tartalmazó duplexéhez. Ennél pontosabb eredményekhez, optimalizált

körülmények között, a teljes telítésbe menő görbét fel kell venni. Az 5-(1-propinil)- és 5-

feniletinil-uracil származékok (I b és I d) esetén az abszorbancia lineáris

41

hőmérsékletfüggést mutatott, ami arra utal, hogy nem alakult ki a duplex a komplementer

DNS szál és az PNS között. Ezek alapján megállapítható, hogy az aril módosítások a

duplexképződést és a duplex termikus stabilitását jelentősen nem befolyásolták, ezzel

szemben az alkinok beépítése nem kedvezett a DNS: PNS komplexek kialakulásának jelen

mérési körülmények között. A refencia vegyület vizsgálata során mért magas Tm pont és

módosított analógok esetében tapasztalt eredmények alapján a mérési körülmények (só

koncentráció, ionerősség, pH, és felfűtési sebesség) optimalizálása szükséges a pontosabb

értékeléshez.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1,00

1,05

1,10

1,15

1,20

1,25

Rel. Absz = Absz (T) / Absz (25oC

Hõmérséklet / oC

30. Az 5-(2-tienil)-uracil tartamazó PNS komplexének termikus vizsgálata

42

3.11. P-királis mononukleotidok szintézise

Kísérleteinkhez modellvegyületekként az 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-

cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamiditet (T-CED) és ennek oxidált származékait

választottam. Mivel az oxidációs reakciók sztereokémiáját is tanulmányozni kívántam

ezért az izomerkeverék T-CED-ből szilikagél kromatográfiával preparáltam a tiszta RP és

SP diasztereomereket és az oxidációs reakciókat ezekből kiindulva hajtottam végre (31. és

32. ábra).

31. A T-CED Rp diasztereomerjének oxidációi

A különböző P(III) származékok (foszfit triészterek, foszforamiditek, stb.)

oxidációja a megfelelő P(V) vegyületekké igen sokféle oxidálószer alkalmazásával

változatos módon valósítható meg 76 77 78 79 80 és ez alapvetően meghatározza a szóban

forgó reakciók sztereokémiáját is. Célvegyületeinket nevezetesen a T-CED oxidált 81,

tiooxidált 82 és szelenooxidált83 származékait mint P-diasztereomer keverékeket korábban

már mások is leírták de közülük csak a foszforotioát analóg izomerjeit szeparálta és

jellemzte kutatócsoportunk egy régebbi munkája során 29. A kiindulási T-CED, akárcsak a

többi védett természetes nukleozid, 3’-foszforamiditjeinek tiszta RP- és SP- izomerjeit

elsőként Pfleiderer és mtsai. izolálták közepes nyomású szilikagél kromatográfiával 84.

43

32. A T-CED Sp diasztereomerjének oxidációi

A disszertációban a P-konfiguráció hagyományos Cahn-Ingold-Prelog (CIP)-

konvenció szerinti RP/ SP jelölése mellett az utóbbi időben Sobkowski és mtsai 85 86 által

javasolt és bevezetett új LP/DP P-sztereokémiai nomenklatúrát is alkalmazom mivel ez

utóbbi minden esetben korrelációban van a központi foszforatomhoz kapcsolódó megfelelő

szubsztituensek térállásával, míg a rendszámokon alapuló CIP prioritási sorrend miatt a

hagyományos RP/ SP jelölés sok esetben (pl. egy Me→SMe csere esetén) a szubsztituensek

azonos térállása ellenére is különböző.

3.11.1. Szintézis

Annak ellenére, hogy a szintézis kiindulási anyagát a T-CED tiszta P-izomerjeit

35a és 35b korábban közepes ill. kis nyomású kromatográfiával szeparálták 84 87, saját

korábbi tapasztalataink és irodalmi adatok 88 89alapján is a savérzékeny nukleozid-3’-

foszforamiditek gravitációs szilikagél kromatográfiával is bomlás nélkül tisztíthatók és

elválaszthatók amennyiben az eluens néhány % bázist (általában TEA-t) tartalmaz, amely

elegendő a szilikagél savasságának közömbösítésére. Jelen esetben az izomerkeverék T-

CED-et kb. ~10 g-os mennyiségben kromatografáltam és az első elválasztás után ~30%-os

bruttó termeléssel izoláltam a tiszta diasztereomereket míg az anyag ~60%-át keverék

formában nyertem vissza.

44

A 35a–ból és 35b–ből kiindulva a lehető legegyszerűbb módon egyszerű reagensek

(pl. elemi kén és szelén) alkalmazásával sztereospecifikus oxidációkat terveztem

végrehajtani, hogy elkerüljem a melléktermékek képződését ezáltal a végtermék

kromatográfiás tisztítását is. A reakciókat szobahőmérsékleten végeztem mindhárom

esetben 4-szeres mólfelesleg oxidálószer alkalmazásával, ami lehetővé teszi a reakcióidők

és a módszerek hatékonyságának összehasonlítását.

A foszforamidát diasztereomerek 36a és 36b szintézisére az acetonitril, mint

oldószer és H2O2 oldat, mint oxidálószer alkalmazása tűnt a legjobb megoldásnak ami igen

rövid idő alatt kvantitatív termeléssel szolgáltatta a kívánt DP-(SP)- és LP-(RP)-izomereket.

Mivel a reakció másik terméke a víz így az elegyek bepárlásával közvetlenül a tiszta

termékeket kaptam. A reakció a kromatográfiás analízisek szerint kemo- és

sztereospecifikus volt, amely a H2O2 –ot alkalmassá teszi más P(III) vegyületek szelektív

oxidációjára is. Itt kell megjegyeznem, hogy a foszfit triészterek szilárd fázisú oxidációjára

általánosan használt reagens (I2/THF-piridin-víz) 90 az én esetemben a P-amidit funkció

érzékenysége miatt nem alkalmazható, másrészt ez a módszer nem sztereospecifikus 76.

A tiszta foszforamidotioát diasztereomerek 37a és 37b szintézisére korábbi

munkánk során is elemi ként használtunk 29 de az egyszerűbb feldolgozás kedvéért a

toluol-2,6-lutidin keverék helyett ezúttal CH2Cl2–t használtam oldószerként, amelyben a

kén ugyancsak homogén oldatot ad a szükséges viszonylag alacsony koncentrációban. A

reakcióelegy bepárlását követően a maradék EtOAc-os digerálásával majd szűrésével a

kénfelesleg nagy része eltávolítható, de nem tökéletesen, ezért a teljesen kénmentes

végtermékek csak egy végső szilikagél kromatográfiás tisztítás után izolálhatók.

Mivel a kénezéshez hasonlóan a P(III) vegyületek szelenooxidációja is megoldható

elemi szelénnel 91 92 így ez a módszer tűnt a legésszerűbbnek a foszforamidoszelenoát

izomerek 38a és 38b előállítására. Mivel a szelén jóval rosszabbul oldódik CH2Cl2–ban,

mint a kén, ezért a reakcióelegy itt szuszpenzió és a reakcióidő is hosszabb (~5 óra) de a

szelén felesleg ezesetben tökéletesen eltávolítható szűréssel. Itt jegyzem meg, hogy egy új,

szerves oldószerekben jól oldódó, szelén transzfer reagens ((iPrC5H4)2TiSe3)

alkalmazásával a 38a és 38b, mint diasztereomer keverék szintézisét korábban már leírták 83.

A leírtakat a 31. és a 32 ábra szemlélteti.

45

3.11.2. NMR vizsgálatok

Az egymáshoz nagyon hasonló 35, 36, 37 és 38 vegyületek szerkezetvizsgálata a 1H, 13C és 31P kémiai eltolódások és bizonyos csatolási állandók összehasonlításán alapul.

Az említett izomerpárok közös tulajdonsága, hogy a 35b, 36b, 37b és 38b izomereknél a 3J

(P,C) csatolási állandók a C4’ szénatom esetében mindig nagyobbak, mint a C2’-nél, míg a

tendencia a 35a, 36a, 37a és 38a izomereknél éppen fordított. Következésképpen a 35b,

36b, 37b és 38b diasztereomerek pozitív ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékei az εt

konformáció dominanciáját jelzik míg a 35a, 36a, 37a és 38a izomerek negatív ∆J értékei

az ε- konformer túlsúlyára utalnak. A 36a, 37a és 38a izomereknél a H2’β proton és a

foszfor közötti négy kötéses csatolási állandók (1,5, 1,4 és 1,3 Hz) ugyancsak összhangban

vannak az ε- konformáció dominanciájával 93, míg a 36b, 37b és 38b vegyületeknél ezek a

csatolások (<0,5 Hz) nem voltak detektálhatók (lásd a 2. táblázatot).

A C3’-O3’ kötés körüli preferált konformációk ismeretében a P-atom abszolút

konfigurációjára nézve az N-izopropil-metil csoportok és a megfelelő cukor protonok

közötti NOE korrelációkból is információkat kapunk. A foszforotioát analógnál (37b (RP)

és 37a (SP)) talált korábbi adatokkal 29 összhangban, a 35b, 36b és 38b izomereknél

jelentős NOE korreláció van az izopropil metil protonok és a H4’ és C5’-2H protonok

között míg a 35a, 36a és 38a izomerek esetében hasonló NOE effektus van a szóban forgó iPr-metil és a H2’α protonok között. Ezenkívül az izopropil csoport metil dubletjei a

„lassú” b izomerek esetében határozottan elkülönülnek míg a „gyors” a izomereknél

gyakorlatilag teljesen egybeesnek. Ez valószínűleg annak tulajdonítható, hogy az előbbi

esetben a két Me csoport közül az egyik közelebb van a furanóz gyűrű O-atomjához míg az

a izomereknél az iPr csoport távolabb van a cukortól ezért a két Me csoport protonjai

csaknem ekvivalensnek tekinthetők. Korábban ennek alapján tettek javaslatot a 35a és 35b

diasztereomerek abszolút konfigurációjára is 84. A 27. és a 28. ábrán a hagyományos

(RP/SP) jelölésen kívül minden vegyület esetében alkalmaztuk az új (DP/LP) nomenklatúrát 85 86 is. Ez utóbbi látható módon korrelál a megfelelő szubsztituensek térállásával, egyúttal

az izomerek kromatográfiás mozgékonyságával is. Eszerint a gyors 35a, 36a, 37a és 38a

izomerek DP, míg a lassú 35b, 36b, 37b és 38b diasztereomerek LP abszolút

konfigurációval rendelkeznek.

A transz és a gauche konformerek preferenciáján és az NOE effektusokon kívül az

LP és DP sorozatokon belül bizonyos protonok kémiai eltolódásaiban is találunk

analógiákat. Így pl. a DP konfigurációjú a izomereknél a H4’ proton valamivel nagyobb

46

eltolódású, mint az LP sorozat megfelelő vegyületeinél, miközben a H2’α protonok kémiai

eltolódásaiban pontosan az ellenkező tendencia figyelhető meg. Miközben az említett két

proton eltolódásaiban jellemző különbség van az izomerek között ezek az értékek

függetlenek a P=X kötés természetétől, vagyis a 36a, 37a és 38a ill. a 36b, 37b és 38b

sorozatokon belül gyakorlatilag azonosak. Ez arra utal, hogy a C3’-O3’-P kötések körüli

konformációk az adott sorozaton belül nagyon hasonlóak vagyis ezeket a heteroatom

minősége, a P=X kötés polaritása nem befolyásolja. Ugyanakkor más spektrális

paraméterek, mint pl. a H3’ és az izopropil metin protonok valamint a C3’ és az izopropil

metin szénatomok kémiai eltolódásai egyértelműen nőnek az X heteroatom

elektronegativitásának csökkenésével. Ugyanez figyelhető meg a 31P kémiai eltolódások

esetében is, itt azonban az oxidációs szám csökkenése (+5-ről +3-ra) okoz igazán jelentős

növekedést. A 2J(P,C3’), 2

J(P,OCH2) és 2J(P,CHN) csatolási állandók szisztematikus

csökkenése ugyancsak jól korrelál az X heteroatom csökkenő elektronegativitásával

ugyanakkor a 31P kémiai eltolódásokhoz hasonlóan ezek a paraméterek is kiugróan

magasak a P(III) vegyületek 35a és 35b esetében.

A sztérikus és elektronikus hatások együttes eredményeképpen a 36b és 36a

oxovegyületek ∆J értékei (+3,6 és -1,9) határozottan különböznek a 37b, 38b és a 37a, 38a

analógok megfelelő értékeitől (+2,2; +2,4 és -2,6; -2,4). Mivel az a és b sorozatokon belül

a C4’, C2’, H4’ és H2’α kémiai eltolódások a C3’-O3’ kötés körüli nagyon hasonló

konformációt jeleznek ezért az említett különbség ez esetben is az O atomnak a kénhez és

szelénhez viszonyított jóval nagyobb elektronegativitására vezethető vissza. A

trikoordinált P-atommal rendelkező 35a és 35b esetében a szóban forgó különbségek

abszolút értékben (-0,5 és +2,0) kisebbek, mint a P(V) analógoknál, de a ∆J-k előjelei itt is

azonosak az oxidált származékok megfelelő izomerjeinél találtakkal, ami előrevetíti a ∆J

alkalmazhatóságát más P(III) vegyületek abszolút konfigurációjának meghatározására is.

A vegyületek szerkezetének oldószerfüggését is tanulmányozni kívántuk ezért a

spektrumokat deuterobenzolban is felvettük, ami a 3J(P,C4’) és 3

J(P,C2’) csatolási

állandók vonatkozásában határozott különbséget mutatott a CDCl3-hoz viszonyítva, míg a

többi C-P csatolásra az oldószercsere nem volt hatással. A C6D6-ban mért nagyobb ∆J–k az

εt konfomerek nagyobb populációját jelzik, ami a hőmérséklet növelésével (a 17°C - 65°C

tartományban) tovább nő. Az aromás oldószer ezen hatása alapvetően a benzol és a

nukleobázis (timin) közötti stacking kölcsönhatásnak tulajdonítható, de ebben valószínűleg

az 5’-dimetoxitritil csoport aromás gyűrűi is közreműködnek.

47

A várakozástól eltérően a 31P kémiai eltolódások nem korrelálnak szigorúan a DP/LP

sztereokémiával az összes izomerpáron belül. Az egyes izomerek egyértelmű asszignációja

céljából a felvételekhez mind a négy esetben a/b = 2/1 mólarányú keverékeket

alkalmaztunk mivel az izomerek közötti kémiai eltolódás különbség minden izomerpárnál

igen kicsi. Meglepetésre azt találtuk, hogy a 35 és 36 vegyületeknél a gyors DP izomerek

jelei magasabb frekvenciánál jelentkeznek a lassú LP diasztereomerekéhez viszonyítva,

míg a 37 és 38 analógok esetében a tendencia éppen fordított.

A vegyületek fontosabb kémiai eltolódás és csatolási állandó értékeit a 2. táblázatban

foglaltuk össze.

48

35a 35b 36a 36b 37a 37b 38a 38b

δ(ppm)a

H4’ 4.18 4.14 4.32 4.28 4.33 4.29 4.34 4.30

H2’α 2.49 2.53 2.58 2.67 2.57 2.66 2.58 2.65

H3’ 4.66 4.66 5.05 5.06 5.28 5.33 5.36 5.42

NCH 3.55 3.56 3.43 3.40 3.73 3.72 3.85 3.84

H5’A 3.32 3.31 3.41 3.37 3.43 3.41 3.47 3.41

H5’B 3.54 3.48 3.53 3.50 3.43 3.48 3.48 3.53

H5’B-H5’A 0.22 0.17 0.12 0.13 0 0.07 0.01 0.12

NCHCH3 1.16 1.06 1.21 1.13 1.29 1.22 1.31 1.24

1.17 1.16 1.23 1.22 1.29 1.28 1.32 1.28

C4’ 85.91 85.61 84.97 84.98 85.02 84.78 85.01 84.97

C2’ 40.26 40.28 39.58 39.62 39.41 39.26 39.52 39.42

C3’ 73.72 74.16 77.13 77.50 77.61 77.82 78.54 79.33

NCH 43.51 43.45 46.57 46.52 47.42 47.39 48.15 48.18

P 149.54 149.12 8.50 8.17 71.26 71.45 74.29 74.89

J(Hz) 3J(P,H3’)a 9.5 9.2 7.5 7.2 11.3 10.5 12.1 11.5 4J(P,H2’ß) - - 1.5 c 1.4 c 1.3 c 2J(P,C3’)a 16.6 17.0 5.4 5.7 5.1 5.4 4.6 5.0

2J(P,OCH2)a 19.0 18.6 5.1 5.2 4.2 4.4 3.8 3.7

2J(P,CHN)a 12.2 12.6 5.1 5.2 4.6 4.9 4.8 4.9 3J(P,CH2CN)a 6.8 7.1 7.5 7.3 9.0 8.5 9.2 9.0

3J(P,C4’)a 3.9 5.5 3.9 7.1 3.5 6.4 3.5 6.4 3J(P,C2’)a 4.4 3.5 5.8 3.5 6.1 4.2 5.9 4.0 3J(P,C4’)b - - 4.5 6.9 4.0 6.8 3.9 6.6 3J(P,C2’)b - - 5.4 2.3 5.9 3.9 6.2 3.8

∆Ja -0.5 +2.0 -1.9 +3.6 -2.6 +2.2 -2.4 +2.4

∆Jb - - -0.9 +4.6 -1.9 +2.9 -2.3 +2.8

2. Táblázat A diasztereomerek (35-38 a,b) kémiai eltolódásai és csatolási állandói

a CDCl3-ban, szobahőmérsékleten, b C6D6-ban, 17 °C-on, c kevesebb, mint 0.5 Hz

49

3.11.3. HPLC analízisek

Míg a T-CED izomerek 35a és 35b oxidációja a megfelelő foszforamidátokká 36a

és 36b, a nagy Rf különbségek miatt jól követhető VRK-n, addig a kénezési és szelénezési

reakciók termékei (37a, 37b és 38a, 38b) több oldószerelegyben sem különböznek

jelentősen a kiindulási anyagoktól. Az utóbbi reakciók előrehaladásának követése másrészt

a heteroatomok kromatográfiás viselkedésre gyakorolt hatásának vizsgálata céljából

célszerűnek tűnt a normál és reverz fázisú HPLC alkalmazása.

A normál fázisú oszlopon a gyors 37a és 38a vegyületek retenciós idői (tR)

gyakorlatilag azonosak voltak, míg a 37b és 38b lassú izomereknél a különbség (~9 sec.)

már detektálható volt. Meglepetésre a foszforotioát analógok 37a és 37b bár csak kicsivel,

de valamivel mégis mozgékonyabbak voltak, mint a megfelelő szeleno izomerek 38a és

38b, ami nem korrelál a szelénnek a kénhez viszonyított nagyobb méretével és

hidrofóbicitásával. A VRK-val összhangban a 36a és 36b oxo izomerek bizonyultak a

legkevésbé mozgékonynak ráadásul a DP és LP izomerek közötti tR különbség (~7 min.)

messze itt volt a legnagyobb az összes izomerpár közül. Összegezve elmondható, hogy a

normál fázisú HPLC profilok alapján a ligandumok függvényében a következő mobilitási

sorrend állapítható meg: nemkötő elektronpár > P=S ≥ P=Se >> P=O.

A reverz fázisú oszlopon a várakozásnak megfelelően a legkevésbé poláros T-CED

izomerek 35a és 35b rendelkeztek a legnagyobb, míg a messze legpolárosabb 36a és 36b a

legkisebb tR értékekkel. A hidrofób csoportok (5’-ODMT és Ni-Pr2) jelenléte miatt az

összes vegyület erősen kötődött a C18 töltethez ezért az eluensnek viszonylag sok (80%)

acetonitrilt kellett tartalmaznia, hogy a retenciós idők ne legyenek túl hosszúak. A normál

fázison talált anomáliától eltérően a reverz fázison érvényesült a szelén kénhez viszonyított

nagyobb hidrofóbicitása így a 38a és 38b tR értékei nagyobbak voltak, mint a megfelelő

foszforotioát izomereké 37a és 37b. Ennek megfelelően a reverz fázisú oszlopon talált

mobillitási sorrend a következő volt: 36 (P=O) > 37 (P=S) > 38 (P=Se) > 35 (nemkötő

elektronpár). Meglepő módon az egyes izomerpárokon belüli mobilitási sorrend mindkét

fázison azonos volt vagyis a gyors a izomerek az oszloptöltet polaritásától függetlenül

kisebb tR értékeket mutattak mint a lassú b izomerek, ami egyúttal megegyezik a VRK-s

sorrenddel is.

A leírtakat a 3. táblázatban foglaltuk össze.

50

Retenciós idő (perc)

Normál fázis Fordított fázis

35a 4.18 6.40

35b 5.11 7.18

36a 8.83 3.86

36b 15.81 4.13

37a 4.47 5.77

37b 5.92 6.50

38a 4.50 5.88

38b 6.06 6.83

3. Táblázat A diasztereomerek (35-38 a,b) HPLC-s retenciós idői

4. Összefoglalás

Doktori kutatásaim során új 5-szubsztituált pirimidin bázisokat tartalmazó peptid-

nukleinsav monomer származékok szintézisével, valamint P-királis mononukleotidok

szintézisével és vizsgálatával foglalkoztam.

Munkám során az elért új tudományos eredmények a következők:

1. A peptid-nukleinsavak szintézisének kulcsintermedierje az etil N-(2- Boc-

aminoetil)-glicinát (Boc-gerinc). Ennek szintézisére az irodalomból ismertnél jobb

és hatékonyabb eljárást dolgoztam ki. A Boc-etilén-diamin köztiterméket

rutinszerűen végezhető módszerekkel (szűrés, extrakció, desztillálás) tisztán

izoláltam. Ezáltal a végtermék kromatográfiás tisztítása sokkal kényelmesebb és a

reakció hozama is növelhető.

2. 5-jód-uracilból kiindulva három lépésben előállítottam az 5-jód-uracil PNS

monomert, amely palládium-katalizált keresztkapcsolási reakciókban

felhasználható és az etilészter csoport hidrolízise után a módosított monomer

alkalmas a szilárdfázisú oligomerizációra Megállapítottam, hogy az uracil

alkilezésére a brómecetsav-t-butilészter a legalkalmasabb, figyelembe véve, hogy a

savas hasítás kvantitatívan eredményezi a várt karbonsavat, mellékreakció nélkül.

A monomer két alkotóelemét modern kapcsolási körülményeket alkalmazva

kötöttem össze.

3. Aril-tributil-sztannán vegyületeket kapcsoltam Stille reakcióval az 5-jód-uracil

PNS monomerhez. Az etilészert lúgos közegben hidrolizáltam. Így az 5-(2-tienil)-,

az 5-(2-furanil)- és az 5-fenil-uracil PNS monomereket állítottam elő.

Megállapítottam, hogy a kapcsolt termékek és a jódvegyület kromatográfiás

tulajdonságai nagyon hasonlítanak, ezért bizonyos esetekben az el nem reagált

kiindulási vegyület reduktív dejódozása nagymértékben megkönnyíti a termék

izolálását.

Végeztem kísérleteket „inverz” és „dupla” Stille kapcsolások megvalósítására is.

Az első esetben az uracil monomeren alakítottam ki a trialkilsztannil-csoportot,

majd ezt az ónvegyületet reagáltattam aromás-halogenidekkel. A másik alkalmazás

52

esetén „one pot” reakciót kíséreltem meg, mely során az aril-halogenidet hexa-

alkil-diónnal kapcsolva aril-trialkil-sztannán keletkezik és ez izolálás nélkül

reagáltatható az 5-jód-uracil PNS monomerrel.

Ezek a kapcsolási módszerek azonban nem minden esetben eredményezik a várt

terméket és hatékonyságuk sem közelíti meg a „normál” Stille kapcsolásét.

4. Az 5-jód-uracil PNS monomer Suzuki és Sonogashira kapcsolásokban történő

felhasználása során problémák merültek fel. Az aromás boronsavak palládium

katalizálta reakciói szinte egyáltalán nem vezettek eredményre, a terminális alkinek

kapcsolásai során pedig nem elhanyagolható mértékben furano[2,3-d]-pirimidin

gyűrűs melléktermékek is képződnek. A probléma kiküszöbölésére laktám-védett

jódvegyületet terveztem, amely a Pd-katalizált kapcsolások körülményei között

stabil.

Az N1-alkil 5-jód-uracilt N3 helyzetben p-metoxi-benzilcsoporttal védtem. Ezt

követően a t-Bu észter hasítása majd a gerichez kapcsolás űtján uzoláltam a 3-

PMB-5-jód-uracil PNS monomert . Ez a védőcsoport oxidatív módon távolítható el,

azonban ezt a lépést még optimalizálni szükséges.

5. Sonogashira kapcsolások során különböző 5-alkinil-uracil PNS monomereket

állítottam elő. Az 5-jód-uracil PNS monomerrel történt kapcsolások csak

elfogadható hozammal eredményezték a kívánt termékeket a furano[2,3-d]-

pirimidin gyűrűs melléktermékek képződése miatt. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS

monomer, mint kiindulási anyag, alkalmazásakor viszont a kapcsolások közel

kvantitatív hozammal valósíthatók meg. Előállítottam a védett 5-(1-propinil)-, 5-

feniletinil- és 5-(1-hexin-1-il)-uracil PNS monomereket.

6. A boronsavak könnyű hozzáférhetősége és nagy tárháza miatt a Suzuki kapcsolás

kiválóan alkalmas nagyszámú aril-analógok szintézisére. Az 5-jód-uracil PNS

monomeren végzett keresztkapcsolási reakciók során azt tapasztaltam, hogy

vízmentes közegben a Suzuki kapcsolás nem valósítható meg. Ennek oka

valószínűleg az, hogy bázikus közegben az uracil laktám csoportja deprotonálódik

és a közeli negatív töltés hatására a palládium elektrofil jellege csökken, amely a

transzmetallálást nagy mértékben gátolja. Azaz szükséges a laktám csoport

átmeneti védelme.

53

Ezt az elképzelést alátámasztják az eredményeim, mivel a 3-PMB-5-jód-uracil PNS

monomeren sikeresen kapcsolási reakciókat hajtottam végre különböző aril-

boronsavakkal és így N3-PMB-védett 5-(2-tienil)-, 5-(4-bifenil)-, 5-(benzo[b]tiofén-

2-il)- és az 5-(4-dimetilaminofenil)-uracil PNS monomereket állítottam elő. A

boronsavak helyett boronsav-pinakolésztereket alkalmazva a konverzió kb. 10 %-

kal növelhető.

7. Az uracil laktám funkciója könnyen trimetilszililezhető és a TMS csoport könnyen

eltávolítható. Ugyanakkor extra érzékenysége miatt az ilyen jellegű származékok

nem izolálhatóak. Ezek alapján in situ szililezéssel dolgoztam ki módszert az 5-jód

uracil származékok Suzuki kapcsolására. A TMS csoport bevitelét BSA-val

hajtottam végre, az eltávolítása a rekcióelegy vizes feldolgozása során végbement.

Az N1-alkil-5-jód- uracilon végrehajtott reakciók hozama jónak mondható, az 5-

jód-uracil PNS monomer esetén ez alacsonyabb a mellékreakciók miatt.

Elmondható, hogy az in situ szilil védelem melletti Suzuki kapcsolások az N1-alkil-

5-jód- uracillal elfogadható termeléssekkel hajthatók végre és a PMB-től eltérően a

4-OSiMe3 védőcsoport eltávolítása kombatibilis a gerinc védőcsoportokkal.

8. Az irodalomból ismert szintézisek optimalizálásával, korszerűbb módszerek és új

reagensek alkalmazásával előállítottam a timin PNS monomert.

9. A citozin PNS monomer előállítására új eljárást dolgoztam ki. A szakirodalomban

leírt triazolil származékon keresztüli uridin – citidin átalakítást alkilezett uracilon is

sikerrel alkalmaztam. Az előállított N1-alkil citozinból az 5-jód-uracil és timin

monomerek esetén is alkalmazott modern módszereket felhasználva Boc/Z védett

citozin PNS monomert állítottam elő.

10. Az 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamidit

(T-CED) tiszta DP,RP- és LP,SP-diasztereomerjeit H2O2-dal, elemi kénnel ill.

szelénnel oxidálva gyakorlatilag kvantitatív hozamokkal izoláltam a megfelelő

P(V) vegyületeket. Az NMR és kromatográfiás analízisek szerint a reakciók

minden esetben kemo- és sztereospecifikusak voltak és a P-konfiguráció

retenciójával játszódtak le. A termékek közül a foszforamidátokat és

54

foszforamidoszelenoátokat korábban csak P-diasztereomer keverék formában írták

le az irodalomban.

11. A P-királis mono- és dinukleotidokkal kapcsolatos korábbi NMR vizsgálatainkkal

összhangban megállapítottam, hogy a ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékek a

preparált új analógok esetében is jellemzőek a P-konfigurációra. Eszerint a negatív

∆J –k az LP míg a pozitív értékek a DP abszolút konfigurációval rendelkező

izomerekre jellemzőek. Külön érdekesség, hogy az említett korrelációt korábban

csak a kettős kötésű heteroatomot tartalmazó P(V) vegyületeknél vizsgálták. Jelen

adatok szerint ez a hozzárendelés a P(III) vegyületekre is érvényesnek bizonyult

ami NOE mérésekkel megerősítve a jövőben alkalmas módszer lehet más királis

foszfitok abszolút P-konfigurációjának meghatározására is.

12. A normál és különösen a reverz fázisú HPLC analízisek alapján megállapítottam,

hogy a foszforatomhoz kettős kötéssel kapcsolódó heteroatomok

elektronegativitása és a retenciós idők között egyértelmű összefüggés áll fenn. Az

RP-HPLC-vel talált mobilitási sorrend: (P=O) > (P=S) > (P=Se) > (nemkötő

elektronpár) megfelel a várakozásnak. Az egyes izomerpárokon belül, a ∆J

értékekhez hasonlóan, a HPLC profilok alapján is egyértelmű korreláció van a

retenciós idők és az abszolút P-konfiguráció között. Érdekes módon a „gyors” DP

izomerek mindkét fázison mozgékonyabbak voltak, mint a „lassú” LP hasonmások.

5. Kísérleti rész

5.1. Vékonyréteg-kromatográfia

Az előállított vegyületek tisztaságát első lépésben mindenkor vékonyréteg-kromatográfia

segítségével ellenőriztem, DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 (Merck) típusú lemezen.

Alkalmazott eluensek (v/v): (1) EtOAc: hexán 2:1; (2) EtOAc: hexán 1:1; (3) Kloroform:

metanol 9:1; (4) Kloroform: metanol 19:1; (5) n-butanol: ecetsav: víz 3:1:1; (6) Kloroform:

metanol 2:1; (7) EtOAc: hexán 1:2.; (8) EtOAc: metanol 9:1; (9) EtOAc; (10) Kloroform:

metanol: ecetsav 90:8:2; (11) EtOAc: n-butanol: ecetsav: víz 3:1:1:1; Klorofrom: metenol

92:8

5.1.1. Előhívó reagensek:

5.1.1.1. Klór-tolidin

33. Az o-tolidin szerkezete

Az oldat készítése: 80 mg o-tolidint (33. ábra), 15 ml ecetsavat és 0,5 g KI-ot elegyítünk,

majd vízzel 250 ml-re egészítjük ki. A megfuttatott vékonyréteg-lapot klórgázzal telített

kádba helyezzük egy percre, majd a felesleges klórt hideg levegő lemezre fúvásával

eltávolítjuk, végül a lemezt a tolidines oldatba mártjuk. A kialakuló N-klór vegyületek

oxidálják a tolidint, ekkor zöldeskék színűvé oxidált vegyületek keletkeznek.

5.1.1.2. Ninhidrin

0,2 g ninhidrint 99,8 ml acetonban oldunk. A lemezt az oldatba mártás után, néhány percig

100°C-ra hevítjük, ekkor a szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületek kékes-lila,

esetleg sárga elszíneződést mutatnak

5.2. HPLC vizsgálat

Az előállított PNS és DNS oligomerek vizsgálatára és tisztítására nagyhatékonyságú

folyadékkromatográfiás (HPLC) módszereket is felhasználtam. Az 5’-dimetoxitritil-

56

timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit származékokat szintén

HPLC-vel jellemeztem. Az alkalmazott Merck típusú rendszerben (LaChrom 7100 pumpa

és Lambda 1010 UV-VIS detektor) Hypersil 5 ODS (250 mm × 4 mm) C18-csoporttal

módosított reverz fázisú és Hypersil 5 (250 mm × 4 mm) normál fázisú oszlopot

alkalmaztam. A detektálást 220 és 260 nm-en végeztem. A teljes áramlási sebesség minden

esetben 1ml/perc volt. Az alkalmazott eluensek és gradiensek az alábbiak voltak:

I. (PNS oligemerek)

A eluens: nagytisztaságú víz, 0,045%(v/v) TFA

B eluens: HPLC minőségű acetonitril, 0,036%(v/v) TFA

gradiens: 5% B-től 95% B-ig 30 perc alatt

II. (DNS oligomer)

A eluens: 0,1 M TEAA oldat: HPLC minőségű acetonitril 95: 5

B eluens: 0,1 M TEAA oldat: HPLC minőségű acetonitril 1: 1

gradiens: 0% B-től 100% B-ig 40 perc alatt

III. (Foszforamidit származékok, reverz fázis)

A eluens: 0,1M TEAA oldat

B eluens: HPLC minőségű acetonitril

gradiens: A: B = 1: 4 izokratikus elúció, 20 perc alatt

IV. (Foszforamidit származékok, normál fázis)

A eluens: HPLC minőségű EtOAc, 2 % TEA

B eluens: HPLC minőségű hexán, 2% TEA

gradiens: A: B = 3: 1 izokratikus elúció, 20 perc alatt

5.3. A gyanta kapacitásának meghatározása

5.3.1. Kvantitatív pikrinsavas teszt

A felhasznált oldatok:

Pikrinsav 0,1 M-os diklórmetános oldata (Reagens 1.)

Diizopropil-etil-amin 5 térfogat %-os diklórmetános oldata (Reagens 2.)

A vizsgált gyantát diklórmetánban duzzasztjuk, majd a Reagens 2-vel kétszer 1 percig

semlegesítjük, az esetlegesen rajta lévő savas vegyületektől. A DIEA teljes eltávolítására

ötször mossuk a gyantát diklórmetánnal, majd a gyantát kétszer 1 percig kezeljük a

Reagens 1-gyel. Ezt követően a reagens feleslegének eltávolításához a gyantát ötször

57

mossuk diklórmetánnal. A minta oldat elkészítéséhez a gyantához kötött pikrátot kétszer 1

percig eluáljuk a Reagens 2-vel, a két oldatot egyesítjük, majd 96%-os etanollal hígítjuk,

úgy hogy a végső oldatban a DCM mennyisége kevesebb legyen, mint 20%. A

kiértékeléshez a képződött DIEA-pikrát abszorbanciáját határozzuk meg 358 nm-en. 10-5

M-os oldat abszorbanciája 0,145 (a hígításokat érdemes úgy végezni, hogy a megadott

abszorbancia körüli értéket mérjünk, mert itt a legkisebb a módszer hibája. A kapott

eredményből és az elvégzett hígításokból, valamint a vizsgált gyanta mennyiségéből

aránypárokkal kapjuk meg a gyanta kapacitásértékét.

5.3.2. Kaiser (ninhidrin) teszt Szilárdfázisú szintézis során ha a szabad –NH2-terminálisú oligomerhez védett

aminocsoportot tartalmazó peptid-nukleinsavat kapcsolunk, a reakció teljességét,

sikerességét a Kaiser-teszttel vizsgáljuk. A teszthez négy oldatot használunk:

1. 3,3 mg KCN-ot oldunk 5 ml vízben, ennek 0,2 ml-es részletét piridinnel 10 ml-re

egészítjük ki

2. 500 mg ninhidrint 10 ml n-butanolban oldunk

3. 40 g fenolt 10 ml n-butanolban oldunk

4. jégecet

A gyanta kis részletét alaposan mossuk, majd az 1, 2, 3. oldatokból két-két cseppet adunk

hozzá, és a 4. oldatból egy cseppet. (Ekkor sárga színű oldatot kapunk.) 5 percre 100°C-os

szárítószekrénybe tesszük. A kék szín pozitív teszteredményt jelez (szabad aminocsoport

még jelen van), a sárga szín negatívat (nincs jelen szabad aminocsoport).

58

5.4. Boc-gerinc szintézis

5.4.1. Boc-etilén-diamin előállítása

NH2NH

O

OO

O

O

O

OH2N NH2

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,382 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

Etilén-diamin (1) C2H8N2 60,10 8,000 1833 110 124 0,89 Di-tert-butil dikarbonát

C10H18O5 218,25 1,000 229 50

Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) Dioxán 600 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

Boc-EDA (2)

C7H16N2O2 28,69 179 78 160,21 1,000 229 36,7

Az etiléndiamint dioxánban oldottam és 3 óra alatt hozzácsepegtettem a di-terc-

butildikarbonát dioxános oldatát, majd a reakcióelegyet 16 órán át utókevertettem. A

dioxánt bepároltam és a maradékhoz 300 ml desztillált vizet adtam. Kevés, fehér szilárd

csapadék vált le (Boc-NHCH2CH2NH-Boc) amelyet kiszűrtem. Az anyalúgot 3x150 ml

DCM-mel mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és

bepároltam. A visszamaradó sárga olajat vákuumdesztilláltam. A főpárlat 0,4 Hgmm

nyomáson 130-132 oC-on desztillált.

Rf (3): 0,85; (4). 0,36 MS m/z számolt: 160,12, mért: 161,0 [M+H]+ 1H NMR (DMSO) δ = 1,38 (s, 9H), 2,76 (t, 2H ), 3,42 (t, 2H) 13C NMR (DMSO) d = 28,9, 42,3, 44,3, 78,0, 156,3

59

5.4.2. N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (Boc-gerinc) szintézise

HN

NH

O

O

NH2NH

O

O

O

O

Br

O

O

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,608 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

Boc-EDA (2) C7H16N2O2 160,21 1,000 91 14,6 Brómecetsav-

etilészter C4H7BrO2 167,00 1,100 100 16,74 11,09 1,51

TEA C6H15N 101,19 2,000 182 18,44 25,6 0,72 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) DMF 150 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

Boc-gerinc (3)

C11H22N2O4 20,41 83 91 246,30 1,000 91 22,45

A Boc-EDA-t DMF-ben oldottam és hozzáadtam a TEA-t. Keverés közben 3 óra alatt

hozzácsepegtettem a brómecetsav-etilésztert, majd 4 órán át kevertettem. Éjszaka állni

hagytam. Az elegyet leszűrtem és bepároltam. A maradékot 250 ml DCM-ben oldottam és

3x100 ml telített NaHCO3-oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam,

szűrtem és bepároltam. Kromatográfiával tisztítottam (Kloroform - kloroform : metanol

99:1 gradiens elúció). Sűrű sárga olajszerű anyagot kaptam.

Rf (3): 0,45 (4): 0,15 MS m/z számolt: 246,16; mért: 247,0 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,79 (s, 1H) 2,63 (t, 2H) 3,18 (t, 2H ), 3,36 (s, 2H,) 4,13 (m, 2H) 7,95 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,4; 28,6; 40,3; 48,9; 50,6; 60,9; 78,2; 156,3; 172,6

60

5.5. 5-jód-uracil PNS monomer szintézis

5.5.1. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észter előállítása

HN

NH

O

O

I

HN

N

O

O

I

O

OBr

O

O

K2CO3

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,429 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

5-jód-uracil (4) C4H3IN2O2 237,98 1,000 150 35,7 Brómecetsav-terc-butilészter

C6H11BrO2 195,05 1,105 166 32,3 24,5 1,32

Kálium-karbonát CK2O3 138,21 0,598 90 12,4 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) DMF 350 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

5 C10H13IN2O4 46,46 132 88 352,13 1,000 150 52,8

Az 5-jód-uracilt DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a kálium-karbonátot és 1 órán át

szobahőmérsékleten kevertettem. Keverés közben hozzácsepegtettem a brómecetsav-

tercbutilésztert, 5 órán át utókevertettem, majd éjszakára állni hagytam. A kálium-

bromidot kiszűrtem, a DMF-et bepároltam. A maradékot 400 ml klorformban oldottam és

3x70 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és

bepároltam. Sárgás színű szilárd anyagot kaptam, amelyet EtOAc-hexánból

átkristályosítottam. Fehér kristályos anyagot kaptam. Kiszűrtem, az anyalúgot bepároltam

és kloroform – metanol 19-1 eluens alkalmazásával kromatográfiásan tisztítottam.

Rf (1): 0,73, (3): 0,73, op.: 185-187 oC

MS m/z számolt: 352,13; mért: 352,7 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,45 (s, 9 H), 4,45 (s, 2 H), 8,06 (s, 1 H), 11,78 (s, 1 H) 13C NMR (CDCl3) d = 27,8; 49,1; 67,7; 82,4; 149,7; 150,7; 161,0; 166,6

61

5.5.2. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav előállítása

HN

N

O

O

I

O

O

HN

N

O

O

I

OH

OOF

F

F

OH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,170 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

5 C10H13IN2O44 352,13 1,000 51,1 18 Trifluorecetsav C2HF3O2 114,02 25,4 1298 148 100 1,48 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) DCM 300 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

6 C6H5IN2O4 15,05 50,8 99 296,02 1,000 51,1 15,13

Az (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észtert 300 ml DCM-ben szuszpendáltam és

hozzáadtam 100 ml TFA-t. 4 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Az elegyet

bepároltam és a maradékot 150 ml MeOH-al szuszpendáltam. Szűrtem és szárítottam.

Fehér kristályos anyagot kaptam.

Rf (5):0,56; (11):0,62; op.: 230-234 oC

MS m/z számolt: 295,93; mért: 295,0 [M-H]- 1H NMR (CDCl3) δ = 7,20 (s, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 9,07 ( s, 2 H), 10,96 (s, 1 H) 13C NMR (CDCl3) d = 49,1; 67,7; 149,7; 150,7; 161,4; 169,6

5.5.3. N-(5-jód-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (5-

jód-uracil PNS monomer) szintézise

HN

N

O

O

I

OH

O

HN

NH

O

O

O

O

NNH

O

O

O

O

HN

N

O

O

I

O

N

NN

N

O

N

N

BF4

62

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,209 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

Boc-gerinc (3)

C6H5IN2O4 296,02 1,000 33,5 9,91

6 C11H22N2O4 246,30 1,102 36,9 9,09 TBTU C11H16BF4N5O 321,08 1,050 35,2 11,29 TEA C6H15N 101,19 3,200 107 10,84 15,06 0,72 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) DMF 160 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

5-jód-uracil PNS monomer (7)

C17H25IN4O7 15,79 30,1 90 524,31 1,000 33,5 17,55

A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam az (5-jód-uracil-1-il)-ecetsavat, a

TBTU-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül, majd az oldószert

bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 250 ml DCM-ben

oldottam és 3x60 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on

szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: CHCl3 :

MeOH 19:1). Halványsárga kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (6): 0,86, Rf (3): 0,49 és Rf (4): 0,25, Rf (9): 0.68, op.: 138-140 oC

MS m/z számolt: 524,08; mért: 547,0 [M+Na]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,33 (t, 2H), 3,53 (t, 2H) 4,06 (s, 2H), 4,21 (m, 2H), 4,62 (s 2H), 5,52 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 8,90 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,2; 28,5; 38,5; 48,0; 48,7; 50,2; 61,4; 68,1; 79,5; 149,7; 151,0; 156,3; 161,3; 167,2; 169,2

63

5.6. Stille-kapcsolások

5.6.1. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-

etilészter szintézise

HN

N

O

O

I

N

OO

ONH

Boc

O Sn

Pd(PPh3)4HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

O

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,131 M Hőmérséklet 90 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

% Wt (%)

1 5-jód-uracil-PNA monomer (7)

C17H25IN4O7 524,31 0,987 6,48 3,40

2 tributil-furán-2-il-sztannán

C16H30OSn 357,12 1,500 9,86 3,63 3,2 1,134 97

3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,020 0,130 0,15 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 50 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 8a C21H28N4O8 2,15 4,63 70,4 464,47 1,000 6,57 3,05

Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort,

a tributil-furán-2-il-sztannánt és 90 oC-on 5 órán keresztül kevertettem. Az oldószert

eltávolítottam és a maradékot 200 ml DCM-ban oldottam, 3x50 ml desztillált vízzel

mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam.

Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc : hexán 1:1 - EtOAc : hexán 9:1) és

sárgás barna szilárd anyaghoz jutottam.

Rf (9): 0,71; (12): 0,48; op.:185-188 oC

64

MS m/z számolt: 464,19; mért: 465,3 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,38 (t, 2H), 3,57 (t, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,59 (s 2H), 4,74 (s, 2H), 5,52 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,40 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,88 (s, 1H) 10,4 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,1; 28,4; 38,3; 47,8; 48,2; 49,9; 61,1; 79,1; 106,2; 108,4; 111,6; 128,5; 139,4; 146,3; 150,2; 156,2; 160,9; 167,5; 169,1

5.6.2. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-

etilészter előállítása

HN

N

O

O

I

N

OO

ONH

Boc

S Sn

Pd(PPh3)4

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

S

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,100 M Hőmérséklet 90 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

% Wt (%)

1 5-jód-uracil-PNA monomer (7)

C17H25IN4O7 524,31 1,000 1,000 0,524

2 tributil-tiofén-2-il-sztannán

C16H30SSn 373,18 1,500 1,500 0,589 0,501 1,175 95

3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,050 0,050 0,058 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 10 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 8b C21H28N4O7S 0,35 0,728 72,8 480,53 1,000 1,000 0,481

Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort,

a tributil-tiofén-2-il-sztannánt és 90 oC-on 6 órán keresztül kevertettem. Az oldószert

eltávolítottam és a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam, 3x30 ml desztillált vízzel

65

mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam.

Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:1 - EtOAc: hexán 9:1) és

sárgás barna szilárd anyaghoz jutottam.

Rf (3): 0,55; (9): 0,69; op.: 176-178 oC

MS m/z számolt: 480,17; mért: 481,3 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,43 (s, 9 H), 3,37 (t, 2H), 3,55 (t, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,59 (s 2H), 4,74 (s, 2H), 5,52 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,68 (s, 1H) 10,4 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,1; 28,4; 38,4; 48,1; 48,5; 61,2; 61,8; 79,2; 109,1; 123,5; 125,1; 126,5; 133,8; 140,8; 150,3; 156,2; 162,2; 167,3; 169,1

5.6.3. N-(5-fenil-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

szintézise

HN

N

O

O

I

N

OO

ONH

Boc

Sn

Pd(PPh3)4HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,100 M Hőmérséklet 90 °C Reaktánsok:

Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól (mmol)

Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

% Wt (%)

1 5-jód-uracil-PNA monomer (7)

C17H25IN4O7 524,31 1,000 4,01 2,10

2 tributil-fenil-sztannán

C18H32Sn 367,16 1,500 6,01 2,251 2,001 1,125 98

3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,030 0,120 0,139 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 40 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 8c C23H30N4O7 1,140 2,403 60 474,51 1,000 4,01 1,901

66

Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort,

a tributil-fenil-sztannánt és 90 oC-on 8 órán keresztül kevertettem. Az oldószert

eltávolítottam és a maradékot 200 ml DCM-ban oldottam, 3x50 ml desztillált vízzel

mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. 30

ml etil-alkoholban oldottam és 1,3 g Zn port adtam hozzá. 2 órán keresztül refluxoltattam.

Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: K-M 19:1). Termékként fehér kristályos

anyagot kaptam.

Rf (3): 0,53; (9): 0,65; op.: 192-195 oC

MS m/z számolt: 474,21, mért: 475,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,24 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,56 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 4,16 (s 2H), 4,66 (s, 2H), 5,58 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,28-7,53 (m, 5H) 9,10 (s, 1H)

5.6.4. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin

szintézise

HN

N

O

O

N

OO

OHNH

Boc

ONaOH

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

O

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,093 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (molar)

1 8a C21H28N4O8 464,47 1,000 4,63 2,15 2 Nátrium-

hidroxid NaOH 40,00 3,25 15,04 15,04 1

Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 50 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 9a C19H24N4O8 1,455 3,33 72 436,42 1,000 4,63 2,020

Az N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxánban

oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán

67

keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 50 ml EtOAc és 50 ml víz elegyében

oldottam. A vizes fázist pH 2-re savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az

elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban

szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam.

Rf (5): 0,73; (11): 0,77; op.: 240-244oC

MS m/z számolt: 436,16, mért: 437,2 [M+H]+ 1H NMR (DMSO) δ = 1,46 (s, 9 H), 3,18 (t, 2H), 3,50 (t, 2H), 3,93 (m, 2H), 4,65 (s 2H), 6,41 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 6,93 (s, 1H), 7,40 (s,1H), 7,76 (s, 1H) 11,40 (s, 1H)

5.6.5. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-

etilészter előállítása

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

SNaOH

HN

N

O

O

N

OO

OHNH

Boc

S

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,093 M

Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (molar)

1 8b C21H28N4O7S 480,53 1,000 4,66 2,24 2 Nátrium-

hidroxid NaOH 40,00 8,58 40,0 40 1

Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 50 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 9b C19H24N4O7S 1,645 3,64 78 452,48 1,000 4,66 2,109

Az N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxánban

oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán

keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 50 ml EtOAc és 50 ml víz elegyében

oldottam. A vizes fázist pH 3-ra savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az

68

elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban

szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam.

Rf (5): 0,70; (11): 0,72; op.: 225-226oC

MS m/z számolt: 452,14, mért: 453,2 [M+H]+ 1H NMR (DMSO) δ = 1,41 (s, 9 H), 3,21 (t, 2H), 3,46 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 4,58 (s 2H), 6,91 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,48 (m, 1H), 7,54 (m,1H), 7,65 (m, 1H) 11,40 (s, 1H)

5.6.6. N-[5-(2-fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-

etilészter szintézise

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

HN

N

O

O

N

OO

OHNH

Boc

NaOH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,038 M

Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (molar)

1 8c C23H30N4O7 474,51 1,000 1,138 0,54 2 Nátrium-

hidroxid NaOH 40,00 13,18 15,00 15 1

Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 30 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 9c C21H26N4O7 0,351 0,785 69 446,45 1,000 1,138 0,508

Az N-[5-(2-fenil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-amino)etil)-glicin-etilésztert dioxánban

oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán

keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 20 ml EtOAc és 20 ml víz elegyében

oldottam. A vizes fázist pH 3-ra savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az

69

elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban

szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam.

Rf (5): 0,65; (11): 0,69; op.: 214-218oC

MS m/z számolt: 446,18, mért: 447,2 [M+H]+ 1H NMR (DMSO) δ = 1,46 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,50 (t, 2H), 4,02 (m, 2H), 4,70 (s 2H), 5,22 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 7,35 (s, 1H), 9,80 (s, 1H)

5.7. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise

5.7.1. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter

előállítása

HN

N

O

O

I

O

O

N

N

O

O

I

O

O

OBr

O

NaH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,235 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

% Wt (%)

1 5 C10H13IN2O4 352,13 1,000 58,6 20,65 2 PMB-Br C8H9BrO 201,06 1,000 58,6 11,79 3 NaH HNa 24,00 1,25 73,3 2,93 60 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 250 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 15 C18H21IN2O5 20,96 44,4 76 472,27 1,000 58,6 27,7

Az (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észtert DMF-ben oldottam. Argont

buborékoltattam át ez elegyen és 0 oC-ra hűtöttem. Hozzáadtam a NaH-t majd 1 órán át

szobahőmérsékleten kevertettem. Hozzácsepegtettem a PMB-Br-ot és 4 órán át

kevertettem. 150 ml NaHCO3 oldatot adtam az elegyhez és 4x200 ml EtOAc-tal mostam.

Az egyesített szerves fázist 150 ml telített NaCl oldattal mostam, Na2SO4-on szárítottam,

70

szűrtem és bepároltam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc:hexán 1:4 -1:2

). A csúcsfrakciók bepárlásával fehér kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (2): 0,76; (7):0,30 ; op,: 135-136 oC

MS m/z számolt: 472,05; mért: 472,7 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,42 (s, 9 H), 3,78 (s, 3H), 4,35 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 6,80 (d, 2H), 7,43 (d, 2H), 7,55 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 28,2; 45,8; 50,8; 55,5, 68,4; 83,9; 113,9; 128,7; 131,1; 147,2; 151,3; 159,5; 160,2; 166,3

5.7.2. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav előállítása

N

N

O

O

I

O

O

ON

N

O

O

I

OH

O

OOF

F

F

OH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,148 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 15 C18H21IN2O5 472,27 1,000 44,3 20,93 2 TFA C2HF3O2 114,02 21,97 973 111 75 1,48 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DCM 300 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 16 C14H13IN2O5 18,05 43,4 98 416,17 1,000 44,3 18,44

A [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észtert DCM-ben

szuszpendáltam és hozzáadtam a TFA-t. 4 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Az

elegyet bepároltam és a maradékot 75 ml metanolban szuszpendáltam. Szűrtem,

szárítottam. Fehér kristályos anyagot preparáltam.

Rf (5): 0,76; (11):0,84 ; op,: 216-220 oC

MS m/z számolt: 416,17; mért: 415,0 [M-H]-

71

1H NMR (CDCl3) δ = 3,71 (s, 3H), 4,39 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,76 (d, 2H), 7,38 (d, 2H), 7,59 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 45,7; 50,0; 55,4; 113,9; 128,7; 131,0; 147,5; 151,4; 159,4; 160,3; 169,4

5.7.3. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-

glicin-etilészter (3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer) szintézise

N

N

O

O

I

OH

O

O

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

O

HN

O

ONH

O

O

N

NN

O

N

N

BF4

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;128 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 16 C14H13IN2O5 416,17 1,000 38,4 16,00 2 Boc-

gerinc C11H22N2O4 246,30 1,100 42,3 10,42

3 TEA C6H15N 101,19 3,000 115 11,67 16,21 0,72 4 TBTU C11H16BF4N5O 321,08 1,030 39,6 12,71 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 300 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 17 C25H33IN4O8 21,93 34,0 89 644,46 1,000 38,4 24,78

A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam az [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-

1-il]-ecetsavat, a TBTU-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül,

majd az oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 300 ml

DCM-ben oldottam és 3x70 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-

on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens:

EtOAc: hexán 1:4 - 1:1). Fehér kristályos terméket kaptam.

Rf (1): 0,29; (2): 0,16; (9): 0.82, op.: 148-149 oC

MS m/z számolt: 644,46, mért: 645,1 [M+H]+

72

1H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,33 (t, 2H), 3,52 (t, 2H), 3,73 (s, 3H), 4,02 (s 2H), 4,21 (m, 2H), 4,62 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,50 (s, 1H), 6,80 (d, 2H), 7,41 (d, 1H) 7,53 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,3; 28,7; 38,9; 45,8; 49,2; 48,5; 55,4; 62,0; 68,3; 80,4; 114,0; 128,7; 131,0; 147,7; 151,5; 156,2; 159,4; 160,3; 167,6; 169,8

5.8. Sonogashira-kapcsolások

5.8.1. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-feniletinil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter szintézise

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

ON

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

(PPh3)2PdCl2

CuI

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;055 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitál

ó Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 250 2 TEA C6H15N 101,19 2,000 0,776 79 0,10

9 0,72

3 Fenilacetilén C8H6 102,13 1,200 0,466 47,5 0,051

0,94

4 Pd(PPh3)2Cl2 C36H30Cl2P2Pd

701,90 0,050 0,019 13,61

5 Réz(I)-jodid CuI 190,45 0,050 0,019 3,69 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 18a C33H38N4O8 205 0,331 85 618,68 1,000 0,388 240

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a fenilacetilént, a

Pd(II) katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 1 órán át. Az

elegyet bepároltam, a maradékot 50 DCM-ben oldottam. 4x20 ml 5 %-os EDTA oldattal és

73

2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem,

bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:3 - 1:1).

Sárgásfehér kristályos anyagként állt elő a termék.

Rf (1): 0,55; (2): 0,23; op.: 100-105 oC

MS m/z számolt: 618,27, mért: 619,3 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,44 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,49 (t, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,04 (s, 2H) 4,20 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,59 (s, 1H), 6,80 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,40-7,50 (m, 5H), 7,43 (m, 2H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,2; 28,6; 38,8; 44,8; 49,2 ; 49,4; 49,5; 62,0; 80,3; 80,8; 93,6; 100,2; 113,9; 122,9; 128,6; 128,7; 131,0; 131,8; 145,5; 150,9; 156,1; 159,3; 161,6; 167,1; 169,4

5.8.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(hex-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter előállítása

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

ON

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

(PPh3)2PdCl2

CuI

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;055 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 250 2 TEA C6H15N 101,19 2,000 0,776 79 0,109 0,72 3 1-hexin C6H10 82,14 1,200 0,466 38,2 0,052 0,73 4 Pd(PPh3)2Cl2 C36H30Cl2P2Pd 701,90 0,050 0,019 13,61 5 Réz(I)-jodid CuI 190,45 0,050 0,019 3,69 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 18b C31H42N4O8 167 0,279 72 598,69 1,000 0,388 232

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam az 1-hexint, a

Pd(II) katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán át. Az

74

elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam. 4x20 ml 5 %-os EDTA

oldattal és 2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam,

szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:3 -

1:1). A csúcsfrakciók bepárlása után sárgásfehér kristályos anyag maradt vissza.

Rf (1): 0,25; (2): 0,14; (9): 0.78, op.: 152-158 oC

MS m/z számolt: 598,69, mért: 599,5 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 0,90 (t, 2H), 1,30 (t, 3H), 1,25 (m, 2H), 1,46 (s, 9 H), 1,60 (m, 2H), 2,40 (t, 2H), 3,24 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,03 (s, 2H) 4,20 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,86 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 6,80 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,42 (m, 2H), 13C NMR (CDCl3) d = 13,8; 14,3; 19,4; 22,2; 28,5; 30,8; 38,8; 44,7; 49,1; 49,3; 49,5; 55,4; 62,0; 71,6; 80,3; 95,0; 100,7; 113,9; 128,9; 131,0; 144,9; 150,9; 156,1; 159,3; 162,1; 167,1; 169,4

5.8.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(prop-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter szintézise

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

ON

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

(PPh3)2PdCl2

CuI

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás

0,055 M

Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 250 2 Propin C3H4 40,06 10,000 3,88 155 3 TEA C6H15N 101,19 2,000 0,776 79 0,109 0,72 4 Pd(PPh3)2Cl2 C36H30Cl2P2Pd 701,90 0,050 0,019 13,61 5 Réz(I)-jodid CuI 190,45 0,050 0,019 3,69 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 18c C28H36N4O8 177 0,318 82 556,61 1,000 0,388 216

75

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a Pd(II)

katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten propint vezettem az elegybe és

kevertettem 3 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ben oldottam. 4x20

ml 5 %-os EDTA oldattal és 2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-

on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens:

EtOAc: hexán 1:3 - 1:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (1): 0,22; (2): 0,14; (9): 0.75, op.: 175-179 oC

MS m/z számolt: 555,61; mért: 556,5 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (m, 2H), 1,44 (s, 9 H), 1,80 (s, 3H), 3,42 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,13 (m, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,86 (s, 1H), 5,12 (s, 2H), 6,85 (m, 2H), 7,25 (s, 2H), 7.30 (s, 1H), 8,08 (bs, 1H)

5.9. Suzuki-kapcsolások

5.9.1. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter előállítása

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

O

N

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

Pd(PPh3)4

K2CO3

S BOH

OH

S

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 mmol 250 2 2-tienil-boronsav C4H5BO2S 127,96 1,100 0,427 mmol 54,6 3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 4 Kálium-karbonát K2CO3 138,21 2,200 0,853 mmol 118 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 19a C29H36N4O8S 198 0,330 85 600,68 1,000 0,388 233

76

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a 2-tienil-

boronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át.

Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam. és 3x30 ml desztillált

vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és

oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:3 - 1:1). Fehér kristályos

anyag keletkezett.

Rf (1): 0,50; (2): 0,25; (9): 0.85, op.: 140-142 oC

MS m/z számolt: 600,68, mért: 623,4 [M+Na]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,24 (t, 3H), 1,43 (s, 9 H), 3,35 (t, 2H), 3,53 (t, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,02 (d, 2H), 4,12 (m, 2H), 4,61 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,82 (m, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,59 (m, 1H), 8,88 (m, 2H) 9,27 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 14,3; 28,7; 38,9; 44,8; 45,9; 49,5; 55,4; 62,0; 68,3; 80,4; 114,0; 124,4; 126,9; 128,7; 130,9; 131,0; 138,7; 147,6; 151,5; 156,2; 159,4; 160,3; 167,1; 167,6; 169,8

5.9.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(bifenil-4-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-

aminoetil)-glicin-etilészter szintézise

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

O

N

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

Pd(PPh3)4

K2CO3

BOH

OH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 mmol 250 2 Bifenil-boronsav C12H11BO2 198,03 1,300 0,504 mmol 100 3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 4 Kálium-karbonát K2CO3 138,21 2,200 0,853 mmol 118 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

77

Termék Összegképlet Preparált tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 19b C37H42N4O8 117 0,175 45 670,75 1,000 0,388 260

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a bifenil-

boronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át.

Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és 3x30 ml desztillált vízzel

mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és

oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1). A reakció

eredményeként fehér kristályos anyag keletkezett.

Rf (1): 0,45(2): 0,21 (9): 0,78 op.: 155-158 oC

MS m/z számolt: 670.75, mért: 693,4 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,40 (s, 9 H), 3,38 (t, 2H), 3,51 (t, 2H), 3,78 (s, 3H), 4,09 (dd, 2H), 4,18 (m, 2H), 4,57 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 5,18 (s, 2H) 6,84 (m, 2H), 7.25 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,5 (m, 4H), 7.59 (m, 2H), 8,88 (m, 2H) 9,27 (s, 1H)

5.9.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]-acetil-N-

(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter előállítása

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

O

N

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

Pd(PPh3)4

K2CO3

S BOH

OH

S

Reakció körülmények: Reakció molaritás

0,055 M

Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 mmol 250 2 benzo[b]tiofén-2-il -

boronsav C8H7BO2S 178,02 1,300 0,504 mmol 90

3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 4 Kálium-karbonát K2CO3 138,21 2,200 0,853 mmol 118 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek:

78

Termék Összegképlet Preparált tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 19c C33H38N4O8S 159 0,244 63 650,74 1,000 0,388 252

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a boronsavat, a

Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át. Az elegyet

bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és 3x30 ml desztillált vízzel mostam.

A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával

tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (1): 0,48; (2): 0,23 (9): 0,81 op.: 181-183 oC

MS m/z számolt: 650,74, mért: 651,6 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,41 (s, 9 H), 3,42 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,81 (s, 3H), 4,12 (dd, 2H), 4,38 (m, 2H), 4,77 (s, 2H), 5,18 (s, 2H) 6,82 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7,50 (m, 2H), 7,61 (m, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.96 (m,1H), 8.03 (bs, 1H), 9,28 (s, 1H)

5.9.4. N-[3-(4-metoxibenzil)- (5-(4-dimetilamino)fenil)-uracil-1-il]-acetil-

N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise

N

N

O

O

I

N

OO

ONH

O

O

ON

N

O

O

N

OO

ONH

O

O

O

Pd(PPh3)4

K2CO3

BOH

OHN

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (mg)

1 17 C25H33IN4O8 644,46 1,000 0,388 mmol 250 2 Dimetilaminofenil-

boronsav C8H12BNO2 165,00 1,300 0,504 mmol 83

3 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 4 Kálium-karbonát K2CO3 138,21 2,200 0,853 mmol 118 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 7 Termékek:

79

Termék Összegképlet Preparált tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (mg)

1 19d C33H43N5O8 92 0,144 37 637,72 1,000 0,388 247

A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a 4-

dimetilaminofenil-boronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on

kevertettem 5 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és

3x30 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem,

bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1).

Termékként fehér kristályos anyagot preparáltam.

Rf (1): 0,54; (2): 0,27, (9): 0,85 op.: 156-158 oC

MS m/z számolt: 637,72, mért: 638,6[M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,28 (t, 3H), 1,43 (s, 9H), 2,94 (s, 6H), 3,34 (d, 2H), 3,55 (d, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,05 (s, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,62 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 6,70 (d, 2H), 6,81 (d, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,37 (d, 2H), 7,46 (m, 2H)

5.10. In situ szilezés Suzuki kapcsolás során

5.10.1. [5-(2-tienil)-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása

HN

N

O

O

I

O

O

HN

N

O

O

O

O

BOH

OH

S

SO

N

Si

SiNa2CO3

Pd(PPh3)4

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,100 M

Hőmérséklet 95 °C

Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 2-tienil-boronsav

C4H5BO2S 127,96 0,750 1,500 0,192

2 5 C10H13IN2O4 352,13 1,000 2,00 0,704 3 BSA C8H21NOSi2 203,43 2,000 4,00 0,814

80

Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól (mmol)

Bemért tömeg (g)

4 Nátrium-karbonát

CNa2O3 105,99 1,000 2,000 0,212

5 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,025 0,05 0,058 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 20

Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C14H16N2O4S 0,130 0,422 42,2 308,35 0,500 1,000 0,308

Az 5-jód-uracil-1-il)ecetsav-terc.butil-észtert absz. dioxánban oldottam és ehhez N,O-

bisz-trimetilszilil-acetamidot (BSA) adtam. Az elegyet 2 órán át kevertettem

szobahőmérsékleten majd az így kapott szilil vegyület oldatát két egyenlő részre osztottam.

Az egyik feléhez argon alatt Na2CO3-ot, 2-tienil-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam.

Az elegyet 95 oC-on 15 órán át kevertettem, majd oldatlan részt kiszűrtem és a szűrletet

bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal

majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam

szűrtem és bepároltam. Az így kapott szilárd maradékot oszloponkromatográfiával, hexán-

EtOAc 6:1→1:1 lineáris gradienssel eluálva tisztítottam. A csúcs frakciók egyesítése és

bepárlása után fehér szilárd anyagot izoláltam

Rf (2): 0,32 ESI MS m/z számolt: 308,3 mért:309,1 [M+H]+ 1H NMR (DMSO-d6) δ = 1,40 (s, 9H); 4,45 (s, 2H), 7,04 (dd, 1H); 7,37 (dd, 1H); 7,43 (dd, 1H); 8,27 (s, 1H); 11,7 (bs, 1H) 13C NMR (DMSO-d6) d = 28,1; 49,6; 82,5; 108,1; 123,2; 126,1; 127,0; 134,1; 141,9; 151,1; 162,2; 167,4

81

5.10.2. [5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]ecetsav t-butil észter

HN

N

O

O

I

O

O

HN

N

O

O

O

O

BOH

OH

S

SO

N

Si

SiNa2CO3

Pd(PPh3)4

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,100 M Hőmérséklet 95 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 2-benzo[b]tiofén- boronsav

C8H7BO2S 178,02 0,750 1,500 0,267

2 5 C10H13IN2O4 352,13 1,000 2,00 0,704 3 BSA C8H21NOSi2 203,43 2,000 4,00 0,814 4 Nátrium-

karbonát CNa2O3 105,99 1,000 2,000 0,212

5 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,025 0,05 0,058 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 20 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C14H16N2O4S 0,183 0,511 51,1 358,41 0,500 1,000 0,358

Az előzőekben leírt szililvegyület oldatának másik feléhez argon atm.-ban Na2CO3-ot, 2-

benzo[b]tiofén-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam Az elegyet 15 órán át kevertettem

95 oC-on, majd oldatlan részt kiszűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml

CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl

oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam szűrtem és bepároltam. Az így

kapott szilárd maradékot oszloponkromatográfiával, hexán- EtOAc 6:1→1:1 lineáris

gradienssel eluálva tisztítottam. A csúcs frakciók egyesítése és bepárlása után enyhén

drapp színű szilárd anyagot izoláltam.

Rf (2): 0,37

82

ESI MS m/z számolt: 358,3 mért: 359,1 [M+H]+ 1H NMR (DMSO-d6) δ = 1,40 (s,9H); 4,51 (s,2H), 7,27 (t,1H); 7,32 (t, 1H); 7,76 (d, 1H); 7,77 (s,1H); 7,88 (d, 1H); 8,41 (m, 1H); 11,8 (bs,1H) 13C NMR (DMSO-d6) d = 28,1; 50,0; 82,5; 107,7; 119,9; 122,4; 123,5; 124,6; 124,9; 135,2; 139,1; 139,5; 143,7; 150,3; 162,2; 167,4

5.10.3. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin-

etilészter előállítása

HN

N

O

O

I

N

OO

ONH

Boc

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

S

O

N

Si

Si

SBOH

OH

Na2CO3

Pd(PPh3)4

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M

Hőmérséklet 95 °C

Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (mg)

1 7 C17H25IN4O7 524,31 1,000 1,000 0,524 2 BSA C8H21NOSi2 203,43 2,000 2,000 0,407 3 2-tienil-

boronsav C4H5BO2S 127,96 1,000 1,000 0,128

4 Nátrium-karbonát

CNa2O3 105,99 1,500 1,500 0,159

5 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,050 0,050 0,058 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 20

Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (mg)

1 C21H28N4O7S 0,055 0,114 22,89 480,53 0,500 0,500 0,240

Az N-(5-jód-uracil-1-il)acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin etilésztert absz. dioxánban

oldottam és ehhez BSA-t adtam és az elegyet 2 órán át kevertettem szobahőmérsékleten.

Az így kapott szilil vegyület oldatát 2 egyenlő részre osztottam. Az egyik feléhez argon

atm.-ban Na2CO3-ot, 2-tienil-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam. Az elegyet 95 oC-on

83

2,5 órán át kevertettem, majd az oldatlan részt nuccson szűrtem és a szűrletet bepároltam.

A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd

ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam, szűrtem

és bepároltam. A sárga szilárd maradékot szilikagél oszlopon CHCl3 → CHCl3-MeOH

(5%) lineáris gradienssel eluálva kromatografáltam. A terméket a csúcsfrakciók egyesítése

és bepárlása után izoláltam fehér szilárd anyag formában.

Rf (12): 0,46 ESI MS m/z számolt: 480,49; mért: 481,3 [M+H]+ 1H NMR (DMSO-d6) δ = 1,14 és 1,22 (2t, 3H); 1,35 (s, 9H); 3,16 (t, 2H); 3,40 (m, 2H), 4,02 és 4,29 (2s, 2H); 4,05 és 4,16 (2q, 2H); 4,77 és 4,60 (2s, 2H); 7,03 (dd, 1H); 7,36 (dd, 1H); 7,42 (dd, 1H); 8,10 és 8,06 (2s, 1H); 11,7 (bs, 1H) 13C NMR (DMSO-d6 d = 14,4; 28,6; 38,8; 47,4; 48,4; 48,6; 61,0; 78,5; 107,9; 123,0; 126,0; 126,9; 134,2; 142,3; 150,4; 156,2; 162,2; 167,6; 169,4

5.10.4. N-[5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-

glicin etilészter

HN

N

O

O

I

N

OO

ONH

Boc

HN

N

O

O

N

OO

ONH

Boc

S

O

N

Si

SiS B

OH

OHNa2CO3

Pd(PPh3)4

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 95 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (mg)

1 7 C17H25IN4O7 524,31 1,000 1,000 0,524 2 BSA C8H21NOSi2 203,43 2,000 2,000 0,407 3 2-

benzo[b]tiofén- boronsav

C8H7BO2S 178,02 1,000 1,000 0,178

4 Nátrium-karbonát

CNa2O3 105,99 1,500 1,500 0,159

5 Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd 1155,56 0,050 0,050 0,058 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 20

84

Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (mg)

1 C21H28N4O7S 0,107 0,202 40,3 530,59 0,500 0,500 0,265

Az előzőekben leírt szililvegyület oldatának másik feléhez argon atm.-ban 1,5 mmól = 160

mg Na2CO3-ot, 1,0 mmól = 178 mg tianaftén-2-boronsavat végül 0,05 mmól = 58 mg

Pd(PPh3)4-t adtam. Az elegyet 95 oC-on 2,5 órán át kevertettem, majd az oldatlan részt

nuccson szűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15

ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves

fázist Na2SO4-tal szárítottam, szűrtem és bepároltam. A sárga szilárd maradékot szilikagél

oszlopon CHCl3 → CHCl3-MeOH (5%) lineáris gradienssel eluálva kromatografáltam. A

terméket a csúcsfrakciók egyesítése és bepárlása után fehér szilárd formában izoláltam.

Rf (12): 0,49 ESI MS m/z számolt: 530,55 mért: 553,2 [M+Na]+ 1H NMR (DMSO-d6) δ = 1,14 és 1,22 (2t, 3H); 1,33 (s, 9H); 3,19 (t, 2H); 3,40 (m, 2H); 4,03 és 4,31 (2s, 2H); 4,04 és 4,16 (2q, 2H); 4,83 és 4,65 (2s, 2H); 7,27 (t, 1H); 7,32 (t, 1H); 7,76 (d, 1H); 7,77 (s, 1H), 7,88 (d, 1H); 8,25 és 8,20 (2s, 1H); 11,8 (bs, 1H) 13C NMR (DMSO-d6) d = 14,4; 28,6; 38,0; 47,6; 48,4; 48,7; 61,0; 78,5; 107,5; 119,0; 122,4; 123,5; 124,5; 124,9; 135,3; 139,0; 139,5 144,0; 150,3; 156,3; 162,2; 167,8; 169,4

5.11. Timin PNS monomer szintézise

5.11.1. timin-1-il-ecetsav

HN

NH

O

O BrOH

O

KOHHN

N

O

O

O

OH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 1,586 M Hőmérséklet 40 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 Timin C5H6N2O2 126,11 1,000 39,6 5,00 2 KOH KOH 56,11 3,84 152 8,55 3 BrCH2COOH C2H3BrO2 138,95 1,503 59,6 8,28 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml)

85

Név Arány Térfogat (ml) 1 víz 25 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C7H8N2O4 3,36 18,25 46,0 184,15 1,000 39,6 7,30 A kálium-hidroxidot vízben oldottam majd hozzáadtam a timint. Az elegyet 40 oC-ra

melegítettem és hozzáadtam a brómecetsav 15 ml vízzel készített oldatát. 6 órán keresztül

kevertettem majd 0 oC-ra hűtöttem és pH 2-re savanyítottam 1 N HCl oldattal. A fehér

csapadékot kiszűrtem, majd 20 ml metil-alkoholban szuszpendáltam és ismét kiszűrtem.

Fehér kristályos anyagot izoláltam.

Rf (5): 0,43; op.: 261-265 oC

ESI MS m/z számolt: 184,15 mért: 185,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 2,43 (s, 3H), 4,40 (s, 2H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)

5.11.2. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

szintézise

HN

N

O

O

O

OH

HN

NH

O

O

O

O

N

NN

O

N

N

BF4

HN

N

O

OO

NNH

O

O

O

O

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,182 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 T-CH2-COOH

C7H8N2O4 184,15 1,000 18,18 3,35

2 Boc-gerinc C11H22N2O4 246,30 1,100 20,00 4,93 3 TEA C6H15N 101,19 3,000 54,5 5,52 7,67 0,72 4 TBTU C11H16BF4N5O 321,08 1,100 20,00 6,42 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 100

86

Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C18H28N4O7 6,85 16,61 91 412,44 1,000 18,18 7,50

A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, hozzáadtam a timin-1-il-ecetsavat , a TBTU-t és a

TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül, majd az oldószert bepárlással

eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 250 ml DCM-ban oldottam és 3x60

ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem,

bepároltam és a maradékot oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: CHCl3 : MeOH

19:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (3): 0,43; op.: 112-115 oC

ESI MS m/z számolt: 184,15 mért: 185,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,44 (s, 9 H), 1,82 (s, 3H ), 3,30 (d, 2H), 3,56 (s, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,20 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 5,78 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)

5.11.3. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin (Timin PNS

monomer) előállítása

HN

N

O

O

O

NNH

O

O

O

O

HN

N

O

O

O

NNH

OH

O

O

O

NaOH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,158 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (M)

1 C18H28N4O7 412,44 1,000 15,76 6,5 2 NaOH NaOH 40,00 2,54 40,0 40 1 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 100 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C16H24N4O7 5,31 13,81 88 384,38 1,000 15,76 6,06

87

A N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxán és 1 M NaOH oldat

elegyében oldottam. 2 órán keresztül szoba hőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5 –re

savanyítottam 1 M NaHSO4 – oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 300 ml EtOAc-ot és

100 ml desztillált vizet adtam. Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5 – re állítottam

és 4x50 ml EtOAc-al mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem,

bepároltam és szárítottam. Fehér kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (5): 0,57, (11): 0,62; op.: 112-115 oC

MS m/z számolt: 384,16, mért: 385,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9 H), 1,82 (s, 3H ), 3,30 (d, 2H), 3,56 (s, 2H), 4,20 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 5,78 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)

5.12. Citozin PNS monomer szintézise

5.12.1. Uracil-1-il-ecetsav terc-butil észter előállítása

HN

NH

O

O

HN

N

O

O

O

OBr

O

O K2CO3

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,500 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 Uracil C4H4N2O2 112,09 1,000 100 11,20 2 Brómecetsav-

tercbutilészter C6H11BrO2 195,05 1,100 110 21,44 16,24 1,32

3 Kálium-karbonát K2CO3 138,21 0,600 60,0 8,29 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 200 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C10H14N2O4 18,01 80 80 226,23 1,000 100 22,61

Az uracilt DMF-ben oldottam, hozzáadtam a kálium-karbonátot és 1 órán át kevertettem. 1

óra alatt hozzácsepegtettem a brómecetsav-tercbutilésztert és 5 órát utóreagáltattam

88

szobahőmérsékleten. A KBr-ot kiszűrtem, az anyalúgot bepároltam. A maradékot 300 ml

kloroformban oldottam és 3x50 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on

szárítottam, szűrtem, bepároltam. Sárga színű kristályos anyaghoz jutottam, melyet 50 ml

dietiléterben szuszpendáltam, majd EtOAc-hexán elegyből átkristályosítottam. Fehér,

pelyhes kristályos anyag keletkezett.

Rf (1): 0,26; op.: 176-178 oC

MS m/z számolt: 226,23, mért: 227,0 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9H), 4,37 (s, 2H), 5,72 (d, 1H), 7,09 (s, 1H), 9,57 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 28,2, 49,6, 83,8, 102,7, 144,8, 151,1, 163,9, 166,6

5.12.2. (2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil

észter

HN

N

O

O

O

O

N

N

N

O

O

O

NN

NH

NN

P OClCl

Cl

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,181 M Hőmérséklet 0 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 C10H14N2O4 226,23 1,000 81 18,43 2 POCl3 Cl3OP 153,33 3,500 285 43,7 26,6 1,65 3 C2H3N3 69,07 10,500 855 59,1 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Piridin 450

Termékek:

Termék Összegképlet Preparált tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C12H15N5O3 15,18 54,7 67,2 277,28 1,000 81 22,59

Az 1,2,4-triazolt piridinben oldottam és jeges vízes hűtés és keverés mellett

hozzácsepegtettem a foszfor-oxi-trikloridot. A kivált piridinium-hidrokloridot kiszűrtem.

Jeges-vizes hűtés közben becsepegtettem az uracil-1-il-ecetsav-tercbutilészter piridines

89

oldatát. 6 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem. 120 ml (856,5 mmol) trietil-

amint adtam hozzá, leszűrtem és az elegyet bepároltam. A maradékot 500 ml

diklórmetánban vettem fel és 3x150 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. Na2SO4-on

szárítottam, szűrtem és bepároltam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc :

MeOH 19:1).

Rf (1): 0,35; MS m/z számolt: 277,28, mért: 278,0 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9 H), 4,60 (s, 2H), 7,04 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 9,14 (s, 1H) 13C NMR (CDCl3) d = 28,2, 52,2, 84,2, 95,1, 143,5, 151,4, 154,3, 155,2, 160,0, 166,0

5.12.3. Citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észter előállítása

N

N

N

O

O

O

N

N

N

N

NH2

O

O

O

NH3

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,213 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

% Wt (%)

1 C12H15N5O3 277,28 1,000 53,2 14,76 2 H3N 17,03 68,9 3670 250 250 1 25 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 250 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C10H15N3O3 11,42 50,7 95 225,24 1,000 53,2 11,99

A (2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil észtert oldottam dioxán

és 25%-os ammónia-oldat elegyében. Egy éjszakán át kevertettem. Az elegyet bepároltam,

a maradékot dietiléterben szuszpendáltam.

Rf (3): 0,35; MS m/z számolt: 225,24, mért: 226,1 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,40 (s, 9 H), 4,48 (s, 2H), 6,65 (s, 2H), 7,24 (d, 1H), 7,65 (s, 1H)

90

5.12.4. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter szintézise

N

N

NH2

O

O

O

N

N

NH

O

O

O

O

O

N N

OO

Cl

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,420 M Hőmérséklet -15 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 C10H15N3O3 225,24 1,000 42,0 9,46 2 Z-Cl C8H7ClO2 170,59 2,000 84 14,33 11,99 1,20 3 DMAP C7H10N2 122,17 2,000 84 10,26 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DCM 100 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C18H21N3O5 13,95 38,8 92 359,38 1,000 42,0 15,09

A Z-Cl-ot -15 oC-os DCM-ben oldottam és hozzáadtam a DMAP-t. 15 percig -15 oC-on

kevertettem. Hozzáadtam a citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észtert. 15 percig -15 oC-on majd

egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertettem. 30 ml MeOH-t adtam hozzá, és 20 percig

kevertettem. Bepároltam majd a maradékot 400 ml kloroformban felvettem és 3x150 ml

telített NaHCO3 oldattal mostam. Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam, végül

oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc : MeOH 19:1). Sárgásfehér kristályos

termékhez jutottam.

Rf (1): 0,30; MS m/z számolt: 359,38, mért: 360,0 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,47 (s, 9 H), 4,51 (s, 2H), 5,21 (s, 2H), 7,24 (d, 1H), 7,33 (m, 5H), 7,53 (d, 2H), 7,64 (s, 1H)

5.12.5. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav előállítása

91

N

N

NH

O

O

O

O

O

N

N

NH

O

OH

O

O

O

NaOH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,219 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (M)

1 C18H21N3O5 359,38 1,000 17,53 6,3 2 Nátrium-hidroxid NaOH 40,00 4,56 80 80 1 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxane 80 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C14H13N3O5 4,72 15,56 89 303,27 1,000 17,53 5,32

A (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észtert dioxán és NaOH oldat elegyében oldottam. 2

órán át szobahőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5-re savanyítottam 1 M NaHSO4

oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 100 ml EtOAc-ot és 80 ml desztillált vizet adtam.

Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5- re állítottam és 4x40 ml EtOAc-tal mostam.

Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. A

várt terméket fehér kristályos anyagként preparáltam.

Rf (5): 0,57; (11): 0,64; MS m/z számolt: 303,09, mért: 304,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 4,53 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 7,03 (d, 1H), 7,35 (m, 5H), 7,85 (d, 1H)

92

5.12.6. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter

szintézise

N

N

NH

O

OH

O

O

ON

N

NH

OO

O

OHN

NH

O

O

O

O

NNH

O

O

O

O

N

NN

O

N

N

BF4

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás

0,187 M

Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 C14H13N3O5 303,27 1,000 14,94 4,53 2 Boc-gerinc C11H22N2O4 246,30 1,100 16,44 4,05 3 TEA C6H15N 101,19 3,000 44,8 4,54 6,30 0,72 4 TBTU C11H16BF4N5O 321,08 1,100 16,44 5,28 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DMF 80 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C25H33N5O8 6,60 12,42 83 531,56 1,000 14,94 7,94

A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam a (4-Z-citozin-1-il)-ecetsavat, a

TBTU-t és a trietilamint. Szobahőmérsékleten kevertettem 1 órán keresztül, majd az

oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 200 ml DCM-

ban oldottam és 3x 60 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on

szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Halványsárga kristályos anyaghoz

jutottam.

Rf (1): 0,45; MS m/z számolt: 531,23, mért: 532,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,26 (t, 3H), 1,42 (s, 9 H), 3,18 (d, 2H), 3,60 (d, 2H), 4,06 (s, 2H), 4,20 (d, 2H), 4,60 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 5,75 (s, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,25 (m, 5H), 7,69 (d, 1H), 9,65 (s, 1H)

93

5.12.7. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin előállítása

N

N

NH

O

O

O

O

NNH

O

O

O

O

N

N

NH

O

O

O

O

NNH

OH

O

O

O

NaOH

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,153 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Molaritás (M)

1 C25H33N5O8 531,56 1,000 12,23 6,50 2 Nátrium-hidroxid NaOH 40,00 3,27 40,0 40 1 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Dioxán 80 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

1 C23H29N5O8 5,38 10,69 87 503,51 1,000 12,23 6,16

Az N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxán és NaOH oldat

elegyében oldottam. 1 órán át szobahőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5-re

savanyítottam 1 M NaHSO4 oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 100 ml EtOAc-ot és 80

ml desztillált vizet adtam. Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5- re állítottam és

4x40 ml EtOAc-al mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem,

bepároltam és szárítottam. Halványsárga kristályos anyaghoz jutottam.

Rf (5): 0,72; (11): 0,79 MS m/z számolt: 503,20, mért: 504,0 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3) δ = 1,38 (s, 9 H), 3,04 (d, 2H), 3,45 (d, 2H), 3,98 (s, 2H), 4,80 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 6,65 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,38 (m, 5H), 7,81 (s, 1H)

94

5.13. Oligomer szintézisek

5.13.1. A PNS oligomerek szintézise

A módosított PNS monomereket tartalmazó 11-mer oligomereket, és a módosítást nem

tartalmazó refencia szálat manuálisan MBHA gyantán állítottam elő. A gyanta duzzasztása

és előkészítése után a Boc-D-Lys(ClZ)-OH-t DIC és HOBt jelenlétében kapcsoltam a

hordozóhoz, majd a szabad amino-csoportokat ecetsavanhidriddel keppeltem. A Boc-

csoport hasítása után pikrinsavas teszttel meghatároztam a kapacítást.

A peptidnukleinsav egységek beépítése során az alábbi kapcsolási és hasítási

körülményeket használtam:

Boc-védett PNS monomer: HBTU: DIEA = 2,00: 1,90: 5,00 ekv. Kapcsolási idő: 60 perc.

Hasítás: 40 % TFA / DCM. Hasítási idő: 20 perc. Az egyes kapcsolások eredményességét

Kaiser teszttel ellenőriztem, pozitív eredmény esetén a kapcsolást megismételtem. A

szintézis végén először a védőcsoportokat távolítottam el. TFA: dimetilszulfid: m-krezol =

1: 3: 1 és TFA: TFMSA = 9: 1 elegyek 1: 1 arányú alkalmazásával. A hasítás ideje 1 óra

volt, melynek végén a reakcióelegyet eltávolítottam és TFA-val mostam a gyantát. Az

oligomert TFMSA: TFA: m-krezol = 2: 8: 1 elegyével hasítottam le a hordozóról 1,5 óra

alatt. A reakcióidő végén TFA-val mostam a gyantát és az összegyűjtött oldatból

dietiléterrel csaptam ki a nyersterméket, melyet centrifugálással izoláltam. RP-HPLC-vel

tisztítottam, és liofilizáltam.

Szekvencia RT M

(számolt)

M

(mért)

H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 5,70 3012,24 3014

H–t c c c tPr tPr tPr c t t t-D-Lys-NH2 6,49 3084,24 3086

H–t c c c tPh tPh tPh c t t t-D-Lys-NH2 8,12 3198,29 3200

H–t c c c tPhE tPhE tPhE c t t t-D-Lys-NH2 7,26 3270,29 3272

H–t c c c tTie tTie tTie c t t t-D-Lys-NH2, 7,39 3216,16 3218

5.13.2. A komplementer ODN szintézise

A target d(5’-AAA GAA AGG GA-3’) oligodezoxinukleotidot MilliGen/Biosearch 8700

DNS szintetizátor segítségével állítottam elő. A szintézishez szükséges N6-benzoil-5’-O-

dimetoxitritil-2’-dezoxiadenozin-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil)-foszforamidit és az

N2-izobutiril-5’-O-dimetoxitritil-2’-dezoxiguanozin-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil)-

95

foszfor- amidit valamint a szilárd hordozó dA-SynBaseTM CPG-t (kapacitás: 32 µmól/g) a

Link Technologies Ltd-től (Bellshill, Skócia) származott. A szintézisméret 4,0 µmól volt.

Izolált hozam: 6,0 mg = 1,74 µmól (43,5 %); RP-HPLC tisztaság: 98,35%;

ESI MS negatív ion mód (m/z): Számított: C110H133N55O57P10–re 3447,19 Da, mért: [(M-

3H)/3]3- = 1148,2 M = 3447,6 Da

5.14. 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-

foszforamidit származékok szintézise

5.14.1. A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-

cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit szintézise

PO N

NN

O

OH

O

N

NH

O

O

O

O

O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,414 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 C31H32N2O7 544,60 1,000 20,71 11,28 2 C15H32N3OP 301,41 1,500 31,06 9,36 3 C7H15N5 169,13 0,750 15,53 2,63 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DCM 50 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

35a DP-(RP) C40H49N4O8P 3,02 4,05 19,58 744,81 1,000 20,71 15,43 35b LP-(SP) C40H49N4O8P 1,90 2,55 12,32 744,81 1,000 20,71 15,43

Az 5’-Dimetoxitritil-timidint .N,N,N’,N’-tetraizopropil-O-(2-cianoetil)-foszforodiamidittel

reagáltattam diizopropilammónium tetrazolid jelenlétében 94. A nyerterméket

oszlopkromatográfiával tisztítottam EtOAc-hexán-TEA 49:49:2 - EtOAc-TEA 98:2

96

gradiens alkalmazásával. A tiszta frakciókat egyesítettem, az elegyeket bepároltam, és

szilárd fehér habokhoz jutottam melyeket vákuumban szárítottam.

35a,

Rf (9): 0.59 ESI MS m/z számolt: 744,74, mért : 745,3 [M+H]+, 1H NMR (CDCl3): δ = 1,17 (dd, 2×6H,), 1,42 (d, 3H); 2,32 (ddd, 1H), 2,40 (t, 2H,), 2,49 (ddd, 1H), 3,32 (dd, 1H); 3,54 (dd, 1H), 3,55 – 3,68 (m, 4H), 4,18 (ddd, 1H), 4,66 (m, 1H), 6,40 (dd, 1H, ), 7,62 (q, 1H), 8,3 (s, 1H,); 13C NMR (CDCl3) d = 11,95; 20,42; 24,75; 24,83; 40,26; 43,51; 58,38; 63,30; 73,72; 87,13; 85,91; 111,44; 117,57; 135,83; 150,38; 163,76; 31P NMR (CDCl3): δ = 149,54;

35b,

Rf (9): 0.55 ESI MS m/z számolt: 744,74, mért: 745,2 [M+H]+ 1H NMR (CDCl3): δ = 1,16 (dd, 2×6H,); 1,45 (d, 3H); 2,32 (ddd, 1H), 2,53 (ddd, 1H); 2,61 (t, 2H); 3,31 (dd, 1H); 3,48 (dd, 1H), 3,56 (m, 2H), 3,76 + 3,82 (m, 2H), 4,14(ddd, 1H), 4,66 (m, 1H), 6,40 (dd, 1H), 7,58 (q, 1H), 8,34 (s, 1H), 13C NMR (CDCl3): d = 11,94; 20,62; 24,76; 40,28; 43,45; 58,52; 63,50; 74,16; 85,61; 87,14; 111,47; 117,71; 135,85; 150,45; 163,75 31P NMR (CDCl3): δ =149,12;

5.14.2. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-

cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidát előállítása

O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

H2O2O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

O

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok:

97

Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól (mmol)

Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

DP-(RP) és LP-(SP)

C40H49N4O8P 744,81 1,000 0,250 186

H2O2 34,01 4,00 1,000 34,0 0,10 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 Acetonitril 5 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

36a DP-(SP) C40H49N4O9P 190 0,250 100 760,81 1,000 0,250 190 36b LP-(RP) C40H49N4O9P 190 0,250 100 760,81 1,000 0,250 190

A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-

foszforamiditet acetonitrilben oldottam és hozzáadtam a H2O2-ot. A reakcióelegyeket 3

percig kevertettem majd szárazra pároltam és vákuumban szárítottam. Fehér szilárd

anyagokhoz jutottam

36a,

Rf (9): 0,29; op, 98-101 °C ESI MS m/z számolt: 760,74, mért: 783,3 [M+Na]+ 1H NMR (CDCl3): δ = 1,21 + 1,23 (2 x d, 2×6H), 1,39 (d, 3H), 2,43 (dddd, 1H), 2,58 (ddd, 1H), 2,50 + 2,60 (2 x ddd, 2×1H), 3,41 (dd, 1H), 3,43 (m, 2H), 3,53 (dd, 1H), 4,00 + 4,04 (2 x ddd, 2×1H), 4,32 (ddd, 1H), 5,05 (m, 1H), 6,45 (dd, 1H), 7,62 (q, 1H), 8,91 (bs, 1H) 13C NMR, (CDCl3): δ = 11,82; 19,81; 22,67; 39,58; 46,57; 60,61; 63,65; 77,13; 84,97; 87,36; 111,81; 116,74; 135,33; 150,57; 163,93 31P NMR (CDCl3): δ = 8,31.

36b,

Rf (9): 0.20, mp:85-89 °C; ESI MS m/z számolt: 760.74, számolt: 783.1 [M+Na]+ 1H NMR (CDCl3): δ = 1,13 + 1,22 (2 x d, 2×6H,), 1,38 (d, 3H), 2,43 (ddd, 1H), 2,67 (ddd, 1H), 2,72 (t, 2H), 3,37 (dd, 1H), 3,40 (m, 2H), 3,50 (dd, 1H), 4,09 + 4,17 (2 x ddd, 2×1H), 4,28 (ddd, 1H), 5,06 (m, 1H), 6,44 (dd, 1H), 7,58 (q, 1H), 8,82 (bs, 1H) 13C NMR (CDCl3): δ = 11,81; 20,03; 22,63; 39,62; 46,52; 60,55; 63,64; 77,50; 84,98; 87,40; 111,89; 117,01; 135,30; 150,66; 164,02 31P NMR (CDCl3): δ = 7,95;

98

5.14.3. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-

cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidotioát szintézise

O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

SO

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

S

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

1 DP-(RP) és LP-(SP)

C40H49N4O8P 744,81 1,000 0,250 186

2 S 32,07 4,00 1,000 32,1 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DCM 5 Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

37a DP-(SP) C40H49N4O9P 185 0,238 95 776,88 1,000 0,250 194 37b LP-(RP) C40H49N4O9P 183 0,235 94 776,88 1,000 0,250 194

A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-

foszforamiditet DCM-ben oldottam és kénport adtam az elegyekhez. A gyorsan

homogénné váló oldatokat 1 órán át kevertettem szobahőmérsékleten, majd bepároltam

őket. A nyerstermékeket oszlopkromatográfiával tisztítottam EtOAc-hexán 1:1 eluens

alkalmazásával. Fehér szilárd terméket izoláltam.

37a,

Rf (9): 0,54, mp: 88-91 °C; ESI MS m/z számolt: 776,81, mért: 799,3 [M+Na]+

99

1H NMR (CDCl3): δ = 1,29 (2xd, 2×6H), 1,43 (d, 3H), 2,42 (dddd, 1H), 2,57 (ddd, 1H), 2,47 + 2,57 (2xddd, 2×1H), 3,43 (dd, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,53 (dd, 1H), 3,97 + 4,02 (2xddd, 2×1H), 4,33 (ddd, 1H), 5,28 (m, 1H), 6,43 (dd, 1H), 7,62 (q, 1H), 8,37 (bs, 1H); 13C NMR, (CDCl3): δ = 11,72; 19,35; 22,63 + 22,66; 39,41; 47,42; 60,05; 63,54; 76,71; 85,02; 87,19 ; 111,56; 116,64; 135,34; 150,20; 163,41; 31P NMR (CDCl3): δ = 71,26

37b.

Rf (9): 0,51, mp: 78-81 °C; ESI MS m/z számolt: 776,81, mért: 799,0 [M+Na]+ 1H NMR (CDCl3): δ = 1,22 + 1,28 (2xd, 2×6H), 1,42 (d, 3H), 2,41 (ddd, 1H), 2,66 (ddd, 1H), 2,73 + 2,79 (t, 2H), 3,41 (dd, 1H), 3,41 (m, 2H), 3,48 (dd, 1H), 4,07 + 4,22 (2xddd, 2×1H), 4,29 (ddd, 1H), 5,33 (m, 1H), 6,42 (dd, 1H), 7,57 (q, 1H), 8,60 (bs, 1H); 13C NMR (CDCl3): d = 11,63; 19,56; 22,46 + 22,60; 39,26; 47,39; 60,74; 63,42; 77,82; 84,79; 87,15; 111,51; 116,77; 135,34; 150,28; 163,48; 31P NMR (CDCl3): δ = 71,45

5.14.4. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-

cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidoszelenoát előállítása

O

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

SeO

O

O

N

NH

O

O

O

OP

O

N

N

Se

Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt Ekv Mól

(mmol) Bemért tömeg (g)

Vol (ml)

Sűrűség (g/ml)

1 DP-(RP) és LP-(SP)

C40H49N4O8P 744,81 1,000 0,250 186

2 Se 78,96 4,00 1,000 79 0,071 1,11 Oldószerek: Név Arány Térfogat (ml) 1 DCM 5

100

Termékek: Termék Összegképlet Preparált

tömeg (g)

Preparált mol (mmol)

Termelés (%)

Mt Ekv Elm. mol (mmol)

Elm. tömeg (g)

38a DP-(SP) C40H49N4O9P 194 0,236 94 823,77 1,000 0,250 206 38b LP-(RP) C40H49N4O9P 194 0,236 94 823,77 1,000 0,250 206

A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-

foszforamiditet DCM-ben oldottam és mindkét elegyhez szelén port adtam. A

szuszpenziókat 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem. Az elegyeket

papírszűrőn engedtem át és 5-5 ml DCM-mel mostam őket. A szűrletek bepárlása után

fehér szilárd termékekhez jutottam.

38a,

Rf (A): 0,55, op: 86-89 °C; ESI MS m/z számolt: 823,70, mért: 847,1 [M+Na]+, 1H NMR (CDCl3): δ = 1,31 + 1,32 (2×d , 2×6H), 1,43 (d, 3H), 2,44 (dddd, 1H), 2,58 (ddd, 1H), 2,46 + 2,57 (2 x ddd, 2×1H), 3,47 (dd, 1H), 3,48 (dd, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,97 + 4,02 (2 x ddd, 2×1H), 4,34 (ddd, 1H), 5,36 (m, 1H), 6,43 (dd, 1H), 7,61 (q, 1H), 8,78 (bs, 1H); 13C NMR (CDCl3): δ = 11,94; 19,35; 22,95; 39,52; 48,15; 61,62; 63,75; 78,54; 85,01; 87,43; 111,81; 116,83; 135,37; 150,55; 163,84; 31P NMR (CDCl3): δ = 74,43; 38b,

Rf (A): 0,48, mp: 87-91 °C; ESI MS m/z számolt: 823,70, mért: 847,0 [M+Na]+, 1H NMR (CDCl3): δ = 1,24 + 1,28 (2 x d, 2×6H), 1,42 (d, 3H), 2,44 (ddd, 1H), 2,65 (ddd, 1H), 2,74 + 2,81 (2 x ddd, 2×1H), 3,41 (dd, 1H), 3,53 (dd, 1H), 3,84 (m, 2H), 4,07 + 4,25 (2 x ddd, 2×1H), 4,30 (ddd, 1H), 5,42 (m, 1H), 6,42 (dd, 1H), 7,59 (q, 1H), 8,84 (bs, 1H); 13C NMR (CDCl3): δ = 11,88; 19,63; 22,88; 39,42; 48,18; 61,81; 63,65; 79,33; 84,97; 87,43; 111,79; 116,99; 135,36; 150,62; 163,88; 31P NMR (CDCl3): δ = 75,00;

101

6. Irodalomjegyzék

(1) Gutierrez, A. J.; Terhorst, T. J.; Matteucci, M. D.; Froehler, B. C. Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 5540-5544.

(2) Gutierrez, A. J.; Froehler, B. C. Tetrahedron Letters 1996, 37, 3959-3962. (3) Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. Journal of the American Chemical

Society 1995, 117, 3873-3874.

(4) Nielsen, P.; Egholm, M.; Berg, R.; Buchardt, O. Science 1991, 254, 1497-1500.

(5) Egholm, M.; Buchardt, O.; Nielsen, P. E.; Berg, R. H. Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 1895-1897.

(6) Eriksson, M.; Nielsen, P. E. Quart. Rev. Biophysics 1996, 29, 369-394. (7) Egholm, M.; Buchardt, O.; Christensen, L.; Behrens, C.; Freier, S. M.;

Driver, D. A.; Berg, R. H.; Kim, S. K.; Norden, B.; Nielsen, P. E. 1993, 365, 566-568.

(8) Wittung, P.; Nielsen, P. E.; Buchardt, O.; Egholm, M.; Norde[acute]n, B. 1994, 368, 561-563.

(9) Wittung, P.; Eriksson, M.; Lyng, R.; Nielsen, P. E.; Norden, B. Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 10167-10173.

(10) Püschl, A.; Sforza, S.; Haaima, G.; Dahl, O.; Nielsen, P. E. Tetrahedron Letters 1998, 39, 4707-4710.

(11) Sforza, S.; Haaima, G.; Marchelli, R.; Nielsen, P. E. European Journal of Organic Chemistry 1999, 1999, 197-204.

(12) Nielsen, P. E.; Haaima, G.; Lohse, A.; Buchardt, O. Angewandte Chemie International Edition in English 1996, 35, 1939-1942.

(13) Sforza, S.; Corradini, R.; Ghirardi, S.; Dossena, A.; Marchelli, R. European Journal of Organic Chemistry 2000, 2000, 2905-2913.

(14) Merrifield, R. B. Journal of the American Chemical Society 1963, 85, 2149-2154.

(15) Merrifield, R. B. Journal of the American Chemical Society 1964, 86, 304-305.

(16) Merrifield, R. B. Biochemistry 1964, 3, 1385-1390. (17) Kaiser, E.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Analytical

Biochemistry 1970, 34, 595-598. (18) Bárány, G.; Merrifield, R. B. Academic Press: New York. 1979, 2, 1-248.

(19) Atherton, E.; Fox, H.; Harkiss, D.; Logan, C.; Sheppard, R.; Williams, B. J. Chem. Soc. Chem. Commun 1978, 537-539.

(20) Kofoed, T.; Hansen, H. F.; Řrum, H.; Koch, T. Journal of Peptide Science 2001, 7, 402-412.

(21) Thomson, S. A.; Josey, J. A.; Cadilla, R.; Gaul, M. D.; Hassman, C. F.; Luzzio, M. J.; Pipe, A. J.; Reed, K. L.; Ricca, D. J.; Wiethe, R. W.; Noble, S. A. Tetrahedron 1995, 51, 6179-6194.

(22) Lankhorst, P.; Haasnoot, C.; Erkelens, C.; Westernik, H.; Marel, G.; Boom, J.; Altona, C. Nucleic Acids Res 1985, 13, 927-942.

(23) Tömösközi, I.; Gács-Baitz, E.; Ötvös, L. Tetrahedron 1995, 51, 6797-6804. (24) Gács-Baitz, E.; Tömösközi, I.; Kajtár-Peredy, M. Tetrahedron Assymetry

1996, 7, 2447-2452.

102

(25) Machytka, D.; Gács-Baitz, E.; Tegyey, Z. Nucleosides & Nucleotides 1998, 17, 2311-2322.

(26) Gács-Baitz, E.; Wozniak, L.; Kajtár-Peredy, M. Chirality 2000, 12, 675-680.

(27) Machytka, D.; Sági, G.; Kajtár-Peredy, M.; Gács-Baitz, E. Nucleosides &

Nucleotides 2000, 19, 903-915. (28) Kajtár-Peredy, M.; Tömösközi, I.; Gács-Baitz, E. Nucleosides, Nucleotides

& Nucleic Acids 2001, 20, 1615-1623. (29) Gács-Baitz, E.; Kajtár-Peredy, M. Chirality 2002, 14, 814-818.

(30) Gács-Baitz, E.; Kajtár-Peredy, M.; Sági, G. Anal Bioanal Chem 2004, 379, 56-59.

(31) Gács-Baitz, E.; Sági, G.; Kajtár-Peredy, M. Nucleosides Nucleotides &

Nucleic Acids 2005, 24, 247-257. (32) Dueholm, K. L.; Egholm, M.; Buchardt, O. Organic Preparations and

Procedures International 1993, 25, 457-462. (33) Viirre, R. D.; Hudson, R. H. E. The Journal of Organic Chemistry 2003, 68,

1630-1632. (34) Meltzer, P. C.; Liang, A. Y.; Matsudaira, P. The Journal of Organic

Chemistry 1995, 60, 4305-4308. (35) Kim, I.-H.; Morisseau, C.; Watanabe, T.; Hammock, B. D. Journal of

Medicinal Chemistry 2004, 47, 2110-2122. (36) Krapcho, A. P.; Kuell, C. S. Synthetic Communications: An International

Journal for Rapid Communication of Synthetic Organic Chemistry 1990, 20, 2559 - 2564.

(37) Hudson, R. H. E.; Lia, G.; Tse, J. Tetrahedron Letters 2002, 43, 1381-1386. (38) Stille, J. K. Pure and Applied Chemistry 1985, 57, 1771-1780.

(39) Yamamoto, Y.; Seko, T.; Nemoto, H. The Journal of Organic Chemistry 1989, 54, 4734-4736.

(40) Wigerinck, P.; Pannecouque, C.; Snoeck, R.; Claes, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. Journal of Medicinal Chemistry 1991, 34, 2383-2389.

(41) Farina, V.; Hauck, S. I. Synlett 1991, 1991, 157-159. (42) Flynn, B. L.; Macolino, V.; Crisp, G. T. Nucleosides, Nucleotides and

Nucleic Acids 1991, 10, 763 - 779. (43) Crisp, G. T. Synthetic Communications: An International Journal for Rapid

Communication of Synthetic Organic Chemistry 1989, 19, 2117 - 2123. (44) Crisp, G. T.; Flynn, B. L. Tetrahedron Letters 1990, 31, 1347-1350.

(45) Crisp, G. T.; Macolino, V. Synthetic Communications: An International Journal for Rapid Communication of Synthetic Organic Chemistry 1990, 20, 413 - 422.

(46) Wigerinck, P.; Kerremans, L.; Claes, P.; Snoeck, R.; Maudgal, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. Journal of Medicinal Chemistry 1993, 36, 538-543.

(47) Beletskaya, I. P. Pure and Applied Chemistry 1997, 69, 471-476. (48) Robins, M. J.; Barr, P. J. The Journal of Organic Chemistry 1983, 48, 1854-

1862. (49) Yamaura, M.; Suzuki, T.; Hashimoto, H.; Yoshimura, J.; Okamoto, T.; Shin,

C.-g. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1985, 58, 1413-1420. (50) Danishefsky, S. J.; DeNinno, S. L.; Chen, S. H.; Boisvert, L.; Barbachyn,

M. Journal of the American Chemical Society 1989, 111, 5810-5818.

103

(51) Akiyama, T.; Nishimoto, H.; Ozaki, S. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1990, 63, 3356-3357.

(52) Aeroschot, A. V.; Jie, L.; Herdewijn, P. Tetrahedron Letters 1991, 32, 1905-1908.

(53) Myers, A. G.; Gin, D. Y.; Rogers, D. H. Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 4697-4718.

(54) Caplar, V.; Zinic, M. Tetrahedron Letters 1995, 36, 4455-4458. (55) Savya, P.; Benhida, R.; Fourreya, J.-L.; Maurisseb, R.; Sunb, J.-S.

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2000, 10, 2287-2289. (56) Sonogashira, K.; Tohda, Y.; Hagihara, N. Tetrahedron Letters 1975, 16,

4467-4470. (57) Sharma, R. A.; Kavai, I.; Hughes, R. G.; Bobek, M. Journal of Medicinal

Chemistry 1984, 27, 410-412. (58) Ma, T.; Pai, S. B.; Zhu, Y. L.; Lin, J. S.; Shanmuganathan, K.; Du, J.;

Wang, C.; Kim, H.; Newton, M. G.; Cheng, Y. C.; Chu, C. K. Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 2835-2843.

(59) Hashimoto, H.; Nelson, M. G.; Switzer, C. Journal of the American Chemical Society 1993, 115, 7128-7134.

(60) Miyaura, N.; Suzuki, A. Chemical Reviews 1995, 95, 2457-2483. (61) Casalnuovo, A. L.; Calabrese, J. C. Journal of the American Chemical

Society 1990, 112, 4324-4330. (62) Amann, N.; Pandurski, E.; Fiebig, T.; Wagenknecht, H.-A. Angewandte

Chemie International Edition 2002, 41, 2978-2980. (63) Western, E. C.; Daft, J. R.; Johnson, E. M.; Gannett, P. M.; Shaughnessy, K.

H. The Journal of Organic Chemistry 2003, 68, 6767-6774. (64) Dueholm, K. L.; Egholm, M.; Behrens, C.; Christensen, L.; Hansen, H. F.;

Vulpius, T.; Petersen, K. H.; Berg, R. H.; Nielsen, P. E.; Buchardt, O. The Journal of Organic Chemistry 1994, 59, 5767-5773.

(65) Rabinowitz, J. L.; Gurin, S. Journal of the American Chemical Society 1953, 75, 5758-5759.

(66) Reese, C. B.; Ubasawa, A. Tetrahedron Letters 1980, 21, 2265-2268. (67) Sung, W. L. Journal of the Chemical Society, Chemical

Communications 1981, 1089a. (68) Sung, W. L. Nucl. Acids Res. 1981, 9, 6139-6152. (69) Sung, W. L. The Journal of Organic Chemistry 1982, 47, 3623-3628.

(70) Lin, T. S.; Luo, M. Z.; Liu, M. C.; Clarke-Katzenburg, R. H.; Cheng, Y. C.; Prusoff, W. H.; Mancini, W. R.; Birnbaum, G. I.; Gabe, E. J.; Giziewicz, J. Journal of Medicinal Chemistry 1991, 34, 2607-2615.

(71) Hattori, K.; Kohchi, Y.; Oikawa, N.; Suda, H.; Ura, M.; Ishikawa, T.; Miwa, M.; Endoh, M.; Eda, H.; Tanimura, H.; Kawashima, A.; Horii, I.; Ishitsuka, H.; Shimma, N. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 867-872.

(72) Schwergolda, C.; Depeckera, G.; Giorgioa, C. D.; Patinoa, N.; Jossinetb, F.; Ehresmannb, B.; Terreuxc, R.; Cabrol-Bassc, D.; Condom, R. Tetrahedron 2002, 58, 5675-5687.

(73) Howarth, N. M.; Wakelin, L. P. G. The Journal of Organic Chemistry 1997, 62, 5441-5450.

(74) Wu, Y.; Xu, J.-C.; Liu, J.; Jin, Y.-X. Tetrahedron 2001, 57, 3373-3381. (75) Koch, T.; Hansen, H. F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H. G.; Otteson, K.;

Orum, H. Journal of Peptide Research 1997, 49, 80-88.

104

(76) Seela, F.; Kretschmer, U. J. Chem. Soc. Chem. Commun 1990, 1154-1159. (77) Seela, F.; Kretschmer, U. The Journal of Organic Chemistry 1991, 56,

3861-3869. (78) Kataoka, M.; Hattori, A.; Okino, S.; Hyodo, M.; Asano, M.; Kawai, R.;

Hayakawa, Y. Organic Letters 2001, 3, 815-818. (79) Wyrzykiewicz, T. K.; Ravikumar, V. T. Bioorganic & Medicinal Chemistry

Letters 1994, 4, 1519-1522. (80) Baraniak, J.; Korczynski, D.; Kaczmarek, R.; Stec, W. J. Nucleosides,

Nucleotides and Nucleic Acids 1999, 18, 2147 - 2154. (81) Scozzari, A. N.; Krotz, A. H. In WO2004113553; Isis Pharmaceuticals Inc:

2004. (82) Caruthers, M. H.; Brill, W. K.-D.; Yau, E.; Ma, M.; Nielsen, J. In

US5750666; Competitve Technologies, Inc.: 1998. (83) Holloway, G. A.; Pavot, C.; Scaringe, S. A.; Lu, Y.; Rauchfuss, T. B.

ChemBioChem 2002, 3, 1061-1065. (84) Stengele, K.-P.; Pfleiderer, W. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids

1990, 9, 423 - 427. (85) Sobkowski, M.; Stawinski, J.; Kraszewski, A. Nucleosides, Nucleotides and

Nucleic Acids 2005, 24, 1301 - 1307. (86) Sobkowski, M.; Stawinski, J.; Kraszewski, A. Nucleosides, Nucleotides and

Nucleic Acids 2006, 25, 1377 - 1389. (87) Charubala, R.; Stengele, K. P.; Pfleiderer, W. Nucleosides, Nucleotides and

Nucleic Acids 1989, 8, 1007 - 1010. (88) Ono, A.; Matsuda, A.; Zhao, J.; Santi, D. V. Nucl. Acids Res. 1995, 23,

4677-4682. (89) Gmeiner, W. H.; Sahasrabudhe, P.; Pon, R. T. The Journal of Organic

Chemistry 1994, 59, 5779-5783. (90) Letsinger, R. L.; Lunsford, W. B. Journal of the American Chemical Society

1976, 98, 3655-3661. (91) Lindh, I.; Stawinski, J. The Journal of Organic Chemistry 1989, 54, 1338-

1342. (92) Wozniak, L. A.; Wieczorek, M.; Pyzowski, J.; Majzner, W.; Stec, W. J. The

Journal of Organic Chemistry 1998, 63, 5395-5402. (93) Blommers, M. J. J.; Nanz, D.; Zerbe, O. Journal of Biomolecular NMR

1994, 4, 595-601. (94) Beaucage, S. In Protocols for Oligonucleotide Conjugates: Synthesis and

Analytical Techniques; S., A., Ed.; Humana Press Inc.: Totowa, 1993; Vol. 26, p 44.

105

Összefoglalás

Az oligodezoxinukleotidokba (ODN) C5-alkinil- vagy C5-heteroaril-analóg

egységek beépítése, növeli az ODN:DNS illetve ODN:RNS duplexek stabilitását. A

peptid-nukleinsavak (PNS) a természetes DNS cukor-foszfát gerince helyett N-(2-

aminoetil)-glicin gerincet tartalmaznak. A PNS:DNS duplexek jóval stabilabbak, mint a

megfelelő DNS hasonmások. Erre alapozva különböző 5-aril- és 5-alkinil-pirimidin

bázisokat tartalmazó PNS-analogonok szintézisét terveztem, amelyek várhatólag még

stabilabb komplexeket képeznek a természetes nukleinsavakkal.

5-jód-uracilból kiindulva több lépésben előállítottam az 5-jód-uracil és a N3-PMB-

5-jód-uracil PNS monomereket, melyek a keresztkapcsolási reakciók kiindulási vegyületei.

Stille kapcsolások során, Pd(0) katalizátor jelenlétében jó termeléssel állítottam elő új 5-

aril analogonokat. A Sonogashira kapcsolások esetében Pd(II), CuI és trietil-amin

jelenlétében N3-PMB-5-alkinil-uracil PNS monomereket szintetizáltam közel kvantitatív

termeléssel. A PMB védőcsoport alkalmazása nélkül a termelés jóval szerényebb ugyanis

jelentős mértékben gyűrűzárt melléktermékek is képződnek. Suzuki kapcsolások

alkalmazásával új N3-PMB-5-aril-uracil számazékokat sikerült előállítanom. A laktám

csoport védelme nélkül szinte egyáltalán nem tapasztaltam termékképződést. A PMB

csoport eltávolítása nem problémamentes, ezért eljárást dolgoztam ki a Suzuki

kapcsolásokra in situ szililezéssel.

A módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc/Z

peptidszintézis protokoll alkalmazásával a H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer modell

szekvenciába építettem be az aláhúzott 3 középső egység helyére, majd. vizsgáltam a DNS:

PNS duplexek termikus stabilitását.

P-királis mononukleotidok szintézise sorám a T-CED tiszta DP,RP- és LP,SP-

diasztereomerjeit oxidálva izoláltam a megfelelő P(V) vegyületeket. Az NMR és

kromatográfiás analízisek szerint a reakciók minden esetben kemo- és sztereospecifikusak

voltak és a P-konfiguráció retenciójával játszódtak le. A P-királis mono- és

dinukleotidokkal kapcsolatos korábbi NMR vizsgálatainkkal összhangban

megállapítottam, hogy a ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékek a preparált új analógok

esetében is jellemzőek a P-konfigurációra. A normál és különösen a reverz fázisú HPLC

analízisek alapján megállapítottam, hogy a foszforatomhoz kettős kötéssel kapcsolódó

heteroatomok elektronegativitása és a retenciós idők között egyértelmű összefüggés áll

fenn.

106

Summary

Incorporation of different 5-heteroaryl-uracil moieties into short

oligodeoxynucleotides results in enhanced thermal stability of the modified DNA:RNA

duplexes compared to that of the thymine-containing counterpart. Similar incorporation of

5-aryl- and 5-alkynyl-uracils into PNA-s is also expected to increase the stability of

PNA:DNA complexes.

A number of protected PNA monomers containing 5-alkynyl- and 5-aryl-uracil

bases have been synthesized using different Pd-catalyzed cross-coupling reactions.

Coupling of the base-unprotected 5-I-U PNA monomer with some aryl-tributylstannanes

(Stille couplings) afforded the 5-aryl analogues in good yields. Copper (I) and palladium

catalysed cross-couplings (Sonogashira couplings) were implemented from 5-I-U PNA

monomer only with acceptable overall yields, due to formation of ring-closured,

unrequired by-products However, starting from the N3-PMB-protected monomer, the

required 5-alkynyl derivatives were isolated by nearly quantitative yields From acceptable

to good yields were attained in the couplings of the N3-PMB-protected monomer with

more aryl-boronic acids (Suzuki couplings)., Unfortunately, the use of the base-

unprotected 5-I-U monomer ,as starting material did not give any coupled product in the 4

cases investigated.

RP- and SP- diastereomers of 5’-dimethoxytrityl-thymidine-3’-O-[O-(2-cyanoethyl)-

N,N-diisopropyl]-phosphoramidite were separated by silica gel chromatography. Oxidation

of both isomers resulted in the corresponding oxidized analogues by nearly quantitative

yields. All reactions were found to proceed with retention of P-configuration. This was

confirmed by thorough NMR analysis which, in addition, aimed to study the spectral

properties of the diastereomers with a special respect to differences in the heteroatom

effect of the O, S and Se atoms, double-bonded to the phosphorus, on the vicinal carbon-

phosphorus couplings. It was found that the changes in the ∆J (=3J (P,C4’) – 3J (P,C2’))

values were basically induced by the electronegativity of the heteroatoms, rather than

differences in the rotational preferences about the C3’-O3’ bond. The behaviour of the

compounds was also investigated by chromatography. The reverse phase HPLC profiles

unambiguous correlation was found between the electronegativity of the heteroatoms and

the chromatographic mobility of the analogues.