ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA MECÁNICA Y ELÉCTRICA UNIDAD AZCAPOTZALCO

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SISTEMA AUXILIAR PARA EL DIAGNOSTICO DEL CARCINOMA EPIDERMOIDE INVASOR EN TEJIDO

CERVIX EMPLEANDO TECNOLOGIA LÁSER.

• Ávila Salazar Carlos Alberto • Calderón Hernández Laura Lourdes • Espinoza de los Monteros Aguilar Erick

Directora del proyecto: M. en C. Aurora Aparicio Castillo

México, D.F. Diciembre de 2008

     

 

  

  

     

        

REPORTE FINAL

Clave SIP 20080425

1

Abstract  

 Laser Induced Fluorescence Spectroscopy (LIFS) is a technique that has been recently used to detect in vivo or in vitro cancer. The LIFS system has been used to analyze cervical tissue samples for histological evaluation.  Because the  fluorescence  spectra  are  position  and  inter‐probe  dependent  (albeit  they  were  equally  classified  by histological evaluation) the relationship that exists in the data is complex.  So, a back‐propagation Artificial Neural Network is used to detect the relationships contained within them. The validation of the system was done with 5 different proves and a 100% classification coincidence between  the neural network classification and a normal histological one was obtained.  The LIFS‐System works with a N2 laser of 5 μJ pulse energy (tFWHM = 3.8 ns at 337.1 nm wavelength) and spectra from 350 to 650 nm were processed and evaluated in a  PC.  Keywords.  Laser Induced Fluorescence, Cervical Cancer and Neural Network.  

Resumen 

 La  espectroscopia  de  inducción  de  fluorescencia  con  láser  (LIFS)  es  una  técnica  recientemente  usada  para detectar cáncer  in vivo o  in vitro.   En este trabajo se usa esta técnica   para analizar y diagnosticar muestras de tejido  cervical  preparadas  para  su  evaluación  histológica.    Debido  a  que  los  espectros  de  fluorescencia  son muestra  a muestra  y  punto  a  punto  diferentes  (a  pesar  de  ser  clasificados  como  iguales  por medio  de  su evaluación histológica) no resulta simple determinar  las relaciones básicas de  los datos medidos.   Por  lo cual se usa  una  red  neuronal  artificial  del  tipo  “back‐propagation”  para  detectar  estas  relaciones.  La  validación  del sistema  se  realizó  con  5  diferentes muestras  y  se  obtuvo  una  coincidencia  del  100  %  entre  la  clasificación realizada por esta y  la  realizada por el proceso histológico normal. El sistema LIFS  trabaja con pulsos de 5 μJ  (

)1.3378.3 nm a nstFWHM =  provenientes de un láser de N2 y los espectros de 350 a 650 nm fueron procesados 

y evaluados en una computadora personal.  Palabras claves: Fluorescencia inducida con luz láser, cáncer cervicouterino y redes  neuronales.       

1

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2

 

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3

 

  

Figura 2. Sistema elemental de clasificación de características de patrones espectrales.  Por otro  lado, el  sistema de Hardware encargado de  adquirir  los espectros de  fluorescencia  fue basado en el fenómeno que ocurre cuando una muestra de materia es irradiada con luz ultravioleta, produciendo la excitación de  sus  estados  electrónicos  y  la  posterior  emisión  de  luz  visible  desde  dichos  estados.  Concretamente,  la excitación lleva a la molécula a una serie de subniveles vibracionales asociados con el estado electrónico excitado. Y puesto que en el caso de excitación con  láser  la energía se absorbe en paquetes de  luz de  la misma energía, denominados cuantos. Toda molécula puede ser excitada por diferentes tipos de láser, cada uno con una longitud de onda característica. En este proyecto se utilizó un láser de N2 que emite a  una longitud de onda de 337.1nm   El fenómeno de fluorescencia fue inducido en el tejido de cérvix con la luz de un láser de N2. La fluorescencia fue analizada, tanto temporalmente como en su contenido de longitudes de onda. La figura 3 muestra el sistema de fluorescencia empleado.  

 Figura 3 Sistema básico para la medición de fluorescencia 

3. Módulos de Hardware 

 Los espectros de  fluorescencia  son obtenidos midiendo  la emisión de  luz de  la muestra de  tejido cervical bajo estudio cuando se le excita con una fuente que emite una longitud de onda específica.  Como fuente de excitación se utilizó un láser de N2 cuyo haz es alineado hacia el sistema divisor de haz por medio de dos espejos, el divisor de haz se utilizó para reflejar una parte de esa luz hacia un fotodetector de referencia que sirve para medir la potencia del láser y sincroniza la operación del osciloscopio. La luz que no se refleja llega a una  lente biconvexa que  la enfoca sobre  la muestra que se está analizando,  la fluorescencia emitida por ésta se colecta, utilizando un par de esferas de vidrio, en una fibra óptica que  le  lleva al espectrómetro para realizar su análisis  espectral.  El  fotomultiplicador  convierte  las  intensidades  ruinosas  en  forma de  voltaje para  poder  ser monitoreada en el osciloscopio. 

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 Éste último envía las formas de onda, por medio de una interfaz GPIB, a una PC que se encarga de registrarlas e ir extrayendo la información para generar el espectro de fluorescencia. El espectrómetro es controlado desde la PC por medio de un puerto serie (RS‐232).  El software fue desarrollado en LabView 6 de National Instruments. 

4. Fuente de Excitación (Láser de Nitrógeno)  

 La fuente de excitación es un láser de nitrógeno, que emite pulsos de luz con una longitud de onda de 337.1nm (UV) y tienen una duración de 4ns.El diagrama eléctrico del  láser de nitrógeno se muestra en la Figura 4.   

  

 

5. Sistema óptico 

 El sistema óptico es el encargado de adecuar la luz del láser para dividirla en el haz que servirá como referencia y el haz que será concentrado y enfocado en la muestra que se esté estudiando. También consta de lentes que se encargan de concentrar  la mayor cantidad de  luz emitida por fluorescencia de  la muestra y dirigirla a una fibra óptica.  El sistema óptico consta de los siguientes elementos (figura 5):  

• Divisor  de  haz  (vidrio  portaobjeto).‐  Permite  desviar  18.2%  de  la  luz  del  haz  láser  incidente  hacia  el fotodetector de referencia. 

• Lente biconvexo (BK7) concentran el haz de luz en una sola zona de 1.7 mm x 0.9 mm. • Fotodetector MRD500.‐ El cual esta aislado dentro de un tubo de aluminio, y cuenta con una salida hacia 

el osciloscopio. • Fibra óptica (cuarzo).‐ Para conducir la fluorescencia hacia el espectrómetro. 

 

  

Figura 5. Arreglo Óptico 

-15KV

Spark gap

Cámara de descarga

Figura 4 Diagrama eléctrico del láser de nitrógeno.

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6. Sistema espectrométrico 

 Esta  parte  la  componen  la  fibra  óptica,  el  espectrómetro,  el  tubo  Fotomultiplicador  y  el  fotodetector  de referencia. El  trabajo principal del  sistema espectrométrico es  tomar  la muestra de  fluorescencia y obtener  la intensidad de la variación en función de la longitud de onda.   Este sistema está constituido por los siguientes elementos:  • Fibra  óptica.‐  La  fibra  óptica  se  encarga  de  conducir  la  fluorescencia  inducida  por  el  láser  hacia  el 

espectrómetro, mismo que la descompondrá en sus componentes, la intensidad de cada componente será convertida por el fotomultiplicador a señal eléctrica y observada en un osciloscopio. 

• Espectrómetro.‐ Su función es la de realizar el análisis espectral de la luz fluorescente, la intensidad de cada componente  espectral  es  convertida  por  el    fotomultiplicador  a  señal  eléctrica  y  observada  en  un osciloscopio. En  las  figuras 3.8 y 3.9, el espectrómetro es controlado por  la PC por medio de  la  interfaz serial (RS‐232). 

• Fotomultiplicador.‐ Como se menciono anteriormente este dispositivo convierte la irradiancia luminosa en voltajes, los cuales son capturados por el osciloscopio para después ser enviados a la tarjeta GPIB. 

 

 Figura 6. Espectrómetro 

7. Adquisición  de radiación láser y fluorescencia 

 Las señales de  la radiación  láser y  la fluorescencia proporcionadas por  los fotodetectores son registradas en un osciloscopio digital Tektronix®2440.  El osciloscopio utilizado no tiene la capacidad de registrar estas señales en un disco, sin embargo cuenta con una interfase de comunicación GPIB con el estándar IEEE 488 que le permitirá comunicarse con una PC para transferir todas las señales que se requieran en un tiempo considerablemente corto. 

8. Red Nuronal 

 Como se mencionó anteriormente, cada material  tiene como característica su espectro de  fluorescencia.   En el caso  del  tejido  cervical  uterino  su  estado  sano  y  cada  una  de  las  diferentes  patologías  también  presentan espectros de  fluorescencias diferentes, no  sólo en  intensidad  sino en  su  forma.   Así, el  reconocimiento de  los patrones de fluorescencia es  la propuesta que aquí se maneja para hacer un sistema de diagnóstico   del estado patológico del tejido.  Dicho reconocimiento podría hacerse por medio de un sistema experto que podría ser una 

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persona, o por medio de un  sistema de  cómputo a  través de una  red neuronal artificial.   En este proyecto  se diseñó una red neuronal “backpropagation”, la cual permite en forma adecuada el reconocimiento y diagnóstico de las biopsias analizadas por medio de su fluorescencia inducida.  Una red neuronal artificial genérica puede definirse como un sistema computacional que consiste de un conjunto de  unidades  procesadoras  altamente  interconectadas,  denominados  como  neuronas,  los  cuales  procesan información  en  respuesta  a  un  estímulo  externo.  Una  neurona  artificial  es  una  representación  simplista  que simula  la  conducta  de  integración  de  señales  y  umbral  de  disparo  de  las  neuronas  biológicas  por medio  de ecuaciones matemáticas.  En analogía a su contraparte biológica, las neuronas artificiales están enlazadas entre sí a través de conexiones que determinan el flujo de información entre pares de ellas.  Los estímulos son trasmitidos vía sinopsis o  interconexiones desde una unidad procesadora a otra.   Estos estímulos pueden ser excitadores o inhibidores.  Las  redes neuronales  son  típicamente arreglos de diferentes  capas de unidades procesadoras.    La  información fluye a través de cada unidad en la forma de un esquema entrada–salida.  En otras palabras cada elemento recibe una  señal  de  entrada  la manipula  y  genera  una  señal  de  salida  que  alimenta  a  otras  unidades  en  la  capa adyacente. La única tarea de la capa de entrada es recibir el estímulo externo y transportarlo a la siguiente capa.  La capa oculta  recibe  la  suma ponderada de  las  señales de entrada y  la procesa por medio de una  función de activación. 

  

Figura 8. Red neuronal  

Para que  la  red neuronal  artificial haga un  trabajo  similar  al del  cerebro humano  está  también  tiene que  ser entrenada, para esto se le alimenta con una serie de datos de entrenamiento, en los cuales los datos de entrada producen un  conjunto  conocido de  salidas o  conclusiones.   Así  la  red  aprende  a dar  respuestas  correctas por medio del ejemplo.  Conforme la red es alimentada con nuevos datos, cada caso es comparado con los ya antes procesados.   Si hay diferencias entre el caso nuevo y  los ya existentes, se calcula   un  factor de corrección y se aplica  a  los  nodos  en  la  capa  oculta.    Esta  etapa  se  repite  hasta  que  la  corrección  es menor  a  un  valor  pre‐determinado 

9. Redes Backpropagation  

 El término backpropagation se refiere al proceso por el cual pueden calcularse  las derivadas de error de  la red, con respecto a sus pesos y bases. Este proceso puede usarse con varias estrategias de optimización diferentes.  Debido a la naturaleza general del proceso de aprendizaje, algunos de los campos generales de aplicación son: 

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 • Codificación de Información. • Traducción de texto a lenguaje hablado. • Reconocimiento de lenguaje hablado. • Reconocimiento óptico de caracteres (OCR). 

 La importancia de la red backpropagation consiste en su capacidad de autoadaptar los pesos de las neuronas de las capas intermedias para aprender la relación que existe ente un conjunto de patrones de entrada y sus salidas correspondientes. Es importante la capacidad de generalización, facilidad de dar salidas satisfactorias a entradas que el sistema no ha visto nunca en su fase de entrenamiento. La red debe encontrar una representación interna que  le permita generar  las salidas deseadas cuando se  le dan entradas de entrenamiento, y que pueda aplicar, además, a entradas no presentadas durante la etapa de aprendizaje para clasificarlas. Para los propósitos de este trabajo se opto por la red backpropagation  ya que este tipo de red respecto a las demás es  fácil de implementar, tiene la flexibilidad de adaptarse para aproximar cualquier función y la velocidad de procesamiento de  los datos es menor;  sin embargo es  importante mencionar que actualmente existen  redes backpropagation modificadas (con momentum) las cuales podrían ser analizadas en un siguiente trabajo para determinar sus beneficios.  La red neuronal para la clasificación de los espectros de fluorescencia de biopsia de tejido de cérvix uterino es una red backpropagation con 65 neuronas en la capa de entrada, 9 en la capa intermedia y 1 en la capa de salida. 

10. Arreglo empleado para obtener las señales de fluorescencia  

 En la Figura 9 se muestra el diagrama a bloques del sistema de medición implementado:  

Los  pasos  que  se  siguen  para  obtener  las mediciones  de  fluorescencia  de  las  muestras tisulares  fijadas  en  el  vidrio  porta  y  cubre objetos,  son  los  que  se  describen  a continuación:   

• Mediante una bomba de vacío se genera el vació adecuado en  la cámara de descarga del láser  de  N2,  abrir  la  llave  del  tanque  de Nitrógeno,  verificar  que  la    presión  sea  la adecuada  (60mbar)  y  aplicar  alto  voltaje  hasta observar la descarga del láser.  

• Verificar  que  los  elementos  ópticos estén  perfectamente  alineados  con  respecto  al haz  láser, es decir que al pasar por el divisor de haz efectivamente una parte del  láser se desvié hacia  el  fotodiodo  (referencia),  para  verificar dicho efecto es recomendable conectar la salida del  fotodiodo  a  un  canal  del  osciloscopio  y 

observar  la  señal  desplegada  en  la  pantalla  del  instrumento,  lo  que  nos  asegura  el  correcto funcionamiento del láser (≈3%). La señal observada se muestra en la figura 10: 

 

Figura 9. Arreglo empleado para obtener las señales de Fluorescencia

8

 € Iniciando  (d) Iniciando 

 

€Osciloscopio Capturando el pulso láser  

Figura 10. Pulso láser observado en el fotodiodo  

• Verificar que  la otra parte del haz  láser  (≈81.2%)  llega al sistema óptico e  incide en  la parte central del punto donde quedará  la muestra, de ser así se apaga el  láser y se coloca  la muestra bajo medición y se fija, como se ilustra en la figura 5.3.  

   (a) Colocando la muestra en el pulso láser  (b) Cubriéndola con la pieza 

 Figura 11 Colocación de la Muestra 

 • En la PC en la barra de INICIO seleccione y elija LabView • Una  vez  en  LabView  pulse  la  pestaña  ABRIR  y  elija  el  programa  que  tiene  la  siguiente  ruta: 

C:\WINDOWS\Escritorio\flu\Tek2440\Graphed12a.vi, y se elige  la aplicación que controla el sistema, ver la siguiente figura. 

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• Posicione  el  control de  acción  en  inicializar  espectrómetro,  encienda  el  espectrómetro,  al  tiempo que aparece en el espectrómetro el mensaje de inicializando debe dar clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar en la PC. 

“correr continuamente” 

  

Figura 12 Espectrómetro inicializándose  

• Verifique  que  aparece  el  mensaje  de:  COMPUTER  CONTROL  en  el  espectrómetro  y  en  la  PC  debe mostrarse el mismo mensaje, en caso contrario repita el proceso 

• Se  establecen  las  longitudes de onda para  el barrido que  realizará  el  espectrómetro,  en  este  caso  los controles de posición del espectrómetro se colocan de tal forma que inicien en 330nm  hasta 650nm con incrementos de 5. 

• Indique una ruta para guardar el archivo de Excel que se generara al término de este proceso. • Indique una ruta para guardar el archivo de texto que se generara al término de este proceso. • Ahora posicione el control de acción a realizar en posición inicial. 

 

 Figura 13  Control de Acción a realizar en la posición inicial.  

 • Dar clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar. • Verifique que el espectrómetro se posicione en 330nm, si es así detenga el programa haciendo clic en el 

botón STOP de la barra ejecutar 

10

  

Figura 14  Espectrómetro situado a 330nm.   

• Encienda la fuente de alimentación del fotomultiplicador.  

 Figura 15 Fuente de alimentación 

 • Debe fijarse a un voltaje de 15V ±1. • Una vez colocada la muestra posicione el control de acción a realizar en barrido. • De clic al botón de correr continuamente en la barra de ejecutar. 

 

 Figura 16 Control de acción a realizar en posición de barrido. 

 • Una vez que el espectrómetro llegue a la posición final (650nm) debe dar clic en el botón Stop de la barra 

ejecutar. 

11

• Una vez que ha  terminado  todos  los barridos el espectro de  fluorescencia  resultante se muestra como sigue: 

 

11.  Señales de Fluorescencia obtenidas de muestras de tejido cervical 

 Las muestras de  tejido cervical después de ser tomada del paciente fueron puestos en formaldehido  al  10%  durante  24  horas  en un  cuarto  a  temperatura  constante, posteriormente son incrustados en parafina para  su  corte.  Secciones  de  4  μm  fueron cortadas para ser analizadas empleando un microscopio.  Se  tiñeron  las  muestras  con  hematoxilina  y eosina.   En este estudio  se utilizaron  15  muestras  de  15  diferentes pacientes.  El  diagnóstico  histopatológico fue  tomado  como  el  diagnostico  correcto con  el  cual  posteriormente  se  comparara el  resultado entregado por el  sistema  LIF. 10 de las muestras fueron empleadas  para entrenar  la  red  neuronal,  la  cual posteriormente  se  empleo  para  clasificar 

las  restantes  5  muestras  de  tejido  y  así  validar  la  red  neuronal.  Todas  las  muestras  de  tejido  tenían  una antigüedad promedio de 3.5 años.  La  Figura  17  muestra  la  intensidad  de  fluorescencia  promedio  contra  la  longitud  de  onda  obtenida  en  10 diferentes puntos de cada una las muestras. La fluorescencia de las muestras de tejido saludable es mayor que la fluorescencia de otras en las bandas de 350 a 540nm y de 575 a 650nm, y este podría ser un criterio para separar muestras malignas  y  no malignas.  Para  una  excitación  de  320nm  algunos  autores  han  propuesto  usar  solo  la relación de  la  intensidad de  la  fluorescencia a 383 y 460nm para clasificar muestras malignas y no malignas de biopsias cervicales in‐vitro obteniendo un 33% en los diagnósticos falso‐negativo.   Para  comparar  todos  los  valores  de  las  intensidades  de  los  espectros  de  fluorescencia  obtenidos  para  cada muestra,  es necesario que  los  espectros de  la  figura 5.9  sean normalizados. Para normalizar  se  toma  el  valor máximo de la fluorescencia y se dividen todos los valores entre dicho valor, de tal manera que los valores de las señales oscilaran entre “0” y “1”, ver figura 18.   En la figura 18   ahora es clara la diferencia entre todos los patrones de fluorescencia. Por ejemplo, los máximos de  los espectros de  infección con HPV, cáncer  invasivo y carcinoma  in‐situ tienen  lugar alrededor   de 560nm, y toman diferentes valores entre 350nm y 500nm. También se observa que el máximo del espectro de tejido sano y cervicitis crónica tiene lugar a 350nm, y toman diferentes valores entre 550nm y 600nm.   

Figura 17.   Espectros de fluorescencia para diferentes tejidos de cérvix. 

(HPV‐Human Papillomavirus)

12

  

Figura 18  Normalización a 1 de los espectros de la  Figura 5.9. 

  

14.    Entrenamiento  de  la  Red  neuronal para  reconocimiento  de  las  muestras  de tejido  La  opción  optima  para  el  tratamiento de  la  señal,  fue  la  elección  de  un intervalo  apropiada  para  el  barrido  de  la señal. El primer  intervalo propuesto  fue de una  longitud de onda de 330 a 650 nm, un  total de 64 puntos, sin embargo como se menciono antes se ha observado que  la información que nos interesa esta en un intervalo de 420 a 660nm, con lo que se redujeron los puntos a 49.  De  la misma  forma  se  trataron  todas  las muestras  analizadas,  por  lo  que  para  cada muestra  se  formaron  50 vectores de entrenamiento, 10 vectores por cada padecimiento que se desea analizar, así que el diseño de la red neuronal propuesto para resolver el problema es el siguiente:  La  red  neuronal  estará  constituida  de  dos  capas,  una  intermedia  y  una  de  salida.  Para  el  caso  de  la  capa intermedia va muy ligada con el número de características que contendrán los patrones de entrenamiento de la red y que posteriormente serán los patrones de reconocimiento y esto es debido al modelo de variante de la red backpropagation que se eligió.  Así, de la red neuronal diseñada en el capítulo 4, se utilizaron 49 neuronas en la capa de entrada y 5 neuronas en la capa de salida, con lo cual el patrón de entrada tiene 49 características, con funciones de transferencia tansig y logsig. El entrenamiento de la red neuronal se realizó en matlab, y se obtuvo un buen resultado a partir de 7000 épocas a 50000 épocas, sin tener el problema de generalización de patrones (apéndice A).  15.  Señales de Fluorescencia obtenidas de muestras de líneas celulares  Como un experimento adicional se investigaron los patrones de fluorescencia de las líneas celulares C‐33, CaLo y HeLa, preparadas en el Laboratorio de la Dra. Eva Ramón Gallegos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Las  células  epiteliales  y  las  tumorales  se  mantienen  de  forma  más  prolongada  en  sus  medios  de  cultivo. Espontáneamente, por clonación o por inducción mediante substancias químicas o virus, algunas células pueden transformarse y mantenerse indefinidamente en su medio de cultivo y dar lugar a líneas celulares permanentes. En la figura 19 se observan las graficas de fluorescencia de las líneas celulares C‐33, Calo y Hela,  

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Figura 19  Graficas de Fluorescencia de las líneas celulares  

Para  hacer más  claras  las  diferencias  existentes  entre  las  graficas  correspondientes  a  las  tres  líneas  celulares empleadas, mostradas en la figura 19, es necesario realizar la normalización, para lo cual se establece el máximo valor de amplitud de cada  línea celular y se dividen  todos  los valores entre este, por  lo que  los valores que se obtienen fluctúan entre “0” y “1”.  En la figura 20  aparece el valor máximo para las tres líneas celulares alrededor de 405 nm  otra diferencia notable es la forma en que después del pico correspondiente al pulso láser las señales de fluorescencia alcanzan su mayor valor.  

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

330 380 430 480 530 580 630

VOLT

AJE

(V)

LONGITUD DE ONDA (nm)

LINEAS CELULARES

C-33

CALO

HELA

14

 Figura 20 Gráficas de Fluorescencia de las líneas celulares normalizadas a “1”. 

   En este estudio se tomaron 9 muestras de línea celular C‐33, 9 de Calo y 9 de Hela, de las graficas de fluorescencia obtenidas para cada  línea celular  se obtuvieron  la mayor cantidad de  rasgos característicos de cada  línea para posteriormente entrenar la red neuronal.   

16.  Entrenamiento de la red neuronal para reconocimiento de las líneas celulares 

 Las graficas empleadas para el entrenamiento de  la  red neuronal se muestran en  las  figuras 21 a 23  las cuales corresponden a las 9 muestras de la línea celular C‐33, 9 de Calo y 9 de Hela, respectivamente. 

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

330 380 430 480 530 580 630

VOLT

AJE

(V)

LONGITUD DE ONDA (nm)

LINEAS CELULARES NORMALIZADAS

C-33

CALO

HELA

15

 Figura 21. Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de C‐33 empleadas para entrenar la Red Neuronal 

  

Figura 22 Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de Calo empleadas para entrenar la Red Neuronal 

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

330 380 430 480 530 580 630

VOLT

AJE

(V)

LONGITUD DE ONDA (nm)

LINEA CELULAR C-33 SIN NORMALIZAR

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

Muestra 7

Muestra 8

Muestra 9

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

330 380 430 480 530 580 630

VOLT

AJE

(V)

LONGITUD DE ONDA(nm)

LINEA CELULAR CALO SIN NORMALIZAR

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

Muestra 7

Muestra 8

Muestra 9

16

Figura.  23 Graficas de Fluorescencia de las 9 muestras de la Hela empleadas para entrenar la Red Neuronal  Las graficas anteriores se obtienen graficando  los datos que se adquieren a través de  la tarjeta de LabView,  los cuales son guardados en dos tipos de archivos .xls y .txt, los datos del archivos .txt posteriormente se introducen al  software WinNN  para  establecer  las  reglas  de  aprendizaje  y  los  valores  de  entrenamiento  para  la  red  tipo Backpropagation.   Una  vez  entrenada  la  red  neuronal  se  procedió  a  realizar mediciones  sobre muestras  de  líneas  celulares  no empleadas para el entrenamiento, obteniéndose en la pantalla de la PC la etiqueta que indica el tipo de muestra identificada, esto se realizo con 3 muestras de C‐33, 3 de Calo y 3 de Hela, sin ningún error en las clasificaciones.  

 Figura 24.  Resultado de la red neuronal 

 

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

330 380 430 480 530 580 630LONGITUD DE ONDA (nm)

LINEA CELULAR HELA SIN NORMALIZAR

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

Muestra 7

Muestra 8

Muestra 9

17

 

Conclusiones 

 La prueba de papanicolau, en  la cual una pequeña muestra de células colectadas desde el epitelio cervical son diagnosticadas bajo el microscopio por un experto, es en el presente un método muy extendido para detectar cáncer cervical. Si bien esta prueba  ha sido efectiva en la reducción de la mortalidad debida al cáncer cervical (1), (2),  esta  es  altamente  dependiente  de  la  habilidad  y  experiencia  del  patólogo.  La  sensitividad  y  especificidad usando la prueba de Papanicolau son 73% y 63% respectivamente. Una  prueba  de  Papanicolaou  anormal  es  seguida  por  una  colposcopia,  donde  se  usa  un montaje  de  lentes amplificadoras para ver el cérvix. La  sensitividad de  la colposcopia es excelente  (96%) pero  su especificidad es pobre  (48%)  (4). El cervix es cubierto por dos  tipos de  tejido epitelial: el ectocervix  tiene un epitelio escamoso estratificado y; el endocervix tiene un epitelio columnar. La unión entre estos dos es conocida como  la zona de transformación y puede ser reconocida basándose en su apariencia colposcopica característica.   La espectroscopia de  fluorescencia ha sido  investigada como un método efectivo y no  invasivo para chequeo y detección  de  cáncer  cervical.  La  espectroscopia  de  fluorescencia  del  tejido  es  afectada  por  diferentes  causas, entre estas el cambio en el  índice de refracción en el tejido y el esparcimiento en  las células nucleoides son  los más importantes. Las moléculas de hemoglobina absorben significativamente a ciertas longitudes de onda. La luz es también absorbida por fluoroporos,  los cuales entonces emiten  luz fluorescente. Fluoroporos biológicos tales como el NADH y  las  flavinas están directamente relacionadas al metabolismo humano. Así, el esparcimiento,  la absorción y  la fluorescencia producidos por la interacción de radiación con tejido generan una gran cantidad de información morfológica, citológica e histopatológica del tejido bajo investigación.  Los espectros de fluorescencia obtenidos con las biopsias de cérvix muestran que la interacción de la luz laser UV con  los tejidos producen diferentes espectros de  intensidades de  fluorescencia y diferentes tiempos de vida de fluorescencia, en  la figura 5.9 se puede ver que, para una excitación UV a 337nm, existe una emisión máxima a diferentes  longitudes de onda para cada tipo de tejido analizado; de tal manera que  la máxima emisión para  la muestra con tejido con VPH, la de cáncer invasivo y la de carcinoma in‐situ se obtiene en 560nm; para la muestra de  tejido  con  cervicitis  crónica; el máximo pico de emisión  se encuentra a 580nm.Conforme el  tejido pasa de normal a pre cáncer, la intensidad de fluorescencia  disminuye. La fluorescencia de estas muestras ginecológicas se atribuye a la combinación de colágeno, elastina y NADH (Nicotinamide Adenina Dinucleotide).  La red neuronal utilizada este trabajo de tesis es del tipo back‐propagation. Esta  emplea todas las mediciones de las intensidades a las diferentes longitudes de onda  (49 por espectro). Para las biopsias utilizadas, la red permite clasificar  los  cinco  casos  de  tejido  bajo  estudio.  La  red  neuronal  ha  sido  suficiente  para  discriminar  estados precanceroso  o  cancerosos te tejido sano. La  red  neuronal  es  una  buena  opción  para  representar  una  relación  compleja  entre  cualquier  numero  de parámetros de entrada (como los mostrados en las figuras 4.1 y 4.2) y un resultado de interés. La realidad es que una  red  neuronal  es  en  gran  parte  independiente  de  suposiciones  respecto  a  la  distribución  estadística  que relaciona a los datos que son más relevantes, cuando se tienen grandes cantidades de datos. Siguiendo la teoría de las Redes Neuronales se propusieron dos capas (con funciones de transferencia tansing y logsig para las capas ocultas  de  entrada  y  de  salida)  de  pesos  adaptivos  en  un  diagrama  de  realimentación,  ver  la  figura  4.4. Consideramos 49 entradas, 1 por cada  (Iλ  ,  λ) mediciones  (espectro desde 420 a 660nm), 49 capas ocultas y 5 salidas (una para cada clasificación de los tejidos en la figura).  

18

En la red empleada, cada sitio de entrada está conectado a una sola unidad oculta a través de un peso asociado ωi,j (donde i = 1,……,49 es el número de puntos de entrada y de las unidades ocultas). Todas las unidades ocultas están conectadas a las unidades de salida a través de lo pesos asociados ωi,j (donde j = 1,….,5 es el numero de las unidades de salida). Los pesos de los umbrales son propuestos aleatoriamente.  Cuando  un  espectro  de  entrada  (Iλ  ,  λ)  proveniente  de  una  biopsia  es  ingresado  a  la  red  esta  produce  un diagnostico, arrojado por el algoritmo de aprendizaje backpropagation, obteniéndose un 100% de coincidencia en la clasificación de los datos. Esto es, la red neuronal utilizada en este trabajo de tesis emplea todas las mediciones de las intensidades a las diferentes longitudes de onda  (49 por espectro) y, para las biopsias de prueba utilizadas, la  red permite  clasificarles dentro de  los  cinco  casos de  tejido bajo estudio  con  toda precisión. Con  lo  cual  se puede además concluir que ésta ha sido suficiente para discriminar estados precancerosos  o  cancerosos te tejido sano.  De igual forma, los experimentos que se llevaron a cabo con líneas celulares ofrecen resultados similares. Debido a que tanto  las células epiteliales como  las tumorales se mantienen prolongadamente en medios de cultivo con características previamente establecidas, Una vez normalizados los patrones de fluorescencia, es posible observar las diferencias existentes entre ellos. Con  los datos obtenidos  se entreno  la  red neuronal para  llevar a cabo el análisis de estas células partiendo de sus rasgos característicos. Una vez entrenada la red neuronal se realizaron las mediciones de líneas celulares de prueba clasificándolas sin error.  El método  de  clasificación  a  través  de  la  red  neuronal  y  sólo  resta  para  establecer  su  completa  validez  la realización de pruebas sobre una mayor cantidad de muestras, por ejemplo en la mayoría de los reportes médicos es costumbre reportar estudios consistentes en más de 100 muestras.    

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Referencia Bibliográfica 

 • Alejandro  López  Saavedra  y Marcela  Lizano  Soberón:  Cáncer  Cérvicouterino  y  el  virus  del  Papiloma 

Humano. Unidad de  Investigación Biomédica en Cáncer. UNAM  ‐  INCan.  Subdirección de  investigación básica. Instituto Nacional de Cancerología. México D.F., Rev. Cancerología 1 (2006):31‐55. 

 • Ferlay  J,  Bray  F,  Pisani  P,  Parkin  DM:  GLOBOCAN  2002;  cancer  incidence,  ortality  and  prevalence 

worldwide, iarc cancer base no. 5. Version 2.0, IARCPress, Lyon, 2004. (http://www‐dep.iarc.fr/)•  

• De  la Rosa  J., Bautista F.  J.: Optical properties of paper at 337.1 nm. Revista Mexicana de Física 2005; 51(1): 110‐113   

 • Majumder  S.  K.,  R.  Kumar,  N.  Gosh  and  P.  K.  Gupta,  Cancer  Diagnosis  Using  N2  laser  excited 

autofluorescence spectroscopy of formalin‐fixed human tissue. Conference Proceeding of Photonics 2004.  http//eel.inst.ac.ir/Sadr/Papers/bio4.pdf   

 • Majumder  S.  K.,  Kumar  R.,  Gosh  N.  P.,  Gupta  P.  K.:  Cancer  Diagnosis  using  N2  laser  excited 

autofluorescence spectroscopy of formalin‐fixed human tissue, Conference Proceeding of Photonics 2004. http//eel.inst.ac.ir/Sadr/Papers/bio4.pdf   

  

• Moreno  J.  A., Gallegos  F.  J.,  Ponomaryov,  V., De‐la‐Rosa  V.  J. M.  (2007)  Radial  Basis  Function Neural Network Based on Order  Statistics.  SEPI‐ESIME  Zacatenco,  Instituto  Politécnico Nacional, Av.  Instituto, Politécnico Nacional S/N, Col.  Lindavista, Del. Gustavo A. Madero,   México, D.F. Tel/Fax: 5729600, Ext. 54622  

 • Glassman W.  S.,  Liu  C. H.,  Tang G.  C.,  Lubicz  S.,  Alfano  R.  R.,  (1992) Ultraviolet  excited  Fluorescence 

spectra from non‐malignant tissues of the gynecological tract, Lasers in the Life Sciences 5, pp. 49‐58.