DNK REPARACIONI SISTEM KOD LJUDI

Celularna DNK je stalno podložna atacima reaktivnih grupa unutar ćelije kao i uticaju spoljašnje sredine. Toksične i mutagene konsekvence se pokušavaju minimizovati putem reparacije DNK. Do danas je poznato 130 humanih gena čiji produkti učestvuju u reparaciji DNK. Poznata je njihova hromozomska lokacija kao i cDNK sekvenca. Medjutim, veliki deo podataka o funkciji produkata ovih gena i njihovoj ulozi u održavanju normalnog funkcionisanja ljudskog organizma još uvek ne postoji. Akumulacija saznanja iz ove oblasti vodiće ka kliničkoj primeni uključujući unapredjenje radioterapije i tretmana antikancer lekovima.

Humani genom, kao i drugi genomi, kodira i informaciju da zaštiti sopstveni integritet. DNK reparacioni enzimi konstantno proveravaju hromozome da bi korigovali oštećene nukleotide nastale ekspozicijom kancerogenima i citotoksičnim komponentama. Oštećenja su delom posledica agenasa spoljašnje sredine kao što je UV svetlo, dim cigareta ili pak odredjen način ishrane. Šta više velika proporcija DNK lezija izazvana je nezaobilaznim endogenim mutagenima uključujući vodu, metabolite koji deluju kao alkilirajući agensi itd.

Na bazi pretrage humanog genoma na Tabeli 1. je data lista nekih gena koji učestvuju u DNK reparaciji. To su sve geni čiji produkti su funkcionalno vezani za prepoznavanje i reparaciju oštećene DNK kao i geni koji pokazuju visok stepen homologije sa genima za DNK reparaciju drugih organizama.Postoje tri različite forme ekscizione reparacije DNK: Bazna eksciziona reparacija (BER), Nukleotidna eksciziona reparacija (NER) i "Mismatch" reparacija ili reparacija pogrešno sparenih baza (MMR). Osim ovih načina reparacije postoji i mogućnost direktne reparacije oštećenja, rekombinacioni putevi reparacije prekida DNK lanaca i mogućnost da DNK polimeraza može "zaobići" DNK oštećenje pri DNK replikaciji.

DNK repearacioni sistemi služe održavanju integriteta genoma: popravljaju lezije koje mogu nastati usled grešaka tokom replikacije DNK, uticaja uslova sredine ili kao kumulativne promene nastale efektima starenja. U ovom delu biće sumirano sve što se do danas zna o ovim genima i homolozima ovih gena nadjenih kod bakterija, kvasca i miša.

DNK reparacija je odgovor ćelije na pokušaj menjanja primarne DNK sekvence. Ova definicija se može proširiti jer postoje podaci da neka oštećenja DNK mogu biti tolerisana ili se čak mogu generisati promene u sekvenci u cilju ćelijskog preživljavanja. Izučavanje DNK reparacije na prokariotskim sistemima u poslednjih 30 godina dalo je puno podataka koji su kasnije korišćeni u izučavanju DNK reparacije kod kvasca i miša. Postojanje izvesne homologije izmedju gena uključenih u reparaciju DNK bakterija, kvasca, miša i čoveka omogućilo je kloniranje humanih gena čiji su produkti uključeni u reparaciju ili popravku oštećene DNK.Alternativni put u otkrivanju humanih gena čiji produkti učestvuju u reparaciji DNK bio je traženje genetičke osnove mnogih humanih bolesti. Prva bolest koja je identifikovana kao bolest uzrokovana deficijencijom reparacionog sistema bila je xeroderma pigmentosum (XP): nasledno

1

oboljenje uzrokovano deficijencijom u bilo kom od 7 reparacionih gena čiji produkti učestvuju u eksciziji nukleotida. Druge, do sada poznate bolesti, vezane za deficijenciju sistema za DNK reparaciju su: trihotiodistrofije, Kokein sindrom, Fankonijeva anemija, ataksija telangiektazija, Blumov sindrom i nasledni nepolipozni kolorektalni kancer (HNPCC). Bolesti nastale zbog deficijencije reparacionih sistema su izuzetno kompleksne i veoma teške. U izučavanju veze izmedju DNK reparacije i bolesti koriste se ćelijske linije i animalni modeli.

DNK reparacija je podeljena u 5 sistema na osnovu substrata ili mehanizma reparacije.

Direktna reparacija

Najjednostavniji odgovor ćelije na oštećenje DNK je direktno uklanjanje lezija i restauriranje originalne sekvence (tabela 2). Kod bakterije i kvasca nekoliko fotoliaza može direktno ukloniti leziju nastalu nakon UV zračenja ili nakon tretmana cisplatinom i to mehanizmom zavisnim od vidljivog svetla. U humanom genomu je pronadjen homolog gen genu čiji je produkt E.coli (6-4) fotoliaza. Fotoliaze su, u evoluciji, verovatno nastale pre pojave eukariota. Ovaj enzim se eksprimira u svim humanim tkivima, što je paradoksalno pošto vidljivo svetlo ne dopire do svih tkiva. Takodje je pokazano da aktivnost fotoliaze može biti indukovana oksidativnim stresom. Kod kvasca, mutacija u genu za fotoliazu je praćena rezistencijom na MNNG i cis-diaminhloroplatinu. Pretpostavlja se da vezivanje fotoliaze za oštećenu DNK služi kao regulatorni signal za aktivaciju drugih reparacionih puteva. Humani gen koji kodira (6-4) fotoliazu lociran je na 12q23-24.1 hromozomu a produkt ovog gena je mase 66 kDa.

Po najnovijim saznanjima i dalje se može reći da mnogi organizmi sadrže fotoliaze koje monomerizuju lezije indukovane UV svetlom kao što su ciklobutanski pirimidinski dimeri i (6-4) fotoprodukti. Humani genom sadrži dva CRY gena sličnih sekvenci kao i gen za fotoliazu E.coli. Ova dva CRY gena kodiraju, kako je pokazano, receptore za plavo svetlo uključene u uspostavljanje cirkadijalnog ritma ali ne učestvuju u fotoreaktivaciji DNK oštećenja. Nisu detektovani drugi homolozi fotoliaze u humanom genomu što potvrdjuje pretpostavku da je aktivnost fotoliaze prisutna kod mnogih kičmenjaka uključujući ribe, reptile, torbare ali ne i placentarne sisare.

Drugi enzim uključen u direktnu reparaciju je O6 –metilguanin DNK metiltransferaza (MGMT). Ovaj enzim igra važnu ulogu u reparaciji oštećenja nastalih alkilacijom DNK. Gen koji kodira O6 – metilguanin transferazu lociran je na 10q24-33 hromozomu a produkt gena je mase 22 kDa. Ovaj enzim katalizuje transfer metil grupe sa O6-metil guanina sa DNK na cisteinski ostatak samog enzima. Alkil grupa lezije biva ireverzibilno prebačena na cisteinski ostatak aktivnog mesta MGMT enzima. Ovako nastali inaktivirani alkil-MGMT enzim biva degradiran putem ubikvitinske proteolize. Ovaj proces zahteva ogromnu količinu energije, a rezultat je uklanjanje samo jedne alkil grupe. Humane ćelije poseduju i druge “jeftinije” reparacione sisteme koji uklanjaju alkil grupe ali ti sistemi su mnogo sporiji u poredjenju sa MGMT. Alkilirajuća ošećenja tipa O6-metilguanina mogu imati trenutne posledice na ćeliju i zbog toga

2

moraju biti momentalno uklonjena čak i ako to zahteva ogromnu količinu energije. Oko 20% humanih tumorskih ćelijskih linija ima redukovanu aktivnost MGMT-a i povećanu osetljivost na alkilirajuće agense kao što je MNNG. Postoji podatak o visokoj mutacionoj frekvenciji u mgmt genu kod pacijenata sa rakom ezofagusa.

Nedostatak MGMT aktivnosti nije uvek vezana za mutacije u mgmt genu što ukazuje na verovatnu epigensku regulaciju ovog gena. Metilacija citozina u regionima CpG ostrvaca u promotoru mgmt gena redukuje ekspresiju MGMT. Pokazano je da i metilacija udaljenih uzvodnih i nizvodnih sekvenci oko mgmt gena ima uticaja na ekspresiju MGMT tako što dovodi do kondenzovanja hromatinske strukture i time biva onemogućena transkripciona aktivacija.

Humani MGMT je krucijalan za ukljanjanje alkilirajućih oštećanja ali indukcija ekspresije mgmt gena jonizujućim ili UV zračenjem, deksametazonom čak i p53 proteinim sugerira da MGMT može imati još neke reparacione funkcije odnosno može učestvovati u popravci lezija koje nisu alkilirajućeg tipa.

Bazni ekscizioni reper

BERBazni ekscizioni reper je višestepeni sistem popravke lezije u kome

učestvuje više proteina (Tabela 3). Target za ovu reparaciju su lezije produkovane metilacijom, oksidacijom, redukcijom ili fragmentacijom baza jonizujućim zračenjem ili oksidativnim oštećenjem. Uklanjanje (isecanje) slobodnih baza iz DNK, procesom katalizovanim DNK glikozilazama, je glavni tip bazne ekscizione reparacije. DNK polimeraza, nakon isecanja oštećene baze, popunjava prazninu na novonastalom 3’ OH kraju DNK lanca, a DNK ligaza katalizuje spajanje prekida.

Ćelijski nukleus i mitohondrije sadrže nekoliko sličnih ali ne identičnih DNK glikozilaza dobijenih kao posledica alternativnog splajsovanja transkripata. Tri različite nuklearne DNK glikozilaze popravljaju oštećenja nastala oksidacijom dok četvrta uglavnom iseca alkilirane purine. Četiri od osam identifikovanih DNK glikozilaza imaju sposobnost uklanjanja uracila iz DNK i svaka od njih ima specijalizovanu funkciju. UNG, koja je homologa E.coli Ung enzimu, funkcioniše na DNK replikacionoj viljušci i uklanja uracil koji se greškom postavlja nasuprot adenina. SMUG1, koji je jedinstven za više eukariote, verovatno uklanja uracil koji nastaje u DNK deaminacijom citozina. MBD4 iseca uracil i timin specifično sa deaminisanih CpG i 5-metil-CpG sekvenci, a TDG uklanja etenoC, produkt lipidne peroksidacije i takodje sporo uklanja uracil i timin iz G:U i G:T baznih parova.

Postoje četiri adenozin trifosfat (ATP)- zavisne DNK ligaze kodirane od strane tri gena pri čemu je LIG3-XRCC1 glavna ligaza u funkciji BER-a.Do nedavno je samo jedna endonukleaza za abazna mesta pronadjena u humanom genomu, iako postoje po dve i u E.coli i u kvascu a pretpostavlja se da postoje tri gena u biljci Arabidopsis thaliana. Drugi humani gen, APE2 je nedavno pronadjen. APE2 kodira protein minornog značaja pošto delecija glavnog gena APE1 dovodi do ranog umiranja embriona.

3

Reparacija 3-metiladenina, blokirajuće lezije za DNK replikaciju, je drugi primer ekonomičnosti humanog genoma. Kod drugih organizama, nekoliko DNK glikozilaza, nimalo sličnih po primarnoj sekvenci, može ukloniti 3-meA. Medju njima je Tag1 E.coli, AlkA E.coli i MPG kod viših eukariota. U humanom genomu je do sada okarakterisan samo MPG. Ovo je u suprotnosti sa najmanje 2 alkA i šest tag1 homologa nadjenih u Arabidopsisu. Humani genom, za sada ne sadrzi tag1 i alkA homologe.

Verovatno postoji još tipova DNK glikozilaza koje još uvek nisu identifikovane. Ekspresija nekih glikozilaza može biti zavisna od ćelijskog ciklusa ili faze razvića. Glikozilaze se nalaze u nukleusu i pre nego što dodje do oštećenja DNK i deluju preventivno. Postoji jako malo informacija o vezi DNK glikozilazne deficijencije i humanih bolesti. Sve, do danas poznate, glikozilaze su identifikovane na bazi homologije sa genima za DNK glikozilaze E.coli i kvasca. Pokazano je da je nedostatak bazne ekscizione reparacije dramatično povećava frekvenciju mutacija kod E.coli, kvasca i miša. Zato se pretpostavlja da DNK glikozilazna deficijencija može biti predisponirajući faktor za humane bolesti uključujući i rak.

Nukleotidni ekscizioni reper

NER

NER uglavnom uklanja glomazne "dodatke" (engl. "adducts") izazvane spoljašnjim agensima a to su : acetilaminofluoren-guanin, cisplatina-guanin, psoralen-timin, dimere timina, 6-4 fotoprodukti i dr. Kod E.coli tri polipeptida UvrA, UvrB i UvrC lociraju i isecaju ovakve lezije sa obe strane a zatim uklanjaju segment nukleotida sa oštećenjem.Eukariote, uključujući kvasac i humane ćelije, nemaju direktne homologe UvrABC polipeptidima ali zato koriste znatno kompleksniji ansambl genskih produkata da obave funkciju NER-a. Npr. E.coli UvrA se vezuje za mesta DNK oštećenja, dok najmanje četiri različita humana NER faktora ima ovu sposobnost (XPC,DDB, XPA i RPA kompleksi). Takodje u humanim ćelijama imamo aktivne najmanje 2 helikaze (XPB i XPD) umesto jedne UvrB E.coli. Takodje u humanim ćelijama postoje dve nukleaze (XPG i ERCC1-XPF) za svaki od dva prekida, umesto jedne UvrC kod bakterija. Kod kvasca imamo još dva dodatna produkta Rad7 i Rad17 koji su važni u NER-u.

Transkribovani lanac aktivnih humanih gena se reparira brže od netranskribovanog lanca u transkripcija-kuplovanom reparacionom procesu koji uključuje produkte CSA, CSB i XAB2. Ovaj mehanizam je za sada, u potpunosti nepoznat.

Ovaj tip ekscizionog repera je ekstenzivno izučavan kod bakterija i kvasca i humanih XP ćelija (xeroderma pigmentosum). Humani nukleotidni ekscizioni reper je veoma kompleksan sistem. Glavni enzim ovog sistema, ekscinukleaza, sačinjen je od najmanje 16 polipeptida (Tabela 4). Mehanizam nukleotidnog ekscizionog repera ima četiri stupnja: prepoznavanje lezije, incizija (prekid), popunjavanje praznine (engl. “gap-filling”) i ligacija.

Proces ekscizije počinje jednolančanim prekidom oko lezije. To se ostvaruje ekscinukleaznim kompleksom uz utrošak ATP-a. Ekscinukleazni kompleks katalizuje sečenje 5-te fosfodiestarske veze sa 3’ kraja i 24-te

4

fosfodiestarske veze sa 5’ kraja lezije. Praznina nastala prekidom i ekscizijom popunjava se DNK sintezom katalizovanom polimerazama i dalje učešćem DNK ligaze i dodatnih faktora.Enzimi ovog reper sistema su multifunkcionalni i uključeni su i u druge ćelijske procese kao što je regulacija ćelijskog ciklusa. Mutacije u genima za ove enzime mogu dovesti do pojave raka bilo promenama u regulaciji ćelijskog ciklusa ili usled same deficijencije nukleotidnog ekscizionog repera.

Bolesti izazvane deficijencijom ovog reper mehanizma su kseroderma pigmentosum, Kokein sindrom i trihotiodistrofija.

Popravka pogrešno sparenih baza (engl. “mismatch repair”)

MMRDo pogrešnog sparivanja baza može doći za vreme DNK replikacije,

formiranjem heterodupleksa i formiranjem sekundarnih struktura kao što su imperfektni palindromi. Pogrešno sparene baze mogu, takodje, biti i posledica deaminacije 5-metilcitozina u uracil (koji ne bude na vreme uklonjen uracil-N-glikozilazom) što rezultira u G:T pogrešno sparenim bazama. Ovaj sistem može razlikovati ispravan parentalni lanac od lanca koji sadrži pogrešnu informaciju. Osnovna strategija je slična kao kod ekscizionog repera: niz nukleotida se uklanja sa jednog lanca, a zatim dolazi do popunjavanja praznine i ligacije.

Bakterijski mutS i mutL geni kodiraju proteine odgovorne za identifikovanje pogrešno sparenih baza a postoje brojni homologi geni u humanom genomu. Neki od ovih proteina su specijalizovani za lociranje različitih tipova pogrešno sparenih baza u DNK, neki su specijalizovani za mejotsku rekombinaciju, a neki imaju funkcije koje još nisu detektovane. Kod E.coli novosintetisani DNK lanac biva identifikovan uz pomoć MutH endonukleaze koja nema humani ortolog. Diskriminaciju lanaca u humanim ćelijama možda signalizira orijantacija komponenti DNK replikacionog kompleksa kao sto je PCNA ili nekim drugim faktorima koji još nisu identifikovani.

U humanim ćelijama je pokazano prisustvo dva tipa reparacije pogrešno sparenih baza: “long-patch repair” (LPR) i “short-patch repair” (SPR) (reparacija dugih i kratkih nizova). LPR gotovo da ne pokazuje sekvensnu specifičnost i iseca dugačke fragmente DNK. SPR je specifičan za definisane sekvence i rezultira u eksciziji jednog ili samo nekoliko nukleotida.

U humanim ćelijama okarakterisano je 6 gena homologih E.coli genima čiji su produkti uključeni u popravke pogrešno sparenih baza i LPR kvaščevim genima i to: hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS1 i hPMS2 (tabela 5). HMSH2, hMSH3, hMSH6 i Pep-3/Duc-1 su humani homolozi E.coli mutS gena. G:T pogrešno sparene baze bivaju detektovane produktom hMSH6 gena koji formira heterodimer sa produktom hMSH2 gena pre vezivanja za DNK. Humani MutL homolozi: hMLH1, hPMS1 i

5

hPMS2 takodje imaju važnu ulogu u ovom tipu reparacije kao i MutL u E.coli.LPR uklanja deo DNK lanca od 90-170 nukleotida. Humani MutH homolog nije još identifikovan. Još uvek nije poznato koji protein pravi prekid u lancu DNK a koji uklanja deo lanca koji sadrži pogrešno sparene baze.

Što se tiče reparacije kratkih nizova DNK (SPR) do sada su identifikovana tri humana enzima koja poseduju sposobnost prekida DNK. To su enzimi koji specifično prepoznaju T/G parove, A/G parove i treći tip enzima koji prepoznaje sve tipove pogrešno sparenih baza.

Mutacije u hMLH1, hMLH2, hMLH6, hPMS1 i hPMS2 su nadjene kod pacijenata obolelih od naslednog nepolipoznog kolorektalnog kancera.Mutacije u hMSH3 genu dovode do velike mikrosatelitne nestabilnosti.

Reparacija dvolančanih DNK prekida (engl. “double strand brake repair”)

Prekidi oba lanca DNK nastaju u fiziološkim uslovima uključujući somatsku rekombinaciju. Takodje mogu nastati kao posledica jonizujućeg zračenja i oksidativnih oštećenja. Prekidi oba lanca blokiraju dalju replikaciju i transkripciju. Šta više eksponirani krajevi ovakvih fragmenata postaju substrat za nukleaze koje vrše degradaciju lanaca. Efikasna reparacija ovakvog oštećenja DNK je neophodna za održanje integriteta genoma. Geni čiji produkti su uključeni u ovaj proces su RAD51, RAD52 i RPA (Tabela 6).

Dvolančani prekidi DNK mogu se popraviti bilo homologom ili nehomologom rekombinacijom. Specifičnost humanog genoma je u tome što ima čak sedam gena koji kodiraju proteine slične Rad51 S.cerevisie i RecA E.coli. RecA homolog učestvuje u sparivanju lanaca i razmeni za vreme rekombinacije. Četiri člana Rad1 familije nadjena su u Drosophila genomu i četiri u genomu Arabidopsis-a. Homologa rekombinacija u humanim ćelijama verovatno uključuje enzime koji učestvuju u "branch migration" i resolvaze koje su funkcionalni analozi bakterijskog RuvABC sistema.

U poslednjih par godina zahvaljujući sekvenciranju humanog genoma otkrivene su mnoge DNK polimeraze. Postoji najmanje 15 DNK polimeraza u humanim ćelijama što znatno prevazilazi broj nadjen u ostalim organizmima.

Trenutno se izučava genom Deinococcus radiodurans. Ova bakterija je posebno otporna na agense koji prave DNK oštećenja, specijalno na jonizujuće zračenje. Ostaje da se vidi da li će neki od tih gena imati svoje homologe u humanom genomu.

Postoji nekoliko klasa DNK oštećenja za koje je mehanizam reparacije savim nepoznat. Tako se očekuje da budu identifikovani novi geni uključeni u repraciju DNK oštećenja izazvanih lipidnom peroksidacijom. "Knockout" miševi za DNK glikozilaze su ,pokazali sasvim neočekivane rezultate, tj. rezultat je bio veoma blag za razliku od istih eksperimenata kod kvasca ili E.coli. Ovakav rezultat implicira na postojanje nekih "backup" sistema verovatno zato što endogena oštećenja predstavljaju frekventniji problem za veće genome.

6

Veoma mnogo se radi na razumevanju procesa kojim DNK oštećenje prenosi signale na "checkpoint" mašineriju ćelijskog ciklusa i na sistem koji kontroliše apoptozu.

Nove kliničke aplikacije povezane sa humanim genima za reparaciju će se tek razvijati. Tumorske ćelije često postanu rezistentne na citostatike ili radijaciju. Genomski pristup sa upotrebom "array" tehnologije biće korišćen da se definišu neki DNK reparacioni geni koji mogu biti povećano eksprimirani u ovom kontekstu. Bilo bi veoma važno naći načina da se specifično inhibira reparacija DNK u ovim rezistentnim ćelijama nalaženjem ključnih enzima.

Upotrebom novih molekularno bioloških metoda biće moguće uporediti ekspresione profile gena za DNK reparaciju u normalnim i tumorskim ćelijama što može voditi individualno "skrojenim" terapijama sa citostaticima i radijacijom. Npr. tumori sa niskim nivoom NER-a su podložniji tretmanu sa cisplatinom. MMR deficijentne ćelije pokazuju visoku toleranciju na alkilirajuce hemoterapeutske lekove.

Ćelijski ciklus i DNK reper

Regulacija ćelijskog ciklusa je tesno povezana sa odgovorima na oštećenja DNK. Ćelije koje sadrže oštećenu genomsku DNK zaustavljaju se u G1-S i G2-M tranziciji da bi imale dovoljno vremena za reparaciju lezija i time izbegle fiksiranje mutacije za vreme replikacije i ćelijske deobe. Produkt p53 gena koji može biti indukovan oštećenjem u DNK, igra centralnu ulogu u: 1) zaustavljanju ćelija u G1 fazi kroz indukciju GADD45, MDM2 i CIP1/WAF1 koji inhibiraju ciklin zavisne kinaze neophodne za G1-S tranziciju ; 2) zaustavljanju ciklusa u G2 fazi; 3) indukciji DNK repera i 4) apoptozi.

Nivo ekspresije nekih reper gena fluktuira za vreme ćelijskog ciklusa. Tako npr. ung gen (gen koji kodira uracil-DNK-glikozilazu) je pod kontrolom transkripcionih faktora zavisnih od ćelijskog ciklusa kao što je E2F-1.

Nereparabilna oštećenja dovode do apoptoze pri kojoj dolazi do proteolize i do degradacije genomske DNK.

7