SOCIETAT CATALANA DE FARMACOLOGIA

FIJACióN DE BRETILIO A FRACCióN DE MEMBRANAS *

A. DfEz-CAscóN MENÉNDEz, F. GARCÍA-VALDECASAS

INTRODUCCIÓN. - A partir de 1965 los trabajos de HERTTIG e IvERSEN 1

• 2•

3 condujeron a la hipótesis de que hay receptores alfa adre­nérgicos en la superficie exterior de las terminaciones nerviosas adre­nérgicas y que estos receptores presinápticos alfa están implicados en la liberación de noradrenalina a través de un mecanismo de realimen­tación negativa mediado por el mismo transmisor (figs. 1 y 2). Hipótesis que se vio apoyada al demostrarse que agonistas alfa inhiben la libera­ción de transmisor durante la estimulación nerviosa 4• s. 6• 7 y que la reducción en la liberación así obtenida por la exposición a agonistas adrenérgicos se observa igualmente en tejidos en los que la respuesta del órgano efector es mediada por receptores alfa 6•

7• 8 o por receptores

beta.4• s. 9

1 cant 1dad total de transmisor l ·::Je­rado por estimuiacion del ner ro

2 noradrenalina receptada por 10 terminacion

3 fraccion del ~ransmisor liberado capaz de act ivar los receptores postsinapticos a o fl ·

4 noradrenalina que no alcanza fes rece¡>tores y es metabolizada

5 f lujo

FIG. 1

• Sessió del din 31 de gencr de 1979.

32 ANNALS DE _';!EDICINA

Mecanismo de realimentacion negativa para la liberacion de noradrenalina

FIG. 2

Recientemente se ha postulado que además de existir un mecanismo de realimentación negativa para la liberación de noradrenalina por esti­mulación nerviosa vía receptores alfa, existe un mecanismo de realimen­tación positiva en las terminaciones nerviosas adrenérgicas que se pone en funcionamiento a través de la activación de receptores beta adrenér­gicos presinápticos.10• 11•

12• 13•

14 Hipótesis que se basa en que la expo­sición a bajas concentraciones de isoprenalina aumenta la liberación de noradrenalina durante la estimulación nerviosa en varios órganos con inervación adrenérgica 10• 11 • 12•

14•

15•

16 (figs. 3 y 4). Los efectos de la iso­prenalina en la liberación de transmisor pueden paliarse por preincuba­ción con propranolol 0,1 ¡.¡.M.11

Mecanismo de realimentacion positivo poro lo liberocion de norodrenolino

FIG. 3

papel de los rec.epto.res presí­nopticos a: y t3 en lo liberacion de norodrenalina

FIG. 4

A. DÍEZ·CASCÓN. FIJACIÓN DF. BRF.TILIO A FRACCIÓN DE MEMBRANAS 33

La naturaleza B1 o B2 de los receptores presinápticos está sujeta toda­vía a controversias. Según DAHLOF y col. / 7 los receptores presinápticos son Bt porque son bloqueados selectivamente por Metoprolol. Según STJii.RNE y BRUNDIN/4 es B2, dado que la Terbutalina y el Salbutamol favorecen la liberación de transmisor.

La técnica más apropiada para la identificación directa de recepto­res y la que proporciona mayor información es la utilización de subs­tancias marcadas radiactivamente como receptor-ligandos.17

• 18 Así se ha

identificado el receptor beta adrenérgico utilizando (lH) Alpreno­lol; 19

• 20• 21 eH) Hidroxibencilpindolol; 22 (lH) Propanolol, 23

• 24 y (lH) Di­

hidroalprenolol 25 y el alfa adrenérgico utilizando (lH) Dibidroergocrip­tina.26

Los trabajos realizados hasta la fecha no distinguen entre el carác­ter pre- o postsináptico del receptor y una aportación en este sentido puede ser valiosa; para ello, y de entre los bloqueantes presinápticos de que disponemos, alcaloides reserpínicos, metil dopa y derivados gua­netidinicos, se elige un representante de este último grupo dado su locus de acción y la no modificación del contenido de catecolaminas de las vesículas. La elección del bretilio y no de la guanetidina se debe a la realización de trabajos paralelos conectados con el presente en nuestro departamento.

MATERIAL Y MÉTODOS. -Se utilizan, para nuestro estudio, ratas macho Sprague-Dawley de 200 ± 10 g., a las que después de sacri­ficar se extirpan los conductos deferentes, que se homogeneízan (con homogeneizador de. vidrio) a la máxima velocidad durante 15 segundos en Sacarosa 0,25 M,Cl-TRIS 5 mM,Mgeh 1 mM. Después de filtración a través de gasa hidrófila se centrifuga el homogeneizado a 600 X g a 3° e durante 30 minutos, descartándose el sedimento. El sobrenadante se vuelve a centrifugar a 20.000 X g a 3° e durante 20 min. El sedi­mento así obtenido se resuspende en Cl-TRIS 50 mM,Mgeh 10 mM a razón de 10 mg. de tejido original por mililitro de tampón.

Se incuban porciones de 5 rol. de la preparación obtenida con concentraciones de bretilio tritiado «free carrier» variables entre 2,5 X 10-9 M y 2,5 X 10 4 a 37° e y a tiempos comprendidos entre O y 20 minutos .

Transcunido el tiempo predeterminado para la incubación se pone fin a ésta añadiendo 5 ml. de tampón de incubación helado y centri­fugado a 105.000 X g durante 30 minutos. Se lava el sedimento con tampón de incubación y se añaden 2 rol. de ácido fórmico al 85 % para su disolución. A las 48 horas se introducen las muestras en viales de centelleo que contienen 10 mi. de Merit (Isolab) y se cuentan durante 10 minutos.

34 AN!\Al-S DE MEDfCTNA

Se considera como específica la diferencia entre la fijación así obte­nida y la resultante de desplazar con una concentración de bretilio frío mil veces superior.

Los resultados obtenidos se muestran en los gráficos 5 y 6.

r (mol /gr proteino).I0-7

o o

3

12.5 f.J tvl

o o

2

_______ _c----------- -oa 2.5 fJM

5 10· 20 t (min)

FrG. 5

A otro grupo de muestras, después de transcurrido el tiempo de incubación con bretilio, se les añade adrenalina, noradrenalina y anfe­tamina, no observándose en ningún caso desplazamiento del bretilio fijado, tal como se muestra en la figura 7 .

Se realizan, asimismo, experimentos en los que se preincuba la suspensión de fracción de membranas con adrenalina, noradrenalina y anfetamina a idénticas concentraciones y posteriormente se realiza la incubación con bretilio del modo antes indicado (fig. 8).

Por último se realizan una serie de experiencias en las que se íncuba suspensión de fracción de membranas con bretilio tritiado y los agonis­tas citados anteriormente con los resultados que se muestran en las figuras 9 y 10.

Asimismo se determina el contenido en proteínas de la fracción de membranas del conducto deferente de rata y que resulta ser de 1,43 mg/ml. de suspensión.

A. DÍEZ-CASCÓN. FrJACIÓN DE BRETILIO A FRACCIÓN DE MEMBRANAS 35

4

3

2

r (mol/gr proteína) 10 -?

FIG. 6

w·6 10·5 10-"

conc bretil io (M)

REsULTADOS Y DISCUSIÓN.- El bretilio pertenece a un grupo de fármacos que previene la liberación del transmisor adrenérgico por el impulso nervioso. El mecanismo de esta acción no ha sido dilucidado hasta el presente. Otras substancias del grupo son la Guanetidina, Beta­nidina, Ciducenina, Debrisoquina ... Además de la liberación por el impulso nervioso, las substancias de este grupo también inhiben la acción de los adrenérgicos indirectos. Por otra parte, las substancias bloqueantes de la recaptación son capaces de inhibir a su vez la acción de la guanetidina y el bretilio. Por lo tanto parece que el bretilio, la guanetidina y demás substancias son capaces de interferir los meca­nismos de liberación a nivel de la membrana. Resulta por lo tanto suge­rente el investigar la posible existencia de un receptor sobre el cual actuarán estos cuerpos. ·

36

r ( mol/gr proteina ).lo-7

'·

Adic..

3

2

5

r (mol/gr proteína) . 10-?

4 o

3

2

prein. 1 hora

5

ANNAl-S DE MEDICINA

2

3

Noradrenalina ( 1.1,5.5 y 11 ~M)

Adrenalina (1.1, 5.5 y 11 fJM)

Anfetamina ( 1 y 100 fJM y 1 mM)

o

10

FtG. 7

o

o

Anfetom•no lmM

Adrenalina ll pM

Noradrenal ina 11 )JM

10 FIG. 8

25 ~M o

t (m in)

20

o <D

Bret. 25 pM

Q)

o <3l

t (min)

20

A. DÍEZ-CASCÓN. FIJACIÓN DE BRETILIO A FRACCIÓN DE MEMBRANAS 37

En la figura 5 se observa que el equilibrio se alcanza a los 5 minutos aproximadamente. La capacidad máxima de fijación se determina por el método de Scatchard (fig. 11 ), observándose la existencia de una afinidad con N= 1,84 X I0-7 mols/g. de proteína y K= 21,0 X 107

moles-1•

No se observa disminución de la fijación al añadir adrenalina, nora­drenalina o anfetamina después de haber incubado 5 minutos con bre­tilio, como puede constatarse en la figura 7. Este hecho, no desplaza­miento del bretilio fijado por una serie de agonistas adrenérgicos, indujo a ensayar dos variantes :

a) Preincubado con los diferentes agonistas durante 60 minutos, transcurridos los cuales se añade bretilio tritiado, dándose por finalizada la incubación a las 5, 10 y 20 minutos. Los resultados pueden obser­varse en la figura, 8 en la que puede notarse que la noradrenalina

r (mol/gr proteina).l0-7

4

3

2

2 ' 4 6

FIC. 9

6 25 ~ ~--~

o 12.5 ~M

• 2.5 }JM

conc. NA ( pM)

8 10 12

38 ANNALS DE ~1EDICINA

r (mol/gr proteina).l0-7

4

25 JJM

3

2

conc. A (pM)

2 4 6 8 10 12

FtG. 10

produce un desplazamiento del 35% aproximadamente, la adrenalina del 20 % y la anfetamina no lo produce.

b) Incubando bretilio y el agonista adrenérgico juntos a 37° C y finalizando la incubación a los 5, 10 y 20 minutos. Los resultados se muestran en las figuras 9 y 10, en las que se observa que la noradre­nalina produce un desplazamiento máximo del 50 % a unas concentra­ciones 11 (.J..M de NA y 25 (.J..M de bretilio, desplazamiento que se reduce al 25 % a 11 (.J..M de NA y 12,5 (.J..M de bretilio y no es percep­tible apenas a 11 (.J..M de NA y 2,5 (.J..M de bretilio. Algo análogo ocurre con la adrenalina a las mismas concentraciones y el desplaza­miento es del 20 % en el primer caso, 8 % en el segundo e impercep­tible en el tercero. En el caso de la anfetamina es impercptible un desplazamiento en los márgenes ensayados.

De los resultados que presentamos en esta primera comunicación se puede deducir que el bretilio se fija de manera específica en bastante proporción. Esta fijación es reversible en presencia del bretilio frío. Por

A. oJEZ-CASCÓN. FIJACIÓN DE BRETILIO A FRACCIÓN DE MEliiBRANAS 39

el contrario, no se modifica en presencia de anfetamina, que es un adrenérgíco indirecto, ni en presencia de fenoxibenzamina, que es un bloquean te alfa.

I,Q

30

10

~ -- -- - - - - - - -- -- -- -- :'~.- -----o

3 4

FIG. 11

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Departament de Farmacología. Faculta! de Medicina. Universitat de Barcelona. Centre Coordina! del C.S.I.C.