1. OBJETO

1.1. Describir la formar de preparar el estndar de solucin Mc Farland.

2. DESRIPCIN 2.1. EQUIPOS Y MATERIALES:

Frascos volumtricos de 100 ml.

Pipetas automticas de 0.50 ml

Tubos de ensayo tapa rosca

Gradilla 2.2. REACTIVOS.

Acido sulfrico 95 -98 % (H2SO4)

Cloruro de bario dihidratado, p.a. (BaCl2.2H2O).

Agua destilada. 2.3. LA ESCALA Mc FARLAND La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina al 0.9% o solucin de peptona al 0.1% en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual). La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin bacteriana. Creamos 10 estndares (en la tabla aparece la composicin de estos) y por espectrofotometra, creamos una recta patrn, de forma que vamos a poder detectar la concentracin de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la bacteria, la formacin de agregados). La escala se basa en la capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico. La escala de MacFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato de bario con el nmero presente en la muestra

Mc Farland BaCl2 1% (p/v) H2SO4 1% (v/v) u.f.c/ml

0.5 0,5 99,5 1,5x108

1 0,1 9,9 3,0x108

2 0,2 9,8 6,0x108

3 0,3 9,7 9,0x108

4 0,4 9,6 1,2x109

5 0,5 9,5 1,5x109

6 0,6 9,4 1,8x109

7 0,7 9,3 2,1x109

8 0,8 9,2 2,4x109

9 0,9 9,1 2.7x109

10 1,0 9,0 3,0x109

2.4. PRERACION DE LA SOLUCION Mc FARLAN 0.5

Los estndares de turbidez de Mc Farland se utilizan para estandarizar el nmero de bacterias aproximado en una suspensin comparando la turbidez de la misma con la turbidez del estndar. Los estndares de Mc Farland se preparan agregndole cloruro de bario a una solucin de cido sulfrico para obtener un precipitado de sulfato de bario. Se pueden preparar estndares con varios grados de turbidez, ajustando los volmenes de ambos reactivos, lo que representa distintas concentraciones de bacterias. El estndar usado ms comnmente en el laboratorio de microbiologa para los mtodos de sensibilidad de rutina es de 0.5, el cual representa 1.5x10

8 bacterias

por ml.

Reactivos Acido sulfrico 1% v/v (H2SO4)

Agregar aproximadamente 90 ml de agua destilada en un frasco graduado de 100 ml.

Con una pipeta de 1 ml agregar 1 ml de H2SO4

Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar.

Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por ms de un ao.

Cloruro de Bario.2H20 (1.75% p/v) (BaCl2)

Pesar 1.175 g BaCl2. 2H2O y pasarlo a u frasco graduado de 100 ml.

Agregar aproximadamente 50 ml de agua destilada y mezclar bien hasta disolver.

Llevar a 100 ml de volumen con agua destilada y mezclar.

Se puede guardar en una botella de vidrio con tapa rosca por ms de un ao.

Procedimiento.

Agregar aproximadamente 85 ml de H2SO4 (1%, v/v) a un frasco graduado de 100 ml.

Con una pipeta de 0.5 ml agregar 0.5 ml de BaCl2.2H2O (1.175% p/p) gota a gota al H2SO4 (1%, v/v) manteniendo agitacin constante.

Llevar a 100 ml de volumen con H2SO4 (1%, v/v)

Examinar la solucin visualmente para asegurarse de que sea homognea sin precipitados visibles.

Fraccionar en tubos similares a los que se van a utilizar para preparar los inculos bacterianos (3-5 ml).

Cerrar los tubos y sellarlos con Parafilm o parafina.

Conservar en oscuridad a temperatura ambiente por 3 meses o ms.

Para tener una referencia de la turbidez, la solucin se le puede medir en un turbidmetro. Cuando se realice la preparacin de suspensin de microorganismos con equivalencia de 0.5 en la escala de Mc Farland se debe medir ambas soluciones, debindose obtener valores cercanos de turbidez.

Control de Calidad.

Cada vez que se a utilizar el estndar controlar si hay precipitados visibles y comprobarlo con un estndar que no este uso. Si se observan precipitados, descartar el estndar.

Controlar cualquier evidencia de evaporacin. Esto puede hacerse dibujando una lnea en el tubo sealando el menisco en el momento de llenar los tubos. Si al usarlo el nivel de lquido est por debajo de esa marca, descartar el estndar.

Luego de tres meses de uso leer la densidad ptica de un estndar o