SOLUCIONES DE AGILENT PARA METABOLOMICA … · PROGRAMA 10.00 Introducción. 10.15 Mass Hunter and METLIN Database Busqueda de compuestos e identificación en Base de ... Overall

SOLUCIONES DE

AGILENT PARA

METABOLOMICA

Y

PROTEOMICA

Herramientas de software

Integradas

15 Febrero 2011Page 1

Jaume C. Morales

LC/MS Product Specialist

Agilent Technologies

PROGRAMA10.00 Introducción.

10.15 Mass Hunter and METLIN Database

Busqueda de compuestos e identificación en Base de Datos/Libreria

10.45 Mass Profiler Professional / Pathway Analysis

Análisis estadístico/diferencial, identificación y localización en vías metabólias

11.15 Descanso / Café

11.30 Agilent Spectrum Mill Proteomics Software

Procesado de datos y Busqueda en librerias de peptidos/proteínas

Cuantificación diferecial con SILAC/ITRAQ labelling

12.00 Peptide Optimizer & MH QQQ Acq

Proteómica cuantitativa por DMRM

12.30 MasHunter BioConfirm

Caracterización más exacta y rápida de peptidos y proteinas.

13.00 Sesión de preguntas y cierre

ASMS Metabolomics Bottleneck Summary

2009 ASMS Metabolomics Survey Results

http://metabolomics.us/2009/ASMSMetabolomicsWorkshop/SurveyResults/

81% de los encuestados

confirman que los retos

son software NO hardware

1. Compound Identification – 35%

2. Biological Significance – 27%

3. Data Processing – 14%

4. Statistical Analysis – 5%

MassHunter: el software de MS más popular• Control, proceso y optimización adquisición datos de LC/MS, GC/MS and ICP-MS

• Cuantitativo: High-Throughput Quant con LC/GC-Q, QQQ, TOF, Q-TOF + UV

• Cualitativo: ID desconocidos, impurezas, confirmación formula molecular, cribados masivos,….

Mass Profiler Professional (MPP)• Análisis diferencial con PCA y ANOVA para descubrimiento y validación de biomarcadores.

• Comparación y Clasificación de muestras

• Análisis de Rutas Metabólicas (“Pathway Analysis” opcional

• METLIN accurate mass MS/MS library (PCDL)

Bases de Datos y Bibliotecas de Espectros de Compuestos

• Cribados masivos e ID de compuestos: Forénsicos, Tóxicos y Pesticidas con Bases de Datos

personalizables de masa exacta (PCD) + RT (AMRT) y bibliotecas de espectros (PCDLs)

Farma Workflows para ADME, Bioanálisis & Confirmación Compuestos

• MetID: Identificación de metabolitos exógenos conocidos Y desconocidos.

• BioConfirm: Caracterización de proteínas intactas, anticuerpos y péptidos sintéticos.

• Analytical Studio Reviewer (ASR): navegador resultados de pureza y confirmación. .

Nuevo PearlHunter Proteomics Workflow

• Spectrum Mill: ID de proteínas mediante BD, cuantificación con o sin marcado (“label-free”)

• MPP: para descubrimiento y validación de biomarcadores.

MassHunter Workstation: “From Ions to Answers”

Overview of Agilent

Metabolomics Workflow

Page 5

Agilent Metabolomics WorkflowG

CM

SLC

MS

Separate &

Detect

GC/MSD

GC-QQQ

LC-TOF/QTOF

LC-QQQ

Feature

Finding

Quantitate

MassHunter QualAMDIS or Find by

chromatographic

deconvolution

MassHunter QualMFE,

Find by Formula,

Find by Ion

Alignment &

Statistics

Mass Profiler

Professional

(MPP)

Identify

ID Browser

Pathways

Pathway module

Cytoscape

Mass Profiler

(MP)

Recursive

2nd pass extraction

with Find-by-Ion

MassHunter Qual

Aumento de productividad.El interés del usuario está en obtener rápidamente

toda la información disponible sobre los

compuestos de una muestra

• Revolucionario procesado de datos:

“compound-centric “

• Extrae automáticamente toda la

información disponible del compuesto, no

sólo masas y picos cromatográficos.

• Encuentra con fiabilidad:– Todos los compuestos ionizados en sus muestras,

– Las diferencias entre muestras o grupos de muestras.

• Fácilmente confirmar e identificar

desconocidos a través de:– Confirmar o Generar la fórmula molecular

– Búsqueda Bases de datos AMRT (m/z exacta+ Tiempo

retención

– Búsqueda en Bibliotecas de espectros de MS / MS.

MassHunter Qual

Mass Hunter QualBusqueda de compuestos e identificación

Permite ajustar el amplio elenco de

posibles tareas a las específicas

del usuario / instrumento

Plataforma cualitativa para

diferentes tipos de instrumentación

MS, MS/MS (UV y ADC)

CONFIGURABLE

Mass Hunter QualEntorno gráfico

Data

Navigator

Method

Explorer

Chromatogram

Results

Method

Editor Spectrum Results

Mass Hunter QualOrientado a compuestos

MS Targe MS/MS Auto MS/MS

LC MFE & FBFMFE, FBF & Find by

Target

MFE, FBF & Find By

Auto

GC Deconvolution Deconvolution Deconvolution

Diferentes algoritmos de búsqueda de compuestos según origen :

Mass Hunter QualFind Compounds by Chromatogram Deconvolution (GC/MS)

Algoritmo diseñado para datos adquiridos en un GC/MS tanto para MS como MSMS.

Similar a AMDIS, con discriminación de ruido, eliminación de artefactos y métricas de

picos.

Ejecuta secuencialmente :

1. Análisi del ruido

2. Percepción de compuestos.

3. Deconvolución espectral agrupando juntos aquellos iones con idéntico perfil de

pico.

Después de encontrar los compuestos, éstos pueden

identificarse a través de algoritmos de MH en librerias

espectrales (MH, NIST, Wiley, Fiehn….) y/o exportarlos a otros

programas (MPP, NIST, mzData, Xml…)

Mass Hunter QualFind Compounds by Target MS/MS (LC/MS)

Algoritmo diseñado para uso con datos LC-MS/MS adquiridos especificando un ion

precursor a un tiempo determinado, en un QTOF.

Mass Hunter QualFind Compounds by Target MS/MS (LC/MS)

Busca todos los espectros MS/MS para un único precursor m/z.

Identifica:

•El ion m/z precursor del que se ha hecho MS/MS,

•Los m/z de fragmentos del precursor, o las diferencias neutras respecto a éste

para espectros de pérdida o ganancia neutra.

Generando :

•Un cromatograma MSMS TIC de los fragmentos del precursor

•UN espectro MS/MS promedio

Los espectros MS/MS pueden buscarse en una Librería de Espectros

Los datos generados por Target MS/MS suelen tener un objetivo de

cuantificación (MH Quant) o bien Post-Identificación

Mass Hunter QualFind Compounds by Auto MS/MS (LC/MS)

Algoritmo diseñado para uso con datos LC-MS/MS provinientes de una adquisición de

datos “Data Dependant” en un QTOF.

MS

MSMS

Mass Hunter QualFind Compounds by Auto MS/MS (LC/MS)

Este modo de adquisición trabaja en base a los espectros de MS. El “Motor de

decisión” examina los espectros MS y en base a unos criterios, establecidos por el

usuario , selecciona candidatos a los que aplicar MSMS.

Identifica :

•La m/z del ion precursor para hacer MSMS.

•Los m/z de fragmentos del precursor, o las diferencias neutras respecto a éste

para espectros de pérdida o ganancia neutra.

Genera :

•un cromatograma MS y un espectro MS,

•un cromatograma MS/MS y un espectro MS/MS

Los datos adquiridos en Auto MSMS,por su alto contenido en

información suelen ser objeto de busqueda en librerias.

Mass Hunter QualFind Compounds by Formula (LC/MS)

Espectro real

Espectro Limpio


Algoritmo diseñado para uso con datos LC-MS proveniences de una adquisición datos

“Full Scan” MS en un TOF ó QTOF.


Este modo de adquisición trabaja en base a las Fórmulas elementales proporcionadas

por el usuario.

Se suministra el total de compuestos de los que se quiere confirmar su presencia.

MH extrae los EIC sumando todas las especies iónicas que pueden pertenecer a cada

compuesto (C12, C13, C14, Aductos e isótopos, multicargas, dimeros, etc….).

Esos EIC son integrados, extrayendo luego los espectros MS de sus picos y

confrontando los m/z y distribución isotópica medidos con los teóricos de la Fórmula

suministrada.

Algoritmo de ALTA sensibilidad, utilizado para screening o

confirmación de falsos negativos.

Mass Hunter QualFind Compounds by MFE (LC/MS)

Avanzado Algoritmo de Deconvolución. Búsqueda de compuestos desconocidos.

ESENCIAL en Metabolómica Masa exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados.

Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF


MFE, antes que nada, elimina el background persistente a lo largo del tiempo.


Luego, espectro X espectro busca relaciones entre formas iónicas gracias a la

masa exacta y confirma distribucón isotópica.

C12(M+H)+

C13(M+H)+

C14(M+H)+

C14(M+Na)+

C13(M+Na)+

C12(M+Na)+

Cl37(M+Na)+

Cl35(M+Na)+


A continuación confirma la presencia del compuesto por su perfil cromatográfico


Generando al final un listado de posibles compuestos “Features” listos para identifcar

o en bases de datos (METLIN, PCDB, CSV,…) o por generación de Fórmula (MFG), o bein

exportar a tratamiento estadístico (MPP)

15 Febrero 2011

MFE seguido de MFG – Excelente combinación para la identificación de un

desconocido.

Average error:

Standard deviation:

0.47 ppm

0.37 ppm

Mass Hunter QualIdentificación por MFG (LC/MS)

15 Febrero 2011

Monoisotopic mass

(varies in ppm)

Isotope spacing

(varies in ppm)

Isotope distribution

(varies in %)

Scoring based onMass Match +

Abund. Match +

Spacing

Match =

Overall Score

Sin el uso de la información isotópica, la identificación hubiera sido incorrecta!

Mass Hunter QualIdentificación por MFG (LC/MS)

METLIN Database

Aumento de productividad.

METLIN DataBase es la versión EDITABLE y

mejorada de Agilent de la biblioteca pública

Metlin.

Rápida Identificación de metabolitos así como

incorporación de nuevos, “personalizando” la

base de datos

Analisis de Metabolitos usando METLIN con

Tiempo de retención, Exactitud de masa y

Distribución Isotópica

METLINPersonal Compound Database

Base de datos específica para METABOLOMICA

• Instalada en el PC

• Contiene ~23.000 compuestos

– ~8000 lípidos añadidos de LipidMaps

• Busquedas manuales o automatizadas

– Basadas en masas monoisotópicas

• Editable

– Añadir compuestos

– Asignar tiempos de retención cromatográfico

a los metabolitos

– Crear bases de datos subsidarias

• Sincronizada com MassHunter

Exclusivo de Agilent

15 Febrero 2011

15 Febrero 2011

Mayor especificidad en la identificación

•Búsqueda de la masa exacta mono-isotópica

•Requiere tiempo de retención

•Cálculo de la fórmula empírica usando la distribución isotópica

•Generación de la fórmula empírica paradatos no identificados

•Adición del compuestos no identificados paraseguimiento futuro.

- tiempo de retención y fórmula propuesta

Molecular Formula and METLIN Personal Metabolite Database Matching Applied to the Identification of Compounds Generated by LC/TOF-MS, T. Sana et al, Journal of BiomolecularTechniques 1 9:258–266 2008

METLINPersonal Compound Database AMRT

AMRT Database Generation For METLIN PCDL

• Over 700 Standards for most common metabolite classes analyzed

•Simple linear gradient: 2% methanol to 98% methanol in 13 minutes, 6 minute hold at 98% methanol; Flow rate 0.6 mL/min

•Compatible with ESI/APCI and positive/negative ionization modes

•EIC of each standard is evaluated: Retention Time and Accurate Mass are added to the METLIN Personal Metabolite Database

20

40

60

80

100

Me

tha

nol %

2.1 x 30 mm, 3.5 µm SB-C8 Guard

2.1 x 50 mm, 1.8 µm SB-aq C18

METLINPersonal Compound Database AMRT

15 Febrero 2011

Librería de metabolitos específica para

LC-MS/MS Q-TOF • Librería y base de datos de masa exacta

LC-MS/MS

– Comparte contenido con la base de datos

METLIN AMRT

• Incluye espectros MS/MS con ESI en modo

positivo y negativo

• Los espectros MS/MS se generan partiendo

del ion monoisotópico

• Se recogen espectros a tres energías de

colisión distintas : 10, 20 and 40

• Espectros MS/MS de standards procesados

– Fragmentos corregidos en masa y

filtrados de ruido antes de ser añadidos.

• Identificación por doble busqueda en un

sentido y reverso

• Resultado de la identificación cuantificado

mediante un “Match Quality”

15 Febrero 2011

10, 20, 40 eV

La librería está siendo

desarrollada en colaboración

con Gary Siuzdak Exclusivo de Agilent

METLINAMRT & Spectra Library

Urine Analysis: Compound

Identification Using Accurate Mass

Retention Time (AMRT)

A m/z 206.08270 hay 6 distintos picos

cromatográficos

• METLIN utilizando un margen de error

de (+/- 5 ppm) proporciona 5

posibilidades

• Una mayor precisión o la distribución

isotópica no ayudaría pues las formulas

empíricas son idénticas C11H11NO3.

• La búsqueda en METLIN usando la

masa exacta Y el tiempo de retención

proporcionan una sóida posibilidad :

5-Methoxyindoleacetate5-Methoxyindoleacetate

EIC of 206.0827

15 Febrero 2011


Compound Identification In Urine:

Targeted MS/MS Fragment m/z

192.0655

5-Hydroxyindoleacetic acid

Reverse match score:

@ 10 eV = 99.4

@ 20 eV = 97.5

@ 40 eV = 91.1


15 Febrero 2011

Agilent Metabolomics WorkflowG

CM

SLC

MS

Separate &

Detect

GC/MSD

GC-QQQ

LC-TOF/QTOF

LC-QQQ

Feature

Finding

Quantitate

MassHunter QualAMDIS or Find by

chromatographic

deconvolution

MassHunter QualMFE,

Find by Formula,

Find by Ion

Alignment &

Statistics

Mass Profiler

Professional

(MPP)

Identify

ID Browser

Pathways

Pathway module

Cytoscape

Mass Profiler

(MP)

Recursive

2nd pass extraction

with Find-by-Ion

Mass Profiler Professional

Differential Analysis Software Solution

for Mass Spectral Data

15 Febrero 2011

Analisis Multivariante Metabólico

Objetivo: Detectar diferencias observadas de

fenotipo a nivel químico

El análisis multivariante es una herramienta

adecuada para detectar esas diferencias y

puede “puntuar” la importancia del metabolito

para el fenotipo.

Pero no explica la biología subyacente

Phosphoguanidinoacetate

Mass Profiler Professional

A new Compound Exchange File (.cef) enables recursive feature extraction

• Allows recursive workflow to improve differential analysis statistics

• Allows annotation with compound IDs and MS/MS spectra

• Enables mapping to biological pathways

• More automation and convenience for differential analysis workflow

MFE

GC/MS

LC/MS

MassHunter

Qual.d

Mass Profiler

Professional

Pathway

AnalysisCASID

Raw feature lists.cef .cef

.cef

.cef

Combined binned List

.CEF.CEF.cefRefined

feature lists

1

2

3

MassHunter

ID Browser

.cefDifferential features

4

.cef 5Annotated

compounds

1

3 FBI

Mass Profiler ProfessionalMPP Workflow

Project – Espacio de trabajo, contenedor de Experiments

Experiment – Colección de muestras analizadas en un conjunto

Parameter – Variable en un experimento (p.e. Tiempo o Temp)

Condition – Una o más muestras que representan un estado biológico

común (p.e. Tiempo 14h)

Interpretation – Muestras agrupadas basadas en Conditions. (p.e.

Tiempo vs Temp)

Entity – Entidad molecular para la cual se conoce tiempo de retención,

masa y abundancia . Puede ser “Identificada” o “NO Identificada”.

Technology – Registro contenedor de la información de todas las

Entities e información biológica sobre ellas (annotation)

Mass Profiler ProfessionalMPP Terminology

15 Febrero 2011

Interpretation 1: Define samples by

parameter GrapeCondition1: Cabernet Sauvignon (samples 1-4)

Condition2: Merlot (samples 5-8)

Condition3: Pinot Noir (samples 9-12)


parameter CountryCondition1: USA (samples 1,2,5,6,9,10)

Condition2: France (samples 3,4,7,8,11,12)


parameter Grape and CountryCondition1: Cabernet Sauvignon-USA (samples 1,2)

Condition2: Cabernet Sauvignon-France (samples 3,4)

Condition3: Merlot-USA (samples 5,6)

Condition4: Merlot-France (samples 7,8)

Condition5: Pinot Noir-USA (samples 9,10)

Condition6: Pinot Noir-France (samples 11,12)

Mass Profiler ProfessionalMPP Terminology

15 Febrero 2011

Experiment

Navigator

Legend

Window

Project

Navigator

Workflow

Browser

Status bar

Tool & Menu

bar

Mass Profiler ProfessionalMPP Interface

Desktop area with

views

Agilent LC/MS

Agilent GC/MS

Agilent QQQ

Generic (cvs, tsv, xls)

mzXML from non-Agilent

Experiment Creation

Data Load Filtering Experiment createdBaseliningNormalizationMass vs RT plot


Guided Workflow

Advanced Workflow

Nivel básico, inicial

Nivel avanzado, experto

Mass Profiler ProfessionalAlignment Summary – Experiment READY

15 Febrero 2011

Number of compounds found in

each sample is displayed.

A „flag‟ is automatically

assigned to each entity in each

sample:

Present – entity is detected and

abundance measured

Absent – entity is not found in

sample. Nominal abundance

value of 1.0 is given to these.

MassHunterQuant data – the

user can determine how flags

are assigned based on input

files (Present, Marginal, Absent)

Export for recursion possible

Total number of aligned

compounds found

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 1 : Summary Report

1. Summary Report

2. Experiment Grouping

3. Filter on Flags

4. Filter by Frequency

5. QC on Samples

6. Significance Analysis

7. Fold Change

8. ID Browser identification

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 2: Grouping

Filter on “Present” and “Marginal” (saturated entity)

- Can be used to filter out entities which are

rarely detected, therefore not very reliable

- Similar to filter by frequency

14502 entities retained out of 14502

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 3: Filter on Flags

1547 entities retained

out of 14502

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 4: Filter by Frequency

By default, each sample is plotted

according to its values for the first three

Principal Components

Principal Components are vectors that

capture the most variance in the data.

Assumption: samples within an

experimental condition should be more

similar to each other than to those from

different conditions.

Expect to see samples from the same

experimental condition to group closer to

each other than to samples of a different

condition

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 5: QC on Samples

PCA to verify quality of Samples and separation of groups

PCA Is a Variable Reduction Method

An eigenvalue-eigenvector decomposition is performed on the covariance matrix of the entity expression values around zero

The eigenvector corresponding to the largest eigenvalue is called the first principal component

Successive principal components are eigenvectors corresponding to each smaller eigenvalue

PC 2

PC 1

PCA to verify quality of Samples and separation of groups

Mass Profiler ProfessionalPCA is a variable reduction Method

Entity by Chance False Discovery Rate

Depending upon the

experimental grouping,

Mass Profiler

Professional performs

either T-test or Analysis of

Variance (ANOVA) based

on the samples.

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 6: Significance Analysis

2-way ANOVA 3-way ANOVA

T-test ANOVA

Statistical Tests

One-way Tests: Compare conditions defined by a single parameter (i.e

Grape)

Pinot NoirMerlot Merlot Pinot Noir Caber

Vintage

2004

2006X

Grape

Merlot

Pinot Noir

Country

USA

FranceX

N-way Tests: Compare conditions defined by 2 or more parameters

Grape

Merlot

Pinot Noir

Country

USA

FranceX

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Statistical Tests

Filter Sets Fold Change P> 2.0.. To more

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 7: Fold Change

Entities will be annotated upon return to MPP Program

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 8: ID Browser

Mass Profiler ProfessionalGuided Workflow Analysis – Step 8: ID Browser - Return

After Guided Wizard

1-Choose Interpretation

2-Choose Analysis

3-Choose Plot

Mass Profiler ProfessionalAfter Guided Worklfow

Listing EntitiesMass Profiler ProfessionalListing Entities

Exporting Entities as Inclusion List

Inclusion list for Target MS/MS on QTOF

Mass Profiler ProfessionalExporting Entities

Agilent LC/MS

Agilent GC/MS

Agilent QQQ

Generic (cvs, tsv, xls)

mzXML from non-Agilent

Experiment Creation

Data Load Filtering Experiment createdBaseliningNormalizationMass vs RT plot


Guided Workflow

Advanced Workflow

Nivel básico, inicial

Nivel avanzado, experto

Advanced Analysis

• Use of Experiment Browser

•User defined Interpretations

•User defined Analysis

•Free use of Advanced

tools & Utilities

15 Febrero 2011

Experiment Browser is designed

following usual workflow

Mass Profiler ProfessionalMPP Advanced Workflow

Advanced Analysis

15 Febrero 2011

Mass Profiler ProfessionalExperiment Setup

Quick Start Guide / Experiment Grouping / Create Interpretation

Create conditions and

Populate values

Define Interpretations,

group samples

Quality

Control on

Entities

Quality

Control on

Samples

Mass Profiler ProfessionalQualty control

Goal: To remove poor quality or outlying samples before analysis

Assumption: Samples within the same experimental condition should be more similar in their global abundance profiles than samples from other experimental conditions

Goal: To remove entities which do not

have reproducible measurements

within a condition (%CV or SD) or

entities which are rarely detected –

therefore not very reliable

15 Febrero 2011

Advanced Analysis Workflow : Analysis

Tools for finding:

Which entities are differentially expressed?

What patterns of expression are there in the experiment?

Mass Profiler ProfessionalAnalysis

Parametric Test

Bell shaped distribution symmetrical about the

mean

MPP assume that you have sampled from populations where expression of Entity

X follows a normal distribution

Expression of Entity X

Fre

qu

en

cy

Mass Profiler ProfessionalAnalysis- Parametric Test

Parametric test Non- Parametric test

Does not assume normal distribution

Does not assume equal variances

Ranks the order of normalized data across

conditions for analyses

With small number of replicates, non-

parametric tests have less statistical power

than the corresponding parametric tests

P-value Calculation Methods

Asymptotic Method Permutation Method

5HT1c 0.002364

NFL 0.002649

NMDA2C 0.017181

aFGF 0.027544

GRa3 0.041179

actin 0.045342

nAChRd 0.046372

EGFR 0.0468

bFGF 0.087842

5HT2 0.106591

Brm 0.137903

SOD 0.147089

mGluR2 0.174708

IGF.I 0.223558

SC2 0.274809

trkC 0.288776

mGluR1 0.313801

SC6 0.343059

CNTFR 0.354717

pre-GAD67 0.366955

BDNF.rat 0.417615

GDNF 0.421125

IP3R2 0.421308

L1 0.443525

GAD67 0.462416

H2AZ 0.561907

IP3R1 0.573717

MK2 0.630177

CCO2 0.640797

mGluR3 0.654866

PDGFa 0.659352

IGF.II 0.683554

CNTF 0.690512

nAChRe 0.701041

IGFR2 0.728141

GAP43 0.732078

ODC 0.745628

SC1 0.74575

NT3 0.78811

PTN 0.795557

trk 0.82403

mGluR5 0.8305

cjun 0.839991

Ins2 0.841945

MAP2 0.851833

neno 0.879299

GRb1 0.888485

TCP 0.892361

GRb2 0.900601

S100beta 0.930265

Truly

differentially

expressed

Unchanged

between

populations

15 Febrero 2011

Mass Profiler ProfessionalP-value Cut-off

What type of error you are more comfortable with

Type I Error (false positive): Calling entities differentially

expressed when they really are not

Type II Error (false negative):

Not calling entities differentially expressed when they really are

Choice of cut-off trades off between type I and type II errors

p-value=0.05

Which MTC to Use?

> Family-wise Error Rate (FWER) - Very conservative and does not tolerate any false positives

> False Discovery Rate (FDR) - False positives a percentage of called entities

> None - False positives a percentage of entities being tested

More false

negatives

More false

positives

Bonferonni FWER

Bonferonni Holm FWER

Benjamini Hochberg FDR

No Correction

Mass Profiler ProfessionalMultiple Testing Correction

1 entity = 1 individual test

• 10000 entities = 10000 tests

• With p-value = 0.05 and analyzing 10000 entities: 500 entities (0.05 x 10000) likely to appear significant by chance

– Number of false positives increases proportionally to number of tests being performed

Performing multiple testing correction further decreases the number of false positives

Which MTC to Use?Mass Profiler ProfessionalPost Hoc Tests

Decreases rate of false positives, only available in MPP for one-way ANOVA tests

MPP test options:

Tukey‟s Honestly Significant Difference (HSD) testStudent-Newman-Keuls (SNK) test

Blue boxes contain

entities whose

expression differs

significantly between

the two conditions

Pink boxes contain

entities whose

expression does not

differ significantly

between the two

conditions

15 Febrero 2011

Clustering Background

Clustering is an unsupervised method for identifying patterns

within datasets.

Mass Profiler ProfessionalCLUSTERING

1) What do you want to cluster together?

2) What similarity metric to select?

3) What clustering algorithm will be applied?

15 Febrero 2011

Hierarchical Clustering

Overview:

• Hierarchical clustering algorithm can be used to group entities and conditions based on the similarity of their expression profiles

• Performing Hierarchical clustering on both entities and conditions result in a 2-dimensional dendrogram

• Most similar profiles are joined together into a group and groups are further joined in a tree structure until all data forms a single group

Mass Profiler ProfessionalHierarchical CLUSTERING

15 Febrero 2011

K-means Clustering

Overview:

• User chooses K, the

number of clusters to

partition selected entities

or conditions into

• Algorithm attempts to

minimize intra-cluster

variability and maximize

inter-cluster variability

Groups of Compounds that behave similarly

Mass Profiler ProfessionalK-means CLUSTERING

15 Febrero 2011

Mass Profiler ProfessionalPathway Analysis

Two types of pathway analysis in MPP:

1. Find Significant Pathways:

Is there a significant enrichment of my entities of

interest in a particular pathway?

2. Pathway Analysis:

How do my entities of interest interact in a biochemical network?

Pathway Anaylsis allows for Finding Biological Relevance of

differencial entities

15 Febrero 2011

Importing and Visualizing BioPAX Pathways

BioPAX (Biological Pathway Exchange) is a standard pathway data exchange format.

Pathways in the biopax format will have the extension .owl

MPP users can import pathway data standard pathway sites in BioPAX level 1 or 2

format

• www.pathguide.org is a useful website which list repositories of pathways

Databases for any organism of interest can be created using the Biopax files- Rice,

zebra fish, chimpanzee, dog

Mass Profiler ProfessionalPathway Analysis

http://www.pathguide.org/

15 Febrero 2011

Find Significant Pathways Tool

Is there a significant enrichment of my entities of interest in a particular pathway?

Analysis will be performed on every pathway that has been imported into MPP for the

matching organism and every pathway created in MPP

Mass Profiler ProfessionalPathway Analysis – Find Significant Pathway

15 Febrero 2011

Pathway Viewer

Layout of entities can be changed – 6 options including cellular view

Mass Profiler ProfessionalPathway Viewer

0

500

1000

1500

2000

2500

L-ornithine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

L-arginine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

citrulline

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw0

500

1000

1500

2000

2500

L-ornithine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

L-Arg (Arginine)OrnithineCitrulline

Pathway analysis in MPP showing differential abundances for three compounds in the urea cycle

Infected

Blood cells

Non infected

Mass Profiler ProfessionalPathway Viewer

15 Febrero 2011

Node-Legend Edges-Legend Relation-Legend

Mass Profiler ProfessionalPathway Viewer - Legends

15 Febrero 2011

Pathway Analysis using Interaction Database

Pathway Analysis in MPP can be used to find relationships between entities of interest. These

may be direct interactions or other relationships such as common regulators or common targets.

Pathway Analysis utilizes preloaded interaction databases. The information is extracted from

literature using Natural Language Processing (NLP) algorithms to search PubMed abstracts.

These databases contain details of biological and chemical entities, relationships between

entities, and properties of these entities

These must be downloaded from the Agilent server and are currently available for the following

organisms:

• Human, Mouse, Rat, Arabidopsis, Drosophila, Yeast, E.coli, Rice, C.elegans, Plasmodium

falciparum, Mycobacterium tuberculosis, B. Subtilis, C.reinhardtii, Zea mays, N.crassa

The protein sections of these databases are organism specific. All other data is contained in the

generic section of the database.

Mass Profiler ProfessionalPathway Analysis – Using Interaction Data Base

15 Febrero 2011

Relation from NLP inference

UBE2L3 up-regulates the

expression of MT1G. VEGFA

modulates this up-regulation of

expression

UBE2L3 up-regulates the

expression of MT1G. VEGFA

modulates this up-regulation of

expression

Mass Profiler ProfessionalPathway Analysis – Using Interaction Data Base

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