Solunum Sistemi HastalıklarındaDeneysel Hayvan Modelleri

veKliniğe Uyarlanması

Dr. Sibel Atış

Solunum Sistemi HastalıklarındaDeneysel Hayvan Modelleri

İnsanlar neden bize bu kadar benziyor ??

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Modelleri:

Kullanım Amaçları

• fonksiyonel ve yapısal değişikliklerin izlenmesi• etyopatogenezlerinin aydınlatılması• inflamatuvar süreçlerin belirlenmesi• havayolu davranışlarındaki değişimlerin

gözlenmesi• yeni bir molekülün etkilerinin değerlendirilmesi • tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde

Solunum sistemi hastalıklarında;

Hayvan modeli seçimi

Model oluşturmak için verilecek

madde

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Modelleri:

Kliniğe Uyarlanması

• Hayvan modeli seçimi:Hayvan türüPatogenez (insana benzerlik?)Çalışma hedefleri Kullanılacak gereç ve yöntemler Hayvanın kolay elde edilebilmesi (Fiyat, barınma)

• Model oluşturmada verilecek madde ve ilişkili sistem:Ajanın verilme şekliDozuAjanın formu

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Modeli Çalışmaları:

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Modeli Çalışmaları:

Hayvan Modeli Seçimi

Hayvan türü

Patogenez (insana benzerlik?)

Çalışma hedefleri

Kullanılacak gereç ve yöntemler (uygulanacak girişimler v.s)

Hayvanın kolay elde edilebilmesi (Fiyat, barınma)

Seçim Kriterleri:

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

Uygun hayvan türünün seçimi: – Model oluşturmada ajana duyarlılık açısından

Patogenez (insana benzerlik?)Çalışma hedefleri Kullanılacak gereç ve yöntemler (uygulanacak girişimler v.s)Fiyat

Solunumsal hastalık modellerinde verilen ajana duyarlılık açısından uygun hayvan türleri

Hastalık Uygun Hayvan TürleriAstım Fareler (mouse, murine), kobay

(guinea pig), sıçan (rat), köpek, kedi, maymun, domuz

KOAH Kemirgenler, köpek, maymun, domuz

Akciğer Kanseri Fare (mouse, murine), kobay

Tüberküloz Fare, kobay, sıçan, tavşan, primatlar (maymun)

Bakteriyel/viral Pnömoni Kemirgenler ve primatlar

İnterstisyelpnömonitis/fibroz

Kemirgenler, tavşan, köpek, koyun, primatlar (maymun)

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

Hayvan türü

Patogenez: İnsanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından • Tam benzerlik gösteren modeller• Kısmi benzerlik gösteren modeller (tüm

benzerlik kriterlerini taşımayanlar)

Çalışma hedefleri Kullanılacak gereç ve yöntemler Fiyat

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Astım hayvan modelleri:

Antijenle oluşturulan astım hayvan modellerinin tümünde insan astımının karakteristik özellikleri olan;

- havayolu aşırı duyarlılığı,

- havayollarında eozinofilikinflamasyon,

- mukus hipersekresyonu,

- yüksek IgE düzeyleri

Astım hayvan modelleri:- Farelerde oluşturulan alerjik

astım modelleri insan astımınıoldukça iyi taklit etmektedir.

- Fare modellerinde: diğer bulgulara ek olarak, allerjenprovakasyonunu takiben akciğerlerde aktive Th2 hücre veya dendritikhüc.infiltrasyonu

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Astım hayvan modelleri:Spontan olarak astım gelişen hayvan modellleri:

- “Ascaris”e allerjik domuzlar

- Pireye allerjik köpekler

- Nakavt fareler:(allerjen sensitizasyongerekmeden astım oluşabilmektebu yüzden intrensek astım içiniyi bir model oluşturmakta)

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

C57BL/6 ve BALB/c farelerde allerjik astım oluşturan protokoller

İmmünizasyon Aerosol allerjen

OVA 25 μg/alum i.p., 0 & 5. gün 1% OVA, 60 dk. 2 kez/gün, 12&13. gün

OVA 10 μg in PBS i.p., 0 & 21. gün 1% OVA, 60 dk. 2 kez/gün, 28&29. gün

OVA sunan dendritik hücre, i.p.,0. gün

1% OVA, 60 dak. 2 kez/gün, 7 & 8. gün

Koagüle yumurta beyazı implantı, s.c. , 0. gün

1% OVA, dak. 2 kez/gün, 10&11. gün

Astım hayvan modelleri:

• Farelerde mesleksel astım modeli:– Toluene diisocyanate

– Trimellitic anhydride (TMA), solunum duyarlaştırıcısı(Daha fazla solunum cevabı)

– 1-chloro-2,4- dinitrobenzene (DNCB), dermalduyarlaştırıcı.

(Vanoirbeek JAJ, et al, J Allergy Clin Immunol 2006)

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:Kullanılan protokolün çeşidine ve maruziyetin süresine göre oluşan lezyonlar ve derecesi bazı farklılıklar göstermekle birlikte temelde benzerlikler göstermektedir.

Deneysel amfizem modeli oluşturmada kullanılan metotlar:

1) Doku yıkımı yapan enzimler (proteinazlar) ya dakimyasallar ve partiküller gibi zararlı ajanların egzojen olarak verilmesi

2) Sigara dumanı maruziyeti

3) Genetik müdahale

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:1) Proteinazlar ya da egzojen ajanlarla

• Porcine pancreatic elastase (PPE), papain ve insan nötrofil elastazı gibi proteinazlarınintrapulmoner verilmesi ile panasiner tipte amfizem

• PPE ile oluşturulan amfizem, sekretuvar hücre metaplazisi, solunum fonksiyon bozukluğu, hipoksemi, sağ ventrikül hipertrofisi gibi insan KOAH’nın karakteristik özelliklerini göstermektedir.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:İnflamasyon ve akciğer hasarı oluşturmada kullanılan çeşitli egzojen ajanlar:

Tekrarlayan endotoksin: nötrofil ve aktive makrofaj birikimiNitrojen dioksit gibi oksidanlar:akciğer hasarıTekrarlayan uzun süreli nitrojen dioksit:fokal amfizemOzon: fibrozisKadmiyum klorid: fibrozisin baskın olduğu amfizemKömür tozu ve silika:fokal amfizem

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:

2) Sigara dumanı ile oluşturulan KOAH modeli

• Hayvanlarda oluşturulan en iyi KOAH modelidir.• Kronik sigara dumanına maruz bırakılan hayvanlarda

amfizem gelişimi aşikar. Küçük hava yolu lezyonları ve sekretuar hücre metaplazisi insanlardakine oldukça benzer

• İnsanlar ve hayvanlar arasında bronşial glandlardakideğişimler açısından ise büyük farklar var. (anatomik farklılıktan kaynaklanabilir)

• Sitokin profili, hücre proliferasyonu ve apopitozis açısından insanlar ve hayvanlar arasındaki benzerlikler/farklılıklar hakkındaki bilgiler ise oldukça sınırlıdır.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:Sigara dumanı ile oluşturulan KOAH modeli

KOAH hayvan modelleri:Sigara dumanı ile oluşturulan modellerde önemli noktalar:

a) Amfizem lezyonların oluşumu için zaman gerekli:• Hayvandan hayvana, • Maruziyet miktarına (sigara dozu) • Maruziyet metoduna (nazal yada tüm vücut) Gerekli süre en az 4 ay (bazı türlerde 12 ay ↑)

b) Seçilecek hayvan ve cinsi önemli.• Köpek: akciğer parankim lezyonları insan amfizemini tam

olarak taklit eder. Diğer hayvanlar tam taklit edemez.• Kobay modelleri: sigara dumanı ile vazküler değişiklikler • Sıçan modelleri: bu özellik bulunmaz

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

KOAH hayvan modelleri:3) Genetik müdahale ile oluşturulan amfizem modeli:

- Nakavt fareler- Transgenic” fareler

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Akciğer kanseri modelleri:Farelerde tanımlanmış çeşitli akciğer kanseri modelleri:

1) Duyarlı cins farelerde spontan olarak akciğer kanseri gelişen spontan modeller

2) Kimyasal olarak tam karsinojenlerle oluşturulan modeller

3) Sigara dumanına maruziyet ile oluşturulan modeller

4) “Transgenic” ve nakavt modeller

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Akciğer kanseri modelleri:Farelerde spontan olarak gelişen akciğer kanserlerinin morfolojik, histopatolojik ve moleküler özellikleri insan adenokanserlerine benzer.

Günümüzdeki küçük hücre dışı akc. kanseri (KHDAK) modelleri nadiren metastaz özelliği göstermektedir.

Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) için fare modelleri metastaz özelliği dahil insan küçük hücreli akciğer kanserlerinin pek çok özelliğini göstermektedir.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Akciğer kanseri modelleri:

Gerek KHAK gerekse de KHDAK modellerinde kliniğe uyarlanmasıgereken en önemli nokta: radyosensitivitelerinin vekemosensitivitelerinin saptanması

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Tüberküloz modelleri:İlk olarak, Robert Koch, deneysel olarak farelerde M. tuberculosis inokülasyonunun insanlardaki doğal hastalığa benzer lezyonlara yol açtığını göstermiştir.

Çeşitli hayvanlarda M. tuberculosis kültürleriyle enfeksiyon saptanmıştır.

Ancak enfekte insanlar ve hayvanlardan alınan örneklerin incelemeleri farklı hayvan türlerinde farklı paternde patolojik reaksiyonlar ortaya çıktığını göstermiştir.

Kobaylar doğuştan duyarlı iken insanlar, fareler ve tavşanlar genotiplerine bağlı olarak çeşitli derecelerde dirençgösterirler.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Laboratuar hayvanlarının tüberküloz patogenezi açısından karşılaştırılması

Özellik Fare Kobay Tavşan Maymun

Hücreselimmünite İyi Zayıf İyi Zayıf

Kazeözdoku Az Çok Orta Çok

Hastalık yayılımı

Ölüme dahi yolaçabilengranülomlar

Hematojenyayılım;Yaygın kazeöznekrozlaakciğerlerdedestrüksiyon

Kaviteformasyonu ve bronşialyayılımharicinde hastalık iyileşir.

Hematojenyayılım; yaygınkazeöznekrozla akciğerlerdedestrüksiyon

Pnömoni modelleri:Farelerde en iyi tanımlanmış ve en sık kullanılan bakteriyel pnömoni modelleri (insanlardakine benzer olarak):• S. pneumoniae, • K. pneumoniae, • P. aeruginosa ile oluşturulan pnömonilerdir.

Bakteriyel pnömoni, şu şekillerde oluşturulabilir:1) İstenen sayıda bakteri içeren küçük volümde bir sıvının

intratrakeal bir kateter yardımıyla verilmesiyle2) Burnuna bakterinin direkt olarak verilmesi ile: noninvaziv

ve pulmoner enfeks. oranı %100’e yakın3) Farenin tüm vücudunun içine girdiği bir kabinde aerosolşeklinde bakteriye maruz bırakılması ile

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Pnömoni modelleri:Viral pnömoni modelleri:

Hiçbir hayvan modeli insan viral pnömonilerindeki (RSV gibi) klinik spektrumu tam olarak gösterememektedir.

İnsan RSV hastalığı benzeri ancak primatlarda görülebilir. Ancak pahalı ve büyük hayvanlar olduğu için elde etme zorlukları var.

Gen teknolojilerindek, gelişmeler sayesinde kemirgen modelleri arasında, BALB/c fareler preklinik aşıçalışmalarında başarıyla kullanılmaktadır.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

İntersitisyel pnömonitis/fibrozismodelleri:

Hiçbir hayvan modeli insanlarda gözlenen hastalığın klinik seyir veya histopatolojisini tam güvenilir olarak göstermez. Bununla birlikte, tüm bu modeller akciğer parankiminde genel birfibrozisle sonuçlanır.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

İntersitisyel pnömonitis/fibrozismodelleri:

Çeşitli hayvan türlerinde ve çok sayıda egzojen ajanla pulmoner fibrozis modeli oluşturulabilir. Bleomisin ile oluşturulan pulmoner fibrozis modeli en sık kullanılanıdır.

Olayı başlatan etyolojik ajandan bağımsız olarak, herhangi bir modelde dikkate alınması gereken en önemli nokta, modelin fibrotik insan akciğerinde görüldüğü gibi uzun süreli kalıcı lezyonları oluşturma kapasitesidir.

Patogenez: insanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modeller

Pulmoner Fibrozis - Hayvan Modelleri

Egzojen ajan / yaklaşım Doku hasarının oluşum şekli Hayvan türü

BleomisinProinflamatuar, fibrojenik sitokinsalınımına yol açarak akc.de gentranskripsiyon paternini değiştirir

Fare, sıçan, hamster, tavşan, köpek, primat

İnorganik partiküller (silika, asbest)

Tip 4 hipersensitivite reaks.(Granülom formasyonu ile Birlikte veya birlikte olmadan)

Fare, sıçan, hamster, tavşan, koyun

Radyasyon Serbest radikaller aracılı DNA hasarı

Fare, sıçan, tavşan, köpek, primat, koyun

Gen transferi (TGF-β, IL-1β, GM-CSF)

Spesifik sitokin yolunun akışaşağı aktivasyonu Fare, sıçan

Fluoresceinisothiocyanat

Tam olarak anlaşılmamış. Tahmin: T hücrelerden bağımsız Fare

Vanadium pentoxide Tam olarak anlaşılmamış. İnorganik bir metal oksit Fare, sıçan

Haptenik antigenler(trinitrobenzensulfonik asit bileşikleri)

Hatırlanan hücre aracılı immünCevap Fare, hamster

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

Hayvan türü

Patogenez

Çalışma hedefleri (ve çalışmada değerlendirilmesi amaçlanan parametreler?)

Kullanılacak gereç ve yöntemler Fiyat

Çalışma hedeflerine göre model seçimi

Çalışma hedefleri:

Sürvi / mortalitePatogenez/patolojik süreçlerKlinik Gözlem

- Pnömoni- Solunumsal ve/veya diğer semptom ve bulgular (ateş vs.)

Klinik Biyokimya (KC fonks.test, inflamasyon belirteçleri v.s)Bakteriyemi / ViremiFonksiyonel / fizyolojik değerlendirmeBir molekül veya farmakolojik bir ajanın etkinliğiAşı etkinlik değerlendirmesi

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

Hayvan türü

Patogenez

Çalışma hedefleri

Kullanılacak gereç ve yöntemler- Uygulanacak girişimler

Fiyat

Çalışmada kullanılacak gereç ve yöntemlere göre model seçimi

Gerekli gereç ve yöntemler:– Göğüs Radyografileri

• Daha büyük hayvan modelleri tercih.

– Tanısal girişimler• Bronkoskopi, BAL,pulmoner kateterizasyon

– Fizyolojik izlem• SFT, elektrofizyoloji

– Bir maddeye maruziyet• İnhalasyon (Sadece baş, sadece burun veya tüm vücut)• Diğer (Parenteral, Oral, İntraperitoneal)

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

Hayvan türü

Patogenez

Çalışma hedefleri Kullanılacak gereç ve yöntemler

Hayvanın kolay elde edilebilmesi (Fiyat, barınma v.s)

• Hayvan Fiyatları

– Ödenek sorunu: Nadiren limitsiz ödenek– İstatistiksel değerlendirmede çalışmaya alınacak

hayvan sayısı? - anlaşılmaya her zaman varılamaz– Fiyat Karşılaştırması

• Maymunlar ~ $3,500-$5,000• Tavşan ~ $90-$100• Kobay ~ $45-$55• Sıçan ~ $25• Fare ~ $5• Genotipik olarak özelleştirilmiş hayvanlar–daha pahalı

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları: Hayvan Modeli Seçim Kriterleri

• Model oluşturmada verilecek madde ile ilişkili sistem:

Hayvan modeli için uygun doz• Sensitizasyonu sağlama, letal doz bilinmeli

Ajanın verilme şekli• IM, SQ, Oral, Nazal, Aerosol

Ajanın cinsi veya formu• mikrobiyal bir ajan verilecekse serotipi, enfekte

etme olasılığı v.s önemli

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları:

Model oluşturmada verilecek madde:

Ajanın cinsi veya formu (Kullanılan ajanlar)• Sensitize edici ajanlar (antijenler, allerjenler v.s)• Gazlar; ozon, NO2, SO2 vb• Partiküller; PM, çevresel partiküller, karbon, DEP,

nanopartiküller, asbest partikülleri vs• Sigara dumanı, ürünleri• Diğer toksik ajanlar• Mikrobiyal ajanlar• Lipopolisakkarit (selektif pulmoner nötrofiliye yolaçar)• Çeşitli kanserojenler

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları:

Model oluşturmada verilecek madde:

Ajanın verilme şekli

Solunum Sistemi Hastalıkları ile İlgili Deneysel Hayvan Çalışmaları:

Model oluşturmada verilecek madde:

Hayvan Maruziyet Üniteleri

Birden Fazla Hayvan İçin Tasarlanmış Kabinler

Tek Hayvan maruziyetdüzenekleri

SONUÇLAR

Solunum sistemi hastalıklarında; etyopatogenezve yeni bir tedavi ajanının etkileri başta olmak üzere daha birçok özellik hakkında detaylı bir değerlendirme imkanı verdiği için in vivo hayvan modellerine gereksinim vardır.

Solunum sistemi hastalığı ile ilgili deneysel bir hayvan modeli oluştururken, bu modelin insanlardaki kliniğe en iyi şekilde uyarlanabilmesi açısından hayvan modelinin seçimi ve model oluşturmada seçilecek ajan oldukça önemlidir.

SONUÇLAR

Hayvan modellerinin bir takım kısıtlılıklarının da olduğu unutulmamalıdır.

Spontan olarak solunumsal hastalık gelişen model oldukça azdır. Hayvan modelleri ister istemez solunum sistemi hastalığının tam fenotipik özelliklerini göstermez.

Her bir hayvan türünün kendine göre zayıf ve güçlüyanları olup, araştırıcı bunlar arasından test edeceği hipotez açısından en uygun modeli seçebilmelidir.

TeTeşşekkekküürlerrler……DoDoçç.Dr.Dr. Sibel ATI. Sibel ATIŞŞ

SorularSorular ????