PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM

Biológiai Doktori Iskola

Az Eisenia fetida coelomasejtjei: struktúra, funkció, eredet

PhD értekezés

Somogyi Ildikó

Témavezetők:

Dr. (habil) Pollák Edit egyetemi docens

Dr. (habil) Molnár László egyetemi docens

................................. ................................. ....................................

Témavezetők aláírás Iskolavezető aláírása

Pécs, 2012

2

Tartalomjegyzék

1. Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................................... 4

2. Bevezetés ............................................................................................................................................. 6

2.1. Az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei ................................................................................ 7

2.1.1. Morfológiai jellegzetességek ................................................................................................. 8

2.1.2. A coelomasejtek eredete ...................................................................................................... 18

2.1.3. A coelomasejtek funkciói .................................................................................................... 20

2.2. A gyűrűsférgek immunrendszere ............................................................................................... 21

2.3. Citotoxicitás ............................................................................................................................... 24

2.4. A gyűrűsférgek regenerációja..................................................................................................... 26

2.5. Neuroimmun kölcsönhatások ..................................................................................................... 27

3. Célkitűzések ...................................................................................................................................... 31

4. Anyagok és módszerek ...................................................................................................................... 33

4.1. A kísérleti állatok tartása ............................................................................................................ 33

4.2. A coelomasejtek izolálása .......................................................................................................... 33

4.3. Egér agy és hipofízis kiboncolása a Western blot analízis kontroll mintáihoz .......................... 33

4.4. Fénymikroszkópos hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatok ..................................................... 34

4.4.1. May-Grünwald Giemsa (Pappenheim-féle panoptikus festés) ............................................ 34

4.4.2. Hematoxilin-eozin festés ..................................................................................................... 34

4.4.3. Perjódsav-Schiff-reakció ..................................................................................................... 34

4.4.4. Szudánfekete festés ............................................................................................................. 35

4.4.5. Akridinoranzs festés ............................................................................................................ 35

4.5. Funkcionális vizsgálatok ............................................................................................................ 36

4.5.1. A coelomasejtek szerepének vizsgálata a regeneráció folyamatában .................................. 36

4.5.2. Birka vörösvértestek fagocitózisának vizsgálata ................................................................. 39

4.5.3. Citotoxicitás vizsgálata ........................................................................................................ 39

4.6. Ultrastruktúrális vizsgálatok ....................................................................................................... 40

4.7. Dokumentáció, képfeldolgozás, számítógépes utómunkálatok .................................................. 41

5. Eredmények ....................................................................................................................................... 42

5.1. Intakt állatok coelomasejtjeinek morfológiai leírása .................................................................. 42

5.1.1. Az eleocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése .................................................... 42

5.1.2. Az amoebocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése .............................................. 46

5.1.3. A granulocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése ................................................ 50

5.1.4. Bazofil citoplazmájú sejtek ................................................................................................. 53

5.1.5. Lebenyezett sejtmagvú coelomasejtek ................................................................................ 54

3

5.1.6. Korábbról nem ismert sejttípusok a coelomában ................................................................ 56

5.1.7. Az eleocyták és a chloragogén eredetű sejttöredékek kialakulása ...................................... 57

5.2. A coelomasejtek funkcionális vizsgálata.................................................................................... 59

5.2.1. A coelomasejtek szerepe a regeneráció folyamatában ........................................................ 59

5.2.2. A fagocitózis folyamatának vizsgálata ................................................................................ 71

5.2.3. Citotoxicitás jelensége coelomasejt-lizátummal kezelt sejtvonalon.................................... 73

6. Az eredmények megbeszélése ........................................................................................................... 77

6.1. Eleocyták .................................................................................................................................... 77

6.2. Amoebocyták ............................................................................................................................. 78

6.3. Granulocyták .............................................................................................................................. 80

6.4. Bazofil sejtek .............................................................................................................................. 83

6.5. Egyéb sejttípusok ....................................................................................................................... 83

6.6. Funkcionális kapcsolatok ........................................................................................................... 84

7. Összefoglalás ..................................................................................................................................... 88

8. Summary ........................................................................................................................................... 89

9. Köszönetnyilvánítás .......................................................................................................................... 90

10. Irodalomjegyzék .............................................................................................................................. 91

11. Publikációs jegyzék ....................................................................................................................... 101

4

1. Rövidítések jegyzéke

AgNP – ezüst-nanopartikulum

AO – akridinoranzs (Acridine Orange)

cAMP – ciklikus adenozin-monofoszfát

CCF – coeloma citolítikus faktor

CCL – coelomasejt-lizátum

DAB – 3,3’ diaminobenzidin

DER – durva felszínű endoplazmatikus retikulum

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium

EP - eiseniapore

FM - fénymikroszkóp

GA – glutár-aldehid

HE – hematoxilin-eozin

LBSS - Lumbricus Balanced Salt Solution

LPS - lipopoliszacharid

MGG – May-Grünwald-Giemsa

NK – Natural Killer

PACAP – hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid (pituitary adenylate cyclase-activating

peptide)

PAC1R – PACAP 1. típusú receptora

PAS – Perjódsav - Schiff

PB – foszfát puffer (phosphate buffer)

PBS - phosphate-buffered saline solution

5

PFA - paraformaldehid

PLC – foszfolipáz C

RIA - radioimmunoassay

RIPA – Radio Immuno Precipitation Assay

SEM – scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp

SPI – szerin-proteáz inhibitor

TBS – Tris-Buffered Saline

TEM – transzmissziós elektronmikroszkóp

TNF – tumor nekrózis faktor

VIP - vasoactive intestinal peptide

6

2. Bevezetés

A gerinctelen állatok testfelépítésének és életfolyamatainak megismerése részben a

filogenezis folyamatának alaposabb megismerését biztosíthatja számunkra. Másrészt

elősegítheti olyan biológiai jelenségek alapjainak a feltárását is, amelyek a különböző

fejlettségi szintű állatcsoportokban általánosan előfordulnak. A bonyolultabb testfelépítésű

szervezetekben, így a gerincesekben egyes jelenségek (pl. regeneráció, öröklődés,

egyedfejlődési folyamatok, szöveti differenciálódás stb.) nehezebben, esetenként magasabb

költségigényű kísérletek alkalmazásával tanulmányozhatók.

Nem véletlen, hogy számos gerinctelen modellállatot használnak különböző

alapkutatási projektekben, ezek közül terjedelmi okok miatt csak a legismertebbek

megemlítése lehetséges. Több mint egy évszázada tanulmányozzák a csalánozók, a

laposférgek regenerációjának folyamatát, és napjainkban több a regenerációban szerepet

játszó gént és génterméket, szabályozó faktorokat azonosítottak ezekben a csoportokban,

amelyekhez hasonló molekulák jelenlétét magasabb rendű szervezetekben, így gerincesekben

is kimutatták.

A kromoszómák és a gének öröklődésben játszott szerepét Morgan és munkatársai a

már klasszikusnak tekinthető Drosophila melanogaster kísérletekkel mutatták ki. Szintén D.

melanogaster-t használtak a röntgensugarak mutációt indukáló hatásának kimutatására.

A megtermékenyítés, az embrionális fejlődés folyamatának fő lépéseit részben szintén

gerinctelen modell-állatok (férgek, tengeri sünök) felhasználásával tisztázták. Az embrionális

fejlődés alatti szövetdifferenciálódás folyamatát és az abban kulcsszerepet játszó

programozott sejthalál (apoptózis) morfológiai jellegzetességeit, biokémiai folyamatait

Sydney Brenner 1960-as években megkezdett kísérletei alapján a Caenorhabditis elegans

(Nematoda) fajban írták le először.

A kevéssertéjű gyűrűsférgek különböző fajait modell-állatként használják fémhalmozási

és detoxikálási kísérletekben, ökotoxikológiai vizsgálatokban. Nehézfém-rezisztenciájuk

fiziológiai háttere a fémionok inaktiválása és átmeneti tárolása, amelyben egyes

coelomasejtek és a chloragocyták kiemelkedő szerepet játszanak. A gyűrűsférgekben jelenik

meg először a törzsfejlődés során a veleszületett immunitás mellett a humorális immunválasz

(Bilej és mtsai. 1995). Az antimikrobiális peptidek szintézise szintén a coelomasejtekben

játszódik le. A csoport egyes fajai, így az Eisenia fetida is kiemelkedő regenerációs

potenciállal jellemezhető, és ismert az is, hogy a regeneráció egyes lépései csak a

coelomasejtek jelenlétében játszódnak le (Herlant-Meewis 1965). Az előzőek alapján

7

nyilvánvaló, hogy a coelomasejtek szerkezetének és funkciójának megismerése számos

élettani folyamat lépéseinek feltárását segítheti elő.

2.1. Az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei

Az oligochaeta rend több tagjának is vizsgálták már a coelomasejtjeit, így ismert a

Lumbricus terrestris (Stein és mtsai. 1977; Stein és Cooper 1978; Linthicum és mtsai. 1977),

a Dendrobaena veneta (Adamowicz 2005) és az Allolobophora chlorotica (Kurek és mtsai.

2007) coelomasejtek tipizálása. Ezek a leírások nagyon különbözőek és nem teljesen

egyértelműek. A különböző oligochaeta fajokban leírt coelomasejt-típusok összefoglalását az

1. táblázat tartalmazza.

A kevéssertéjű gyűrűsférgek coelomaüregét coelomafolyadék tölti ki (1. ábra), amely az

érfalakon át a vérből szűrődik ki. Ebben szabadon mozgó sejtek, az ún. coelomasejtek több

típusa található (Jamieson 1981). A sejtek száma széles határok között változhat, extrém

esetben teljesen kitölthetik a testüreget (1/b ábra). A coelomaüreg minden szelvénye egy

dorsalis pórussal és egy páros metanephridiummal érintkezik a külvilággal, ezért az állat

életmódjának köszönhetően a testüreg rendszeresen bakteriális és egyéb fertőzéseknek van

kitéve. A coelomafolyadék a hidrosztatikai váz része, részt vesz a belső és a külső környezet

kommunikációjában, fontos szerepet tölt be a homeosztázis fenntartásában, és mindemellett

ez tartalmazza az immunkompetens coelomasejteket. A coelomafolyadék fontos szerepet

játszik az ozmoregulációban, speciális ionösszetétele - mely nem azonos a vérplazma

összetételével - már korábban ismertté vált (Fischer 1975). A coelomafolyadék ennek

megfelelően részt vesz a belső szervek közti anyagcseréjében (Jamieson 1981), az átmeneti

folyadéktárolásban és az immunfunkciókban (Cooper és mtsai. 2006; Engelmann és mtsai.

2004).

A bélcsatorna, főként a középbél periintestinalis sinusaihoz kapcsolódó chloragogen

szövet nagy, élénksárga színű sejtekből áll, a splanchopleurából származik. A typhlosolisba

benyomuló részét centrális chloragogen szövetnek hívjuk. Elképzelhető, hogy a chloragogen

sejtekben többek között antibakteriális anyagok termelése is folyik. A perifériális chloragogen

szövet más gerinctelen fajok hepatopancreasával megegyező funkciót lát el, tápanyag-

raktározást (lipidek és glikogén), bomlástermékek tárolását, az ionforgalom szabályozását

(Sima és mtsai. 1995). Ezen kívül hemoglobinszintézisre képes, ezért funkcionális

szempontból a gerincesek vörösvértestjeihez vagy éppen a polychaeták erythrocytáihoz

hasonlítható (Fischer és Horváth 1978). A chloragogen sejtekben a szervezet számára még

hasznosítható, valamint detoxikált anyagok halmozódnak fel. Felhalmozott anyagaikat a

8

vérből veszik fel, és a coelomaüregbe adják le (Jamieson 1981). Ezen kívül a chloragogen

szövet részt vesz a növekvő kokonok táplálásában (Liebmann 1942a), és a regenerációs

folyamatokban is (Liebmann 1942a, b; Moment 1974). A chloragogen sejtek citoplazmáját 1-

2 μm átmérőjű, kerek, sárgás pigmentet tartalmazó testek (chloragosomák) töltik ki. Mivel a

sejtek időnként leválnak a bélfalról, vagy chloragosomákat adnak le a testüregbe (Fischer és

Molnár 1992), egyes szerzők önálló coelomasejttípusként tárgyalják őket (Jamieson 1981).

1. ábra: Az Eisenia. fetida keresztmetszete hematoxilin-eozin kontrasztosítással. bw:

bőrizomtömlő; dv: dorzális vérér; cc: testüreg; cns: központi idegrendszer; i: bélcsatorna

ürege; ty: typhlosolis a centrális chloragogén szövettel; pc: perifériás chloragogen szövet.

2.1.1. Morfológiai jellegzetességek

Cooper és Stein (1981) szerint a coelomasejtek morfológiájuk és eredetük szerint két

sejtpopulációt alkotnak, ezek az amoebocyták (hyalin és granuláris) és az eleocyták. Az

eleocyták - Cooper és Stein szerint ezek a sejtek azonosak a chloragogen sejtekkel – a

chloragogen szövetből származnak, a bélcsatorna és a nagyobb erek külső felszínén

helyezkednek el, endogén anyagok (glikogén, lipidek, pigmentek pl.: riboflavin) tárolására

alkalmasak. A riboflavin-tartalom miatt egyes fajokban az eleocyta-típusú sejtek

autofluoreszcenciát mutatnak (D. veneta, A. chlorotica, Dendrodrilus rubidus, E. fetida),

ezzel ellentétben autofluoreszcencia nem jellemző a Lumbricus és Aporrectoda fajokban. Az

egyes fajokban a coelomasejtek száma és az egyes sejttípusok aránya fajtól, évi ritmustól és

környezeti hatásoktól is függ.

9

A. chlorotica D. veneta L. terrestris

Kurek és mtsai. 2007 Adamowitz 2005 Linthicum és mtsai. 1977 Stein és Cooper 1978

1. fő típus hyalin/agranuláris amoebocyta

granulummentes

citoplazma

nagy pszeudopódiumok

amoebocyta

fagoszómák,

lizoszómák,

mitokondriumok

pszeudopódiumok

lymphocyta-szerű coelomasejt

lizoszómák

fagocitózis

invagináció a

sejtmagon

nagyméretű pszeudopódiumos

bazofil coelomasejt

2. fő típus granuláris amoebocyta

denz granulumban

gazdag citoplazma

pszeudopódiumok

granulocyta

ectoplazma

organellummentes

endoplazmában

mitokondriumok,

lizoszómák, szabad

riboszómák, denz

vakuólumok

granulocyta-szerű coelomasejt

elektrondenz

granulumok,

vakuólumok

változatos alakok

pszeudopódium ritkán

acidofil

granulocyta

neutrofil

granulocyta

3. fő típus eleocyta/chloragocyta

chloragosomák

glikogénszemcsék

néhány pszeudopódium

eleocyta

endoplazma

organellummentes

ektoplazma:

chloragosomák,

mitokondriumok,

egyéb denz

granulumok

eleocyta/chloragocyta

számos

pszeudopódium

granulumok: lipid,

protein, szénhidrát

chloragocyta

aggregálódnak

~ helyt ülő chloragocyta

maradványtesteket tartalmazó

coelomasejtek

kisebb bazofil sejtek

átmeneti sejtek

1. táblázat: Az Oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei

10

Kurek és munkatársai (2007) az A. chlorotica fajban tanulmányozták a coelomasejtek

morfológiáját (2. ábra). Három sejtpopulációt különböztettek meg fénymikroszkópos,

pásztázó-, és transzmissziós- elektronmikroszkópos valamint áramlási citometriás

technikákkal. A hyalin (vagy más néven agranuláris) amoebocyták a coelomasejtek 30%-át

képviselik, az élő sejtek áttetsző citoplazmájúak, nem fluoreszcensek, May-Grünwald-Giemsa

festéssel sötét vagy világoskék agranuláris citoplazmával, ovális vagy bab alakú, sötétkék

vagy ibolyaszínű sejtmaggal jellemezhetők. SEM képen a sejtmembrán kiterjedt

pszeudopodiumokat képez, TEM preparátumokon pedig alacsony számban kisméretű

granulumok láthatóak a citoplazmában. A granuláris amoebocyták a sejtek 8%-át teszik ki,

citoplazmájuk áttetsző, hosszú vékony pszeudopodiumokkal rendelkeznek, nem mutatnak

fluoreszcenciát, MGG festés során számos piros vagy sötétkék granulum látható a

citoplazmában, a sejtmag ovális és sötétkékre festődik, a TEM preparátumokon nagy számban

láthatunk elektrondenz granulumot a citoplazmában. A sejtek harmadik típusa az eleocyták

vagy chloragocyták csoportja. Az élő sejtek nagy, sárgásbarna granulumokat tartalmaznak,

amelyek autofluoreszcenciát mutatnak, MGG festéssel pedig alacsony mag/citoplazma arányt,

nagy granulumokkal telített citoplazmát és kisméretű, kerek, sötétrózsaszínre festődő

sejtmagot mutatnak. SEM vizsgálatokkal a sejtek felszínén rövid pszeudopodiumokat és

labdaszerű chloragoszómákat, TEM vizsgálatokkal pedig átlátszó granulumokat

(chloragoszómák) és glikogén partikulumokat lehet kimutatni.

11

2. ábra: Az Allolobophora chlorotica coelomasejtjeinek fény- és elektronmikroszkópos fotói.

hA: hyalin/agranuláris amoebocyta; gA: granuláris amoebocyta; E: eleocyta. Aránymérték: 5

µm. (Kurek és mtsai. 2007)

12

Adamowicz (2005) jellemezte a Dendrobaena veneta coelomasejtjeinek morfológiáját

és ultrastruktúráját (3. ábra). Adamowicz szerint a sejtek eredete még nem világos, hiszen

nehéz egyértelműen megállapítani, hogy bizonyos sejtek különböző fejlődési útvonalakat

képviselnek vagy ugyanazon sejtvonal különböző fejlődési stádiumai. Ráadásul zavart keltett

annak a nomenklatúrának a használata is, melyet Stein és munkatársai (1977) vezetett be a

gerinces hematológia mintájára. Ezek után Adamowicz három sejttípust (eleocyta,

amoebocyta, granulocyta), és azokon belül több alpopulációt nevezett meg, ahol az

alpopulációk szerinte ugyanazon sejtvonal különböző állapotait jelentik.

Az eleocyta sok különböző méretű ovális struktúrát tartalmaz a citoplazmájában, ezt a

sejttípust a korábbi nevezéktanból chloragocytáknak nevezte el. A sejtek morula-szerű

felszínnel rendelkeznek. A sejtek a szabad coelomasejtek 30%-át teszik ki, a mag/citoplazma

arány alacsony, kisméretű kerek sejtmagjuk általában excentrikus elhelyezkedésű, kondenzált

kromatint tartalmaz. A citoplazma homogén, organellummentes endoplazmára és heterogén

ektoplazmára tagolódik. A sejtek nem képeznek pszeudopodiumokat, nagy tömegűek,

kevésbé mobilisek és nehezen adherálódnak. A sejtek hasonlítanak a többi fajban leírt

chloragocytákra, melyeket Stein és munkatársai (1977) I. típusú chloragocytának, Affar és

munkatársai (1998) L. terrestris-ben és E. fetida-ban chloragocytának hívtak. A mikroszkópos

vizsgálatok során a sejtek magját a chloragoszómák fedik el. A TEM vizsgálatok kimutatták,

hogy a citoplazma elektrondenz organellumokat (granulumokat, mitokondriumokat)

tartalmaz.

Az amoebocyták általában aggregálódásra képesek. A sejtek 42%-át teszik ki. Ez a

sejtcsoport a pszeudopodiumok és az ultrastruktúra alapján két altípusra osztható. Az I. típusú

amoebocyta a II. típusú sejt fiatal alakja. A szerző erre a sejtek morfológiájából

következtetett. A sejtek kisebbek, organellumokban szegényebbek, rövid lobopódiumokkal

rendelkeznek. Sejtmagjuk nagy, ovális vagy konkáv, általában centrális helyzetű, kromatinja

nem kondenzált. A citoplazma kevés, különböző denzitású lizoszómát, vakuólumot és

vezikulát tartalmaz. A II. típusú amoebocyta szabálytalan alakú pszeudopodiumokat képez,

amelyek a sejt egyik pólusára koncentrálódnak, nagy bab alakú magjában a kromatin nem

kondenzált. A citoplazma általában a homogén ektoplazmára és a szemcsés endoplazmára

oszlik. Az endoplazmában longitudinális mitokondriumok, szabad riboszómák, lizoszómák,

és elektrondenz tartalmú fagoszómák találhatók. A sejtek fagocitotikus aktivitásra képesek,

amelyre a pszeudopodiumok és a citoplazmában jelen lévő mikrofilamentumok is utalnak.

A granulocyták számos karakterisztikus, elektrondenz, citoplazmatikus granulumot

tartalmaznak, amelyeket a sejtek exocitózissal üríteni képesek. A coelomasejtek 28%-át teszik

13

ki, a sejtek magja kicsi, ovális, periférián helyezkedik el és alacsony denzitású kromatinnal

rendelkezik. A citoplazma homogén, organellummentes ectoplasmára és organellumgazdag

endoplasmára tagolódik, amelyben kevés ovális mitokondrium, lizoszómák, szabad

riboszómák és különböző elektrondenzitású vakuólumok találhatók. A granulocyták nem

hajlamosak aggregálódásra.

3. ábra: A Dendrobaena veneta coelomasejtjeinek transzmissziós elektronmikroszkópos

fotói. (Adamowicz 2005) a: eleocyta; b: I. típusú amoebocyta; c: II. típusú amoebocyta; d:

granulocyta. Jelmagyarázat: ch: chloragosoma; l: lizoszóma; v: vezikula; psp:

pszeudopódium; enp: endoplasma; ecp: ectoplasma. Aránymérték: (a) 2 µm; (b-d) 1 µm.

14

Linthicum és munkatársai (1977) ultrastruktúrális vizsgálatokat végeztek L. terrestris

coelomasejtjein, és négy sejttípust különböztettek meg (4. ábra). Ezek a lymphocyta-szerű,

illetve a granulocyta-szerű coelomasejt, az eleocyta (Linthicum is a chloragogen sejttel

azonosítja) és a maradványtesteket tartalmazó coelomasejt, ezeken a csoportokon belül pedig

különböző fejlődési alakok figyelhetők meg. Linthicum a négy sejttípust a sejtek

ultrastruktúrája alapján, az alsejttípusokat pedig fénymikroszkópos módszerekkel állapította

meg.

A lymphocyta-szerű coelomasejtek hasonlítanak az éretlen gerinces lymphocytákra,

fénymikroszkópos vizsgálatokkal bazofil festődésűek. Két altípust különböztetett meg. Az I.

altípus 4,5-7 μm átmérőjű, gömbölyű vagy ovális, sejtmagja 2,5-4 μm, centrális

elhelyezkedésű, heterokromatinja főleg marginális. A magmembrán invaginációt mutat, a

nucleolus feltűnő, kondenzált. A citoplazma kevés organellumot tartalmaz (kevés kisméretű

mitokondrium, feltűnő Golgi apparátus, szabad riboszómák, rövid DER ciszternák), nagy

vezikulumokat azonban nem találunk benne. A II.típusú sejtek nagyobbak (5-8,5 μm),

sejtmagjuk szintén centrálisan található és morfológiailag hasonlít az előző sejttípus magjára.

A citoplazma sok vakuólumot tartalmaz, amelyek valószínűleg másodlagos lizoszómák,

bennük finoman granulált tartalom van vagy üresek. A mitokondriumok száma és a DER is

hasonlít az I. típushoz. Ellentétben az I. sejttípussal, hosszú, keskeny pszeudopodiumokat

képez, amelyből az következhet, hogy ezek a sejtek az érettebbek.

A második nagy sejtcsoport a granulocyta-szerű coelomasejt, amelynek

citoplazmájában elektrondenz granulumok találhatók. Ebben a csoportban is két altípust

különböztettek meg, amelyek annyira különböznek egymástól, hogy valószínűleg nem

ugyanannak a sejtvonalnak az alakjai. A I típusú sejtek nagyméretűek (9-15 μm), basofil

festődésűek, sejtmagjuk nagy (6-7 μm), centrális helyzetű, benne kevés kondenzált kromatin

található. Citoplazmájuk organellumgazdag endoplazmára és kevés organellumot tartalmazó

ektoplazmára oszlik. Intracelluláris membránrendszere (DER, Golgi apparátus) kevés és

fejletlen. Endoplazmában nagyszámú mikrofilamentum, kicsi (0,1-0,3 μm) sötét granulum és

α és β glikogén-partikulum (amely aktív fagocitózis eredménye lehet) található. Az

ektoplazma kevés granulumot és lekerekített, tompa végű pszeudopódiumot tartalmaz. A

sejtek pszeudopódiumaik és mikrofilamentumaik miatt mobilisak. A II.típusú sejtek csillag

alakúak, fénymikroszkópban basofilak, a sejttestjük 7-9 μm átmérőjű, a sejtmag excentrikus,

invagináció gyakran látható a magmembránon, a mag perifériáján kondenzált kromatin

található, látható a sejtmagvacska. A citoplazmában kevés DEG és Golgi apparátus és

mérsékelt mennyiségű mitokondrium van, mikrofilamentumok nem látszanak. Kétféle

15

granulumot tartalmaz citoplazmájuk: (1) 0,1-0,3 μm átmérőjű kicsi, ovális granulumokat,

amelyek hasonlítanak az előző típusú sejtek granulumaihoz, de jóval kevesebb van belőlük, és

lizoszómára emlékeztet, valamint (2) nagyobb, 0,2-0,8 μm átmérőjű, kerek, világos, homogén

tartalmú granulumokat, amelyek membránja nagyon szembetűnő, szekunder lizoszómára

emlékeztet. A granulumok a citoplazmában mindenhol megtalálhatók, a pszeudopódiumok

eredésénél pedig koncentráltabban vannak jelen. A citoplazma nem tagolódik ekto- és

endoplazmára, perifériás részén glikogén szemcsék figyelhetők meg.

A harmadik sejttípus az eleocyta, amelyet a szerző azonosnak vélt a chloragocytával.

Ezek a legnagyobb coelomasejtek (18-25 μm), a chloragogen szövetből származnak, sok

rövid pszeudopódiummal rendelkeznek. Sejtmagjuk heterokromatikus, a sejtmag/citoplazma

arány 1:10, a citoplazmában DER és Golgi apparátus nincs vagy nagyon kevés, vezikulumok

(glikogén) és granulumok nagy számban találhatók. A granulumok különböző méretűek és

alakúak. A sejtek lipid, protein és szénhidrát tartalmú granulumaikat a coelomafolyadékba

ürítik, amelyeket más coelomasejtek képesek fagocitózissal felvenni. Az eleocyták a

granulocytákéhoz hasonló, kisméretű granulumokat nem tartalmaznak.

A negyedik típusú sejt maradványtesteket tartalmaz a citoplazmájában. A denz testek

tartalma ismeretlen. A sejtek méret 5-8 μm, gömbölyűek és fénymikroszkópban acidofil

festődésűek. Éretlen és érett formák is fellelhetők. Az éretlen formák sok nagy, sötétszürke

maradványtestet tartalmaznak, méretük változó, a citoplazmájuk finoman granulált, Golgi

készülékük jól fejlett, DER ciszterna ritkán látható. A maradványtestek a Golgi komplex

konvex felszíne mellett találhatók, és ha a citoplazma perifériájára kerülnek, nagyobbá és

világosabbá válnak. Az érett alakokban a granulumok elektrondenzitása lecsökken, a

granulumok a perifériás citoplazmarészekből kiürülnek, ezért ezekben a sejtalakokban sokkal

kevesebb a granulum, üres vakuólumokat találunk bennük és a maradványtestek mindig a

plazmamembránhoz közeli citoplazmarészekben vannak. Ezek a morfológiai jelek

exocitózisra utalnak.

A szerző az egyes sejttípusok alaki jellegzetességei alapján egy lehetséges fejlődési

útvonalat feltételezett: eszerint az I. típusú lymphocyta-szerű coelomasejtek éretlen

sejtalakok. Ezek a sejtek fokozatosan több lizoszómát halmoznak fel, amelyek denz

granulumokként látszanak, illetve secunder fagoszómákat találhatunk bennük (világosabb

granulumok), amelyek a fagocitózis eredményei. A sejtek pszeudopódiumokat növesztenek,

és így már II. típusú lymphocyta-szerű coelomasejteknek tekinthetjük. Feltételezése szerint

ezek a sejtek idegen anyagok hatására aktiválódnak, majd II típusú granulocyta-szerű

16

coelomasejtté alakulnak, amelyek sok granulummal, sok vakuolummal és bonyolult

pszeudopodium-rendszerrel rendelkeznek.

4. ábra: A Lumbricus terrestris coelomasejtjeinek tipizálása Linthicum és munkatársai

szerint (1977). a: I. típusú lymphocyta-szerű sejt; b: II. típusú lymphocyta-szerű sejt; c: I.

típusú granulocyta-szerű sejt; d: II. típusú granulocyta-szerű sejt; e: eleocyta; f:

maradványtesteket akkumuláló sejttípus. Jelmagyarázat: D: denz maradványtest; DG: denz

granulum; EP: ectoplasma; EV: üres vezikula; G: Golgi apparátus; GG: glikogén; L: világos

maradványtest; LG: közepesen denz granulum; M: mitochondrium; MF: mikrofilamentumok;

MT: mikrotubulus;N: nucleus; NC: magmembrán invagináció; NO: nucleolus; PS:

pszeudopódium; RER: durvafelszínű endoplazmatikus retikulum; V: vakuólum.

17

Stein és Cooper (1978) különböző citokémiai festések segítségével hét különböző sejtet

különböztettek meg a földigiliszta (L. terrestris) coelomafolyadékában.

Basofil sejteknek nevezték el a legnagyobb számban (63,5%) jelenlévő 5-30 μm

átmérőjű, erősen basofil citoplazmájú sejteket, amelyeknek brómfenolkék festés során néha

sötétkék 0,5 μm nagyságú granulumok találhatók a citoplazmájában. A kisebb sejtek gyér

citoplazmával és a sejtmag körül keskeny szegéllyel rendelkeznek. A nagyobb sejtek

citoplazmája gazdagabb, világosabb kékre festődik és átlátszó vakuólumokat találunk benne.

A sejtek gyakran egymással összetapadnak és sejtaggregátumokat alkotnak, kisebb

filopódiumokat vagy petaloid pszeudopódiumokat képeznek. A közepes és nagyobb méretű

basofil sejtek felcsavarodott megnyúlást mutatnak. A sejtmagjuk kompakt, 4-8 μm átmérőjű,

centrális vagy perifériás elhelyezkedésű, a kromatin kondenzált és sötétkékre festődik, a

nucleolus nem látható ennél a festési eljárásnál. A sejtek 5-30 μm-esek, de a legtöbb 8-15 μm

és ezek alkotják általában a sejtcsomókat is. Sok állatban találtak 100 μm átmérőjű sejteket is,

de általában 30-60 μm-eseket, amelyek főleg a basofil sejtekre hasonlítanak, ezek közül a

kisebbek (30-40 μm) nagy, átlátszó vakuólumokat tartalmaznak, amelyek vékony

citoplazmahidakon keresztül anasztomizálnak. Ezeket a sejteket a szerzők nagy basofil

sejteknek nevezték el.

Acidofil sejtekként írták le azokat a sejteket, amelyek általában granuláltak, a

sejtfelszínük hólyagos a granulumok miatt, amelyek PAS-reakció során rózsaszínűre illetve

pirosra festődnek. Az egyik altípusban a granulumok nagy számban figyelhetők meg, 1-2 μm

átmérőjűek, és kitöltik a sejteket. A sejtmag excentrikus elhelyezkedésű, 5-9 μm átmérőjű,

lapos, sötétpirosra vagy ibolyára festődik, a nucleolus nem látható. A sejtek 10-30 μm

átmérőjűek. A másik altípusba sorolt, 10-15 μm átmérőjű sejtekben a granulumok nagyobbak

(2-4 μm), a sejtmag 6-8 μm átmérőjű, centrális vagy perifériás lokalizációjú, pirosas-ibolyásra

festődik, benne a nucleolus nem látható.

A granulocyta sejtcsoportba sorolt sejtekben a granulumok nagy változékonyságot

mutatnak fejlődési tulajdonságukban és méretben is, ugyanis 0,5-2 μm átmérőjűek, brómfenol

és Biebrich Scarlet basofil vagy acidofil festődést mutatnak, színük a specifikus

kontrasztosítás után rózsaszín, lila és kék. A sejtfelszínen hólyagokat találunk. A sejtmag 6-8

μm, excentrikus, sötétlila, kondenzált kromatint tartalmaz.

A neutrofil sejttípus 12-50 μm, a citoplazma gyengén kékre festődik, kicsi vagy közepes

vakuólumokat tartalmaz, amelyekben baktériumot vagy chloragogént találhatunk. A

citoplazma általában homogén, néha 1 μm világos granulumokat tartalmaz. A sejtmagja nagy

18

(8-10 μm), pirosra festődik, kevés heterokromatin látható benne. A sötétre festődő homogén

kromatin között nem festődő területek találhatók. A nucleolus látható, kékre festődik.

Az ötödik sejtcsoport a chloragogen sejt, amely elnevezés nagy, sok granulumot

tartalmazó sejtet takar. A coelomasejtek közül a chloragogen sejt az egyetlen, amely nem

aggregálódik. A szerzők két chloragogen-altípust különböztettek meg. Az egyik altípus 10-25

μm széles és 30-60 μm hosszú. A granulumok élénk kékre festődnek, kerek vagy ovális

alakúak, 1-2 μm átmérőjűek és gyakran láthatók szabadon a coelomafolyadékban. A másik

sejtaltípus gömbölyű, 12-20 μm átmérőjű, a granulumai szabálytalan alakúak, 0,5-2 μm

átmérőjűek, sötétkék vagy ibolya festődésűek. Néha 4-6 sejt sejtcsomót alkot. A sejtmag

perifériásan helyezkedik el. A chloragogen sejtek esetében a granulumok eltakarják a

sejtmagot, ha a sejtmag azonban mégis látszik, akkor kicsi, rózsaszínre festődik és látható

benne a nucleolus. A peritóneumról leszedve a hozzátapadt sejteket I. típusú chloragocytát

mindig találtak, de II. típusút nem.

Az utolsó sejttípus a sejtek 2 %-a, Stein átmeneti sejteknek nevezte el őket. Összetett

kategóriának tekinthető, szinte mindenféle kombinációban kétfajta sejt átmeneti

tulajdonságait mutatják.

2.1.2. A coelomasejtek eredete

A gyűrűsférgek coelomasejtjeinek származása napjainkban még nem teljesen tisztázott.

Négy teória (5. ábra) létezik a coelomasejtek eredetére vonatkozóan (Jamieson 1981):

(i) Egyes szerzők szerint a sejtek coelomaüreg falát képező parietális lemezből vagy más

néven somatopleurából származnak. A somatopleurából származó sejtek egy külön

leukocyta-szerű sejtvonalat képeznek, melyre a granulált citoplazma jellemző.

Egyes szerzők ezeket granulocytának hívják. A granuláris sejtek között

pszeudopódiumokat képző illetve inkább transzport folyamatokat ellátó sejteket

írtak le.

(ii) Más szerzők szerint a splanchnopleura vagy viscerális lemez epitheliumának leváló

sejtjeiből coelomasejtek differenciálódnak. A chloragogen sejtek szintén a

viscerális epithelium származékai, emiatt többen a coelomasejteket leváló

chloragogen sejteknek tartják. Ennek a sejtvonalnak a tagjaira fejlett Golgi

apparátus, sok riboszóma jellemző. Ezen kívül megfigyelhetők olyan sejtalakok

illetve sejttöredékek is a coelomafolyadékban, amelyek valószínűleg citoplazma-

lefűződéssel jöttek létre a chloragogen sejtekből, hasonlóan a gerinces

vérlemezkék megakaryocytából történő leszakadásához.

19

(iii)A szelvények közötti dissepimentumok felületén szintén találunk peritoneális sejteket,

amelyek a leváló coelomasejtek előalakjai lehetnek.

(iv) A középbél területén lévő nagyobb erek külső felszínén szintén chloragogént találunk,

de a chloragogen sejtek között elszórtan kisméretű világos citoplazmájú és nagy

sejtmagvú hyaloblastokat is találunk, melyek hyalocyták, hyalin típusú

coelomasejtek előalakjai lehetnek. Ezen sejtvonalra az agranuláris citoplazma,

gyakori autofagoszóma és intenzív fagocitózis jellemző.

5. ábra: A coelomasejtek fejlődésének feltételezett útvonalai Valembois (1971) szerint. A-C:

somatopleurából származó granuláris sejtfejlődési vonal; D-E: hyalin típusú sejtek fejlődési

alakjai. Jelmagyarázat: av: autofág vakuólum; g: Golgi apparátus; ger: durvafelszínű

endoplazmatikus retikulum; gl: glikogén; mf: microfibrillumok; ph: fagoszóma; r: szabad

riboszómák; sg: specifikus granulumok;

20

2.1.3. A coelomasejtek funkciói

(i) A giliszták coelomafolyadéka a hidrosztatikai váz része, részt vesz a belső és a külső

környezet kommunikációjában, fontos szerepet tölt be a homeosztázis fenntartásában és

mindemellett az immunkompetens coelomasejteket tartalmazza. Az amoebocyták

képesek felismerni és eliminálni az idegen anyagokat (Jamieson 1981), fagocitózisra

(Stein és mtsai. 1977; Cooper 1996, 2001; Kauschke és mtsai. 2001), enkapszulációra

képesek (Valembois és mtsai. 1992; Cooper és mtsai. 2002), részt vesznek a

véralvadásban, a gyulladásos folyamatokban, a graft rejekcióban, a granuloma

formálásában (Field és mtsai. 2004) és a coelomafolyadék koagulációjában (Koenig és

mtsai. 2003).

Több szerző szerint (Stein és munkatársai 1977; Engelmann és mtsai. 2005) egyes

coelomasejtek képesek fagocitózisra, kivételt képeznek ez alól a chloragogen sejtek. Az

acidofil sejtek és a granulocyták kevésbé, a basofil és neutrofil coelomasejtek rendkívül

intenzíven fagocitálnak.

Az immunválasz kialakításában betöltött szerepükkel részletesebben később

foglalkozunk.

(ii) Egyes gyűrűsféreg fajok nagymértékű regenerációra képesek, és ebben nagy jelentőséget

tulajdonítanak a coelomasejteknek (Herlant-Meewis 1965; Liebmann 1942b). Az állat

sérülésekor vazokonstrikció, coelomasejt-akkumuláció, sebdugó-képzés és

izomösszehúzódás megy rögtön végbe. A sebgyógyulás az amoebocyták migrációjával

jár, ezek aggregálódnak és dugót képeznek, amely a további folyadékvesztést

megakadályozza (Lemmi és Cooper 1981; Bilej és mtsai. 1995).

Liebmann (1942b) szerint a chloragogen szövet sejtjei exkréciós és raktározó funkciót

látnak el, továbbá egyes coelomasejtek (amoebocyták, eleocyták) a regenerációban is

szerepet játszanak. Szerinte a chloragogén sejtek különböző anyagokat vesznek fel a

vérből, azokat a chloragosomákban raktározzák, és ezután, ha szükséges, a

coelomafolyadékba ürítik, amelyek tartalmát az amoebocyták veszik fel. Ezt később a

metanephridiumba ürítik, és így eliminálják a szervezetből. Kutatásai azt igazolták, hogy

a chloragoszómákban találhatók urátok, guanin, kitin, glikogén, fehérjék és zsírok, és a

chloragogen sejtekben intenzív lipidtermelés folyik. A chloragogen szövetből

felszabaduló szabadon úszó coelomasejteket eleocytáknak nevezte.

Részletesen vizsgálta fénymikroszkóppal a giliszták caudális regenerációjának

folyamatát. A kutató kimutatásai szerint a sérülés után 3 órával megnő az eleocyták

21

száma a sebhez közeli szelvényekben. 9 órával a sérülés után a sejtekben egyesülnek a

zsírcseppek és kilökődnek. Ezután a legtöbb sejt szétesik. Az eleocyták funkciója

Liebmann szerint a nutritív anyagok kibocsátása, valamint az, hogy sérülés után az

amoebocytákkal aggregálódva, megakadályozzák a coelomafolyadék-veszteséget és

elzárják a sebet. A sérülés utáni heg felépítését is vizsgálta a coelomasejtek

szempontjából. Egyrészt maga a forradás vagy heg amoebocytákból áll, amelyek

citoplazmája sok zsírgranulumot tartalmaz. Ez alatt a zárt felső réteg alatt pedig

eleocytákból álló lazább réteg alakul ki. A sérülést követő 4-5 nappal a craniálisabb

szelvényekből is eleocyták migrálnak a vágás közelébe és ott feldúsulnak. Szerinte az

eleocyták kisebb része epitheloid sejtekké transzformálódik, valamint zsírgranulumokat

bocsájt ki, amelyek szükségesek a heg záródásához. Ezen kívül az eleocyták által

szállított nutritív anyagok részt vesznek az új szövetek felépítésében is.

(iii) A coelomasejtek fontos szerepet játszhatnak trofikus faktorok, hormonok, bioaktív

anyagok szállításában is. Egyrészt a korábban említett regenerációs folyamatokban, ahol

nutritív anyagokat a sérülés helyére szállítanak, illetve azokat kiürítve elősegítik a

sebgyógyulás és a regeneráció folyamatát (Liebmann 1942b). Másrészt intakt állatok

anyagcsere-folyamataiban is fontos szerepet játszhatnak, hiszen TSH és TSH-receptor

immunreaktív sejteket találtak a coelomasejtek között (Wilhelm és mtsai. 2006). Eszerint

a sejtek a termelődés helyéről hormonszerű anyagokat szállíthatnak a perifériás

szövetekhez, ezzel elősegítve a homeosztázis szabályozását, a perifériás szövetek

esetleges szekrécióját vagy éppen az emésztés folyamatát. Mindezen szállító és trofikus

funkciót főként a granuláris típusú sejteknek tulajdonítják.

(iv) Egyes szerzők (Liebmann 1942a; Jamieson 1981) feltételezése szerint az eleocyták fontos

szerepet játszanak a gyűrűsférgek ivarsejtképzésében is, illetve az embrionális

fejlődésben. Eszerint az eleocyták granulumaikkal tápanyagot (lipideket, fehérjéket,

glikogént) biztosítanak a testüregben megtalálható ivarszerveknek, miközben azok a

petesejtek és a hímivarsejtek termelését végzik. Ezen kívül a coelomasejtek, főként az

eleocyták granulumaik tartalmát a coconfolyadékban is megtalálhatjuk, és mint nutritív

anyagok, segítik az embriók fejlődését.

2.2. A gyűrűsférgek immunrendszere

A kevéssertéjű gyűrűsférgek saját immunrendszere már nem csak celluláris, hanem

elsőként a törzsfejlődés során humorális immunválaszra is képes (Bilej és mtsai. 2000). Az

22

oligochaeta gyűrűsférgek coelomaüregében található coelomafolyadék leukocyta-szerű

sejteket tartalmaz. A sejtek morfológiai és funkcionális szempontból is analógiát mutatnak a

gerincesek fehérvérsejtjeivel, és képesek in vivo illetve in vitro opszonizációra, fagocitózisra

(Stein és mtsai. 1977), enkapszulációra (Valembois és mtsai. 1992), gyulladásos folyamatok

megindítására, agglutinációra, allograft és xenograft elpusztítására és eliminálására (Hostetter

és Cooper 1972).

A celluláris immunválasz ebben a rendszertani csoportban is főként fagocitózisban és

idegen sejtet felismerő folyamatokban nyilvánul meg (Stein és mtsai. 1977; Stein és Cooper

1981). A celluláris immunválasz során az idegen anyag illetve sejt (akár prokarióta, akár

eukarióta) eliminálása három lépésben történik. Elsőként az effektor coelomasejtek a célsejtek

membránjához tapadnak, ezután egy másik, általában kisebb méretű sejtekből álló sejtcsoport

a célsejteket elpusztítja. Utolsó lépésként nagyméretű coelomasejtek az elpusztított idegen

sejtek maradványait fagocitálják, illetve ún. brown body-k képzését kezdik meg, ezzel a

coelomaüregből eliminálják az idegen sejteket (Valembois és mtsai. 1992; Cossarizza és

mtsai. 1996). A giliszták coelomasejtjeinek fagocitotikus és citotoxikus képessége nem egy-

egy bizonyos sejtcsoportra jellemző. Egyes sejtek emlős sejtfelszíni markereket (pl. CD11a,

CD45RA, CD45RO, β2-mikroglobulin) felismerő monoklonális ellenanyagokkal

keresztreakciót mutatnak (Cooper és mtsai. 2006), de ezek egy része fagocitózisra is képes.

Emiatt azt mondhatjuk, hogy a gyűrűsférgek coelomasejtjei, ellentétben a gerincesek

fehérvérsejtjeivel, multifunkcionálisak, nem kizárólagosan egy immunválaszbeli lépés

elvégzésére képes specifikus sejtek.

A humorális immunválasz többek között lizozim (Lassalle és mtsai. 1988), agglutinin

(Stein és Cooper 1988), fenoloxidázok/peroxidázok (Valembois és mtsai. 1991) szintézisével

és szekréciójával zajlik (Jarosz és Glinski 1997; Cooper és mtsai. 1974). Ezeken kívül E.

fetida-ban írták le elsőként a fetidin nevű lítikus faktort (Roch és mtsai. 1981; Milochau és

mtsai. 1997). Néhány fontosabbnak tartott antimikrobiális faktor: fetidin, coeloma citolitikus

faktor (CCF), eiseniapore, lysenin, Lumbricin, hemolysin, szerin proteáz inhibitor és ezek

izoformái (2. táblázat). A Lumbricin I. kivételével ezek a molekulák nagyobb méretűek, mint

a D. melanogaster-ben illetve rovarokban leírt antimikrobiális aktivitású molekulák (pl.

drosomycin, metchnikowin, drosocin) (Hetru és mtsai. 2003). A citolítikus faktorok rövid

összefoglaló jellemzését a 2. táblázat tartalmazza.

23

Molekula

neve

Hatásmechanizmus,

funkció

Molekulasúly Előfordulás,

expresszió helye

Referencia

Fetidinek

fetidin 1 (négy

izoforma)

fetidin 2

(monomorf)

sphingomyelinhez

kötődnek,

hemolítikus,

pórust képeznek a

membránon,

bakteriosztatikus,

részt vesznek az

agglutinációban, a

vérzéscsillapításban,

az opszonizációban

40 kDa

45 kDa

coelomafolyadék,

chloragogen

sejtek,

pathogen

baktériumok

beinjektálása után

nő a mennyisége

Valembois és

mtsai. 1982,

1988;

Roch és

mtsai. 1989

Coeloma

citolitikus

factor (CCF)

opszonizáció

daganatos sejtek

lízise

mintázat felismerő

molekula

42 kDa coelomafolyadék

coelomasejtek

Bilej és

mtsai. 1995;

Beschin és

mtsai. 1998

Lysenin

(három

izoforma)

patkányban

simaizom

összehúzódást

serkenti

sphingomyelinhez

kötődik

41 kDa coelomafolyadék

coelomasejtek

chloragogen sejtek

Sekizawa és

mtsai. 1997;

Yamaji és

mtsai. 1998

Eiseniapore

(EP) sphingomyelinhez

kötődik

pórust képez a

membránokon

38 kDa coelomafolyadék

és/vagy

coelomasejtek

Lange és

mtsai. 1997

Lumbricin I antimikrobiális hatás 7,2 kDa egész állatban Cho és mtsai.

1998

Hemolysinek (H1, H2, H3)

hemolízis 46, 43, 40 kDa egész állatban Eue és mtsai.

1998

Szerin

proteáz

inhibitor (SPI)

citotoxicitás

serkentése

14 kDa egész állatban Roch és

mtsai. 1998

2. táblázat: Antimikrobiális és citolítikus hatású proteinek listája és tulajdonságaik E. fetida-

ban

24

A gyűrűsférgek immunrendszeréről elmondható, hogy bonyolult celluláris és humorális

folyamatok összetett rendszere, amelynek nagy része a coelomafolyadékban található

faktorok és a coelomasejtek által termelt molekulák által szabályozott lépésekből áll, és a

működése során fontos szerepet tölt be a coelomasejtek fagocitotikus és citotoxikus

képessége. Az immunreakciók feltételezett kaszkád-szerű mechanizmusa külső behatásra

(baktérium, gomba, daganatos sejtvonal) indul meg, amelynek pontos feltárása még nem

történt meg. Az immunválasz kialakításában többek között részt vesznek olyan molekulák,

mint a lizozim, a fetidinek, a szerin proteáz enzimek és azok gátló faktorai, a CCF, az EP,

illetve a lysenin. A feltételezett reakciósorozatot a 6. ábra mutatja.

6. ábra: Az Eisenia fetida külső stimulus hatására bekövetkező immunfolyamatainak

feltételezett kaszkád-szerű szabályozása (Beschin és mtsai. nyomán, 2002).

2.3. Citotoxicitás

Bizonyos gerinctelenek képesek spontán elpusztítani különböző célsejteket anélkül,

hogy olyan klón-specifikus immunsejtekkel rendelkeznének, mint a citotoxikus T

lymphocyták (Tyson és Jenkin 1974; Decker és mtsai. 1981; Söderhäll és mtsai. 1985; Luquet

és Leclerc 1983; Franceschi és mtsai. 1991; Suzuki és Cooper 1995a, b). Mindez arra utal,

hogy NK-szerű aktivitással rendelkeznek. Több irodalmi adat utal arra, hogy a gyűrűsférgek

25

immunrendszere képes xeno- és allogén coelomasejt kultúrákat illetve emlős daganatos

sejtvonalakat eliminálni. Cooper és munkatársai (1995) K562 (erythromyeloid human tumor)

sejtvonalat alkalmaztak ennek vizsgálatára. Eredményeik azt mutatták, hogy a coelomasejtek

és a tumor sejtvonal sejtjeinek 10 perces inkubációját követően a daganatos sejtek jelentős

pusztulásnak indultak in vitro. A coelomasejtek közül a kisebb méretű elektrondenz populáció

képes felismerni, megkötni és elpusztítani az idegen sejteket, hasonlóan a gerinces natural

killer (NK) sejtekhez. A sejtek pszeudopódiumokat használnak és kapcsolatot alakítanak ki a

target sejt membránjával. Ezután pedig a nagyobb méretű, kevésbé elektrondenz

coelomasejtek végzik az elpusztított sejtmaradványok fagocitózisát. A gyűrűsférgek az NK

sejtekre jellemző sejtfelszíni molekulákkal csak részben rendelkeznek, hiszen

immunglobulinok, Fc receptorok hiányoznak, azonban Thy-1 (CD90) (Mansour és mtsai.

1985; Saad és Cooper 1990), β2 mikroglobulin (Shalev és mtsai. 1981; Roch és mtsai. 1983)

illetve Lyt (Negm és mtsai. 1991, 1992) található a gerinctelenek immunsejtjeinek felszínén.

Az említett sejtfelszíni molekulák képesek a nem saját struktúrák felismerésére, és aktiválni

olyan sejtszintű folyamatokat, amelyek az idegen struktúrák, sejtek elpusztításához vezetnek.

Ezen folyamatok alatt a perforin és egyéb hemolitikus pórusképző molekulák

hatásmechanizmusait értjük.

Engelmann és munkacsoportja (2004) szerint E. fetida coelomafolyadéka illetve a

coelomasejtekből készült lizátum is képes elpusztítani daganatos (HeLa, HEp-2) és fibroblast

(PA317) sejtvonalakat. Ebben a munkában arra alapoztak a szerzők, hogy a giliszta

coelomafolyadéka számos antibakteriális anyagot, citotoxikus proteint és citokineket

tartalmaz. Azt azonban, hogy ezek a hatóanyagok a coelomasejtek által termelt molekulák,

még nem bizonyították korábbi munkák. Ebben a kísérletsorozatban az emlős daganatos

sejtvonalakat sejtmentes coelomafolyadékkal, coelomasejtekkel, illetve coelomasejtekből

készült homogenizátummal kezelték. Arra a következtetésre jutottak, hogy a citotoxicitásért

felelős proteinek, amelyeket a coelomafolyadékból azonosítottak, nagy valószínűséggel a

coelomasejtek termékei.

Kobayashi és munkacsoportja (2001) a coelomasejtek citotoxikus hatását vizsgálta

gerinces és gerinctelen célsejtekkel szemben. Azt tapasztalta, hogy a coelomafolyadék toxikus

hatást fejtett ki gerinces sejteken, gerincteleneken azonban gyengébben vagy nem fejtett ki

hatást. Arra a korábbi megállapításra alapozva, miszerint a (1) coelomafolyadékban található

lysenin specifikusan sphingomyelinhez kötődve éri el membránkárosító hatását, (2)

sphingomyelin pedig nincs vagy kevés található a gerincesek membránjában, a

26

coelomafolyadék citotoxikus hatásáért olyan molekula/molekulák felelősek, amelyek a

sphingomyelint használják támadáspontként.

Az elektromosan nem gerjeszthető sejtek működésében a citoplazmába való

kálciumbeáramlás (Ca2+

influx) részt vesz olyan folyamatok szabályozásában, mint az

exocitózis, enzim-kontroll, génexpresszió-szabályozás, sejtnövekedés, sejtproliferáció és az

apoptózis. A Ca2+

influx folyamata során a plazmamembrán, a mitokondriumok, és - a

legfontosabb, intracelluláris kálciumraktár - az endoplazmatikus retikulum

kálciumcsatornáinak megnyílásával következik be. A Ca2+

influx legfőbb útvonala ezekben a

sejtekben az intracelluláris kálciumraktárak citoplazmába ürítése (Parekh 2003).

A biomembránok elszórtan olyan elkülöníthető területekkel rendelkeznek, amelyek

sphingolipidekben illetve koleszterinben gazdag szigetekként jelennek meg a membránban

(lipid raftok). Ezeknek a membránszakaszoknak a tanulmányozása még nehézségekbe

ütközik, ugyanis a megismeréshez szükséges technikai feltételek még csak részben adottak.

Az már ismert azonban, hogy olyan molekulák, mint a kolera toxin vagy a gyűrűsférgekben

azonosított lysenin olyan specifikus membránszakaszokat ismernek fel, amelyek

sphingolipidben gazdagok. A lysenin sphingomyelinhez kötődése következtében lysenin

molekulák oligomerizációja következik be, ami pedig a célsejt membránján pórusképződési

folyamatot indít el. A sphingomyelin-megkötés indukálta Ca2+

influx jelet és ERK

foszforilációt lyseninkezelt Jurkat T sejteken (leukémiás sejtvonal) tanulmányozták

(Kiyokawa és mtsai. 2005).

2.4. A gyűrűsférgek regenerációja

A giliszták életmódjából következik, hogy gyakran éri az állatokat sérülés, ennek

következtében anterior vagy posterior szelvényeket veszítenek. Herlant-Meewis (1965)

szerint a giliszták regenerációjának módja és sikeressége az amputáció anatómiai helyétől

függ. A farki regeneráció során, amikor a szelvények eltávolítása a nyerget követő

testrészekben történt, a műtétet követően sebgyógyulás és regenerációs blastema kialakulása

következett be. Az újra képződő szelvények ebből a regenerációs blastemából képződnek. A

regenerációs blastema eredete ma még nem teljesen ismert. Találhatók benne (i) myoblastok,

amelyek a dedifferenciálódó bőrizomtömlő és bélcsatorna izomzatából származnak, (ii)

bélcsatorna-hámsejtek és (iii) a coelomafolyadékban szabadon úszó mezodermális eredetű

neoblastok és coelomasejtek, melyek a sérülés helyére vándorolnak (Jamieson 1981).

27

Több kutató felvetette, hogy a regeneráció során a sértett szövetek felszínén megtapadó

coelomasejtek egyes típusai dedifferenciálódnak és más szöveti sejtekké (izom- és

idegszövet) alakulnak át (Herlant-Meewis 1965; Jamieson 1981).

Napjainkban általánosan elfogadott elmélet, hogy a giliszták mezodermális eredetű

őssejtjei, az ún. neoblastok valamint a coelomasejtek a különböző sértett területekre

vándorolnak. A neoblastok jellemzően kisméretű basofil sejtek, amelyeknek feltűnően nagy

sejtmagját keskeny citoplazmaszegély veszi körül (Herlant-Meewis 1965, Jamieson 1981). A

blastema kialakulásának sejtszintű háttere még nem teljesen ismert, de a hasdúclánc

ganglionjának jelenléte mindenképp szükséges a szelvények regenerációjához. A hasdúclánc

ganglionjának eltávolítása a sértett szelvényekből késlelteti az új farki szelvény kialakulását

(Herlant-Meewis 1965). Ezen kívül a kutatók megállapították, hogy a gyűrűsférgek központi

idegrendszere nemcsak mediálja a regenerációs folyamatokat, hanem maga is képes sérülést

követő regenerációra (Herlant-Meewis 1965, Jamieson 1981).

2.5. Neuroimmun kölcsönhatások

Egyre több kísérleti adat bizonyítja, hogy az ideg- és az immunrendszer különböző

kémiai anyagok (citokinek, neuropeptidek) átadásával képes kommunikálni egymással. Ezen

kívül számos ún. neurotranszmitter-szerű neuropeptid rendelkezik endogén hírvivő funkcióval

az immunrendszerben, és részt vesz az immunválasz egyes komponenseinek a

szabályozásában. Minden szervezet rendelkezik valamilyen szintű homeosztázis-

szabályozással, amely folyamatban bioaktív molekulák – többek között - antibakteriális

peptidek vesznek részt. Az antibakteriális peptidek jelenléte a gerinctelen és a gerinces

proenkefalin neuropeptid prekurzorokban (enkelytin, peptid B) azt a hipotézist támasztja alá,

hogy néhány neuropeptid prekurzor részt vesz az immunválasz kialakulásában. Az ezekben a

prekurzorokban megtalálható peptidek magas antibakteriális aktivitásukkal további opioid

peptidekkel asszociálva immunkapcsolt kölcsönhatásokban vesznek részt (Salzet 2001).

Napjainkban már sok neuropeptid ismert, amelyek fontos szerepet játszanak az egysejtű

és többsejtű élőlények életműködéseiben. Egyes neuropeptidek, úgymint az

oxitocin/vazopresszin, az angiotenzin aminosav-szekvenciája hasonló a gerincesekben és a

gerinctelenekben, ami pedig arra enged következtetni, hogy ezen peptidek korai

megjelenésűek, és konzervatívak az evolúció folyamatában. Ezek a peptidek már korábban

megjelentek, mint az idegrendszer, ami azt sugallja, hogy az elsők között voltak az

28

intercelluláris kommunikációs folyamatokban. Ezek a peptidek kisszámú csoportot alkotnak,

amelyeket ősi gének kódolnak (Salzet 2000).

A neuropeptidek megtalálhatók a gyűrűsférgek központi idegrendszerében és az

immunrendszerben is. Amióta ezeket a molekulákat megtalálták szabadon a vérben,

hormonként is számon tartják őket (Lefebvre és Salzet 2003). A hormonális folyamatok

enzimatikus szabályozása hasonló a gyűrűsférgekben és a gerincesekben. Ezen kívül az

annelidákban szintetizálódó prekurzor génproduktumok aminosav-szekvenciája nagyban

hasonlít az emlősökben termelődő, hasonló funkciót ellátó saját peptidek aminosav-

szekvenciájára. A gyűrűsférgekben, illetve a gerinctelenekben már specifikus neuropeptideket

is azonosítottak. Salzet (2001) olyan peptidekkel foglalkozott gyűrűsférgekben, amelyek az

opioid proopiomelanocortin prekurzorból származnak (opiátok, endocannabinoidok). Ezek a

peptidek nagyon erős immunszuppresszor hatással bírnak és az endokrin- és immunrendszer

közti kommunikáció modellmolekulái. Paraziták ezeket az immunszuppresszor molekulákat

használják fel a gazdaszervezetben (Salzet 2000).

A gyűrűsférgek központi idegrendszerében (agydúc, hasdúclánc) olyan neuroszekréciós

sejteket találunk, amelyek emlős-szerű neuroendokrin szignálmolekulákat

expresszálnak/raktároznak (3. táblázat). A sejtek neuroszekréciós tulajdonságaiknak

köszönhetően főként a vérbe adják le szekrétumaikat. Ezek a neuropeptidek megtalálhatók az

idegrendszeren kívül a gyűrűsférgek vérében, egyes célszövetekben és az immunsejtekben is.

Szerepük a mai napig nem teljesen tisztázott. Főként regenerációs és szaporodási

folyamatokban résztvevő hormonokat, faktorokat termelnek (Aros és Vígh 1959; Laverack

1964). Ezen kívül pedig azonosítottak egy specifikusan annelidákra jellemző negyedik

peptidcsoport, a myotropikus peptideket (Oumi és mtsai. 1995). A táblázatban felsorolt

peptidek emlősökben főként mint neurohormonok játszanak szerepet különböző folyamatok

szabályozásában. Felvetődik a kérdés, hogy a gyűrűsférgek és a gerincesek neuroendokrin

jelátviteli molekulái mennyire hasonlítanak. Körülbelül 30 neuropeptidet izoláltak már

gyűrűsférgekből, amelyek nagy részét már korábban azonosították gerincesekben.

29

3. táblázat: Neuropeptidek a gyűrűsférgek idegrendszerében.

A fent említett neuropeptidek közül kiemelt fontosságú a PACAP (pituitary adenylate

cyclase-activating peptide), amely az irodalmak szerint többek között neurotrofikus és

neuroprotektív hatással is rendelkezik. A PACAP egy 38 aminosavból álló neuropeptid

(PACAP38), amelyet eredetileg birka hipothalamusában írtak le. Serkenti a ciklikus AMP

(cAMP) termelést a patkány adenohipofízisben, és ezáltal fokozza annak növekedési hormon,

prolaktin, corticotropin és sárgatestserkentő hormon termelését fokozza (Miyata és mtsai.

1989). Később izoláltak egy 27 aminosavból álló peptidet is, melynek aminosavsorrendje

megegyezett a PACAP38 N-terminális első 27 aminosav-szekvenciájával (Miyata és mtsai.

1989; Arimura és mtsai. 1991).

A PACAP izoformák, amelyeknek közös receptoruk van a VIP-pel, két receptor-

típushoz kötődnek. Az I. típusú receptort (PAC1) először exokrin pancreas sejtjeiből izolálták

(Buscali és mtsai. 1990). Molekulasúlya 55 és 65 kDa közötti a glikoziláltsági állapottól és az

expresszálódó izoformáktól függően. Közel 500 aminosavból és 7 transzmembrán domén áll,

a PACAP27 és 38 izoformák nagyobb affinitással kapcsolódnak ehhez a receptorhoz, mint a

Neuropeptid Referencia

Angiotenzin Salzet és mtsai. 1992

Annelid gut tetradecapeptide Oumi és mtsai. 1996

Annetocin (Oxitocin-szerű hormon) Oumi és mtsai. 1996

Bombesin Falugi és Davoli 1993

CAPA peptidek Herbert és mtsai. 2009

Cholecystokinin Reglődi és mtsai. 1999

Corticotropin-releasing factor Lkhider és mtsai. 1987

FMRFamide Falugi és Davoli 1993

Gastrin Reglődi és mtsai. 1999

Opioidok Renzelli-Chain és Kaloustian 1995

PACAP Somogyvári-Vigh és mtsai. 2000

2006

Pancreatic polypeptide Sundler és mtsai. 1977

Proctolin Lengvári és mtsai. 1994

Somatostatin Falugi és Davoli 1993

Substance P Falugi és Davoli 1993

Vasoactive intestinal peptide (VIP) Sundler és mtsai. 1977

30

VIP. Splice-variánsai közül már több ismert (pl.: S, Hip-Hop, Vs, TM4). A jelátviteli

mechanizmusok közül jellemzően stimulálja az adenilát cikláz, a PLC útvonalat és

mobilizálja a kálciumraktárakat (Vaudry és mtsai. 2000).

Ezen kívül pedig számos eredmény számol be arról, hogy a PACAP-nak növekedési

faktor-szerű hatása lehet az idegrendszer fejlődésében és a sérülést követő regenerációban

(Vaudry és mtsai. 2000; Waschek 2002). Kimutatták, hogy a PACAP szabályozza az

axonfejlődést (Guirland és mtsai. 2003), illetve elősegíti az axonális regenerációt a sérülések

helyén (Kimura és mtsai. 2003). A PACAP hatása a gerincesek embrionális neurogenezisben

(Sherwood és mtsai. 2007; Waschek 2002), illetve a perifériás idegrendszer regenerációjában

már korábban ismertté vált (Meyer 2006). A neurotrofikus hatáson túl, exogén PACAP in

vitro toxicitás és in vivo agyi pathológiás modellekben elért protektív hatását vizsgálták

(Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Más szerzők a PACAP protektív hatását vizsgálták

apoptózist indukáló tényezőkkel szemben kisagyi szemcsesejtekben (Vaudry és mtsai. 2003),

valamint kimutatták, hogy a PACAP csökkenti a károsodást és javítja a funkcionális

eredményeket Parkinson-kóros modellekben (Reglődi és mtsai. 2004). Az idegrendszerben

feltehetően léteznek olyan védelmi mechanizmusok, amelyek helyreállítják a kisebb

sérüléseket és indukálják az idegi javító mechanizmusokat, és ebben a működésben

valószínűleg fontos szerepet játszik a PACAP. Az E. fetida szervezetében már

tanulmányozták ezeknek a molekuláknak az eloszlását, főként az idegrendszeri struktúrákban

(Molnár és mtsai. 2006).

A vizsgált peptideknek a gerinces állatcsoportokban számos funkciót tulajdonítanak,

úgymint a vazoreguláció vagy a cirkadián ritmus szabályozása (Colwell és mtsai. 2004). Több

kutatócsoport foglalkozik a PACAP szerepével a gerincesek immunfolyamataiban.

Hízósejtekben a PACAP stimulálja a hisztamin és a szerotonin termelését, amely arra enged

következtetni, hogy a molekula valószínűleg befolyásolja a gyulladásos folyamatok

szabályozását (Mori és mtsai. 1994; Seebeck és mtsai. 1998). Makrofágokban a PACAP

gátolja az IL-6, az IL-2 és a TNF-α, emellett pedig serkenti az IL-10 termelődését. Mindez

arra a következtetésre ad lehetőséget, hogy a PACAP és agonistái gátolják a

proinflammatórikus és serkentik az anti-inflammatórikus folyamatokat, vagyis lassítják a

gyulladásos folyamatokat (Delgado és mtsai. 1998; Martinez és mtsai. 1998).

31

3. Célkitűzések

Napjainkban a trágyagiliszta a toxikológiai, regenerációs, neurobiológiai és

immunbiológiai vizsgálatoknak egyaránt kedvelt tesztállata. Ennek oka, hogy

laboratóriumban természetes életkörülményei könnyen biztosíthatóak és gyorsan szaporodik.

A manapság alkalmazott mikrotechnikai és biokémiai módszerek ennél a fajnál viszonylag

könnyen kivitelezhetőek. Ezen okok miatt választottuk modellállatként az E. fetida (Annelida,

Oligochaeta) kifejlett egyedeit.

Az oligochaeták immunkompetens sejtjei a másodlagos testüregben megtalálható

coelomasejtek.

Ezen sejtek pontosabb megismerése érdekében vizsgálatainkat három szempont szerint

végeztük:

1. A coelomasejtek morfológiájának, citológiájának tanulmányozása, az egyes

sejttípusok elkülönítése, esetleges új sejtalakok leírása.

A kevéssertéjű gyűrűsférgek más fajaiban (D. veneta; A. chlorotica; L. terrestris) már

korábban történt ilyen jellegű vizsgálat. A tesztállatunk egyéb területeken való gyakori

alkalmazása miatt fontosnak tartottuk a faj coelomasejtjeinek részletes tipizálását,

hisztológiai, hisztokémiai és ultrastruktúrális leírását.

2. A coelomasejtek funkciójára vonatkozó egyre bővülő ismereteinket szerettük volna

kiegészíteni a sejtek regenerációban és citotoxikus folyamatokban betöltött szerepével.

a) A gyűrűsférgek nagyfokú regenerációs képessége ma is kedvelt kutatási

célpont. Kísérleteink során egy korábban már gerincesekben bizonyítottan

neuroprotektív hatással rendelkező anyag – a hipofízis adenilát cikláz aktiváló

peptid (PACAP) - szerepét vizsgáltuk E. fetida caudális regenerációjában.

Ezen belül vizsgálni kívántuk az egyes coelomasejtek PACAP és specifikus

receptora- a PAC1 - expressziójának mintázatát, a PAC1-szerű peptid

ultrastruktúrális megjelenését és molekuláris biológiai jellegzetességeit,

valamint a PACAP-szerű peptidek koncentrációváltozását a coelomasejtekben

a regeneráció során.

b) A coelomasejtek immunreakciókban betöltött szerepének tisztázása érdekében

vizsgálni kívántuk a sejtek fagocitotikus képességét, amelyet vizsgáltak már

korábban más fajokban. Korábbi ismereteink szerint a coelomasejtekből

készült homogenizátum citotoxikus hatást vált ki egyes sejtvonalakon, ezért

32

coelomasejtek homogenizátumával való inkubálás hatását vizsgáltuk daganatos

sejtvonalon transzmissziós elektronmikroszkópos módszerrel és intracelluláris

kálcium ion koncentráció-meghatározással.

3. A kevéssertéjűek coelomasejtjeinek származására vonatkozóan számos teóriát találunk

a szakirodalomban. Ez alapján a sejtek származhatnak a somatopleurából, illetve a

splanchnopleurális eredetű chloragogen szövetből. Ennek tisztázása érdekében

ultrastruktúrális vizsgálatokat kívántunk végezni.

33

4. Anyagok és módszerek

4.1. A kísérleti állatok tartása

Kísérleteink során ivarérett trágyagiliszta (Eisenia fetida, Oligochaeta, Annelida)

egyedeket használtunk fel. Az állatokat a Pécsi Tudományegyetem Általános Állattani

Tanszékén 1985-óta fenntartott tenyészetből vettük, standard laboratóriumi körülmények

között tartottuk (hőmérséklet: 20 ± 1°C, napi 12 órás megvilágítás, folyamatos légcsere, a

tenyésztalaj összetétele: 50% hansági tőzeg és 50% lótrágya, nedvességtartalma ~60%). A

kísérletek megkezdése előtt 48 órával a kiválogatott állatokat csapvízzel nedvesített

papírvattán tartottuk, amíg bélcsatornájukból a talajszemcsék kiürültek. A kísérletek előtt az

állatokat csapvízzel alaposan megtisztítottuk.

4.2. A coelomasejtek izolálása

A kísérleti állatokat 4ºC hőmérsékletű coelomasejt-izoláló puffert (71,2 mM NaCl; 5

mM EGTA; 50,4 mM guiacol–glycerol–éter; 5% (v/v) etil-alkohol; pH 7,3) tartalmazó

főzőpohárba helyeztük. A kémiai hatásra kipréselt coelomasejteket tartalmazó szuszpenzióval

különböző vizsgálatokat végeztünk.

4.3. Egér agy és hipofízis kiboncolása a Western blot analízis kontroll

mintáihoz

Az egereket (BALB/c) kloroformmal túlaltattuk, majd bonctálban rögzítettük hasi

oldalukkal lefelé. A koponya bőrét és a koponyatető csontjait eltávolítottuk, a gerincvelőt

elvágtuk a koponyaalap magasságában, majd kiemeltük az agyat és a hipofízist. Az izolált

szerveket RIPA (Radio-immuno-precipitation assay buffer; összetétele: 50 mM Tris/HCl; 150

mM NaCl, 1 % (v/v) NP-40, 0.5 % (w/v) Na-deoxycholate, 5 mM EDTA, 0.1 % SDS,

protease inhibitor cocktail, pH 8.0) pufferbe helyeztük, majd üvegből készült homogenizáló

potterrel (Potter-Elvehjem PTFE, Sigma) homogenizáltuk. Minden szervből három mintát

készítettünk. A mintákkal Western blot analízist végeztünk (ld. 4.5.1.).

34

4.4. Fénymikroszkópos hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatok

A fénymikroszkópos klasszikus hisztológiai és hisztokémiai vizsgálatokat intakt állatok

coelomasejtjein végeztük. A kenetpreparátumokat tisztított és zselatinozott tárgylemezre

készítettük.

4.4.1. May-Grünwald Giemsa (Pappenheim-féle panoptikus festés)

A coelomasejtek általános karakterizálására konvencionális May-Grünwald Giemsa féle

kontrasztosítást használtunk. A kenetpreparátumokra tömény, frissen szűrt May-Grünwald

oldatot cseppentettünk, majd 2 perc után a festékkel megegyező mennyiségű desztillált vizet

juttattunk a tárgylemezekre a festék leöntése nélkül. Ezután a higított festéket még 3 percig a

preparátumon hagytuk, utána bő desztillált vízzel lemostuk. Ezután a Giemsa oldatot

juttattunk a kenetekre (2 ml desztillált vízben 3 csepp tömény Giemsa oldat), amelyet 10

percig hagytunk a tárgylemezeken, majd alapos desztillált vizes mosás után felszálló

alkoholsorban víztelenítettünk. Ezután xilolban derítettünk és DePeX-szel (Fluka) lefedtük a

kontrasztosított preparátumokat.

4.4.2. Hematoxilin-eozin festés

A coelomasejtek citoplazmájában található granulumok karakterizálására és sejtmagjuk

jellemzésére első körben hematoxilin-eozin festést alkalmaztunk. A kenetpreparátumokat

Carnoy-fixálóban (3 ml etil-alkohol, 0,5 ml jégecet, 1,5 ml kloroform) 10 percig rögzítettük.

Mosás után hagyományos szukcedán alumínium-hematoxilin (Carazzi-féle) -eozin festéssel

kontrasztosítottuk mintáinkat, majd felszálló alkoholsoros víztelenítés és xilolos derítés után

DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk.

4.4.3. Perjódsav-Schiff-reakció

A vizsgálandó coelomasejtek citoplazmájának szénhidráttartalmát Perjódsav-Schiff

reakció alkalmazásával vizsgáltuk. A kenetpreparátumokat Carnoy-fixálóban 10 percig

rögzítettük. Mosás után 5 percig perjódsavval oxidáltuk a mintákat, majd alapos csapvizes és

desztillált vizes mosás után 15 percig Schiff-reagenssel reagáltattuk. Ezután alapos

kénessavas, majd csapvizes és végül desztillált vizes mosás után Carazzi-féle alumínium-

hematoxilinnel magfestést hajtottunk végre. Végül felszálló alkoholsoros víztelenítést és

xilolos derítést követően a preparátumokat DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk.

35

4.4.4. Szudánfekete festés

A citoplazma-granulumok lipidtartalmát Szudánfekete festéssel jellemeztük. A

preparátumokat Baker-formalinnal (1 ml 40%-os formaldehid, 1 ml 10%-os kálcium-klorid, 8

ml desztillált víz) 10 percig rögzítettük. Alapos csapvizes és desztillált vizes mosás után 3

percig 70%-os etil-alkoholban áztattuk a keneteket, majd a festést 60 percig 37ºC-on

Szudánfeketével végeztük, amelynek telített oldatát 70%-os etil-alkoholban elegyítettük. A

differenciálást is 70%-os etil-alkoholban végeztük, majd alapos desztillált vizes mosás után

neutrálvörössel magfestést végeztünk. A hidrofób lipidek eltávolítása után a kenetek nem

mutattak Szudán pozitivitást. Ebből arra következtethetünk, hogy a Szudán festésünk sikeres

és specifikus volt. Mosás után a preparátumokat glicerinnel fedtük le.

4.4.5. Akridinoranzs festés

Az Akridinoranzs festést a granulumok savas ph-jának kimutatására használtuk. A

keneteket 4%-os paraformaldehiddel 10 percig fixáltuk. Desztillált vizes mosások után 1

mg/ml koncentrációjú Akridinoranzs oldattal kontrasztosítottuk a mintákat. Az újabb

desztillált vizes mosás után vizes fázisban fedőlemezzel lefedtük és azonnal fluoreszcens

fénymikroszkóppal vizsgáltuk.

36

4.5. Funkcionális vizsgálatok

4.5.1. A coelomasejtek szerepének vizsgálata a regeneráció folyamatában

7. ábra: A regenerációs kísérletek metodikai összefoglalása.

A 4 ºC-os szódavízben elbódított intakt ivarérett kísérleti állatokat a clitellum utáni 23.

szelvénynél átvágtuk, majd az operált állatokat táptalajra helyeztük, és standard laboratóriumi

körülmények között tartottuk. Az állatok egy részét a műtét után 3 órával, 1, 5 nappal, illetve

1 és 2 héttel használtuk fel szövettani és elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz. Ezen kívül a

műtött állatok egy részéből az előzőekben ismertetett módon coelomasejteket izoláltunk és a

következőkben ismertetett vizsgálatokat végeztük el rajtuk (7. ábra).

Regenerálódó testvég fénymikroszkópos vizsgálata

A regenerálódó egyedek egy részének levágtuk a regenerálódott testvégét, azokat

módosított Karnovsky-oldatban (2% paraformaldehid; 2,5% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát

puffer) fixáltuk 2 órán át 4ºC-on, majd foszfát pufferes mosást követően 1%-os OsO4-ban

szintén 2 órán át 4ºC-on ozmifikáltuk. Felszálló alkoholsoros víztelenítés és propilén-oxidos

derítés után epoxi-gyantába (Durcupan, Sigma) ágyaztuk a mintákat. A fénymikroszkópos

vizsgálatra szánt blokkokból Reichert típusú ultramikrotommal 1 μm vastagságú félvékony

37

metszeteket készítettünk, és azokat zselatinos tárgylemezre vittük fel. A preparátumokat

toluidinkék festéssel kontrasztosítottuk, majd DePeX-es (Fluka) fedéssel állandósítottuk.

PACAP27 és PACAP 38 fénymikroszkópos immunhisztokémia

A kiboncolt testrészeket frissen készített, jéghideg 4 %-os paraformaldehidben fixáltuk.

Foszfát pufferben (PBS) való mosás után a mintákat 0,1%-os Triton X-100-tartalmú foszfát

pufferben (PBS pH 7,4) szobahőmérsékleten permeabilizáltuk, az endogén peroxidázok

gátlása érdekében metanol és H2O2 keverékében inkubáltuk, majd az aspecifikus jelölődés

csökkentése érdekében 10%-os borjúszérumban tartottuk 30 percen át. Ezt követően a

mintákat PACAP27 (88121-5) vagy PACAP38 (88111-3) antiszérumot tartalmazó oldatban

inkubáltuk (PBS-ben oldva, 1:800) egy éjszakán át. Az inkubálás után a mintákat egy

éjszakán át PBS-ben mostuk, majd kecske anti-nyúl biotinilált IgG (1:100, PBS-ben oldva)

inkubáltuk 8 órán át. PBS-ben való 4 órás mosást követően a preparátumokat avidin-biotin-

tormaperoxidáz enzim oldatban inkubáltuk egy éjszakán keresztül. Ezután 2 órás PBS-sel

való mosást követően 0,1 M PB-ben feloldott 0,03%-os 3,3’-diaminobenzidin (DAB) és

0,01% hidrogén-peroxid (H2O2) keverékét használtuk a reakció vizualizálásához. Az antitest

jelölést állandó sztereomikroszkópos kontroll mellett végeztük. A reakció leállításához a

mintákat PBS-ben mostuk. Ezután a preparátumokat glicerinnel fedtük le, vizsgálatukat

NIKON Opiphot-2 fénymikroszkóppal végeztük.

Radioimmunoassay (RIA)

Az izolált coelomasejtek tömegének lemérése után a sejteket jéghideg desztillált vízben

homogenizáltuk. A homogenizátum centrifugálása után (12000 rpm, 4 ºC, 30 min) a

felülúszót használtuk PACAP-szerű immunreaktivitás vizsgálatára. A vizsgálatot korábbi

leírás alapján végeztük el (Jakab és mtsai. 2004). Röviden: A jód radioaktív izotópjával jelölt

szarvasmarha PACAP27-et illetve 38-at reverz fázisú HPLC oszlopon tisztítottuk. Standard

hígítási sorban szintetikus szarvasmarha PACAP27/38-at (Sigma) használtunk 0 és 1000

fmol/ml koncentráció-tartományban. A méréseket 0,05M-os foszfát pufferben (0,1M NaCl;

0,05% NaN3; 0,25% BSA; pH 4) készítettük elő. A polipropilén csőhöz, amely a foszfát

puffert tartalmazta, 100 µl higított antitestet (1:100 000), 100 µl radioimmunoassay tracert

(5000 cpm/cső) és 100-100 µl higított PACAP27-et illetve 38-at a hígítási sorból vagy a

mintánkból. Az antitesthez kötött komplexet 4 ºC-on 48-72 órán keresztül inkubáltuk, majd

100 µl szeparáló oldat (10 aktív szén, 1 g dextrán, 0,2 g zsírmentes tejpor 100 ml desztillált

vízben feloldva) hozzáadásával elválasztottuk a szabadon maradt antitestektől. A csöveket

38

centrifugáltuk (3000 rpm, 20 perc, 4ºC), dekantáltuk, majd a kapott precipitátum

radioaktivitását gamma-számlálóval mértük. Az ismeretlen minták PACAP27/38

koncentrációját kalibrációs görbével határoztuk meg. Az eredményeket fmol/mg

PACAP27/38-szerű koncentrációban adtuk meg. A PACAP tartalmak közötti különbséget

ANOVA tesztet követő Neuman-Keul`s posthoc analízissel vizsgáltuk.

Western blot analízis

Az intakt és regenerálódó állatokból izolált coelomasejtek egy részét, illetve az egérből

származó kontroll mintákat fiziológiás oldatban (LBSS: 71,5 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 4,2

mM NaHCO3; 1,1 mM MgSO4 × 7 H2O; 0,4 mM KH2PO4; 0,3 mM NaH2PO4; pH 7,3)

centrifugáltuk (3400 rpm, 4°C, 4 perc), majd a felülúszót proteáz inhibitort (Protease Inhibitor

Cocktail, Sigma) tartalmazó homogenizáló pufferbe (RIPA) helyeztük, és ismét centrifugáltuk

(13000 rpm, 4ºC, 15 perc). A felülúszót 0,5 M Tris-HCl-t, glicerolt, SDS-t, brómfenol- kéket

és β-merkaptoetanolt tartalmazó pufferben főztük. Lehűtés után a mintát SDS-poliakrilamid-

elektroforézis segítségével 200 volt feszültség alkalmazásával futtattuk, majd nitrocellulózra

blottoltuk. Ezután a mintákat PAC1-receptor antitestet (Sigma) tartalmazó primer szérumban,

majd tormaperoxidázhoz konjugált szekunder antitesttel inkubáltuk. Ezután

kemilumineszcenciás detektálást végeztünk. A kontrollként alkalmazott egér agyszövetből és

hipofízisből származó minták előkészítését és vizsgálatát a coelomasejtekkel megegyező

módon végeztük.

Savanyú foszfatáz citokémia

A savanyú foszfatáz (EC 3.1.3.2.) citokémiai lokalizációjához Ericsson és Trump

(citálja Molnár és Gábriel 2001) módszerét alkalmaztuk. A regenerálódott testvégeket 6,25 %-

os pufferelt glutár-aldehidben hidegen fixáltuk, majd intenzív 7,5 %-os szacharózos pufferben

(pH 6,0-6,2) való mosás után a mintákból kriosztát metszeteket készítettünk, amelyeket 30

percre frissen készített Gömöri-féle inkubáló médiumba (5,2 pH-jú 0,1 M-os acetátpufferben

oldott Pb(NO3)2 és nátrium-β-glicerofoszfát keveréke) helyeztünk. Inkubálás után a mintákat

1 percig 0,1 M acetátpufferben és 30 percig 2 %-os ecetsavoldatban tartottuk. Ezután a

mintákat víztelenítettük és epoxi gyantába (Durcupan, Sigma) ágyaztuk. A blokkokból

Reichert típusú ultramikrotómmal ultravékony (60-70 nm) vastagságú metszeteket

készítettünk, amelyeket Jeol 1200C típusú elektronmikroszkóppal vizsgáltunk.

39

Áramlási citometria

A regenerálódó állatokból izolált coelomasejteket 10 % borjúszérumot tartalmazó RPMI

1640 (FCS, Sigma) mostuk, majd enyhe centrifugálás (500 rpm, 5 perc) után mintánként 106

db sejtet használtunk fel a további vizsgálatokhoz. A sejteket 4 % paraformaldehiddel (LBSS-

ben oldva) rögzítettük 20 percig, majd először 0,1 % NaN3 tartalmú giliszta-ringerben, majd

0,1% szaponint és 0,1 % NaN3-tartalmazó giliszta-ringerrel mostuk. Savanyú foszfatáz

immuncitokémiai reakció alkalmazása után (savanyú foszfatáz antitest-Sigma. 1:50, biotinnal

jelölt anti-nyúl antitest 1:100, streptavidin-FITC 1:100) a sejteket szaponin tartalmú giliszta-

ringerrel, szaponint és NaN3-tartalmazó giliszta-ringerrel mostuk, végül 0,1 %-os

paraformaldehiddel rögzítettük és Becton Dickinson FACS Calibur cytométerrel vizsgáltuk.

Adatainkat FCS Express szoftverrel dolgoztuk fel.

4.5.2. Birka vörösvértestek fagocitózisának vizsgálata

Formalinnal fixált birka vörösvértesteket alapos mosás után LBSS-ben diszpergáltuk,

majd fecskendővel szódában bódított egyedek testüregébe juttattuk. A beavatkozást követően

az állatokat nedves papírvattán tartottuk, majd 1, 3 és 5 nap után szövettani feldolgozást

hajtottunk végre rajtuk. A beavatkozás helyétől caudális irányban lévő szelvényeket Carnoy-

fixálóban rögzítettük. A mintákat fixálás után felszálló alkoholsorban víztelenítettük,

benzolban derítettük, majd paraffinba ágyaztuk. A mintákból készült félvékony metszeteket

standard hematoxilin-eozin módszerrel kontrasztosítottuk, DePeX-szel (Fluka) állandósítottuk

és fénymikroszkóppal vizsgáltuk.

4.5.3. Citotoxicitás vizsgálata

Az Sp2 sejtvonalból (Sp2/0-Ag14; egérből származó myeloma sejtvonal) származó

sejtekhez giliszta coelomasejtekből származó lizátumot adtunk a sejtlizátum citotoxikus

hatásának vizsgálatára. Az izolált coelomasejtek szuszpenziójában sejtszámlálást végeztünk,

amelynek eredménye: 107 sejt/ml. A sejteket centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc), majd LBSS-

ben reszuszpendáltuk. Ezután a sejtszuszpenzión ultrahangos lizálást végeztünk, majd a

lizátumot centrifugáltuk (13000 rpm, 4ºC, 15 perc), a felülúszót használtuk coelomasejt-

lizátumként (CCL).

Kontrollként Jurkat sejtvonalból származó sejtekből készített lizátumot használtunk.

Ennek előkészítése a coelomasejt-lizátum készítésével azonos módon történt.

40

Az Sp2 sejteket kigyűjtés után centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc), majd DMEM

médiumban (Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) reszuszpendáltuk, és

sejtszámlálást végeztünk, amelynek eredménye: 3,4×106 sejt/ml. A sejteket centrifugacsőben

30 percig szobahőmérsékleten állandó rázatás mellett feltöltöttük 1 % Fluo3 AM indikátorral

(Boldizsar és mtsai. 2002; Minta és mtsai. 1989). Ezután a centrifugacsöveket feltöltöttük

DMEM médiummal, és még további 30 percig inkubáltuk a sejteket. Az egy órás inkubálást

követően a sejteket centrifugáltuk (1000 rpm, 5 perc) és reszuszpendáltuk friss DMEM

médiumban, úgy, hogy a végkoncentráció 106/ml lett.

Az Sp2 sejtszuszpenzióból 700 µl –es aliquotokat készítettünk, majd a sejteken a Ca2+

-

szignál mérést Becton-Dickinson FACSCalibur áramlási citométeren végeztük. Az alap Ca2+

szint 50 másodperces detektálása után a mintákhoz 30 µl coelomasejt-lizátumot adtunk. A

lizátumot 1:1, illetve 1:2 és 1:10 arányban LBSS-ben higított formában is alkalmaztuk, annak

érdekében, hogy a lizátum esetleges dózisfüggő tulajdonságát is megvizsgáljuk. A Fluo-3 AM

indikátor fluoreszcens szignálját az FL1 csatornában végeztük. Kontrollként a sejtekhez 30 µl

LBSS-t illetve 30 µl Jurkat lizátumot adtunk.

4.6. Ultrastruktúrális vizsgálatok

Az ultrastruktúrális vizsgálatok során négyféle kísérletsorozat készült:

(i) Intakt állatok coelomasejtjeinek szuszpenzióját Eppendorf-csőben centrifugáltuk

(3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára leülepedő aggregálódott

coelomasejteket ezután már sejtrögként kezelve fixáltuk. A fixálószer összetétele:

1% OsO4 (125 µl 4%-os OsO4), 2,5% glutár-aldehid (50 µl 25% glutár-aldehid),

0,1 M kakodilát puffer (250 µl 0,2 M kakodilát puffer), desztillált víz (75 µl).

(ii) PAC1-receptor immuncitokémiára szánt regenerálódott testvégeket módosított

Karnovsky-oldatban fixáltuk. A fixálószer összetétele: 2% paraformaldehid; 2,5%

glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer; desztillált víz.

(iii)A coelomasejt-lizátum citotoxikus hatásának vizsgálatához 700 µl Sp2

sejtszuszpenziót 30 µl coelomasejt-lizátummal, illetve kontrollként ugyanennyi

LBSS-sel és Jurkat sejtlizátummal 10 percig inkubáltuk. Ezután a mintákat

Eppendorf-csőben centrifugáltuk (3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára

leülepedő aggregálódott sejteket fixáltuk. A fixálószer összetétele: 4%

paraformaldehid; 0,3% glutár-aldehid; 0,1 M foszfát puffer; desztillált víz.

(iv) Az ezüst-nanopartikulum (AgNP) hatásának vizsgálatakor a coelomasejtek 24 órás

nanopartikulum-kezelését követően a sejteket Eppendorf-csőben centrifugáltuk

41

(3000 rpm, 5 perc), majd az centrifuga-cső aljára leülepedő aggregálódott sejteket

fixáltuk. A fixálószer összetétele: 4% paraformaldehid; 0,3% glutár-aldehid; 0,1 M

foszfát puffer; desztillált víz.

A fixálást követően az (i) kísérlet kivételével a mintákat 0,1 M PB-ben mostuk, majd 2

órán keresztül 1%-os OsO4-ban utófixáltuk. Az ozmifikálást követően mind a négy mintát

felszálló alkoholsorral víztelenítettünk, propilén-oxiddal derítettük, majd epoxi-gyantába

(Durcupan, Sigma) ágyaztuk. A blokkokból Reichert típusú ultramikrotommal ultravékony

(60-70 nm) metszeteket készítettünk. A metszeteket nikkel-mikrostélyra vittük fel.

A PAC1-receptor immuncitokémiára előkészített mintákat deozmifikálás után 5%-os

normál kecske szérumban 30 percig előinkubáltuk (NaCl-ot tartalmazó TBS-ben) oldva, pH

7,6), majd a grideket szobahőmérsékleten egy éjszakára anti-PAC1 receptort (Sigma)

tartalmazó szérumcseppre helyeztük. Több TBS-ben történt mosás után a grideket 18 nm-es

aranyszemcsékhez kötött anti-nyúl IgG antiszérumot tartalmazó cseppekre helyeztük. A

mintákat desztillált vízben mostuk.

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok előtt mind a négy minta gridjeit uranil-acetáttal és

Reynolds-féle ólom-citráttal kontrasztosítottuk. A minták vizsgálatát Jeol 1200C típusú

elektronmikroszkóppal végeztük.

4.7. Dokumentáció, képfeldolgozás, számítógépes utómunkálatok

A totálpreparátumok, a félvékony sorozatmetszetek és a kenetek vizsgálatához Nikon-

Otiphot-2 típusú fénymikroszkópot alkalmaztunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatainkat

JEOL-1200 típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal végeztük. A fotófilmre előhívott

negatívokat és a western blot kísérleteink eredményét tartalmazó röntgenfilmeket

professzionális lapolvasóval digitalizáltuk. A digitalizált képeken utólagos fényerő- és

kontraszt-változtatásokat Adobe Photoshop CS3 programmal végeztünk. A diagramokat

Microsoft Excel 2007 segítségével készítettük. A radioimmunoassay módszerrel kapott

PACAP-tartalom különbségeket varianciaanalízist követő Neuman-Keul-féle post hoc

analízissel becsültük meg.

42

5. Eredmények

5.1. Intakt állatok coelomasejtjeinek morfológiai leírása

Az E. fetida coelomafolyadékában található sejtek vizsgálatakor a fő sejttípusok

elkülönítéséhez a sejtek méretét, sejtmagjuk alakját, méretét és elhelyezkedését valamint a

citoplazma granuláltságát vettük figyelembe. Három korábban más fajban leírt sejttípus

azonosítása történt meg: (i) eleocyta; (ii) amoebocyta; (iii) granulocyta. Ezen kívül pedig

elszórtan bazofil citoplazmájú sejteket találtunk, valamint olyan sejteket, amelyek sejtmagján

erőteljes invagináció mutatkozik. A sejttípusok vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a három

immunkompetens coelomasejttípus (i-iii) nem homogén sejtpopuláció. A sejtek kromatinja,

magvacskája, granulumainak száma és elhelyezkedése, illetve a nyúlványok megléte, száma

és kiterjedése is változatosságot mutat egy-egy populáció tagjai között.

5.1.1. Az eleocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése

A hematoxilin-eozin festés során a sejtek citoplazmája nem festődött. A sejtek

lekerekítettek, átlagosan 25-30 µm átmérőjűek. Találtunk olyan lehetséges sejtalakokat is,

amelyeknek nincs, vagy nem látszik a sejtmagjuk. Ezek valószínűleg sejttöredékek,

amelyeket az ultravékony mintáinkon is megtaláltunk. Ha van sejtmag, akkor az a sejt

közepén helyezkedik el. A citoplazmában lévő különböző méretű nem festődő képletek a

citoplazma nagy részét elfedik, de még a sejtmag felületére is benyúlnak. A sejteknek

nyúlványai nincsenek és nem aggregálódnak (8/a, b ábra).

May-Grünwald Giemsa – féle kontrasztosítás során a korábban eleocytaként leírt

sejttípuson belül 3 alpopuláció különböztethető meg.

1. Az első típus, amely a legtöbbször fordul elő kenetben, nagyméretű (20 – 35 µm).

Sejtmagja általában középen helyezkedik el (4-5 µm), sötéten festődik, eukromatinizáció nem

látható benne. A sejt felszíne a nagy granulumok miatt nem egyenletes, követi a granulumok

alakját. A granulumok valószínűleg lipideket tartalmaznak. A granulumok mérete kb. 4-5 µm.

A granulumok a citoplazmát teljesen kitöltik, más típusú granulum nem található benne. A

sejtek gyakran csoportosan láthatók a kenetekben (8/c ábra).

2. A második eleocyta altípus sejtátmérője kisebb, 15-20 µm. A sejtmagjuk nagyobb (6-

7 µm), általában excentrikus elhelyezkedésű. A citoplazmában található granulumok, amelyek

nem festődnek, valószínűleg lipidet tartalmaznak. A granulumok mérete kisebb (1-2 µm),

43

mint az első altípusnál. Mivel a granulumok kisebbek, a citoplazma jobban festődik (8/d

ábra).

3. A harmadik típusú eleocyta mérete 20-25 µm. A sejtmag kicsi és centrális helyzetű,

erősen bazofil. Citoplazmája csak néhány óriás vakuólumot vagy lipid tatalmú granulumot

tartalmaz. A citoplazma egyáltalán nem festődik, csak sejteni lehet a tartalmát. A sejtek

gyakran megnyúltak, de nyúlványaik nincsenek (8/e ábra).

PAS reakció során is a korábban tapasztalt 15-25 µm sejtméretet tapasztaltuk.

Citoplazmájukban bazofil és PAS-pozitív granulumok sincsenek. A sejtek lekerekítettek,

nyúlványaik nincsenek.

Az eleocyták korábbi leírása alapján (lipidtartalmú kompartmentek a citoplazmában)

Szudánfekete reakció során több, morfológia alapján elkülöníthető altípust találtunk, amelyek

a következők:

1. A sejtek 25-30 µm átmérőjűek. A sejtmag általában a sejt közepén helyezkedik el,

csak részben látszik a granulumok takarása miatt. 1-2 µm Szudánfekete-pozitív granulumok

találhatók elszórtan a citoplazmában. A kisméretű Szudánfekete-pozitív granulumok mellett a

sejtek nagyméretű, Szudánfeketével sem festődő vakuólumokat tartalmaznak (8/f ábra).

2. A sejtek 20 – 30 µm átmérőjűek. A sejtmag általában látható, a sejt közepén található.

A sejtek nagy, hólyagszerű granulumokat tartalmaznak a citoplazmában, a granulumok

perifériája Szudánfekete-pozitív, a többi része nem festődik, a vakuólumok mérete változó (2-

8 µm) (8/g ábra).

3. A sejtek kisméretűek, kb. 15 µm átmérőjűek. A sejtmag a sejt közepén található,

látszik a sejtmagvacska is. A citoplazmában található Szudánfekete-pozitív, jól elkülönülő

granulumok hosszúkásak, hosszuk 4-5 µm, a sejt perifériáján találhatók (8/h ábra).

4. Maximum 15 µm átmérőjű sejtek, a sejtmag nagyméretű, 5-6 µm átmérőjű. Erősen

Szudánfekete-pozitív 1-2 µm átmérőjű granulumok elszórtan találhatók a sejtben. A nagy,

hólyagszerű képletek hiányoznak a sejtek citoplazmájából. A sejt felszíne nem egyenletes, de

kisebb kiemelkedéseket látunk, mint a nagyméretű eleocytákon (8/i ábra).

5. A sejt kb. 15-20 µm átmérőjű, lekerekített. A sejt felszínén kiemelkedéseket nem

találunk. A sejtmag kerek, kb. 5 µm átmérőjű. A sejtek citoplazmájának külső része

(ektoplazma) homogén, enyhén Szudánfekete-pozitív, endoplazma Szudán negatív

egybefüggő, szinte egy darab nagy hólyag (8/j ábra).

Egyes sejtek akridinoranzs-pozitívnak mutatkoztak. A sejtek 25 – 30 µm átmérőjűek, a

sejtmagjuk a sejt perifériájára szorult. A lipid tartalmú vakuólumok mérete kb. 2-3 µm,

44

alakjuk változó. Azonban találtunk olyan sejteket is, amelyeknek lipidtartalmú granulumaik

sokkal kisebbek (0,5-1 µm) és gömb alakúak (8/k ábra).

8. ábra: Az eleocyták fénymikroszkópos mintákban. (a; b) HE, a citoplazmában nem festődő

granulumok nagy számban vannak jelen; (c) MGG 1. típus, a sejtek nagyméretűek, felszínük

egyenetlen, sejtmagjuk kisméretű, nem festődő granulumaik nagy méretűek; (d) MGG 2. típus

kisméretű, nem festődő granulumokkal; (e) MGG 3. típus rendkívül nagy méretű nem festődő

granulumok a citoplazmában; (f-j) Szudánfekete festéssel kapott sejtaltípusok a lipid tartalmú

granulumok mérete és eloszlása alapján. (f) 1. típus; (g) 2. típus; (h) 3. típus; (i) 4. típus; (j) 5.

típus; (k) AO, a sejtek nagyméretű granulumai nem festődtek. Aránymérték 10 µm.

A transzmissziós elektronmikroszkópos felvételeken (9. ábra) az eleocyták a

legnagyobb méretű sejtek. Alakjuk szabálytalan, a sejtekben a sejtmag/citoplazma arány

alacsony. A sejtmag általában a sejtek közepén helyezkedik el. A nucleus 1,5-2 µm átmérőjű,

nagyjából gömb alakú. A sejtmag eukromatinizált. Némelyik metszetben még az erősen denz

nucleolus is látható. A sejtmag felszínén behúzódás nem látható. A sejtek citoplazmája

homogén, sejtalkotókban szegény endoplazmára és nagyméretű, jól elkülönülő, 0,5-1 µm

átmérőjű, polimorf, membránnal határolt struktúrákkal teli ektoplazmára tagolható. Ezeknek a

45

struktúráknak a nagyobb része nem ozmiofil, de a granulumok között találunk erősen

elektrondenz struktúrákat. A sejt pszeudopódiumokat nem képez, de sejtfelszíne nem

egyenletes a nagy chloragosomákra emlékeztető struktúrák kiemelkedése miatt. A sejtek

gyakran csoportokban helyezkednek el a coelomaüregben, néha sejtkapcsoló struktúrákra

emlékeztető kapcsolatokkal összetapadnak.

9. ábra: Az eleocyták ultrastruktúrája. Jelmagyarázat: n: nucleus; dg: denz granulum; lg: nem

ozmiofil (lipid) granulum, nyíl: sejtkapcsoló struktúrára emlékeztető kontakt. Aránymérték: 1

µm.

46

5.1.2. Az amoebocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése

Az amoebocyták 15-18 µm átmérőjűek. A sejtek felszíne nem egyenletes. Kisebb-

nagyobb pszeudopódiumok találhatók, illetve valószínűleg lezajlott fagocitózisok helyei

láthatók a sejthártyán. A sejtek magja viszonylag nagyméretű (6-8 µm), kerek, a sejt közepén

helyezkedik el. A sejtek általában magányosan helyezkednek el a keneten, nem

aggregálódnak (10/a, b ábra).

May-Grünwald Giemsa kontrasztosítás alkalmazásával több altípust találtunk az

amoebocyta sejtalakok között.

1. A sejtek viszonylag nagyméretűek, átmérőjük kb. 20 µm. Sejtmagjuk kerek, kb. 7 µm

átmérőjű, az eu- és heterokromatin jól elkülöníthető a MGG festéssel. Az erős

eukromatinizáció arra utal, hogy a sejtek intenzív anyagcserét folytatnak. A citoplazma ezzel

a festéssel enyhén rózsaszínűre festődik és apró granulumok láthatók benne. A sejtek

nagyjából lekerekítettek, néha pszeudopódiumra emlékeztető nyúlványokat mutatnak (10/c, d

ábra).

2. MGG festés során olyan sejteket is találtunk, amelyek 12-15 µm átmérőjűek. A

citoplazmában kisebb-nagyobb vakuólumok (2-7 µm), a sejt szélén gyakran kitüremkedések

(talán exocitózis helye vagy pszeudopódiumok). Néha előfordulnak kicsi, sötét granulumok

(maximum 1-2 µm). Sejtmag kerek, excentrikus, mérete: 5-7 µm (10/e, f, g ábra).

Perjódsav-Schiff reakció során korábbi leírások szerinti amoebocyta sejttípust nem

találtunk.

47

10. ábra: Az amoebocyták fénymikroszkópos mintákban. A sejtek változatos alakúak, néha

állábakkal rendelkeznek. Átmérőjük 15-20 µm. (a; b,) HE, a sejtek számos különböző méretű

és hosszúságú állábbal rendelkeznek; (c; d,) MGG 1. típus, nagyméretű sejtek,

citoplazmájukban enyhén rózsaszínűek, néhány pszeudopódiumot képeznek; (e; f, g) MGG 2.

típus, kisebb méretű sejtek citoplazmájukban néhány erősen kékre festődő granulummal.

Aránymérték 10 µm.

Transzmissziós elektronmikroszkópia során is azt tapasztaltuk, hogy a sejtek

szabálytalan alakúak.

A sejtek között két fő típust találunk. Az egyik típusú amoebocyta kisebb

pszeudopódiumokat, lobopódiumokat képez, amelyek rövidek, gumószerűek, tompák. A

sejtek magja a sejt perifériájára szorul, erősen excentrikus helyzetű. A mag nagyméretű a

többi sejttípushoz viszonyítva. A marginális kromatin gyakran erősen kondenzált, de az

eukromatin mennyisége alacsony. A sejtmaghoz közel, nagyjából a sejt közepén sűrűn

elhelyezkedő, nagyszámú, erősen elektrondenz struktúrát találunk, melyek diszkréten

elkülönülnek egymástól, általában megnyúltak, ellipszis alakúak és kb. 50-100 nm átlagos

átmérőjűek. A sejt perifériája felé haladva körben a citoplazmában nagyméretű (200-300 nm,

vagy akár fél µm) szabálytalan alakú diszkrét membránnal határolt vakuólumok találhatók. A

citoplazma sejthártyához közeli peremén gyakran találunk erősen elektrondenz struktúrákat,

valószínűleg fagoszómákat, de a citoplazma ezen része általában viszonylag homogén,

sejtalkotóban szegény (11/a, b, c ábra).

48

A másik típusú sejt hosszabb, keskenyebb, karcsúbb pszeudopódiumokat képez (11/d

ábra). A sejtek alakja erősen szabálytalan, citoplazmájuk világos, kevésbé elektrondenz. A

sejtek magja is szabálytalan alakú, és a heterokromatin mennyisége nagyobb, mint az első

típusú sejt magjában. A hosszú pszeudopódiumok miatt az elektronmikroszkópos metszeteken

nagyméretű üres vakuólomszerű struktúrák látszanak. Gyakran látunk endocitózisra utaló

jeleket (11/f, h ábra). A sejtek pszeudopódiumaikkal gyakran képeznek szomszédos sejtekkel

sejtkapcsolatokat (11/e, g ábra). A sejtek citoplazmája nagy számban tartalmaz különböző

sejtalkotókat (vakuólumokat, granulumokat, mitokondriumokat).

Az amoebocyták többféle megjelenési formája (morfológiája, nyúlványaik, citoplazma-

szerkezetük) arra enged következtetni, hogy a fent leírt sejtalakok esetleg egy sejttípus több

fejlődési alakját mutatják be.

49

11. ábra: Az amoebocyták ultrastruktúrája (a, b, c) 1. típus; (d-h) 2. Típus. Jelmagyarázat: n:

nucleus; dg: denz granulum; ec: endocitózis; ecp: ectoplasma; enp: endoplasma; lp:

lobopódium; v: vakuólum; nyíl: sejtkapcsolatok. Aránymérték: a-d, h: 1 µm; e, f, g: 200 nm.

50

5.1.3. A granulocyták fény- és elektronmikroszkópos jellemzése

A sejtek hematoxilin-eozin festés során (12/c ábra) erősen bazofil granulumokat

mutatnak citoplazmájukban. A granulumok az egész citoplazmát kitöltik, és szinte kiszorítják

a sejtmagot a sejt perifériájára. A granulumok szabályos gömb alakúak és kisméretűek (0,5-1

μm). A sejtek alakja enyhén megnyúlt, hosszabbik átmérőjük kb. 25 μm, rövidebb átmérőjük

pedig 20 μm. A sejtek felszíne egyenetlen a granulumok miatt.

May-Grünwald Giemsa – féle kontrasztosítás után 12-15 μm átmérőjű sejteket

figyeltünk meg. A citoplazma granulumokkal teli, a granulumok sötétpirosra festődnek. A

sejtek alakja általában szabálytalan, néha pszeudopódiumokra emlékeztető nyúlványokat

láthatunk. A sejtek nem aggregálódnak. A sejtek magja erősen bazofil, kerek 6-7 μm

átmérőjű. A granulumok miatt a sejtmag általában a sejt szélére szorul, sőt a sejthártyát is

kitolja és a sejt felszínén kitüremkedést okoz (12/a, b, ábra).

PAS-reakció alkalmazása során a granulocyta sejttípust több alpopulációra tudtuk

osztani, főként a granulumok száma, mérete, PAS-pozitivitása illetve elhelyezkedése alapján:

1. A sejtek mérete kb. 15 µm. Lekerekített sejtek, melyeknek nyúlványa nincs. A

sejtmagjuk (5-6 µm), általában enyhén megnyúlt alakú, hematoxilinnel festve enyhén bazofil,

a legtöbb sejtben a sejt perifériájára szorul, az eu- és heterokromatin viszonylag jól

elkülöníthető. A citoplazmában kisszámú PAS-pozitív granulumot láthatunk (12/d ábra).

2. A sejtek nagyszámú PAS-pozitív granulumot tartalmaznak a citoplazmájukban. A

sejtek magja szinte nem is látszik a granulumok miatt. A sejtek mérete kb. 12-14 µm,

általában lekerekítettek. A sejtek felszíne a granulumok miatt egyenetlen. A granulumok

nagyon kisméretűek, kb. 1 µm átmérőjűek és gömb alakúak (12/e ábra).

3. A sejtek mérete szinte teljesen egyforma, 10 µm átmérőjűek. A sejtek magja a sejt

egyik oldalára szorul, kerek, kevésbé takarják el a granulumok, mint az előző sejttípusnál. A

sejtmag néha erős eukromatinizációt mutat. A citoplazmában 8-10 db erősen PAS-pozitív

granulum található, amelyek nagyobbak (2-3 µm), és gyakran nem is már a sejtben, hanem

annak közvetlen szomszédságában találhatók, mintha a sejtek exocitózissal kiürítettek volna

valamit. A sejtek nem aggregálódnak, általában egyesével találhatók a kenetekben (12/f ábra).

51

12. ábra: A granulocyták fénymikroszkópos mintákban. A sejtek 12-15 µm átmérőjűek,

változatos alakúak. Granulumaik gyakran rendkívül jól festődnek PAS-reakció során. A

granulumok erős kiemelkedéseket okozhatnak a plazmamembránon, emiatt a sejtek felszíne

nem egyenletes. (a, b,) MGG; (c) HE; (d) PAS 1. típus; (e) PAS 2. típus; (f) PAS 3. típus.

Aránymérték 10 µm.

Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a

granulocyták kissé megnyúlt, ellipszoid alakúak.

A sejtmag a sejtek közepén helyezkedik el vagy esetleg kissé excentrikus, de

semmiképp nem szorul teljesen a sejtek perifériájára (átmérője kb. 2-4 µm). A sejtmag

általában lekerekedett, esetleg némileg megnyúlt, eukromatinizált. Nucleolus ritkán látható. A

sejtmag felszínén befűződés nem tapasztalható.

A sejtek morfológiájukat tekintve változatosságot mutatnak, ugyanis egyes sejtek

citoplazmájának alapállománya nem túl denz, de benne nagy számban kisméretű denz

granulumok találhatók. A granulumok általában 150-200 nm átmérőjűek. Vannak köztük

nagyon erősen elektrondenz, gömb alakú granulumok, és kevésbé denz hosszúkás, esetleg

pálcikaszerű képletek. A sejtek citoplazmája két könnyen elkülöníthető részből áll, ugyanis a

citoplazma maghoz közelebbi része (endoplazma) polimorf granulumban és egyéb különböző

elektrondenzitású sejtalkotókban (pl. ovális mitokondrium, lizoszóma, szabad riboszóma,

polimorf vakuólum) gazdag, míg a citoplazma perifériás része (ektoplazma) viszonylag

52

homogén és granulummentes (13/a, b ábra). A sejt felszíne általában egyenletes, rajta néha

kisebb kitüremkedések láthatók. Ezeknek a belsejében elektrondenz struktúrák láthatók (13/b

ábra).

Egyes sejtek citoplazmája viszont erősen elektrondenz, benne a granulumok nagyobbak

(300-400 nm), erősebb denzitásúak. A granulumok a citoplazma egészében megtalálhatók.

Ezeknek a sejteknek a sejthártyája sem egyenletes felületű, ugyanis gyakran észlelhető a

granulumok exocitózisa (13/c, d ábra).

A többféle altípus megjelenése azt sugallja, hogy ezeknek a sejteknek különböző

állapota, esetleg fejlődési stádiuma lehet a coelomafolyadékban. A sejtekről általánosságban

elmondható, hogy gyakran képeznek aggregátumokat, sejtkapcsolatokat más coelomasejttel.

13. ábra: A granulocyták ultrastruktúrális szerkezete. Jelmagyarázat: n: nucleus; enp:

endoplazma; ecp: ectoplasma; dg: denz granulumok. Aránymérték: 1 µm.

53

5.1.4. Bazofil citoplazmájú sejtek

A kenetek tanulmányozása során azt tapasztaltuk, hogy nem nagy számban, de

rendszeresen megjelennek a coelomasejtek között olyan kisméretű sejtek, melyek

citoplazmája bazofil festődést mutat (14. ábra). A sejtek további két csoportba sorolhatók

citoplazmájuk struktúrája szerint. A sejtek egy része kicsi (6-7 µm), a sejtmag pedig

maximum 5 µm átmérőjű. A sejtmag/citoplazma arány magas. A citoplazma gyakran csak egy

keskeny szegélyként látható. A sejtmagokban gyakran eukromatin látható. A sejtek gyakran

képeznek sejtkapcsolatokat a környező szöveti sejtekkel. Az érettebb alakok már

nyúlványokat is képeznek. A keskeny plazmában basofil illetve eozinofil granulumok nem

láthatók, a citoplazma Szudán negatív. A citoplazma PAS módszer alkalmazásával világos

lilára festődik, és keskeny szegélyként jelenik meg a mag körül.

14. ábra: A kisméretű bazofil citoplazmájú sejtek fénymikroszkópos mintákban. A sejtek

átmérője 6-7 µm, a sejtmagé 4-5 µm. A sejtek gömb alakúak, citoplazmájuk keskeny. (a, b)

PAS; (c) MGG. Aránymérték: 10 µm.

A bazofil citoplazmájú sejtek között viszont találunk nagyobb méretű sejteket (8-9 µm),

melyek sejtmagja kissé ovális, és excentrikus elhelyezkedésű (15. ábra). A sejtek citoplazmája

nem granulált, a plazmamembrán felszíne néha nem egyenletes.

15. ábra: A nagyobb méretű bazofil festődésű sejtek. A sejtek átmérője 8-9 µm. A sejtmag

excentrikus, ovális alakú. A citoplazma nem granulált. (a) MGG; (b, c) PAS. Aránymérték: 10

µm.

54

5.1.5. Lebenyezett sejtmagvú coelomasejtek

A sejtek mérete 8-15 µm, citoplazmájuk homogén, sejtmagjuk invaginációt tartalmaz. A

sejtmag bab alakú, középen az invaginációval, mérete 5-8 µm. A sejtek lekerekítettek, kevés

nyúlvány látható rajtuk. Citoplazmájuk nagyon gyengén festődik, PAS-pozitív és bazofil

granulumokat nem tartalmaz. A sejtmag a sejt közepén vagy excentrikusan található (16.

ábra).

Az ultrastruktúrális felvételek alapján elmondható, hogy kétféle sejtalak rendelkezik

befűződéses sejtmaggal. (i) Egy részük számos közepes hosszúságú lobopódiummal

rendelkezik. A sejtek egy-egy nyúlványa néha rendkívül hosszú. A sejtek citoplazmájában

néhány fagoszóma jellegű struktúrát találunk (17/a ábra). (ii) Ezen kívül olyan sejtek

mutatnak még sejtmagjukon invaginációt, amelyek nem nyúlványosak, viszonylag sima

felületű a plazmamembránjuk, néhány vakuólum és granulum található a citoplazmájukban.

Legfeljebb egy-két rövidebb pszeudopódiummal rendelkeznek (17/b, c ábra). Ezek a

megfigyelések egybeesnek a fénymikroszkópos felvételeken tapasztaltakkal.

16. ábra: A lebenyezett sejtmagvú sejttípus fénymikroszkópos mintákban. A nucleus

rendszeresen behúzódással rendelkezik, és minden esetben excentrikus elhelyezkedésű. A

citoplazma nem granulált. (a-d) MGG; (e-h) PAS. Aránymérték: 10 µm.

55

17. ábra: A lebenyezett sejtmagvú sejtek ultrastruktúrája. Aránymérték: 1 µm.

Jelmagyarázat: csillag: magmembrán invaginációja; n: nucleus; lp: lobopódium; psp:

pszeudopódium.

56

5.1.6. Korábbról nem ismert sejttípusok a coelomában

A fénymikroszkópos minták tanulmányozása során olyan, eddig nem ismert sejtcsoport

tagjait találtuk (18. ábra), amelyek enyhén megnyúltak (a hosszabbik átmérőjük kb.12 µm). A

sejtek magja a sejt egyik végében található, sokszor kiemelkedést okozva a sejt felületén. A

sejtmag enyhén bazofil és erős eukromatinizációt mutat, amely intenzív anyagcserére utal. A

sejt citoplazmájában néhány (maximum 4-5) erősen PAS-pozitív granulumot találunk,

amelyek mérete 2-3 µm. A sejtekben gyakran láthatunk nem festődő, fehér hólyagszerű

képleteket, amelyek valószínűleg lipidet tartalmaznak. A sejteken néha nyúlványokat,

pszeudopódium szerű képleteket láthatunk.

18. ábra: Az 1. új sejttípus PAS reakció után. A sejtek citoplazmájában nagyméretű, erősen

PAS-pozitív granulumok találhatók, amelyek főként a sejtmag közelében helyezkednek el.

Aránymérték: 10 µm.

Egy másik eddig nem ismert csoportba tartozó sejtek (19. ábra) nagyméretűek (25-30

µm), szabálytalan alakúak. A sejtek citoplazmája erősen bazofil festődésű sejtalkotókkal,

valószínűleg fagoszómákkal van tele. A fagoszómák általában 3-5 µm átmérőjűek. A sejtek

alakja valószínűleg azért szabálytalan, mert intenzív membránfolyamatok, exo- illetve

endocitózis folyik.

19. ábra: A 2. új sejttípus PAS reakcióval kontrasztosítva. A citoplazmában erősen bazofil

fagoszómák találhatók. Aránymérték: 10 µm.

57

Ezen kívül pedig olyan sejteket találtunk, amelyeknek (20. ábra) több sejtmagjuk van,

azaz multinukleáris sejtek. A sejtek különböző méretűek (10-20 µm), citoplazmájuk általában

granulummentes. A sejtek lekerekítettek, nyúlványokat nem képeznek.

20. ábra: A 3. új sejttípus PAS reakcióval festett kenetben. Aránymérték: 10 µm.

5.1.7. Az eleocyták és a chloragogén eredetű sejttöredékek kialakulása

Intakt egyedek coelomaüregének és chloragogen szövetének vizsgálata során azt

tapasztaltuk, hogy a perifériás chloragogen szövet sejtjeinek egy részében sejtosztódás zajlik.

Fénymikroszkópos metszetein tanulmányozása alapján elmondhatjuk, hogy az osztódás

következtében létrejövő utódsejtek közül a bazálisabban kialakuló sejt a chloragogén

szövetben marad, az apikális utódsejt pedig leválik a chloragogén szövetről és szabadon úszik

a coelomafolyadékban (21. ábra).

21. ábra: Sejtosztódás a chloragogén szövetben. Jelmagyarázat: c: testüreg; ch: chloragogen

szövet; k: periintestinális vérsinus; nyilak: osztódó chloragogén sejt. Aránymérték: 10 µm.

58

Ezen kívül a chloragogén szövet ultrastruktúrális vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy

a sejtekben folyamatos membránátalakulás, membrán- és citoplazmalefűződés történik az

emlős vérlemezkékhez illetve a megakaryocytákhoz hasonlóan. A chloragogen sejtek

citoplazmájának apikális részében erősen elektrondenz és kevésbé elektrondenz granulumok

halmozódnak fel. Ezután a plazmamembrán endomembránokkal olvad össze, majd az apikális

rész lefűződik a coelomaüregbe, a bazális citoplazma-domén és a sejtmag pedig a szomszédos

chloragogen sejtek szövedékében marad. Ez lehet annak a ténynek a magyarázata, miszerint a

coelomafolyadékban állandóan jelen vannak sejttöredékekhez hasonló komponensek (22.

ábra).

22. ábra: A chloragogen sejtek citoplazma-lefűződése. Jelmagyarázat: lm: hosszanti

izomszövet; cm: körkörös izomszövet; nyíl: plazmamembrán lefűződése; kettősnyíl:

fagoszóma; nyílhegy: intracelluláris membrán; kör: denz granulum; csillag: hemoglobin-

tartalmú vakuólum. Aránymérték: 500 nm.

59

5.2. A coelomasejtek funkcionális vizsgálata

5.2.1. A coelomasejtek szerepe a regeneráció folyamatában

A regenerációs blasztéma

A caudális szelvények eltávolítása után gyors sebzáródás következik be, melynek során

a bőrizomtömlő izomzatának kontrakciója és az epidermisz megvastagodása figyelhető meg.

A sérülés helyén rövid időn belül nagy mennyiségű coelomasejt halmozódik fel. A

bélcsatorna végét bezáró heg környékén laza szerkezetű, szabad szemmel is jól látható

regenerációs blasztéma alakul ki a vágást követő napokban (23. ábra). A blasztéma

morfológiailag sokféle sejtből áll, ezek között nagy számban találtunk coelomasejteket és

neoblastokat. Nem csak a sérült szelvény környékén, hanem az utolsó 5 sértetlen szelvényben

is a normálisnál nagyobb számban fordultak elő coelomasejtek. A testüregben főként

eleocytákat és granulocytákat találtunk (24. ábra), míg a bélcsatorna és bőrizomtömlő sérült

szövetei közé amoebocyták és granulocyták bevándorlását tapasztaltuk, valamint lebenyezett

magvú, nagy kiterjedésű lobopódium-rendszerrel rendelkező sejtek is gyakran

megfigyelhetők (25. ábra).

23. ábra: a: Az egy hetes regenerálódott testvég sztereomikroszkópos képe. b: A 2 hetes

regenerálódott testvég fénymikroszkópos hosszmetszeti képe, toluidinkék festéssel.

Aránymérték 100 µm. c: Friss seb körüli coelomasejt-invázió.

60

24. ábra: Coelomasejt-invázió a regenerálódó testvégben. d: dissepimentum; e: eleocyták; g:

granulocyta; nyíl: lobopódiumos sejt. Méretarány: 10 µm

61

25. ábra: A lebenyezett magvú sejtek ultrastruktúrája a regenerációs blasztémában.

Jelmagyarázat: n: nucleus; lp: lobopódium denz fagoszómákkal; csillag: sejtmaghártya

invaginációja. Aránymérték: 1 µm.

62

A neoblastok elektronmikroszkópos felvételeken (26. ábra) lekerekített sejtek,

melyeknek átmérője 7-8 µm. A sejtmag nagyméretű, kondenzált kromatinnal rendelkezik. A

nucleolus gyakran erősen kirajzolódik (26/a, b, c ábra). A sejtek citoplazmája csak keskeny

szegélyként jelenik meg a sejtmag körül, néhány kisebb denz granulumot tartalmaz.

Jellegzetes tulajdonságuk, hogy a szomszédos sejtekkel sejtkapcsoló struktúrákat alakítanak

ki (26/b ábra). Differenciáltabb formáik már nyúlványokkal is rendelkeznek (26/d ábra).

26. ábra: A neoblastok transzmissziós elektronmikroszkópos képei. Aránymérték a, c: 1 µm;

b, d: 500 nm. Jelmagyarázat: nyíl: sejtkapcsolat; m: izomszövet; n: nucleus; nu: nucleolus.

63

PACAP-szerű peptidek és azok receptorának vizsgálata coelomasejtekben a caudális

regeneráció során

A regenerálódó testvégek totálpreparátumain, PACAP27 és PACAP38 immunjelölés

során a regenerálódó szövetek környékén PACAP-pozitív coelomasejteket találtunk a

coelomaüregben (27. ábra). Magányos coelomasejtek találhatók a somatopleurához és a

vérerekhez tapadva. Jelölt sejtek legnagyobb számban a bőrizomtömlő belső oldalán valamint

a sérült ganglion felszínén találhatók, mellettük ugyancsak PACAP-pozitív neoblasztok

figyelhetők meg. A neoblasztok totipotens őssejtek a coelomafolyadékban. Morfológiájukat

tekintve bazofil, kisméretű sejtek, melyek nagy sejtmag/citoplazma aránnyal rendelkeznek.

Könnyen felismerhetőek és a coelomasejtektől elkülöníthetőek, hiszen sejtmagjuk

nagyméretű, körülötte a citoplazma pedig csak keskeny szegélyként látható. A coelomasejtek

közül morfológiai jellegzetességeik alapján egyes granulocyták és amoebocyták mutattak

PACAP-pozitivitást a regenerációs blasztémában és környékén. Eleocyták nem mutattak

PACAP-immunreaktivitást a preparátumainkban.

27. ábra: PACAP27 (a) és PACAP38 (b) -immunreaktivitást mutató coelomasejtek a

regenerálódó testvégben. Nyilak: immunpozitív coelomasejtek, ch: serte; d: dissepimentum.

Aránymérték: a: 50 µm; b: 20 µm.

64

Ultrastruktúrális vizsgálataink során a regenerációs végből készült preparátumokban

PAC1-immunpozitivitást találtunk az amoebocyták (28/a ábra) és a granulocyták egy részén.

Elvétve az eleocyták is mutattak jelölődést, de nem számottevő mértékben. A jelölt sejtek

esetében az immunarany szemcsék főként a plazmamembránban voltak láthatók. Azonban a

sejtek citoplazmájában, azon belül is intracelluláris membránokon is találtunk pozitív

jelölődést. Immunpozitivitást tapasztaltunk az endoplazmatikus retikulum ciszternáin, illetve

vakuólumok és granulumok membránjain. Ezen kívül a regenerálódó testvégben olyan PAC1-

immunpozitív sejttípusokat találunk, melyek hosszú nyúlvánnyal/ nyúlványokkal

rendelkeznek. (28/b ábra) Találtunk továbbá olyan amoebocyta jellegű sejteket is, melyek

szintén PAC1-immunpozitívak és sejtmagjukban nagyméretű invagináció figyelhető meg.

Ezekből a sejtekből sokkal több figyelhető meg, mint az intakt állatokban. Valószínűsíthető,

hogy ez a sejttípus aktiválódik a regenerációs folyamatok során.

65

28. ábra: a, b: PAC1 immunpozitivitást mutató coelomasejtek a regenerálódó testvégben. C:

negatív kontroll. Jelmagyarázat: Nyilak: PAC1R-szerű fehérje. Aránymérték: a: 500 nm, b, c:

1 µm.

66

Radioimmunoassay kísérleteinkben vizsgáltuk az intakt és regenerálódó állatokból

izolált coelomasejtek PACAP27-, és PACAP38-szerű peptidek koncentráció-változását (29.

ábra). PACAP27 és PACAP38-szerű peptidek jelenléte kimutatható volt mind sértetlen mind

regenerálódó állatokban. Az intakt állatok teljes testéből izolált coelomasejtekben a

PACAP27-szerű peptid 6,03±1,09 fmol/mg, a PACAP38-szerű peptid pedig 69,19±19,11

fmol/mg koncentrációban volt jelen (29/a ábra). Ezzel szemben a sértést követő 3. órában vett

mintákban a PACAP38-szerű peptid koncentrációja szignifikánsan lecsökkent, majd a

regeneráció első és 5. napján már folyamatos, a kontroll állatokban mért értéket meghaladó

koncentráció-emelkedést mutatott (29/a ábra). A fiziológiás PACAP38-szerű peptid

koncentrációja a sértést követő 2. héten állt helyre. A PACAP27-szerű peptid koncentrációja

már a sértést követő 3. órában szignifikánsan magasabbnak mutatkozott a kontroll állatokban

mért értékekhez képest. A regeneráció első napjától koncentrációja kisebb ingadozásokat

mutatott, de a teljes vizsgált időszakban magasabb volt, mint az intakt állatokban (29/a ábra).

29/a ábra: A PACAP-szerű peptidek (PACAP27 és 38) RIA módszerrel mért koncentrációja

az intakt és a regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben. Jelmagyarázat: Kék: PACAP27; Piros:

PACAP38. : p<0,1 ; : p<0,05.

RIA kísérleteink következő fázisában azt vizsgáltuk, hogy testrészenként hogyan oszlik

meg a coelomasejtek PACAP27-, illetve a PACAP38-szerű peptid koncentrációja a

regeneráció kezdeti szakaszában, amikor a teljes testből izolált coelomasejtek PACAP-szerű

67

peptidek mennyisége emelkedést mutatott. Ezért megvizsgáltuk a sértett állatok különböző

részeiből izolált coelomasejtek PACAP27-, és PACAP38-szerű peptid koncentrációját a

regeneráció első öt napján (29/b ábra). A PACAP38-szerű peptid koncentrációja folyamatos

emelkedést mutatott a műtétet követő időszakban mind a sértés előtti utolsó 5 intakt

szelvényből, mind az anterior testfélből izolált coelomasejtekben (29/b ábra). Az egyes

testrészekből származó, különböző időszakokban vett izolátumok egymáshoz történő

összehasonlításakor nem kaptunk jelentős eltérést a PACAP27-szerű peptid

koncentrációjában. A sértés előtti utolsó 5 intakt szelvényből izolált coelomasejtek

PACAP27-, és PACAP38-szerű peptid koncentrációja a teljes vizsgált időszakban

szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a test többi részéből izolált coelomasejtekben mért

értékek, ami arra utal, hogy a PACAP-szerű peptidek a regeneráció kezdeti szakaszában egy

karakterisztikus rostrocaudális gradiens mentén változnak.

29/b ábra: A PACAP-szerű peptidek (PACAP27 és 38) RIA módszerrel mért koncentrációja

regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben. Az utolsó 5 szelvényben és az állat többi intakt

szelvényében mért peptidkoncentrációk összehasonlítása. Jelmagyarázat: Kék: PACAP27;

Piros: PACAP38. (5): a regenerálódott szelvények és a vágás előtti öt intakt szelvény

coelomasejtjei. (M): A rostrális intakt szelvények coelomasejtjei. : p<0,1 ; : p<0,05 ;

: p<0,01.

68

Western blot analízisünk alátámasztja (30. ábra) ultrastruktúrális vizsgálatainkat,

miszerint PAC1 receptor-szerű fehérje található a giliszta izolált coelomasejtjeiben. A PAC1

receptor-szerű fehérje molekulatömege - ellentétben az emlős mintákéval, ahol 80-90 kDa

magasságában kaptunk jelet – 40 kDa körül mutatkozott a coelomasejtekből készült

izolátumokban.

30. ábra: PAC1 receptor Western blot vizsgálata intakt (Ci) és regenerálódó (Cr) egyedek

coelomasejtjein. Kontrollként használt minták: egéragy (Br) és egér hipofízis (Hy).

A coelomasejtek savanyú foszfatáz tartalmának vizsgálata a regeneráció során

A szövetdegenerációban jelentős szerepet játszanak egyes coelomasejtek, amelyek

tömegesen vándorolnak be a sértett szöveti struktúrákba. Vizsgálataink szerint a

bőrizomtömlőben, bélcsatornában és a sértett ganglionban nagy számban fordulnak elő magas

fagocitáló aktivitással jellemezhető amoebocyták (31, 32. ábra).

Ultrastruktúrális vizsgálataink azt mutatják, hogy a nyúlványokkal rendelkező,

amoeboid sejtek savanyú foszfatáz tartalmú lizoszómákkal rendelkeznek. A sejtek

szabálytalan alakúak, sejtmagjuk általában a sejt egyik oldalára szorul a nagyszámú

lizoszóma, vakuólum és granulum miatt. A sejtek citoplazmájában erősen savanyú foszfatáz-

pozitív kompartmenteket, lizoszómákat találtunk, illetve kevésbé denz vakuólumok is

található bennük. A sejtek nyúlványai hosszúak, amelyek a sérült szöveti felszíneket,

kötőszöveti és izomsejteken végződnek. Morfológiájukat tekintve a sejtek az amoebocyta

csoportba sorolhatók.

Az izolált, savanyú foszfatáz immuncitokémiai reakcióval megfestett coelomasejteket

fizikai paramétereik (méret és granularitás), valamint immunfluoreszcencia intenzitásuk

69

alapján vizsgáltuk áramlási citometriával. Négy sejtpopulációt azonosítottunk, amelyek

mérete és granularitása karakterisztikus eltéréseket mutatott (31. ábra). Az R1 populációba az

erősen granulált kisméretű coelomasejtek, az R2 populációba az amoebocyták tartoznak, az

R3 populációban többféle sejt található, de többségük erősen autofluoreszcens granulumokat

tartalmazó eleocyta. Az R4 populáció sejtjei nagyméretű, erősen granulált sejtek. A

legerősebb festődést az amoebocyta sejtpopulációban, tehát a nagyobb méretű, kevésbé

granulált csoportban találtunk.

31. ábra: A regenerálódó egyedek áramlási citometriával azonosított coelomasejt populációi.

70

32. ábra: Degenerálódó szövetek és a savanyú foszfatáz aktivitású amoebocyták

elektronmikroszkópos szerkezete. Jelmagyarázat: m: izomszövet; AcP: savanyú foszfatáz

tartalmú granulumok a sejt citoplazmájában; ex: savanyú foszfatáz tartalmú granulumok az

extracelluláris térben. Aránymérték: 1 µm.

71

5.2.2. A fagocitózis folyamatának vizsgálata

A fagocitózis jelenségének vizsgálatakor azt tapasztaltuk mind fény- mind pedig

elektronmikroszkópos mintáinkban, hogy az amoebocyták végzik az idegen anyagok

bekebelezését. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy az intakt állatok coelomasejtjei

idegen kompartmenteknek a testüregbe való juttatásával indukálhatók, a sejtek egy csoportja

fagocitózisra képes.

Birka vörösvértestek fagocitózisa

Intakt állatok coelomájába injektált vörösvértestek fagocitózisát főként amoeboid típusú

sejtek végzik a testüregben. A metszeteken látható, hogy a testüreg falára tapadó nyúlványos

sejtek, illetve a coelomában aggregálódott sejtek is fagocitálták a fixált vörösvértesteket. A

vizsgálatokból az is megállapítható, hogy az eleocyták illetve granulocyta típusú sejtek nem

fagocitálták az 5-6 µm átmérőjű jellegzetes alakú erősen eozinofil vörösvértesteket (33. ábra).

33. ábra: Birka vörösvértestek fagocitózisa egy nappal az injektálás után. ch: chloragogen;

bw: bőrizomtömlő; e: eleocyta; nyíl: amoebocyták, melyek fagocitálták a vörösvértesteket.

Aránymérték: 20 µm.

72

Ezüst nanopartikulumok fagocitózisa in vitro

In vitro vizsgálatok során a coelomasejtek 24 órás inkubációs idő után azt mutatták,

hogy képesek bekebelezni a 80-100 nm méretű AgNP-okat. A sejtek közül főként

amoebocyta típusú sejtek citoplazmájában találtunk nanopartikulumokat. Egyértelmű jelet

kaptunk az amoebocyták fagoszómáiban (34/b és c ábra), bizonyítva, hogy a sejtek képesek

partikulumok bekebelezésére. Ezen kívül mikrofagocitózis jeleit is láttuk mintáinkban (34/a

ábra).

34. ábra: Ezüst nanopartikulumok fagocitózisa amoebocytákban. Aránymérték: a, b: 200 nm;

c: 500 nm.

73

5.2.3. Citotoxicitás jelensége coelomasejt-lizátummal kezelt sejtvonalon

A myeloma sejtvonalból származó sejtekhez coelomasejt-lizátumot adva azt

tapasztaltuk, hogy a sejtekben jelentősen megnőtt az intracelluláris Ca2+

koncentrációja (35.

ábra). Áramlási citometriai vizsgálatok során azt tapasztaltuk, hogy a sejtekhez adott

coelomasejt-lizátum szinte azonnal Ca2+

-jelet váltott ki, a kontrollhoz (LBSS) viszonyítva

sokszorosára nőtt a Fluo3AM által indikált intracelluláris Ca2+

ion koncentráció. Ezen kívül

azt is láthattuk, hogy a sejtekhez adott coelomasejt-lizátum dózisfüggő Ca2+

-jelet indukál,

hiszen az 1:1 arányban, pufferben higított lizátum jóval gyorsabb hatást váltott ki, mint az 1:2,

illetve 1:10 arányban higított lizátum. Ezt mutatják az áramlási citometria során kapott

diagramok is.

35. ábra: Citotoxicitás-vizsgálat áramlási citometriával. CCL: Sp2 sejtek kezelése különböző

higítású coelomasejt-lizátummal kezelve. Kontroll: Sp2 sejtek kezelése a lizátum pufferével

(LBSS).

74

Ultrastruktúrális vizsgálataink során az intakt Sp2 sejtek kisméretűnek mutatkoztak (36.

ábra). A sejtek lekerekedettek, általában nem aggregálódnak, átmérőjük 6-7 µm. A sejtek

nagy számban, rövid nyúlványokat hordoznak, amelyek néha sejtkapcsoló szerkezetekre

emlékeztető struktúrákkal a szomszédos sejtek nyúlványaival mutat kapcsolatot. A sejtek

magja gyakran lebenyezett, sejtmagvacskájuk gyakran hálózatos szerkezetet mutat.

Mitokondriumaik normál méretűek és struktúrájúak, általában lekerekítettek. Az

endoplazmatikus retikulum átlagos mennyiségű a sejtekben, gyakran jól látható a sejtmag

körül.

A Jurkat-sejtvonalból származó lizátummal kezelt kontroll mintákban a sejteken nem

tapasztaltunk változást. Ahogy az áramlási citometriás eredményeken, TEM vizsgálatokban

sem látható jelentős változás a sejtek morfológiájában sem.

Coelomasejt-lizátummal kezelt sejtek ultrastruktúrális vizsgálatai során azt tapasztaltuk

(37. ábra), hogy a sejtek megnőnek, megduzzadnak, átmérőjük elérheti a 10 µm-t is. A sejtek

apró nyúlványai eltűnnek, még inkább lekerekedett sejteket figyelhetünk meg, sejtkapcsolatok

nem láthatók. A sejtek magja is megduzzad, lebenyezettsége eltűnik, kromatinizációja

megváltozik, a heterokromatin állomány nagyobb arányban figyelhető meg. A

mitokondriumok átmérője is megnő, gyakran nagyobb világos tereket láthatunk bennük. Az

endoplazmatikus retikulum is megduzzad. A plazmamembránon dezorganizáció jeleit nem

tapasztaltuk. A sejtmag membránján azonban elvétve sérüléseket láthatunk. A sejtek

citoplazmájáról általánosságban elmondható, hogy denzitása csökken.

75

36. ábra: Intakt Sp2 sejtek transzmissziós elektronmikroszkópos felvételei. Jelmagyarázat: n:

nucleus; m: mitokondrium; er: endoplazmatikus retikulum; nyíl: rövid citoplazma-nyúlványok

sejtkapcsolatokkal. Aránymérték: a, b: 1 µm; c: 200 nm.

76

37. ábra: Coelomasejt-lizátummal kezelt Sp2 sejtek transzmissziós elektronmikroszkópos

felvételei. Jelmagyarázat: n: nucleus; m: mitokondrium; md: membrán-dezorganizáció.

Aránymérték: a, b: 1 µm; c, d: 500 nm.

77

6. Az eredmények megbeszélése

A trágyagiliszta (E. fetida) coelomasejtjeinek fény- és elektronmikroszkópos vizsgálata,

valamint egyes hisztokémiai tulajdonságai alapján azokat öt csoportba soroltuk: eleocyták,

amoebocyták, granulocyták, bazofil citoplazmájú sejtek valamint lebenyezett sejtmagvú

coelomasejtek (38. ábra). Eredményeink részben megerősítik az oligochaeta gyűrűsférgek

coelomasejtjeinek szerkezetéről eddig felhalmozott adatokat, részben pedig a coelomasejtek

nevezéktanának és tipizálásának újragondolását, finomítását vetik fel.

6.1. Eleocyták

A coelomasejtek legkönnyebben azonosítható típusát, az eleocytát több fajban leírták.

Liebmann (1942a) ezt a sejtalakot leváló chloragogén sejtnek tekinti, hiszen

fénymikroszkópos tulajdonságaik nagyban hasonlítanak. A sejtek mérete, fénymikroszkópban

azonosított granulumai nagyban hasonlítanak. Azonban sem Liebmann, sem pedig más a

témával foglalkozó kutatócsoport nem tapasztalt olyan sejtosztódást a chloragogén szövetben,

illetve olyan citológiai átalakulást, amely arra utalna, hogy ezek a sejtek valóban chloragogén

eredetűek. Az A. chlorotica fajban leírt (Kurek és mtsai. 2007) eleocytát a szerzők a

chloragocytával azonos sejttípusnak tartották. A sejtek nagy, sárgásbarna granulumokat

(chloragosoma) tartalmaznak, melyek nem elektrondenzek, ezen kívül a citoplazma még

glikogént halmoz fel nagyobb mennyiségben. A sejtek felszíne egyenetlen a chloragosomák

és néhány kisebb pszeudopódium miatt. D. veneta hasonló jellegű sejtjeit szintén

chloragocytaként azonosították (Adamowitz 2005). A sejt citoplazmájára az

organellummentes endoplazmára és a chloragosomákban, mitokondriumokban, egyéb

elektrondenz granulumokban gazdag ektoplazmára való tagolódás jellemző. A sejtek

pszeudopódiumokat nem képeznek és nem adherálódnak. Linthicum és munkacsoportja

(1977) L. terrestrisben is azonosnak vélte a chloragocyta és az eleocyta sejttípust. A

chloragogén szövetből származtatták ezeket a szabadon úszó sejteket, amelyek nagyszámú

pszeudopódiumot formálnak sejtfelszínükön, ellentétben a másik két faj eleocytáival. A sejtek

citoplazmája rendkívül gazdag olyan granulumokban, amelyek főként lipid, protein és

szénhidrát tartalmúak, és exocitózissal a környezetbe ürülhetnek. Ugyanebben a fajban Stein

és Cooper (1978) eleocytákat nem is említ. A chloragocyták egyik típusát korai alaknak

tekintik és a chloragogén szövetben helyt ülő sejtekkel azonosnak tartják. Granulumaikkal

hasonló festődést mutató citoplazmarészeket a coelomafolyadékban is találtak. A fejlettebb

78

chloragocyta alak kisebb méretű, aggregálódik a coelomafolyadékban és granulumai is

kisebbek.

Eredményeink szerint az E. fetida eleocytái, amelyek méretük és jellegzetes

sejtmagszerkezetük alapján jól azonosíthatók, különböző citoplazma-szerkezetűek lehetnek.

Az eleocytának nevezett sejtek között találtunk olyan sejtalakokat szabadon a

coelomafolyadékban, amelyek erősen hasonlítanak a chloragogén sejtekre, denz granulumok

tömegét tartalmazzák citoplazmájukban. Találtunk olyan típusú sejteket is, amelyek a denz

granulumok között egyre több lipidtartalmú kompartmentet halmoznak fel. Azonosítottunk

olyan sejttípusokat, amelyek már szinte csak lipideket tartalmaznak, főként a citoplazma

perifériás részén. Ezeknek a sejteknek a sejtmag körüli citoplazmája homogén,

granulummentes. Valamint olyan alakokat is találtunk, amelyekben az előbb említett

lipidcseppek, vakuólumok lényegesen nagyobbak, és szinte az egész citoplazmát kitöltik.

A denz granulumot tartalmazó forma valószínűsíthetően a chloragogen szövetből leváló

alak, amely a coelomában degranulálódik és esetleg átalakulhat lipidet, majd később

vakuólmokat tartalmazó eleocytává.

Elsőként adtunk fénymikroszkópos és ultrastruktúrális bizonyítékot arra, hogy a

chloragogén sejtekből alakulhatnak ki az eleocyták. A chloragocyták osztódása után a bazális

helyzetű periintestinális kapillárisokhoz kapcsolódó sejt chloragocytaként funkcionál tovább,

míg az apikális helyzetű utódsejt a lefűződés után a coelomaüregbe kerülve eleocytaként

folytatja életét. A frissen lefűződő eleocyták chloragocytákra emlékeztető sajátosságokat

mutatnak, amely tényre már több korábbi szerző is felhívta a figyelmet (Linthicum és mtsai.

1977; Stein és Cooper 1978).

Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálataink azonban arra is ráirányították a

figyelmet, hogy a chloragocyták apikális része az intracelluláris membránok mentén a

vérlemezkékhez hasonlóan sejttöredék formájában is leválhat. A chloragogén eredetű

sejttöredékeket fagocitáló coelomasejtek kebelezik be, így anyagaik egy részét a szervezet

számára újrahasznosítják. A chloragosomák lebontásával kalciumionok szabadulnak fel a

coelomaüregben, amelyek befolyásolhatják a coelomasejtek működését és aktivitását (Opper

és mtsai. 2010).

6.2. Amoebocyták

A coelomasejtek második nagy csoportját szinte minden fajban lymphocyta-szerű,

agranuláris amoebocytának tartják/tartották. Már fecskendőférgek testüregi sejtjei között is

leírtak hasonló morfológiájú, endocitózisra képes sejteket korábban (Stang-Voss 1970).

79

Kurek és munkacsoportja (2007) A. chlorotica coelomafolyadékában olyan sejteket hív hyalin

vagy agranuláris amoebocytának, amelyek sejtmagja ovális, citoplazmája szinte

granulummentes, és kiterjedt pszeudopódiumokat képeznek. D. venetában (Adamowitz 2005)

a hasonló morfológiájú sejtek állábakat képeznek. A fiatalabbnak tekintett alakok

organellumban szegényebbek, kevesebb lizoszómát, vakuólumot tartalmaznak. A fejlettebb

alakok jóval több denz granulumot, fagoszómát és mitokondriumot hordoznak

citoplazmájukban. L. terrestrisben a rokon sejteket lymphocyta-szerű sejteknek tartották

(Linthicum és mtsai. 1977), amelyek szintén különböző fejlettségi állapotokat produkáltak a

coelomafolyadékban. Fejlettségi szintjükre pszeudopódiumaik méretéből és kiterjedéséből

következtettek. A sejtek egy részének a magján invagináció mutatkozott. Ultrastruktúrális

vizsgálatok szerint ezeknek a sejteknek a fagocitotikus, illetve lizoszómális aktivitása

rendkívül intenzív. Ezen kívül irodalmi adatok vannak arra vonatkozóan, hogy a polychaeta

gyűrűsférgek egyes, hasonló morfológiájú coelomasejtjei ugyancsak patogén baktériumok

fagocitózisát végzik (Fiztgerald és Ratcliffe 1982).

E. fetida-ban az amoebocyta sejtalaknak szintén több formáját találtuk meg. A sejtek

különbséget mutatnak pszeudopódiumaik méretében és számában, vakuólumaik

mennyiségében, illetve fagoszómáik méretében és állapotában. Funkcionális vizsgálataink

során azt tapasztaltuk, hogy az amoebocyták rendkívül magas savanyú-foszfatáz aktivitást

mutatnak az állatok sérülését követően. A magas savanyú foszfatáz aktivitás főként olyan

sejtekre jellemző, amelyek lizoszómális rendszere intenzív lebontást, fagocitált

kompartmentek inaktiválását végzi. A sérülés helyén nagy számban megjelenő savanyú-

foszfatáz aktivitást mutató sejtek valószínűleg a lizoszómális enzimeik egy részét

exocitózissal az extracelluláris térbe ürítik, és ezek az enzimek szerepet játszanak a

szövetlebontási folyamatokban. A magas savanyú foszfatáz aktivitású amoebocyták a

degenerálódó szövetelemek bekebelezését és annak lebontását biztosítják.

Intakt állatok coelomasejtjeinek vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a sejtek

környezetébe kerülő idegen anyagok (birka vörösvértestek, ezüst nanopartikulumok)

indukálják az amoebocyták fagocitotikus aktivitását. Fénymikroszkópos kísérleteink során azt

láttuk, hogy az állatok coelomaüregébe juttatott fixált emlős vörösvértestek bekebelezését,

eliminálását az amoebocyták már rövid idővel (1 nap) az injektálás után elkezdik. In vitro

kísérleteink pedig azt sugallják, hogy az amoebocyták mikrofagocitózis folyamatára is

képesek, ugyanis eredményeink azt mutatják, hogy a sejtek a 80-100 nm átmérőjű ezüst

nanopartikulumok bekebelezését is megkezdik már 24 órán belül.

80

Immunhiszto- és immuncitokémiai vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a

regenerációs blasztémában és környékén megnő a PACAP - és annak specifikus receptora, a

PAC1-immunpozitivitást mutató amoebocyták száma. A PAC1 receptor-szerű fehérjét

immunarany jelöléssel a plazmamembránban és az intracelluláris membránokon is

kimutattuk.

Több közlemény utal arra, hogy gerincesekben a PAC1 receptor a durva felszínű

endoplazmatikus retikulumhoz kötött riboszómákon transzlálódik, majd ugyanitt a

ciszternákban raktározódik, és vezikuláris transzporttal jut el a sejtmembrán bizonyos

területeire (Muroi és mtsai. 1998). Emiatt írtak le gerinces mintákban (agy, hasnyálmirigy)

intracelluláris PAC1-immunreaktív mintázatokat (Seki és mtsai. 1997). A coelomasejtek

ultrastruktúrális vizsgálata során szintén hasonló eredményeket kaptunk, miszerint

immunarany jelölést detektáltunk az ER membránjain, egyéb endomembránokon, vezikulák

membránjain és a sejtmembránon. Immunjelölésünk során az intracelluláris immunarany-

szemcsék valószínűsíthetően az inaktív, a plazmamembrán felé való transzportjának

útvonalán lévő PAC1-szerű peptideket jelölték. A plazmamembránon kapott jel pedig már a

kész, aktív forma jelenlétére utal.

Western blot analízisünk során 40 kDa molekulasúlyú PAC1-R-szerű fehérjét mutattunk

ki izolált coelomasejtekben. A PAC1R molakulatömege nagyfokú változatosságot mutat

különböző fajokban. Ennek oka egyrészt a splice-variánsok megléte lehet (Vaudry és mtsai.

2000), másrészt az alkalmazott protokolltól függően Western blot analízis során különböző

glikoziláltsági fokú fehérjék azonosítása lehetséges (Hashimoto és mtsai. 2000; Abu-Hamdan

és mtsai. 2006).

6.3. Granulocyták

A coelomasejtek harmadik nagy csoportja, a granulocyták, az előző két csoporthoz

hasonlóan rendkívül nagyfokú heterogenitást mutat az egyes fajok coelomasejtjeinek

jellemzése során. Már a kagylók haemolymphájában találkozhatunk különböző festődési

tulajdonságú granulocytákkal (Cima és mtsai. 2000). A gyűrűsférgek közül pedig az A.

chlorotica granulocytái kisméretű elektrondenz granulumokban gazdagok, és állábakat

képeznek (Kurek és mtsai. 2007). Adamowitz szerint (2005) a granulocyták D. veneta-ban

nem aggregálódnak, nem képeznek pszeudopódiumokat, szinte csak a citoplazma centrális

része tartalmaz granulumokat, amelyek között mitokondriumok, lizoszómák, szabad

riboszómák és különböző elektrondenzitású vakuólumok vannak. A L. terrestris granulocyta-

szerű coelomasejtjei (Linthicum és mtsai. 1977) rendkívül változatosak, a granulumok alakja,

81

elhelyezkedése, denzitása alapján, valamint a sejtek alakja, pszeudopódiumok megléte szerint

több alakot is megkülönböztethetünk köztük. Stein és Cooper (1978) szintén ebben a fajban

jellemezte a granulocytákat, amelyek a gerincesek granulocytáihoz hasonlóan többféle

festődésűek lehetnek.

Mintáinkban a granulocyták is különböző megjelenési formákat mutattak. A sejtek

granulumai gyakran PAS-pozitívak, amely nagyobb szénhidráttartalom jelenlétére utalhat,

illetve a lizoszómák enzimjeinek szénhidráttartalmát is mutathatja.

Immunhisztokémiai vizsgálataink szerint a granulocyta sejtek PACAP-szerű peptid-

tartalma a regeneráció során megnő, hasonlóan az amoebocytákhoz. Radioimmunoassay

analízisünk során azt az eredményt kaptuk, hogy a PACAP38 koncentrációja a sértést követő

3. órában már alacsonyabb volt, mint az intakt állatokban, ami arra enged következtetni, hogy

a sejtek leadták PACAP38-tartalmukat, vagyis a PACAP38-nak közvetlen szerepe lehet a

sérülésre adott válaszban. A PACAP27 és 38-szerű peptidek koncentrációja a vágást követő

ötödik napra viszont emelkedést mutatott, amely azt sugallja, hogy ezeknek a peptideknek

szerepe lehet a helyreállítási mechanizmusokban, esetlegesen apoptotikus folyamatok

szabályozásában (Sherwood és mtsai 2000). Ezen kívül pedig a vizsgált peptidek

koncentrációja rostrocaudális irányban változik. Eszerint a sérülést követő helyreállító

folyamatok során a coelomasejtek, főként a granulocyták a sérült testvéghez szállítanak

bizonyos bioaktív anyagokat, majd ott azt képesek leadni.

Gerinctelenek közül főként a Drosophila melanogaster idegrendszerében találtak

nagyobb PACAP koncentrációt, főként az idegrendszer ontogenezise során, ahol a peptid

valószínűleg neurotranszmitterként funkcionál (Zhong 1995; Bhattacharya és mtsai. 2004).

Ezen kívül immunhisztokémiai és immuncitokémiai módszerekkel kimutatták a gyűrűsférgek

központi idegrendszerében, illetve a perifériális szövetekben (bőrizomtömlő, bélcsatorna) két

változatát, a PACAP27-t és a PACAP38-t, valamint a PAC1 receptor jelenlétét (Molnár és

mtsai. 2006, 2008; Reglődi és mtsai. 2000). A Lumbricus polyphemus agydúcában a PACAP

27 nagyobb koncentrációban van jelen, mint a 38 aminosavból álló forma (Somogyvári-Vigh

és mtsai. 2000).A kevéssertéjű gilisztákban főként az idegrendszerben tanulmányozták a

PACAP formák és a PAC1 eloszlását. Az idegrendszer sejtjei között számos neuroszekréciós

sejtcsoport is PACAP-szerű peptidekre vonatkozóan immunpozitívnak bizonyult, tehát

valószínűleg ezen sejtek PACAP-termelése okozza azt, hogy a vérben nagy koncentrációban

van jelen mindkét PACAP-izoforma (Molnár és mtsai. 2011). Valószínűsíthető tehát, hogy a

coelomasejtek a vérből veszik fel PACAP-szerű peptideket, majd azokat a sérülés helyére

szállítják.

82

Gerincesek esetében a PACAP stimulálja hízósejtekben a hisztamin és a szerotonin

termelését, amely arra enged következtetni, hogy a molekula valószínűleg befolyásolja a

gyulladásos folyamatok szabályozását (Mori és mtsai. 1994, Seebeck és mtsai. 1998).

Makrofágokban a PACAP gátolja az IL-6, az IL-2 és a TNF-α, emellett pedig serkenti az IL-

10 termelődését. Mindebből arra lehet következtetni, hogy a PACAP és agonistái gátolják a

proinflammatórikus és serkentik az anti-inflammatórikus folyamatokat, vagyis lassítják a

gyulladásos folyamatokat (Delgado és mtsai. 1998, Martinez és mtsai. 1998).

Ezen kívül pedig számos eredmény számol be arról, hogy a PACAP-nak növekedési

faktor-szerű hatása lehet az idegrendszer fejlődésében és a sérülést követő regenerációban

(Vaudry és mtsai. 2000; Waschek 2002). Kimutatták, hogy a PACAP szabályozza az

axonfejlődést (Guirland és mtsai. 2003), illetve elősegíti az axonális regenerációt a sérülések

helyén (Kimura és mtsai. 2003). A PACAP hatása a gerincesek embrionális neurogenezisében

(Sherwood és mtsai. 2007; Waschek 2002), illetve a perifériás idegrendszer regenerációjában

már korábban ismertté vált (Meyer és mtsai. 2006). A neurotrofikus hatáson túl exogén

PACAP in vitro toxicitás és in vivo agyi pathológiás modellekben elért protektív hatását

vizsgálták (Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Más szerzők a PACAP protektív hatását

tanulmányozták apoptózist indukáló tényezőkkel szemben kisagyi szemcsesejtekben (Vaudry

és mtsai. 2003), valamint kimutatták, hogy a PACAP csökkenti a károsodást és javítja a

funkcionális eredményeket Parkinson-kóros modellekben (Reglődi és mtsai. 2004). Az

idegrendszerben feltehetően léteznek olyan védelmi mechanizmusok, amelyek helyreállítják a

kisebb sérüléseket és indukálják az idegi javító mechanizmusokat, és ebben a működésben

valószínűleg fontos szerepet játszik a PACAP.

Vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy a coelomasejtek nem csak a PACAP-szerű

peptidek jelenlétével jellemezhetők, hanem mindenképpen valamilyen PAC1-szerű receptor

expressziójára is képesek. Ebből pedig azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a sejtek

aktivitása a receptoron keresztül módosítható PACAP-szerű peptiddel, vagy olyan peptiddel,

amelyet ez a receptor képes specifikusan megkötni.

Eredményeink alapján tehát elmondható, hogy

(1) funkcionális kapcsolat lehet a PACAP peptidek és a gyűrűsférgek regenerációja

között;

(2) a coelomasejtek bizonyos populációi valószínűleg PACAP-ot szállítanak (és esetleg

szintetizálnak) a regenerálódó testrészben;

(3) a coelomasejtek egy csoportja, főként az amoebocyták valószínűleg mind PACAP,

mind pedig PAC1 receptort expresszálnak, amely arra utalhat, hogy a PACAP a

83

regeneráció során autokrin és parakrin szabályozási folyamatokban is részt vehet a

coelomasejtek esetében.

6.4. Bazofil sejtek

A coelomasejtekből készült fénymikroszkópos kenetekben kis mennyiségben bazofil

sejteket találtunk, amelyek méretük és struktúrájuk alapján két csoportba tartozhatnak. Az

egyik csoportba olyan 8-10 µm átmérőjű sejteket sorolhatunk, melyek citoplazmája homogén

bazofil festődést mutat, a citoplazma granulumokat nem tartalmaz. A sejtek magja

nagyméretű (4-5 µm átmérőjű), lekerekített, gyakran a sejtek perifériájára szorul. A sejt

nyúlványokat nem képez, általában csoportosan fordulnak elő a coelomában. Erről a

sejttípusról korábban még senki nem számolt be és funkciójának megismeréséhez további

vizsgálatok szükségesek.

A bazofil kisméretű sejtek másik csoportjába a már korábban leírt neoblastok

sorolhatók, amelyek kisebb átmérőjűek (6-7 µm). Sejtmagjuk a sejt méretéhez képest

feltűnően nagy (4-5 µm) és általában a sejt közepén helyezkedik el. A sejtek citoplazmája

nehezen vizsgálható, ugyanis az csak egy keskeny gyűrűként van jelen a sejtmag körül. A

sejtek szintén lekerekítettek, jellemzően csoportokban jelennek meg a coelomaüregben. A

regenerálódó testvég vizsgálata során elektronmikroszkópos képeken is azonosítani tudtuk ezt

a sejttípust, amely jellemzően a regenerálódó állatban jellemzően nagyobb számban fordul

elő. A sejtek ultrastruktúrális vizsgálat során megerősítették fénymikroszkópos

eredményeinket, a sejtek magja nagyméretű, kromatinja erősen kondenzált, a nucleolus

gyakran látható. Immuncitokémiai vizsgálataink során egyes neoblastok membránjain szintén

találtunk PAC1-szerű immunarany jelölést, amely arra utalhat, hogy a PACAP esetlegesen a

neoblastok letapadását, differenciálódását is befolyásolhatja. A neoblastok különböző

fejlődési stádiumokat mutatnak, miszerint a legfejletlenebb kerek, nyúlványoktól mentes

alakok és a különböző differenciáltságú sejtalakok is megtalálhatók a coelomaüregben, a

regenerációs blasztémában és az újonnan differenciálódó szövetek felszínén. A sejtek gyakran

képeznek jól látható sejtkapcsoló struktúrákat, amelyek szintén arra utalhatnak, hogy a

differenciálódó szövetek részeként élik tovább életüket.

6.5. Egyéb sejttípusok

Az intakt egyedek coelomasejtjei között találtunk lebenyezett magvú sejteket is,

amelyeknek száma szintén felszaporodott a regenerálódó egyedekben. A sejtek

84

fénymikroszkópos azonosítása után elektronmikroszkópos vizsgálatok segítségével is

azonosítani tudtuk ezt a sejttípust. Korábbi irodalmi adatok már léteztek erre a sejttípusra

vonatkozóan (Linthicum és mtsai. 1977). Mivel ezeknek a sejtek a száma megnő a

regenerálódó egyedekben, főként a sérült szövetek környezetében, arra lehet következtetni,

hogy ezek a sejtek segítenek a sérülés helyreállításában. Általában ezek a sejtek nagyméretű

nyúlványokkal rendelkeznek, és ezek a nyúlványok rendszerint nagyszámú denz fagoszómát

tartalmaznak, emiatt talán a sérült szöveti törmelék eltakarításában, esetleg a sérülést követő

mikroorganizmusok elleni védekezésben lehet szerepe. Ennek a sejtnek a részletes

morfológiai leírásra, valamint a regenerációban betöltött szerepére korábbi adatok nem

ismertek.

Az általunk multinukleáris sejtnek vélt sejtalakok rendszeresen, de kis számban

találhatók kenetekben. Stein és mtsai (1978) L. terrestris-ben fénymikroszkópos

preparátumokon azonosítottak soksejtmagvú sejteket a testüregben. A sejteknek valószínűleg

szerepe lehet a regenerációs folyamatokban, ugyanis vizsgálataink azt mutatják, hogy

regenerált egyedekből készült mintákban gyakrabban vannak jelen ezek a sejtalakok.

Fénymikroszkópos mintáinkban talált nagyméretű, PAS-pozitív granulumokkal

rendelkező, valamint a fagoszómákkal teli citoplazmával jellemezhető sejttípusok korábbi

leírásokban nem találhatók. A sejtek ultrastruktúrális és funkcionális jellemzéséhez további

vizsgálatokra van szükség.

6.6. Funkcionális kapcsolatok

Kísérleteink eredményeinek és a korábbi irodalmi adatoknak az összevetése után az a

feltételezésünk, hogy az oligochaeta gyűrűsférgek coelomasejtjei inkább funkcionális

szempontból különíthetőek el egymástól, és kevésbé a morfológia alapján. A vizsgált állatok

életkörülményeinek, életfolyamatainak köszönhetően a környezettel közvetlen kapcsolatban

álló coelomaüreg sejtjei folyamatos fejlődésben, átalakulásban lehetnek, ez lehet az oka

annak, hogy minden egyes szerző más-más sejtalakokat tartott dominánsnak a vizsgált fajok

coelomasejtjeinek esetében. A különböző fejlődésű sejtcsoportok tényleges kapcsolatainak

bebizonyítására sejtfelszíni markerek vizsgálatát kívánjuk a jövőben elvégezni.

Kevés és viszonylag korai irodalmi adat (Herlant-Meewis 1965) áll rendelkezésünkre

arra vonatkozóan, hogy az immunkompetens coelomasejtek milyen szerepet játszanak a

restitúciós folyamatokban. Ezek alapján a coelomasejtek közül az aggregálódott amoebocyták

a sebzáródásban, az eleocyták pedig nutritív anyagoknak a sérülés helyére történő

szállításában vesznek részt. Egyéb korábbi közlemények szerint (Liebmann 1942b) a

85

coelomasejtek más szerepet is betölthetnek a regenerálódó testvég szöveteinek

újraképzésében. Eszerint egyes coelomasejtek dedifferenciálódnak a sérülés hatására, majd a

sérülés helyén megtapadva különböző szöveti sejtekké (izom és hámsejtekké)

differenciálódnak.

Tapasztalataink szerint a regenerációs blasztéma nem csak amoebocytákat és

eleocytákat tartalmaz, ahogy azt korábbi közlemények állítják (Liebmann 1942b, Herlant-

Meewis 1965), hanem nagy számban találunk a regenerálódó testvégben granulocytákat,

amelyek szintén bioaktív anyagok szállításában vehetnek részt. Ezen kívül ellentétben azzal a

korábbi feltételezéssel, miszerint a coelomasejtek transzformálódnak és különböző pótolandó

szöveti sejtekké differenciálódnak (Herlant-Meewis 1965; Jamieson 1981), megállapíthatjuk,

hogy valószínűleg a regenerációs blasztémában nagy számban előforduló totipotens

neoblastok végzik a sérült szövetek pótlását, helyreállítását. Ultrastruktúrális vizsgálataink

során azt tapasztaltuk, hogy bár az amoebocyták valóban nagy számban vannak jelen a

regenerálódó testvégben, felszaporodnak a sérülés környezetében, és csupán a sérülés

következtében felhalmozódó sejttörmelékek fagocitózisát, eltakarítását végzik. Azonban nem

tapasztaltuk a sejtek differenciálódását. A fagocitáló amoebocytákról ultrastruktúrális

vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy nagyméretű sérült sejteket és kisebb méretű

sejttörmelékeket is képesek bekebelezni. Ezzel biztosítják a neoblastok számára a

megtapadási felszíneket, valamint a sérülés következtében beáramló mikróbák eliminálásával

védelmi feladatot is elláthatnak.

A coelomasejtek immunfolyamatokban betöltött szerepére vonatkozóan bizonyítékot

szolgáltattunk egyrészt a fent említett fagocitotikus aktivitás megerősítésével, másrészt

kísérleteink eredményei azt is alátámasztják, hogy a sejtek valószínűleg olyan citolítikus

anyagokat termelnek, melyek az idegen sejtek elpusztításában fontos szerepet játszanak. A

gyűrűsférgek immunrendszere nem csak celluláris, hanem humorális immunválasz

kialakítására is képes (Bilej és mtsai. 2000), amelyet bizonyítanak azok a korábbi irodalmi

adatok, miszerint a coelomafolyadékban különböző antimikrobiális, citolítikus hatású bioaktív

anyagok azonosíthatóak (Lassalle és mtsai. 1988; Stein és Cooper 1988; Valembois és mtsai.

1991; Jarosz és Glinski 1997; Cooper és mtsai. 1974; Roch és mtsai. 1981; Milochau és mtsai.

1997). Ezeket valószínűleg a szabadon úszó coelomasejtek termelik. Kísérleteink során

megerősítettük azt a korábbi felvetést, miszerint a coelomasejtek citoplazmájából olyan

anyagok szabadulhatnak fel, amelyek idegen sejtek elpusztítására képesek, hiszen a sejtekből

ultrahangos roncsolás segítségével nyert coelomasejt-lizátum dózistól függően Sp2 sejtek

elpusztítására képes. A felszabaduló anyagok a célsejtekben intracelluláris kalciumion-

86

felhalmozódást okoznak, amely arra utalhat, hogy a sejtek plazma és intracelluláris

endoplazmatikus membránjai károsodnak. Ezt alátámasztják elektronmikroszkópos

megfigyeléseink, melyek szerint a sejtek mitokondriális membránjai is sérüléseket

szenvednek. A mitokondriumok membránjának sérülése összefüggésben állhat a sejt kalcium-

anyagcseréjével (Bernardi és Rasola 2007). További Annexin- és Tunnel assay vizsgálataink

azt sugállják, hogy valóban apoptotikus folyamatok zajlanak a lizátumkezelést követően,

azonban ennek megerősítéséhez még további vizsgálatok szükségesek. Azonban

ultrastruktúrális tapasztalataink azt a feltételezést megerősítik, miszerint a coelomasejtek által

termelt faktorok apoptózis-szerű folyamatot indítanak el a célsejteken. Az apoptózis során a

mitokondriumok (mint intracelluláris kálciumraktárak) károsodnak, membránjaik

permeabililtása megváltozik, a raktározott kalcium pedig a sejt plazmájába ürül. A

membránok integritásának felborulását, permeabilitásuk megváltozását okozhatták a

membránokban található sphingomielinhez kötődő faktorok. A sphingomielin pedig a

gerincesek mellett főként baktériumok és állati egysejtűek jellemző membrán-komponense

(Yamayi és mtsai 1998), amely szintén bizonyíték lehet arra, hogy a coelomasejtek által

termelt faktoroknak fontos szerepe lehet a vizsgált faj természetes környezetében előforduló

mikróbákkal szembeni védekező mechanizmusokban. Korábbi irodalmi adatok alapján már

ismert, hogy a coelomafolyadékban található molekulák közül több is sphingolipidekhez

kötődve fejti ki citotoxikus, lítikus hatását (Valembois és mtsai. 1982; Lange és mtsai. 1997),

ezeknek egy része olyan jelátviteli mechanizmusokat is indukál, melyben kálcium-ionok, mint

másodlagos hírvivők is részt vesznek. Kobayashi és munkacsoportja (2001) már in vitro

kísérletekben bizonyította, hogy a lysenin képes daganatos sejtvonalak lízisére. Ezek alapján

elmondhatjuk, hogy a coelomasejtek lizátuma apoptózis-szerű folyamatot indít el emlős

célsejtekben, és ebben nagy szerep lehet, a coelomasejtek által termelt citolítikus faktoroknak.

A folyamat során az elpusztított sejtekben bizonyítottan membránkárosodás zajlik.

87

88

7. Összefoglalás

Munkánk során a trágyagiliszta (E. fetida) coelomasejtjeinek tanulmányozásával

foglalkoztunk mikroszkópos és molekuláris biológiai módszerekkel. Vizsgálataink során

konvencionális fény- és elektronmikroszkópos technikákkal azonosítottuk az eleocyta, az

amoebocyta és a granulocyta sejttípusokat. Ezen felül a csoportokban főként ultrastruktúra

alapján altípusokat, lehetséges fejlődési stádiumokat írtunk le.

Bizonyítékot szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy a coelomasejtek egy része a trofikus

valamint raktározó funkciót ellátó, hemoglobintermelő chloragogén szövet sejtjeiből

származhat. Elektronmikroszkópos felvételeinken azt tapasztaltuk, hogy a perifériás

chloragogén szövet sejtjeiről a gerincesek vérlemezkéihez hasonlóan diszkrét citoplazma

szegmensek fűződnek le, valamint a chloragogén sejtek osztódására is találtunk példát.

A coelomasejtek funkciói közül részletesen jellemeztük a regenerációban betöltött

szerepüket. Ultrastruktúrális vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy az eleocyták és a

granulocyták valószínűleg bioaktív anyagok szállítását végzik a regenerálódó testrészbe.

Igazoltuk az amoebocyták fagocitotikus aktivitását és indukálható savanyú-foszfatáz

termelését. Ez alapján elmondhatjuk, hogy az amoebocyták felismerik, fagocitálják és

eliminálják a sérült szöveti törmeléket és a sejtmaradványokat. Fény- elektronmikroszkópos

immunhiszto- és immuncitokémia, radioimmunoassay és Western blot analízis

alkalmazásával kimutattuk, hogy a korábban már gerincesekben bizonyított neuroprotektív

hatású peptid, a hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid PACAP–szerű peptid és annak

specifikus (PAC1-szerű) receptora jelen van a regenerálódó testvég coelomasejtjeiben.

Eredményeink azt mutatják, hogy a giliszta PACAP-szerű peptidjeinek koncentrációja megnő

a regenerálódó egyedek coelomasejtjeiben, és eloszlásuk rostrocaudális irányban csökken. Ez

arra utalhat, hogy a sejtek felveszik és a sebzés helyére szállítják a vizsgált peptideket.

Regenerációs kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy korábbi adatokkal ellentétben nem a

szabadon úszó coelomasejtek transzformációjával és differenciálódásával alakulnak ki a

regenerált testrész szövetei, hanem a coelomaüregben sérülés hatására felszaporodó

mezodermális eredetű totipotens őssejtek, a neoblastok alakítják ki azokat. Ezen kívül a

sejtekből készült coelomasejt-lizátummal daganatos sejtvonal sejtjeit kezeltük. Áramlási

citometriás és ultrastruktúrális vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy a coelomasejtek

lizátuma citotoxikus hatással rendelkezik, mely bizonyíték lehet a humorális immunválasz

kialakításában való aktív részvételre.

89

8. Summary

The coelomocytes of the earthworm (E. fetida) were studied with microscopic and

molecular biological methods. Similarly to the previous foundings three major types of

coelomocytes, the eleocyte, the granulocyte and the amoebocyte were identified and

characterized with conventional light- and electron microscopical techniques and

histochemical methods. In addition, subtypes and possible developmental stages were

described within these groups on the basis of their ultrastructure and cytochemical features.

Our results show that both eleocytes and granulated cell debris originated from

haemoglobin-producing chloragogen tissue possessing also trophic and storage functions.

Based on electron microscopic results, we have to conclude that discrete cytoplasmic

segments split from the peripheral chloragocytes like the platelets in the vertebrates from

megakaryocytes, while eleocytes are apical daugther cells of dividing chloragocytes.

The role of coelomocytes was described in the regeneration. We conclude by

ultrastructural data that certain bioactive materials are transported to regenerating part of the

body by eleocytes and granulocytes. The phagocytic activity and inducible production of acid

phosphatase were confirmed in the amoebocytes. Based on the above mentioned amoebocytes

recognize, phagocyte and eliminate the damaged cells and cell debris. It was showed with

light-and electron-microscopic immunocytochemistry, radioimmunoassay and Western blot

analysis that the neuroprotective PACAP-like peptides (which were previously demonstrated

in vertebrates than pituitary adenylate cyclase activating peptide) and their specific PAC1-like

receptor occurre in the coelomocytes isolated from the regenerating caudal segments. Our

results show, that the concentration of PACAP-like peptides increased in the coelomocytes of

the regenerating animals, and the amount of these compounds show a decreasing rostrocaudal

gradient. It may indicate that coelomocytes uptake and transport these peptides to

regenerating segments. Contrary to previous data we found that the renewing tissues of the

regenerating body part do not originate from the free-floating coelomocytes or

dedifferentiating tissues, but they are formed from the mesodermal totipotent stem cells, so

called neoblasts, that migrate to the site of damage, attach to old tissues. Furthermore, cells of

cancer cell lines were treated with lysate of coelomocytes. It can be established by our flow

cytometric and ultrastructural studies, that the coelomocyte lysate has cytotoxic effect, which

may be evidence of active involvement in humoral immune response.

90

9. Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt köszönetet szeretnék mondani témavezetőimnek dr. Pollák Editnek és dr.

Molnár Lászlónak, hogy munkámat szakdolgozókén és PhD hallgatóként is segítették,

támogatták, és nem csak szakmai, hanem baráti segítséget is nyújtottak abban, hogy

pályafutásomnak ehhez a pontjához érkezzem.

Köszönet illeti dr. Engelmann Pétert, aki a molekuláris biológiai módszerekben segített, és

mint barát, egyengette munkámat phd-s éveim alatt.

Külön köszönetet szeretnék mondani dr. Boros Ákosnak, aki seniorként nagyon sokban

segített a laborban és azon kívül is.

Ezen kívül köszönöm az Általános Állattani Tanszék dolgozóinak, Gunszt Dórának, Pozsgay

Sándornénak és a tanszék szakdolgozóinak a sok segítséget.

Valamint köszönöm páromnak, családomnak és barátaimnak, hogy munkámhoz a nyugodt

hátteret biztosították, és támogattak abban, hogy ez a dolgozat elkészüljön.

91

10. Irodalomjegyzék

Abu-Hamdan MD, Drescher MJ, Ramakrishnan NA, Khan KM, Toma VS, Hatfield JS,

Drescher DG (2006) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its

receptor (PAC1-R) in the cochlea: evidence for specific transcript expression of PAC1-

R splice variants in rat microdissected cochlear subfractions. Neuroscience 140(1):147-

161.

Adamowicz A (2005) Morphology and ultrastructure of the earthworm Dendrobena veneta

(Lumbricidae) coelomocytes. Tissue Cell 37(2):125-133.

Affar EB, Dufour M, Poirier GG, Nadeau D (1998) Isolation, purification and partial

characterization of chloragocytes from the earthworm species Lumbricus terrestris. Mol

Cell Biochem 185(1-2):123-133.

Arimura A, Somogyvári-Vigh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991) Tissue

distribution of PACAP as determined by RIA: highly abundant in the rat brain and

testes. Endocrinology 129(5):2787-2789.

Aros B, Vígh B (1959) Changes in the neurosecretion of the nervous system of earthworm

under various external conditions. Acta Biol Hung 3. 47.

Bernardi P, Rasola A (2007) Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell

Biochem 45:481-506.

Beschin A, Bilej M, Hanssens F, Raymakers J, Van Dyck E, Revets H, Brys L, Gomez J, De

Baetselier P, Timmermans M (1998) Identification and cloning of a glucan- and

lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the

activation of prophenoloxidase cascade. J Biol Chem 273(38):24948-24954.

Beschin A, Lucas R, De Baetselier P, Köhlerova P, Bilej M (2002) TNF analogue in

earthworms and role of lectin-saccharide interactions in regulatory functions of

primitive cytokines. In: Cooper EL, Beschin A, Bilej M (eds) A new model for

analyzing antimicrobial peptides with biomedical applications. IOS Press NATO

Science Series, pp. 149–163.

Bhattacharya A, Lakhman SS, Singh S (2004) Modulation of L-type calcium channels in

Drosophila via a pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP)-mediated

pathway. J Biol Chem 279(36):37291-37297.

92

Bilej M, Brys L, Beschin A, Lucas R, Vercauteren E, Hanušová R, De Baetselier P (1995)

Identification of a cytolytic protein in the coelomic fluid of Eisenia fetida earthworms.

Immunol Lett 45(1-2):123-128.

Bilej M, De Baetselier P, Beschin A (2000) Antimicrobial defense of the earthworm. Folia

Microbiol 45(4):283-300.

Boldizsar F, Berki T, Miseta A, Nemeth P (2002) Effect of hyperglycemia on the basal

cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosine-phosphorylation in human T-

cells. Immunol Lett 82(1-2):159–164.

Buscail L, Gourlet P, Cauvin A, De Neef P, Gossen D, Arimura A, Miyata A, Coy DH,

Robberecht P, Christophe J (1990) Presence of highly selective receptors for PACAP

(pituitary adenylate cyclase activating peptide) in membranes from the rat pancreatic

acinar cell line AR 4-2J. FEBS Lett 262(1):77-81.

Cho JH, Park CB, Yoon YG, Kim SC (1998) Lumbricin I, a novel proline-rich antimicrobial

peptide from the earthworm: purification, cDNA cloning and molecular

characterization. Acta Biochim Biophys Sin 1408(1):67-76.

Cima F, Matozzo V, Marin MG, Ballarin L (2000) Haemocytes of the clam Tapes

philippinarum (Adams & Reeve, 1850): morphofunctional characterisation. Fish

Shellfish Immunol 10(8):677-693.

Colwell CS, Michel S, Itri J, Rodriguez W, Tam J, Lelièvre V, Hu Z, Waschek JA (2004)

Selective deficits in the circadian light response in mice lacking PACAP. Am J Physiol

Regul Integr Comp Physiol 287(5):1194-1201.

Cooper EL, Lemmi CA, Moore TC (1974) Agglutinins and cellular immunity in earthworms.

Ann New York Acad Sci 234(0):34-50.

Cooper EL, Stein EA (1981) Oligochaetes. In: Ratcliffe NA, Rowley AF (eds) Invertebrate

blood cells. Academic Press San Diego, pp. 75–140.

Cooper EL, Cossarizza A, Suzuki MM, Salvioli S, Capri M, Quaglino D, Franceschi C (1995)

Autogeneic but not allogeneic earthworm effector coelomocytes kill the mammalian

tumor cell target K562. Cell Immunol 166(1):113-122.

Cooper EL (1996) Earthworm immunity. In: Rincevich B, Müller WEG (eds) Invertebrate

Immunology. Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 10-45.

Cooper EL (2001) Immune Response: Evolution. Ecyclopedia of Life Science.

Cooper EL, Kauschke E, Cossarizza A (2002) Digging for innate immunity since Darwin and

Metchnikoff. BioEssays 24(4):319-333.

93

Cooper EL, Kvell K, Engelmann P, Nemeth P (2006) Still waiting for the toll? Immunol Lett

104(1-2):18-28.

Cossarizza A, Cooper EL, Suzuki MM, Salvioli S, Capri M, Gri G, Quaglino D, Franceschi C

(1996) Earthworm leukocytes that are not phagocytic and cross-react with several

human epitopes can kill human tumor cell lines. Exp Cell Res 224(1):174-182.

Decker JM, Elmholt A, Muchmore AV (1981) Spontaneous cytotoxicity mediated by

invertebrate mononuclear cells toward normal and malignant vertebrate targets:

inhibition by defined mono- and disaccharides. Cell Immunol 59(1):161-170.

Delgado M, Munoz-Elias EJ, Kan Y, Gozes I, Fridkin M, Brenneman DE, Gomariz RP,

Ganea D (1998) Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide inhibit tumor necrosis factor alpha transcriptional activation by regulating

nuclear factor-kB and cAMP response element-binding protein/c-Jun. J Biol Chem

273(47):31427-31436.

Engelmann P, Molnár L, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P (2004) Earthworm leukocyte

populations specifically harbor lysosomal enzymes that may respond to bacterial

challenge. Cell Tissue Res 316(3):391-401.

Engelmann P, Pálinkás L, Cooper EL, Németh P (2005) Monoclonal antibodies identify four

distinct annelid leukocyte markers. Dev Comp Immunol 29(7):599-614.

Eue I, Kauschke E, Mohrig W, Cooper EL (1998) Isolation and characterization of earthworm

hemolysins and agglutinins. Dev Comp Immunol. 22(1):13-25.

Falugi C, Davoli C (1993) Localization of putative biochemical messengers during Eisenia

foetida (Annelida, Oligochaeta) development. Tissue Cell 25(3):311-323.

Field SG, Kurtz J, Cooper EL, Michiels NK (2004) Evaluation of an innate immune reaction

to parasites in earthworms. J Invertebr Pathol 86(1-2):45-49.

Fischer, E. (1975) Az Oligochaeták chloragosomáinak szerepe a homeostasisban. Biológia

23:185-196.

Fischer E, Horváth I (1978) Evidence of the presence of extraperoxisomal catalase in

chloragogen cells of the earthworm, Lumbricus terrestris L. Histochemistry 56(2):165-

171.

Fischer E, Molnár L (1992) Environmental aspects of the chloragogenous tissue of

earthworms. Soil Biol Biochem. 24(12):1723-1727.

Fitzgerald SW, Ratcliffe NA (1982) Evidence for the presence of subpopulations of Arenicola

marina coelomocytes identified by their selective response towards Gram+ve and

Gram-ve bacteria. Dev Comp Immunol 6(1):23-34.

94

Franceschi C, Cossarizza A, Monti D, Ottaviani E (1991) Cytotoxicity and immunocyte

markers in cells from the freshwater snail Planorbarius corneus (L.) (Gastropoda

pulmonata): implications for the evolution of natural killer cells. Eur J Immunol

21(2):489-493.

Guirland C, Buck KB, Gibney JA, DiCicco-Bloom E, Zheng JQ (2003) Direct cAMP

signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced

by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J Neurosci 23(6):2274-2283.

Hashimoto H, Shintani N, Nishino A, Okabe M, Ikawa M, Matsuyama S, Itoh K, Yamamoto

K, Tomimoto S, Fujita T, Hagihara N, Mori W, Koyama Y, Matsuda T, Nagata S, Baba

A (2000) Mice with markedly reduced PACAP (PAC1) receptor expression by targeted

deletion of the signal peptide. J Neurochem 75(5):1810-1817.

Herbert Z, Pollák E, Zougman A, Boros A, Kapan N, Molnár L (2009) Identification of novel

neuropeptides in the ventral nerve cord ganglia and their targets in an annelid worm,

Eisenia fetida. J Comp Neurol 514(5):415-432.

Herlant-Meewis H (1965) Regeneration in Annelids. In: Abercrombie M, Brachet J (eds)

Advances in morphogenesis. Vol. 4. Academic Press, New York, pp. 155-215.

Hetru C, Troxler L, Hoffmann JA (2003) Drosophila melanogaster antimicrobial defense. J

Infect Dis 187(2):327-334.

Hostetter RK, Cooper EL (1972) Coelomocytes as effector cells in earthworm immunity.

Immunol Comm 1(2):155-183.

Jakab B, Reglodi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Oroszi G, Szilvássy

Z, Szolcsányi J, Németh J (2004) Distribution of PACAP-38 in the central nervous

system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem

Biophys Meth 61(1-2):189-198.

Jamieson BMG (1981) The ultrastructure of the oligochaeta. Academic Press, London.

Jarosz J, Glinski Z (1997) Earthworm immun responses. Folia Biol 45(1-2):1-9.

Kauschke E, Komiyama K, Moro I, Eue I, König S, Cooper EL (2001) Evidence for perforin-

like activity assotiated with earthworm leukocytes. Zoology 104(1):13-24.

Kimura H, Kawatani M, Ito E, Ishikawa K (2003) Effects of pituitary adenylate cyclase-

activating polypeptide on facial nerve recovery in the Guinea pig. Laryngoscope

113(6):1000-1006.

Kiyokawa E, Baba T, Otsuka N, Makino A, Ohno S, Kobayashi T (2005) Spatial and

functional heterogeneity of sphingolipid-rich membrane domains. J Biol Chem

280(25):24072-24084.

95

Kobayashi H, Ohtomi M, Sekizawa Y, Ohta N (2001) Toxicity of coelomic fluid of the

earthworm Eisenia foetida to vertebrates but not invertebrates: probable role of

sphingomyelin. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 128(3):401-411.

Koenig S, Wagner F, Kauschke E, Peter-Katalinic J, Cooper EL, Eue I (2003) Mass

spectrometric analyses of CL(39), CL(41) and H(1), H(2), H(3) confirm identity with

fetidin and lysenin produced by earthworm leukocytes. Dev Comp Immunol 27(6-

7):513-520.

Kurek A, Homa J, Kauschke E, Plytycz B (2007) Characteristics of coelomocytes of the

stubby earthworm, Allolobophora chlorotica (Sav.). Eur J Soil Biol 43(1):121-126.

Lange S, Nüssler F, Kauschke E, Lutsch G, Cooper EL, Herrmann A (1997) Interaction of

earthworm hemolysin with lipid membranes requires sphingolipids. J Biol Chem

272(33):20884-20892.

Lassalle F, Lassegues M, Roch P (1988) Protein-analysis of earthworm celomic fluid IV.

Evidence, activity induction and purification of eisenia-fetida-andrei lysozyme

(Annelidae). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 91(1):187-192.

Laverack SM (1964) The Phisiology of the Earthworm. Oxford University Press London.

Lefebvre C, Salzet M (2003) Annelid neuroimmune system. Curr Pharmaceut Des 9(2)149-

158.

Lemmi CAE, Cooper EL (1981) Induction of coelomocyte proliferation by xenografts int he

earthworm Lumbricus terresris. Dev Comp Immunol 5(1):73-80.

Lengvári I, Csoknya M, Lubics A, Szelier M, Hámori J (1994) Proctolin immunoreactive

elements in the nervous system of earthworm (Lumbricus terrestris). Acta Biol Hung

45(2-4):337-435.

Liebmann E (1942a) The coelomocytes of Lumbricidae. J Morphol 11(2):221-249.

Liebmann E (1942b) The role of the chloragogue in regeneration of Eisenia foetida. J

Morphol 70:151-187.

Linthicum DS, Stein EA, Marks DH, Cooper EL (1977) Electron-microscopic observations of

normal coelomocytes from the earthworm, Lumbricus terrestris. Cell Tissue Res

185(3):315-330.

Lkhider M, Marcel R, Tramu G (1987) Establishment of a map of neurons in the brain of

Eisenia fetida (Annelida, Oligochaeta) containing substances immunologically specific

to vertebrate peptides. Gen Comp Endocrinol 65(3):457-468.

Luquet G, Leclerc M (1983) Spontaneous and induced cytotoxicity of axial organ cells from

Asterias rubens (Asterid--echinoderm). Immunol Lett 6(6):339-342.

96

Mansour MH, DeLange R, Cooper EL (1985) Isolation, purification, and amino acid

composition of the tunicate hemocyte Thy-1 homolog. J Biol Chem 260(5):2681-2686.

Martinez C, Delgado M, Pozo D, Leceta J, Calvo JR, Ganea D, Gomariz RP (1998) VIP and

PACAP enhance IL-6 release and mRNA levels in resting peritoneal macrophages: in

vitro and in vivo studies.J Neuroimmunol 85(2):155-167.

Meyer DK (2006) The effects of PACAP on neural cell proliferation. Regul Pept 137(1-2):50-

57.

Milochau A, Lassegues M, Valembois P (1997) Purification, characterization and activities of

two hemolytic and antibacterial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia

fetida andrei. Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol 1337(1):123-132.

Minta A, Kao JP, Tsien RY (1989) Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on

rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem 264(14):8171–8178.

Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH

(1989) Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates

adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem Biophys Res Commun 164(1):567-574.

Molnár L, Gábriel R (2001) Fény- és elektronmikroszkópos mikrotechnika. Dialóg Campus

Kiadó, Budapest-Pécs.

Molnar L, Pollak E, Boros A, Reglödi D, Tamás A, Lengvari I, Arimura A, Lubics A (2006)

Comparative anatomy of PACAP-immunoreactive structures in the ventral nerve cord

ganglia of lumbricid oligochaetes. Ann New York Acad Sci 1070:427-430.

Molnár L, Pollák E, Boros A, Shioda S, Nakajo S, Tamás A, Lengvári I, Reglodi D, Lubics A

(2008) PAC1 receptor localization in a model nervous system: light and electron

microscopic immunocytochemistry on the earthworm ventral nerve cord ganglia. Regul

Pept 145(1-3):96-104.

Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J, Lubics A,

Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-like molecules in earthworms and their influence

on the brain regeneration. Acta Physiol 202:81-81.

Moment GB (1974) The possible roles of coelomic cells and their yellow pigment in annelid

regeneration and aging. Growth 38(2):209-218.

Mori T, Kawashima T, Beppu Y, Takagi K (1994) Histamine release induced by pituitary

adenylate cyclase activating polypeptide from rat peritoneal mast cells.

Arzneimittelforschung 44(9):1044-1046.

97

Muroi M, Shioda S, Yada T, Zhou CJ, Nakai Y, Nakajo S, Arimura A (1998) Distribution and

ultrastructural localization of PACAP receptors in the rat pancreatic islets. Ann New

York Acad Sci 865:438-440.

Negm HI, Mansour MH, Cooper EL (1991) Identification and structural characterization of

Lyt-1 glycoproteins from tunicate hemocytes and mouse thymocytes. Comp Biochem

Physiol B Biochem Mol Biol 99(4):741-749.

Negm HI, Mansour MH, Cooper EL (1992) Identification and structural characterization of an

LYT-2/3 homolog in tunicates. 101(1-2):55-67.

Opper B, Németh P, Engelmann P (2010) Calcium is required for coelomocyte activation in

earthworms. Mol Immunol 47(11-12):2047-2056.

Oumi T, Ukena K, Matsushima O, Ikeda T, Fujita T, Minakata H, Nomoto K (1995) The

GGNG peptides: novel myoactive peptides isolated from the gut and the whole body of

the earthworms. Biochem Biophys Res Commun 216(3):1072-1078.

Oumi T, Ukena K, Matsushima O, Ikeda T, Fujita T, Minakata H, Nomoto K (1996)

Annetocin, an annelid oxytocin-related peptide, induces egg-laying behavior in the

earthworm, Eisenia foetida. J Exp Zool 276(2):151-156.

Parekh AB (2003) Store-operated Ca2+ entry: dynamic interplay between endoplasmic

reticulum, mitochondria and plasma membrane. J Physiol 547(2):333-348.

Reglödi D, Lubics A, Szelier M, Lengvári I (1999) Gastrin- and cholecystokinin-like

immunoreactivities in the nervous system of the earthworm. Peptides 20(5):569-577.

Reglödi D, Lengvari I, Szelier M, Vigh S, Arimura A (2000) Distribution of PACAP-like

immunoreactivity in the nervous system of oligochaeta. Peptides 21(2):183-188.

Reglodi D, Lubics A, Tamás A, Szalontay L, Lengvári I (2004) Pituitary adenylate cyclase

activating polypeptide protects dopaminergic neurons and improves behavioral deficits

in a rat model of Parkinson's disease. Behav Brain Res 151(1-2):303-312.

Renzelli-Cain R, Kaloustian KV (1995) Evidence for the involvement of opioid peptides in

phagocytosis, conformation, granulation and aggregation of immunocompetent

Lumbricus terrestris amoebocytes. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol

Endocrinol 111(2):205-211.

Roch P, Valembois P, Davant N, Lassegues M (1981) Protein-analysis of earthworm celomic

fluid .2. isolation and biochemical-characterization of the Eisenia-fetida-andrei factor

(EFAF). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 69(4):829-836.

98

Roch P, Cooper EL, Eskinazi DP (1983) Serological evidences for a membrane structure

related to human beta 2-microglobulin expressed by certain earthworm leukocytes. Eur

J Immunol 13(12):1037-1042.

Roch P, Canicatti C, Valembois P (1989) Interactions between earthworm hemolysins and

sheep red blood-cell membranes. Biochim Biophys Acta 983(2):193-198.

Roch P, Ville P, Cooper EL (1998) Characterization of a 14 kDa plant-related serine protease

inhibitor and regulation of cytotoxic activity in earthworm coelomic fluid. Dev Comp

Immunol 22(1):1-12.

Saad AH; Cooper EL (1990) Evidence for a thy-1-like molecule expressed on earthworm

leukocytes. Zool Sci 7(2):217-222.

Salzet M, Verger-Bocquet M, Wattez C, Malecha J (1992) Evidence for angiotensin-like

molecules in the central nervous system of the leech Theromyzon tessulatum (O.F.M.).

A possible diuretic effect. Comp Biochem Physiol Physiol 101(1):83-90.

Salzet, M (2000) Invertebrate molecular neuroimmune processes. Brain Res Rev 34(1-2):69-

79.

Salzet M (2001) Neuroimmunology of opioids from invertebrates to human. Neuroendocrinol

Lett 22(6):467-474.

Seebeck J, Kruse ML, Schmidt-Choudhury A, Schmidt WE (1998) Pituitary adenylate cyclase

activating polypeptide induces degranulation of rat peritoneal mast cells via high-

affinity PACAP receptor-independent activation of G proteins. Ann N Y Acad Sci

865:141-146.

Seki T, Shioda S, Ogino D, Nakai Y, Arimura A, Koide R (1997) Distribution and

ultrastructural localization of a receptor for pituitary adenylate cyclase activating

polypeptide and its mRNA in the rat retina. Neurosci Lett 238(3):127-130.

Sekizawa Y; Kubo T; Kobayashi H; Nakajima T; Natori S (1997) Molecular cloning of

cDNA for lysenin, a novel protein in the earthworm Eisenia foetida that causes

contraction of rat vascular smooth muscle. Gene 191(1):97-102.

Shalev A, Greenberg AH, Lögdberg L, Björck L (1981) Beta 2-Microglobulin-like molecules

in low vertebrates and invertebrates. J Immunol 127(3):1186-1191.

Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000) The origin and function of the pituitary

adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon superfamily. Endocr Rev

21(6):619-670.

Sherwood NM, Adams BA, Isaac ER, Wu S, Fradinger EA (2007) Knocked down and out:

PACAP in development, reproduction and feeding. Peptides 28(9):1680-1687.

99

Sima P, Bilej M, Slipka J (1995) Perienteral chloragogen tissue and its role in defense in

lumbricid worms. Adv Exp Med Biol 371:327-329.

Somogyvári-Vigh A, Reglödi D, Li M, Lengvári I, Vigh S, Arimura A (2000) Tissue

distribution of PACAP27 and -38 in oligochaeta: PACAP27 is the predominant form in

the nervous system of Lumbricus polyphemus.Peptides 21(8):1185-1191.

Somogyvári-Vigh A, Reglodi D (2004) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide: a

potential neuroprotective peptide. Curr Pharm Des 10(23):2861-2889.

Söderhäll K, Wingren A, Johansson MW, Bertheussen K (1985) The cytotoxic reaction of

hemocytes from the freshwater crayfish, Astacus astacus. Cell Immunol 94(2):326-332.

Stang-Voss C (1970) Studies on the ultrastructure of invertebrate hemocytes. II. On the

hemocytes of Golfingia gouldi (Sipunculidae). Z Zellforsch Mikrosk Anat 106(2):200-

208.

Stein EA, Avtalion RR, Cooper EL (1977) The coelomocytes of the earthworm Lumbricus

terrestris: morphology and phagocytic properties. J Morphol 153(3):467-478.

Stein EA, Cooper EL (1978) Cytochemical observations of coelomocytes from the

earthworm, Lumbricus terrestris. Histochem J 10(6):657-678.

Stein EA, Cooper EL (1981) The role of opsonins in phagocytosis by coelomocytes of the

earthworm, Lumbricus terrestris. Dev Comp Immunol 5(3):415-425.

Stein EA, Cooper EL (1988) In vitro agglutinin production by earthworm leukocytes. Dev

Comp Immunol 12(3):531-547.

Sundler F, Håkanson R, Alumets J, Walles B (1977) Neuronal localization of pancreatic

polypeptide (PP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) immunoreactivity in the

earthworm (Lumbricus terrestris). Brain Res Bull 2(1):61-65.

Suzuki MM, Cooper EL (1995a) Allogeneic killing by earthworm effector cells. Nat Immunol

14(1):11-19.

Suzuki MM, Cooper EL (1995b) Killing of intrafamilial leukocytes by earthworm effector

cells. Immunol Lett 44(1):45-49.

Tyson CJ, Jenkin CR (1974) The cytoxic effect of haemocytes from the crayfish

(Parachaeraps bicarinatus) on tumour cells of vetebrates. Aust J Exp Biol Med Sci

52(6):925-923.

Valembois P (1971) Étude ultrastructurale des coelomocytes du lumbricien Eisenia fetida

(Sav.). Bulletin de la Société Zoologique de France 96:59-72

Valembois P, Roch P, Lassegues M, Cassand P (1982) Antibacterial activity of the hemolytic

system from the earthworm Eisenia fetida andrei. J Invertebr Pathol 40(1):21-27.

100

Valembois P, Roch P; Lassegues M (1988) Evidence of plasma clotting system in

earthworms. J Invertebr Pathol 51(3):221-228.

Valembois P, Seymour J, Roch P (1991) Evidence and cellular localization of an oxidative

activity in the coelomic fluid of the earthworm Eisenia fetida andrei. J Invertebr Pathol

57(2)177–183.

Valembois P, Lassegues M, Roch P (1992) Formation of brown bodies in the coelomic cavity

of the earthworm Eisenia fetida andrei and attendant changes in shape and adhesive

capacity of constitutive cells. Dev Comp Immunol 16(2-3):95-101.

Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H (2000) Pituitary adenylate

cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions. Pharmacol

Rev 52(2):269-324.

Vaudry D, Falluel-Morel A, Basille M, Pamantung TF, Fontaine M, Fournier A, Vaudry H,

Gonzalez BJ (2003) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents C2-

ceramide-induced apoptosis of cerebellar granule cells. J Neurosci Res 72(3):303-316.

Waschek JA (2002) Multiple actions of pituitary adenylyl cyclase activating peptide in

nervous system development and regeneration. Dev Neurosci 24(1):14-23.

Wilhelm M, Koza A, Engelmann P, Németh P, Csoknya M (2006) Evidence for the presence

of thyroid stimulating hormone, thyroglobulin and their receptors in Eisenia fetida: a

multilevel hormonal interface between the nervous system and the peripheral tissues.

Cell Tissue Res 324(3):535-546.

Yamaji A, Sekizawa Y, Emoto K, Sakuraba H, Inoue K, Kobayashi H, Umeda M (1998)

Lysenin, a novel sphingomyelin-specific binding protein. J Biol Chem 273(9):5300-

5306.

Zhong Y (1995) Mediation of PACAP-like neuropeptide transmission by coactivation of

Ras/Raf and cAMP signal transduction pathways in Drosophila. Nature 375(6532):588-

592.

101

11. Publikációs jegyzék

A disszertáció alapjául szolgáló tanulmányok:

1. Somogyi I, Boros A, Engelmann P, Varhalmi E, Nemeth J, Lubics A, Tamas A, Kiss

P, Reglodi D, Pollak E, Molnar L (2009) Pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide-like compounds could modulate the activity of coelomocytes in the

earthworm. Ann New York Acad Sci 1163:521-523. IF: 2,303

2. Varhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Nemeth J, Reglodi D, Lubics A, Kiss P, Tamas

A, Pollak E, Molnar L (2008) Expression of PACAP- like compounds during the

caudal regeneration of the earthworm Eisenia fetida. J Mol Neurosci 36(1-3):166–

174. IF: 2,061

3. Hayashi Y, Engelmann P, Foldbjerg R, , Somogyi I, ,

Autrup H, Sutherland DS, Scott-Fordsmand J, Heckmann LH (2012) Earthworms

and humans in vitro: characterizing evolutionarily conserved stress and immune

responses to silver nanoparticles. Environ Sci Technol 46(7):4166-4173. IF: 4,827*

4. Molnar L, Engelmann P, Somogyi I, Mácsik LL, Pollak E (2012) Cold-stress

induced formation of calcium and phosphorous rich chloragocyte granules

(chloragosomes) in the earthworm Eisenia fetida. Comp Biochem Physiol Mol

Integr Physiol doi: 10.1016/j.cbpa.2012.06.005. IF: 2,134*

*: legutolsó 2010-es IF alapján

A disszertáció alapjául szolgáló konferencia absztraktok, poszterek és előadások:

1. Engelmann P, Mácsik LL, Somogyi I, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P

(2011) Coelomasejt lizátum membránkárosító hatásának vizsgálata tumor

sejtvonalakon. 41. Membrántranszport Konferencia, Sümeg. Poszter absztrakt.

2. Mácsik LL, Somogyi I, Bovári J, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P,

Engelmann P (2010) Coelomasejt lizátum citotoxikus hatásainak vizsgálata HeLa,

Jurkat és Sp2 sejtvonalakon. 40. Membrántranszport Konferencia, Sümeg. Poszter

absztrakt.

102

3. Mácsik LL, Somogyi I, Bovári J, Opper B, Pollák E, Molnár L, Németh P,

Engelmann P (2010) Coelomasejtek citotoxikus hatásmechanizmusának

térképezése tumrosejtvonalakon. Magyar Immunológiai Társaság 39.

Kongresszusa, Szeged. Poszter absztrakt.

4. Somogyi I (2009) A hipofízis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP)-szerű

vegyületek szerepe a giliszta coelomasejtek működésének modulálásában. Biológus

Doktoranduszok Konferenciája, Pécs. Előadás.

5. Somogyi I, Várhalmi E, Engelmann P, Opper B, Boros Á, Németh J, Lubics A,

Reglődi D, Pollák E, Molnár L (2009) Pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide (pacap) modulates the activity of coelomocytes during the regeneration

of the ventral nerve cord ganglia in the earthworms. 8th Göttingen Meeting of the

German Neuroscience Society, Göttingen, Germany. Poszter absztrakt.

6. Somogyi I, Engelmann P, Boros Á, Németh J, Lubics A, Reglődi D, Pollák, E,

Molnár L (2008) PACAP-like compound modulate the activity of earthworm

coelomocytes. 24th Conference of European Comparative Endocrinologist, Genova,

Italy. Poszter absztrakt.

7. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lammel K, Lubics A, Reglődi D,

Németh J, Molnár L (2008) Possible role of PACAP in regeneration of the ventral

nerve cord ganglia of the earthworm: a biochemical and immunohistochemical

approach. International IBRO Workshop, Debrecen, Hungary. Poszter absztrakt.

8. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lammel K, Lubics A, Reglődi D,

Németh J, Molnár L (2008) Possible role of PACAP in regeneration of the ventral

nerve cord ganglia of the earthworm: a biochemical and immunohistochemical

approach. Ideggyógyászati szemle 61(S1):66-67.

9. Somogyi I, Várhalmi E, Pollák E, Reglődi D, Németh J, Shioda S, Matsuda K,

Lubics A, Molnár L (2007) PACAP and PAC1 receptor immunoreactivity in some

coelomocytes of the regenerating Eisenia fetida. 8th International Symposium on

VIP, PACAP and Related Peptides, Manchester, Vermont, USA. Poszter absztrakt.

103

10. Somogyi I, Várhalmi E, Pollák E, Reglődi D, Shioda S, Lubics A, Molnár L (2007)

PACAP and PAC1 receptor immunoreactivity in some coelomocytes of the

regenerating Eisenia fetida. J. Mol. Neurosci. 33(3):332-332.

11. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lubics A, Reglődi D, Németh J, Shioda

S, Molnár L (2007) Does PACAP influence invertebrate nervous system

regeneration? 8th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides,

Manchester, Vermont, USA. Poszter absztrakt.

12. Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Pollák E, Lubics A, Reglődi D, Shioda S, Molnár

L (2007) Does PACAP influence invertebrate nervous system regeneration? J. Mol.

Neurosci. 33(3):333-333.

Egyéb publikációk:

1. Boros A, Somogyi I, Engelmann P, Lubics A, Reglodi D, Pollak E, Molnar L

(2010) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type 1 (PAC1) receptor

is expressed during embryonic development of the earthworm. Cell Tissue Res.

339(3):649-653. IF: 2,804

Egyéb konferencia absztraktok, poszterek és előadások:

1. Boros Á, Gunszt D, Somogyi I, Pollák E, Molnár L (2011) Characterisation of

CAPAergic neurons in the earthworm brain: from immunocytochemistry to gene

identification. HSM Annual Meeting, Siófok. Társszerzős előadás.

2. Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J,

Lubics A, Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-szerű molekulák gyűrűsférgekben

és szerepük az agyregenerációban. A Magyar Farmakológiai Anatómus

Mikrocirkulációs Élettani Társaságok Közös Tudományos Konferenciája, Pécs.

Társszerzős előadás.

3. Molnár L, Horváth B, Gunszt D, Somogyi I, Engelmann P, Steib A, Németh J,

Lubics A, Reglődi D, Pollák E (2011) PACAP-like molecules in earthworms and

their influence on the brain regeneration. Acta Physiol. 202:81-81.

4. Gunszt D, Somogyi I, Joó T, Vecsei MJ, Debertin G, Pollák E, Molnár L (2010) A

hasdúclánc normál és patológiás regenerációja Eisenia fetidában. Normal and

104

pathological regeneration of the ventral nerve cord ganglia in the earthworm

Eisenia fetida. HSM Annual Meeting, Siófok. Társszerzős előadás.

5. Molnár L, Horváth B, Mátyás M, Oravetz K, Gunszt D, Somogyi I, Boros Á,

Pollák E (2010) A kiirtott agy regenerációja kontroll és mérgezett

gyűrűsférgekben. Regeneration of the extirpated brain in control and toxicated

earthworm. HSM Annual Meeting , Siófok. Társszerzős előadás.

6. Lubics A, Horváth B, Somogyi I, Gunszt D, Boros A, Pollák E, Németh J, Reglődi

D, Molnár L (2010) Brain extirpation stimulate PACAP expression in the central

nervous system of the earthworm. 25th Conference of European Comparative

Endocrinologists, Pécs, Hungary. Poszter absztrakt.

7. Horváth B, Somogyi I, Gunszt D, Boros A, Pollák E, Németh J, Reglődi D, Lubics

A, Molnár L (2009) Brain extirpation stimulatesPACAP expression in the central

nervous system of the earthworm. 9th International Symposium on VIP, PACAP and

Related Peptides, Kagoshima, Japan. Poszter absztrakt.

8. Molnár L, Gunszt D, Boros Á, Pollák E, Somogyi I, Horváth B, Németh J, Reglődi

D, Lubics A. (2009) The role of the circulatory system in the transportation of

PACAP-like compounds in earthworms. 9th International Symposium on VIP,

PACAP and Related Peptides, Kagoshima, Japan. Poszter absztrakt.

9. Molnár L, Gunszt D, Boros Á, Pollák E, Somogyi I, Horváth B, Németh J, Reglődi

D, Lubics A (2010) The role of the circulatory system in the transportation of

PACAP-like compounds in earthworms. J. Mol. Neurosci. 42(3):308-309.

10. Boros Á, Engelmann P, Somogyi I, Lubics A, Reglődi D, Pollak E, Molnar L

(2009): Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) selective

receptor (PAC1R) expression during the earthworm embryogenesis. 8th Göttingen

Meeting of the German Neuroscience Society, Göttingen, Germany. Poszter

absztrakt.

11. Lubics A, Boros Á, Engelmann P, Somogyi I, Herbert Zs, Reglődi D, Pollák E,

Molnár L (2008) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) has an

influence of the development and differentitation of embryonic tissue of the

105

earthworm Eisenia fetida. 24th Conference of European Comparative

Endocrinologist, Genova, Italy. Poszter absztrakt.

12. Boros Á, Pollák E, Reglődi D, Várhalmi E, Somogyi I, Kiszler G, Lubics A, Németh

J, Molnár, L (2007) PACAP isoforms and Pac1 receptors are expressed in the

regenerating ventral nerve cord ganglia of the earthworm Eisenia fetida. 11th

Symposium on Invertebrate Neurobiology, Tihany, Hungary. Poszter absztrakt.