Upload
mahala
View
49
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Současné trendy v klinické imunologii a sérologii. JAN MARTINEK. OSNOVA. Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens). Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD. Humorální Buněčné. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Současné trendy v klinické Současné trendy v klinické imunologii a sérologiiimunologii a sérologii
JAN MARTINEK
OSNOVAOSNOVA
Základní principy metod v imunologii a sérologii
ImunoglobulinyProblematika infekční sérologie (vybrané
infekční agens)
Principy metod v imunologie a Principy metod v imunologie a sérologii - sérologii - DĚLENÍ METODDĚLENÍ METOD
HumorálníBuněčné
Metody nefelometrie a turbidimetrie
• Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG
• Princip: měření intenzity světla• precipitace v roztoku – přímé měření
množství precipitátu - zákal• kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)
TURBIDIMETRIE
NEFELOMETRIE
zdroj světla kyveta s precipitátem detektor
zdroj světla
detektor
kyveta s precipitátem
rozptyl světla
ElektroforézaElektroforéza
• Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především
• Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ).
• možnost denzitometrické kvantifikace
E L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z AE L E K T R O F O R É Z A
I I MM UU NN OO FF II XX AA CC EEI I MM UU NN OO FF II XX AA CC EE
Metody – EIAMetody – EIA
Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE …
Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením
Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA …
Metoda – ELISAMetoda – ELISA
Princip: komplex Ag - Ab detekován sekundární
protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza)
• komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab)
se odstraní promytím• vysoká citlivost (1ng/l)
ELISAELISA – průkazprůkaz antigenuantigenuELISAELISA – průkazprůkaz antigenuantigenu
TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ
SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA
METODA CLIA – ADVIA CENTAURMETODA CLIA – ADVIA CENTAUR
Metoda – WB, ImunodotMetoda – WB, Imunodot
Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …
WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)
Metoda – IFA Metoda – IFA
Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens
NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCENEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE
Jaderné autoantigenypolynukleotidyhistonyribonukleoproteinyantigeny jadérekcentroméradalší antigeny
Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy
buněčné organelyantigeny cytoskeletudalší antigeny
Antigeny asociované s dělením buňky
centrioladělící vřeténkoseparační zóna buňky
Autoprotilátky na HEp-2 buňkách :
Komplement fixace a hemaglutinaceKomplement fixace a hemaglutinace komplement-fixační reakce je založena na vyvazování
komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM).
aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.
NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACENEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE
Testy Buněčné imunityTesty Buněčné imunity
Funkční testy leukocytůStanovení počtu buněk
Funkční testyFunkční testy
Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem
Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)
Funkční testyFunkční testy
BasotestAktivita NK buněkBlastická transformace lymfocytů
Stanovení počtuStanovení počtu
Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií
• vrchol současných možností analýzy • buněčných suspenzí
• částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady
• cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem
PRŮTOKOVÁPRŮTOKOVÁ CYTOMETRIECYTOMETRIEPRŮTOKOVÁPRŮTOKOVÁ CYTOMETRIECYTOMETRIE
Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou
Vyjadřování výsledků - EIA Vyjadřování výsledků - EIA metodymetody
Index pozitivity – Cut off (referenční sérum)
0-0,9 – negativní
0,9-1,1 – hraniční
>1,1 - pozitivníKalibrační křivka – standardy
Vyjadřování výsledků - IFA Vyjadřování výsledků - IFA metodymetody
Subjektivní hodnocení, komentářHraničníSlabě pozitivníPozitivníSilně pozitivní
Vyjadřování výsledků – metody Vyjadřování výsledků – metody WB, ImunodotWB, Imunodot
Semikvantitativní hodnocení, komentářSubjektivní hodnocení v kombinaci se
software
Vyjadřování výsledků – Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrieprůtoková cytometrie
Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly)
U hematologických pacientů komentář
MULTIPLEXYMULTIPLEXY
V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“
Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu
„„Kuličkové“ Multiplexy Kuličkové“ Multiplexy
Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny
Detekce jakýchkoli protilátekNení zatím v rutinní praxi
IMUNOGLOBULINY A B-IMUNOGLOBULINY A B-LYMFOCYTYLYMFOCYTY
HemopoézaHemopoéza
BCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, ImunoglobulinyBCR receptor, Imunoglobuliny
GENETICKÁ ORGANIZACE IgHGENETICKÁ ORGANIZACE IgH
VH DH JH
S S S S S S S S S S
C C
C 3
C 1
C C
1
C 2
C 4
C C 2
Lokalizace genu v genomu:Lokalizace genu v genomu:
Těžký řetězec – 14 chromozom
Lehký řetězec – λ – 2 chromozom
k – 22 chromozom
Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)
Diferenciace B-lymfocytůDiferenciace B-lymfocytů
Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor
Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk
CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEKCHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK
DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDIONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU
kultivace
mikroskopie
PCR
LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA
INFEKČNÍCH NEMOCÍ:
NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ)
PRŮKAZ
Stanovení protilátek
• obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.)
• retrospektivní nález (epidemiologie)
Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM
čas
IgG
IgA
IgM
Mn
ožst
ví p
roti
láte
k
DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDIDYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
EBVEBV
Souhrn - EBVSouhrn - EBV
Čeleď Herpesviridae, DNA virusKosmopolitněRozvojové země – v dětství, západní země – až
adolescenceCeloživotní nosičství (latentní infekce organismu)
- perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)
EBV - ProtilátkyEBV - Protilátky
Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test
Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA
Dynamika tvorby protilátekDynamika tvorby protilátek
Latentní fázeLatentní fáze
Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA
EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál
Lytická fázeLytická fáze
Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů
Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů
Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity
Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo
EBV - Nádory, genetikaEBV - Nádory, genetika
Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním
Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním
spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (X- vázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV)
Chlamydie - CharakteristikaChlamydie - Charakteristika
•„atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu •intracelulárnírůst •bez vlastního energetického metabolismu •=> nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových
kulturách •=> nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu
(beta-laktamováATB) •růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny
Chlamydie - DruhyChlamydie - Druhy
•Chlamydia pneumoniae–původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ???
•Chlamydia trachomatis•původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K)•lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3)•trachom (serotypyA, B, Ba, C)
•Chlamydia psittaci–původce „papouščínemoci“
•Chlamydia pecorum
Chlamydie - DiagnostikaChlamydie - Diagnostika
Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR
Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP
Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce
Hodnocení protilátek u Hodnocení protilátek u ChlamydiíChlamydií
IgM IgA IgG Hodnocení
- - - Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce)
+ - - Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní
+ +- +- Akutní infekce na počátku
+ + + Probíhající infekce
- - + Perzist.IgG po proběhlé infekci
- + +- Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky
BorrelieBorrelie
Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB
Nesrovnalosti mezi výrobci
Děkuji za pozornost